WO2013008743A1 - クラミジアニューモニエ抗原及びその利用 - Google Patents

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WO2013008743A1
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antibody
chlamydia
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pneumoniae
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文雄 岸
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富士レビオ株式会社
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • C07K16/125—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Chlamydiales (O)
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/12—Pulmonary diseases

Definitions

  • the present invention relates to a detection method for pneumoniae chlamydia infection and an anti-pneumonitis chlamydia neutralizing antibody.
  • Chlamydophila pneumoniae (formerly known as Chlamydia pneumoniae) is a bacterium that is classified as an obligate intracellular parasitic gram-negative bacterium and is a causative bacterium that causes respiratory infections (Non-patent Document 1). Persistent infection has been suggested, and involvement in various pathological conditions such as arteriosclerosis and asthma has been suggested.
  • Pneumonia chlamydia is estimated to be associated with about 10% of community-acquired pneumonia. Pneumonia is caused by various pathogenic bacteria such as influenza and mycoplasma, and rapid diagnosis of causative bacteria is important for early identification and treatment of causative bacteria of pneumonia.
  • Non-Patent Document 2 As a diagnostic method for pneumonia chlamydia infection, separation culture using cell lines such as HeLa229, McCoy, HEp2, nucleic acid detection by PCR, antibody titer measurement by EIA method or Microimmunofluorescence (Micro-IF) method are performed. (Non-Patent Document 2).
  • the method of diagnosing Chlamydia pneumoniae infection by separate culture requires time to diagnosis and has low detection sensitivity.
  • the method for detecting nucleic acids by PCR cannot be carried out simply because it requires skill of the practitioner and equipment for culture.
  • the method for detecting Chlamydia antibodies to pneumonia in samples by the Micro-IF method is recommended by the US Centers for Disease Control as a standard method for serodiagnosis tests, but it is difficult to perform and is a method for detecting infection more easily. Development is desired.
  • the antibody detection method by the EIA method is preferable as a serum diagnostic method because it can be easily carried out.
  • ELISA kits utilize outer membrane proteins or lipopolysaccharide (LPS) as antigens.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Non-patent Document 3 antigens other than the above outer membrane proteins and LPS have been identified for antibody detection by the EIA method.
  • these antigens have been identified in order to detect IgG-type antibodies, and Non-Patent Document 3 does not describe any detection of IgM-type antibodies or IgA-type antibodies induced in the early infection stage of patients with initial infection. .
  • Pneumonia Chlamydia results in reinfection of adults from the first infection in children.
  • the relationship between pneumonia chlamydia and arteriosclerosis has attracted attention, and failure of initial treatment in the early stage of infection may lead to persistent infection and cause arteriosclerosis. Therefore, effective elimination treatment at the early stage of infection is important. Under such circumstances, not only antibiotics currently used as therapeutic agents but also infection protection vaccines are effective, but satisfactory infection protection vaccines are not known.
  • Grayston JT et. Al., "A new respiratory tract pathogen: Chlamydia pneumoniae strain TWAR.” J Infect Dis. 1990 Apr; 161 (4): 618-25.
  • Kuo CC et al., "Chlamydia pneumoniae (TWAR).” Clin Microbiol Rev. 1995 Oc; 8 (4): 451-61.
  • Hongliang C., et. Al. "Serodiagnosis of Chlamydia pneumoniae infection.” J Clin. Lab. Anal. 2010; 24: 55-61
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection, which can detect patients with Chlamydia pneumonia first infection with high sensitivity and can be carried out easily.
  • Another object of the present invention is to provide a novel means useful for the treatment and prevention of Chlamydia pneumoniae infection.
  • the inventor of the present application diligently investigated the reactivity of Chlamydia pneumoniae J138 strain with an unknown protein using sera of 8 children with Chlamydia pneumoniae infection and achieved 58 detection sensitivity higher than that of a commercially available ELISA kit.
  • some of these 58 molecules react with IgM and / or IgA anti-pneumonitis chlamydia antibodies, which can be used for early detection of infection in patients with primary infection.
  • the present invention was completed by finding that an antibody against the chlamydia protein Cpj0939 has a neutralizing activity that suppresses infection of Chlamydia pneumoniae cells.
  • the present invention provides an IgM-type anti-pneumonia chlamydia in a specimen separated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (c) as an antigen:
  • a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring an antibody is provided.
  • polypeptide consisting of a partial region of 7 or more consecutive residues in the polypeptide of (a), which binds to an IgM-type anti-pneumoniae chlamydia antibody induced in vivo against chlamydia pneumoniae by an antigen-antibody reaction.
  • an IgM-type protein having 90% or more identity with the polypeptide of (a) or (b), having a size of 7 residues or more, and induced in vivo against pneumoniae chlamydia protein A polypeptide that binds to an anti-pneumonitis chlamydia antibody by an antigen-antibody reaction.
  • the present invention also provides an IgA-type anti-pneumonia chlamydia in a specimen isolated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (g) to (i) as an antigen:
  • a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring an antibody is provided.
  • a polypeptide comprising a partial region of 7 or more consecutive residues in the polypeptide of (g) and binding to an IgA-type anti-pneumoniae chlamydia antibody induced against pneumoniae chlamydia protein in vivo by an antigen-antibody reaction.
  • an IgA-type protein having 90% or more identity with the polypeptide of (g) or (h), having a size of 7 residues or more, and induced in vivo against pneumoniae chlamydia protein
  • the present invention also provides an IgG type anti-pneumonia chlamydia in a specimen isolated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (j) to (l) as an antigen:
  • a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring an antibody is provided.
  • (j) SEQ ID NOs: 3, 22, 39, 42, 43, 48, 52, 54, 58, 14, 30, 7, 24, 29, 35, 41, 47, 53, 56, 15, 57, 45, 50 , 51, 55, 2, 10 to 12, 19, 20, 16, 17, 23, 25, 4, 9, 18, 28, 34, 36, 37, 44 and 46, a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in FIG.
  • (k) A polypeptide comprising a partial region of 7 or more consecutive residues in the polypeptide of (j) and binding to an anti-pneumonitis chlamydia antibody induced against chlamydia pneumoniae in vivo by an antigen-antibody reaction .
  • (l) An IgG-type protein having 90% or more identity with the polypeptide of (j) or (k), having a size of 7 residues or more, and derived in vivo against pneumoniae chlamydia protein A polypeptide that binds to an anti-pneumonitis chlamydia antibody by an antigen-antibody reaction.
  • the present invention provides an anti-pneumonitis chlamydia antibody measurement kit for measuring an anti-pneumonia chlamydia antibody in a sample, comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of (a) to (c) above. To do.
  • the present invention also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that has a neutralizing activity that binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 233 by antigen-antibody reaction and suppresses infection with Chlamydia pneumoniae. Furthermore, the present invention provides a medicament containing the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient and a therapeutic or prophylactic agent for Chlamydia pneumoniae infection. Furthermore, the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for pneumonia chlamydial infection, comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of (d) to (f) below. (d) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 233.
  • a polypeptide comprising a partial region of 7 or more consecutive residues in the polypeptide of (d) and capable of inducing protective immunity against Chlamydia pneumoniae.
  • a protein molecule derived from Chlamydia pneumonia that can be recognized by the human immune system has been identified, and an antigen molecule that can detect Chlamydia pneumonia more stably and more sensitively than conventional ELISA kits has been identified. Even by examining the sera of only 8 patients, the difference in detection sensitivity with the conventional ELISA kit is clearly confirmed.
  • the present invention also provides a novel neutralizing antibody for Chlamydia pneumoniae.
  • the neutralizing antibody can significantly suppress infection of Chlamydia pneumoniae host cells. Therefore, the neutralizing antibody and the protein molecule derived from Chlamydia pneumonia which can immunize the neutralizing antibody in vivo are very useful as a therapeutic or preventive agent for Chlamydia pneumoniae infection.
  • FIG. 6 summarizes the reactivity of 58 antigenic proteins with individual sera from infected patients. The antigen-serum combination for which the reaction was confirmed was shown in black.
  • At least one polypeptide selected from the group consisting of (m) to (o) below can be used as an antigen for the detection of Chlamydia pneumoniae infection.
  • (m) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 58.
  • IgA IgG having 90% or more identity with the polypeptide of (m) or (n), having a size of 7 residues or more, and induced in vivo against pneumoniae chlamydia protein
  • a polypeptide that binds to an IgM antibody by an antigen-antibody reaction Alternatively, a polypeptide that binds to an IgM antibody by an antigen-antibody reaction.
  • the polypeptide of (m) is shown in Table 1. These 58 molecules of polypeptide are proteins encoded by the Chlamydia pneumoniae genome. In the Examples, the primers used for the amplification of the coding region when preparing each pneumonia chlamydia protein are also shown. For the protein in which orthologs exist in C. spp. Trachomatis, the ortholog name and the identity of the pneumoniae chlamydia protein (by comparison of the full length) are also shown.
  • the estimated kDa in Table 1 indicates the molecular weight estimated from the amino acid sequence of each ORF.
  • the actually measured kDa indicates a molecular weight obtained by subtracting the molecular weight of GFP (about 27 kDa) from the molecular weight of each recombinant protein actually detected when each ORF is expressed as a GFP fusion protein in Examples described later.
  • Cpj0068, Cpj0214, Cpj0230, Cpj0301, Cpj0783, Cpj0819, Cpj0874, Cpj0884, and Cpj0945 express the region obtained by removing the signal peptide from each full-length ORF as a GFP fusion protein.
  • the above 58 pneumoniae chlamydia proteins are antigenic proteins whose binding reaction has been detected by Western blot analysis using mixed sera from eight pediatric patients diagnosed with acute primary infection with pneumoniae as primary antibodies.
  • anti-pneumoniae chlamydia antibodies IgA, IgG, or IgM antibodies
  • IgA, IgG, or IgM antibodies anti-pneumoniae chlamydia antibodies induced against pneumoniae chlamydia protein in the body of patients with pneumoniae chlamydia infection are conventionally obtained. It can be detected with higher sensitivity than the kit. Since not only anti-pneumonitis chlamydia IgG but also IgA and IgM occurring at the early stage of the initial infection can be detected with high sensitivity, it is very useful for detection of chlamydial primary infection.
  • Cpj0677 SEQ ID NO: 36
  • Cpj0147 SEQ ID NO: 4
  • Cpj0186 SEQ ID NO: 9
  • Cpj0308 SEQ ID NO: 18
  • IgG IgG
  • Chlamydia trachomatis makes it possible to detect pneumonia chlamydial infections, especially primary infections, specifically and accurately. Can be used particularly preferably.
  • the above polypeptide (n) is a fragment of 58 antigenic proteins shown in Table 1.
  • the size of the fragment is 7 residues or more, preferably 10 residues or more.
  • a polypeptide having a size of about 7 residues or more exhibits antigenicity. Therefore, such a fragment can also bind to an IgA, IgG or IgM type antibody induced against Chlamydia pneumoniae in vivo by an antigen-antibody reaction. It can be used as an antigen for detection.
  • the size of the polypeptide fragment is preferably 30 residues or more, more preferably 40 residues or more, or more than half of the total length.
  • the polypeptide of (o) above consists of an amino acid sequence in which a small number of amino acid residues are substituted, deleted or inserted in the polypeptide of (m) or (n), and the sequence identity with the original polypeptide Is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • the size of the polypeptide (o) is 7 residues or more.
  • a protein antigen has almost the same antigenicity as the original protein even when a few amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted, or inserted. It is well known to those skilled in the art.
  • a polypeptide having such a modified amino acid sequence can bind to an IgA, IgG or IgM antibody induced against Chlamydia pneumoniae in vivo by an antigen-antibody reaction. Similar to protein, it can be used as an antigen for the detection of Chlamydia pneumoniae infection.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted or inserted is preferred as the polypeptide of (o) This is one example.
  • amino acid sequence identity means that both amino acid sequences are aligned so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared match as much as possible, and the number of matched amino acid residues is divided by the total number of amino acid residues. Is expressed as a percentage.
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary.
  • sequence alignment can be performed using a known program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, and the like.
  • the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue.
  • the identity (%) is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the number of amino acid residues matched. Is calculated by dividing.
  • the 20 types of amino acids that make up natural proteins are neutral amino acids with low polarity side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn, Gln) , Thr, erSer, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp)
  • neutral amino acids with low polarity side chains Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro
  • neutral amino acids with hydrophilic side chains Asn, Gln
  • Thr, erSer, Tyr Thr, erSer, Tyr, Cys
  • acidic amino acids Asp, Glu
  • basic amino acids Arg, Lys, His
  • aromatic amino acids Phe, Tyr, Trp
  • a polypeptide consisting of an arbitrary amino acid sequence has a reactivity of binding to an antibody induced in vivo with a pneumoniae chlamydia protein by an antigen-antibody reaction was isolated from, for example, a known pneumoniae chlamydial-infected patient. It can be easily confirmed by reacting a sample such as serum with the polypeptide. If the binding between the antibody present in serum and the polypeptide can be confirmed, it can be determined that the polypeptide has the above-described reactivity.
  • polypeptides (m) to (o) For detection of Chlamydia pneumoniae infection, at least one of the polypeptides (m) to (o) may be used. From the viewpoint of improving detection sensitivity, two or more polypeptides may be combined appropriately as an antigen. It is preferable to use it.
  • the use of two or more kinds of polypeptides of (m) to (o) as antigens is explained by taking Cpj0068 (SEQ ID NO: 1) and Cpj0147 (SEQ ID NO: 2) as an example.
  • Use of a peptide is referred to as “using two kinds of polypeptides as antigens”.
  • the number of types of polypeptides used as an antigen can be appropriately selected. For example, 3, 5, or 10 or more types may be used as an antigen.
  • At least one of the polypeptides (m) to (o) may be used in combination with a protein known as a pneumonia chlamydia antigen, such as an outer membrane protein or lipopolysaccharide (LPS).
  • a protein known as a pneumonia chlamydia antigen such as an outer membrane protein or lipopolysaccharide (LPS).
  • the present invention provides an IgM-type anti-pneumonia chlamydia in a specimen separated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (c) as an antigen: A method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring an antibody is provided.
  • an IgM-type protein having 90% or more identity with the polypeptide of (a) or (b), having a size of 7 residues or more, and induced in vivo against pneumoniae chlamydia protein A polypeptide that binds to an anti-pneumonitis chlamydia antibody by an antigen-antibody reaction.
  • polypeptide (a) has been confirmed to have reactivity with IgM anti-pneumonia chlamydia antibodies in mixed serum obtained by mixing serum samples from 8 patients or individual serum samples (FIG. 2, FIG. 3).
  • Cpj0677 (SEQ ID NO: 36), Cpj0147 (SEQ ID NO: 4), Cpj0186 (SEQ ID NO: 9), Cpj0308 (SEQ ID NO: 18), Cpj0268 (SEQ ID NO: 15), Cpj0068 (SEQ ID NO: 3), Cpj0369 (SEQ ID NO: 3) No.
  • Cpj0677 (SEQ ID NO: 36), Cpj0147 (SEQ ID NO: 4), Cpj0186 (SEQ ID NO: 9), Cpj0308 (SEQ ID NO: 18), Cpj0268 (SEQ ID NO: 15), Cpj0159 (SEQ ID NO: 6), Cpj0472 (SEQ ID NO: 28) , Cpj0181 (SEQ ID NO: 8), Cpj0356 (SEQ ID NO: 21), Cpj0457 (SEQ ID NO: 27) and Cpj0678 (SEQ ID NO: 37) have no gene homologous to them in C. Chlamydia trachomatis, It can be preferably used as an antigen that can detect pneumoniae chlamydia infection, in particular, the initial infection of the initial infection specifically and with high accuracy.
  • Cpj0677 SEQ ID NO: 36
  • Cpj0147 SEQ ID NO: 4
  • Cpj0186 SEQ ID NO: 9
  • Cpj0308 SEQ ID NO: 18
  • Cpj0268 SEQ ID NO: 15
  • Type of anti-pneumoniae antibodies can be detected, and the absence of homologous genes in C.
  • Chlamydia is trachomatis allows specific and high-precision detection of pneumoniae chlamydial infections, especially the initial infection It can be particularly preferably used as a possible antigen.
  • the present invention relates to an anti-pneumonia Chlamydia of IgA type in a sample separated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (g) to (i) as an antigen.
  • a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring the antibody is also provided.
  • an IgA-type protein having 90% or more identity with the polypeptide of (g) or (h), having a size of 7 residues or more, and induced in vivo against pneumoniae chlamydia protein A polypeptide that binds to an anti-pneumonitis chlamydia antibody by an antigen-antibody reaction.
  • polypeptide (g) has been confirmed to react with a mixed serum obtained by mixing serum samples from eight patients or an IgA anti-pneumonitis chlamydia antibody in individual serum samples (FIG. 2, FIG. 3).
  • Cpj0677 (SEQ ID NO: 36), Cpj0147 (SEQ ID NO: 4), Cpj0186 (SEQ ID NO: 9), Cpj0308 (SEQ ID NO: 18), Cpj0068 (SEQ ID NO: 3), Cpj0383 (SEQ ID NO: 24), Cpj0706 (SEQ ID NO: 24) No.
  • Cpj0677 (SEQ ID NO: 36), Cpj0147 (SEQ ID NO: 4), Cpj0186 (SEQ ID NO: 9), Cpj0308 (SEQ ID NO: 18), Cpj1070 (SEQ ID NO: 58) and Cpj0472 (SEQ ID NO: 28) are represented by C. trachomatis (Chlamydia trachomatis) has no gene homologous to these, and therefore, it can be preferably used as an antigen that can specifically and accurately detect infection with Chlamydia pneumonia, in particular, the initial infection of the initial infection.
  • Cpj0677 SEQ ID NO: 36
  • Cpj0147 SEQ ID NO: 4
  • Cpj0186 SEQ ID NO: 9
  • Cpj0308 SEQ ID NO: 18
  • the present invention provides an IgG type anti-pneumonia chlamydia in a specimen isolated from a living body by immunoassay using at least one polypeptide selected from the group consisting of (j) to (l) below as an antigen.
  • a method for detecting Chlamydia pneumoniae infection comprising measuring the antibody is also provided.
  • polypeptide (j) has been confirmed to react with IgG-type anti-pneumonia chlamydia antibodies in mixed serum obtained by mixing serum samples from eight patients or individual serum samples (FIG. 2, FIG. 3).
  • Cpj0068 (SEQ ID NO: 3), Cpj0369 (SEQ ID NO: 22), Cpj0706 (SEQ ID NO: 39), Cpj0726 (SEQ ID NO: 42), Cpj0727 (SEQ ID NO: 43), Cpj0810 (SEQ ID NO: 48), Cpj0884 (SEQ ID NO: 48) No.
  • Cpj1070 (SEQ ID NO: 58), Cpj0178 (SEQ ID NO: 7), Cpj0268 (SEQ ID NO: 15), Cpj1056 (SEQ ID NO: 57), Cpj0067 (SEQ ID NO: 2), Cpj0214 (SEQ ID NO: 10), Cpj0224 (SEQ ID NO: 11), Cpj0225 (SEQ ID NO: 12), Cpj0339 (SEQ ID NO: 19), Cpj0355 (SEQ ID NO: 20), Cpj0147 (SEQ ID NO: 4), Cpj0186 (SEQ ID NO: 9), Cpj0308 (SEQ ID NO: 18), Cpj0472 (SEQ ID NO: 28), Cpj0677 (SEQ ID NO: 36) and Cpj0678 (SEQ ID NO: 37) are preferable as antigens that can specifically and accurately detect Chlamydia pneumoniae infection because C. Chlamydia trachomatis does not have homologous genes
  • Chlamydia spp Includes both Chlamydophila and Chlamydia genera.
  • the polypeptide (p) is an antigenic protein in which an ortholog exists in Trachomatis.
  • the identity of the ortholog shown in Table 1 is the identity compared with the full length as defined in the present application, but the antibody in the serum recognizes about 7 residues in the antigen protein. Since it is a short region (epitope), the antibody in serum can be obtained by using, as an antigen, a polypeptide containing a region having a partially high identity even though the identity of the corresponding antibody of the serum is low. Can be detected.
  • Cpj0379 SEQ ID NO: 23
  • Cpj0525 SEQ ID NO: 31
  • Cpj0533 SEQ ID NO: 33
  • Cpj0577 SEQ ID NO: 35
  • Cpj0706 SEQ ID NO: 39
  • Cpj0884 SEQ ID NO: 52
  • Preferred examples of the polypeptide (p) include, but are not limited to.
  • a polypeptide consisting of an arbitrary amino acid sequence has a reactivity with an antigen-antibody reaction with an anti-chlamydia antibody induced in vivo against a protein of the genus Chlamydia can be determined, for example, in a known chlamydial-infected patient (pneumonia It can be easily confirmed by reacting a sample such as serum isolated from a patient with Chlamydia infection or a C. trachomatis infection with a polypeptide thereof. If the binding between the antibody present in serum and the polypeptide can be confirmed, it can be determined that the polypeptide has the above-described reactivity.
  • At least one kind of polypeptide may be used for (p) to (r), but two or more kinds of polypeptides are appropriately combined from the viewpoint of increasing detection sensitivity. It is preferably used as an antigen.
  • other known antigens known to be able to detect infection with Chlamydia bacteria including pneumonia chlamydia may be used in combination.
  • the polypeptide used as an antigen in the present invention is preferably an artificial polypeptide.
  • An “artificial polypeptide” is a polypeptide artificially produced by chemical synthesis, genetic engineering techniques, or other methods, such as a protein expressed and produced from the Chlamydia pneumonia genome in cells infected with Chlamydia pneumoniae. Those recovered are not included.
  • the amino acid sequences of 58 types of antigen proteins and the base sequences encoding them are as described in SEQ ID NOs: 1 to 58.
  • the codons encoding each amino acid are known, the base sequence of a polynucleotide encoding a specific amino acid sequence can be easily specified. Therefore, even a polypeptide such as (c), (i), (l), (o), (r) having an amino acid sequence different from SEQ ID NOs: 1 to 58, The base sequence can be easily identified.
  • the polypeptide used as an antigen in the present invention can be produced by any method based on the sequence information.
  • the chemical synthesis method examples include Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. Moreover, it can also synthesize
  • polypeptides by genetic engineering techniques are also well known. Briefly, a polynucleotide encoding the polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an appropriate expression vector, and an appropriate expression system is used. The target antigen polypeptide can be obtained as a recombinant polypeptide by expressing it and recovering and purifying it.
  • the recombinant polypeptide can be modified by various post-translational modifications (elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, glycosylation, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, As long as the post-translationally modified form of the polypeptide is also reactive with antibodies induced in vivo against Chlamydia pneumoniae protein, it can be used as an antigen in the method of the present invention. Can be used.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide is, for example, C. pneumoniae J138 strain HEp -2 cells and other suitable host cells are infected, and from these infected cells, a pneumoniere basic body (EB) is recovered using a concentration gradient such as Urografin, and the pneumoniae genomic DNA is extracted from this EB and sequenced. It can be prepared by performing PCR using a primer set consisting of the nucleotide sequences shown by Nos. 117 and 118.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having a desired amino acid sequence can be obtained using a commercially available nucleic acid synthesizer or appropriately introducing mutations into DNA prepared as described above by a conventional method.
  • a desired polypeptide can be obtained by incorporating the prepared polynucleotide into an appropriate vector, expressing it in an appropriate expression system, and collecting and purifying it.
  • the vectors used and various expression systems bacterial expression systems, yeast cell expression systems, mammalian cell expression systems, insect cell expression systems, cell-free expression systems, etc.
  • Various vectors, host cells, reagents, kits Can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • C. pneumoniae strains are also commercially available and distributed, and can also be obtained separately from infected patients, so they are easily available.
  • Immunoassays themselves are well known in this field.
  • the immunoassay can be classified by reaction mode, such as sandwich method, competition method, aggregation method, immunochromatography method, Western blot method, etc. If classified by label, radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay (EIA), biotin immunity There are measurements.
  • various methods of antibody testing using antigens are known. Specific examples include, but are not limited to, EIA (ELISA, CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), Western blot, etc.), aggregation Method (latex aggregation method, etc.), complement binding reaction (CF) and the like.
  • any known immunoassay method may be used.
  • the term “measurement” includes detection, quantification, and semi-quantification.
  • immunoassay is performed using polypeptide antigens on standard samples of known concentrations containing anti-chlamydia antibodies at various concentrations, and the amount of signal from the label and the anti-chlamydia antibodies in the standard samples are measured.
  • a standard curve may be created by plotting the correlation with the concentration. Quantify the anti-chlamydia antibody in the sample by performing immunoassay in the same way for the sample with unknown anti-chlamydia antibody concentration, measuring the amount of signal from the label, and applying the measured signal amount to this standard curve Can do.
  • the above-described polypeptide antigen is used in a form in which an arbitrary amino acid sequence is added to one end or both ends (as a polypeptide comprising an amino acid sequence including such an added sequence). be able to.
  • an arbitrary amino acid sequence is added to one end or both ends
  • an anti-chlamydia antibody in a sample can be immunoassayed.
  • polypeptide antigen when used in the form of a fusion protein with another protein, it is a part of the polypeptide that functions as an antigen of the anti-Chlamydia antibody in the fusion protein, so “use polypeptide as antigen” It is included.
  • the amino acid sequence added to the polypeptide may constitute some functional protein or a functional fragment thereof, or may be a sequence having no physiological activity such as a linker.
  • a tag sequence such as GST or His may be added in the production process, but it can be used as an antigen even if such a tag sequence remains added.
  • the polypeptide antigen is immobilized on a plate or particle, respectively, and this is reacted with a sample to capture the anti-chlamydia antibody in the sample on the solid phase, after washing, It reacts with an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody (for example, anti-IgA antibody, anti-IgG antibody, anti-IgM antibody, etc.), and after washing, a substrate substance is added. Based on the amount of enzyme reaction, the anti-Chlamydia antibody captured on the solid phase can be measured.
  • an enzyme-labeled anti-immunoglobulin antibody for example, anti-IgA antibody, anti-IgG antibody, anti-IgM antibody, etc.
  • the polypeptide antigen is transferred to a membrane after electrophoresis, and this membrane is reacted with a sample, and then reacted with an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like in the same manner as described above. .
  • an anti-IgM antibody and an anti-IgA antibody as the labeled secondary antibody.
  • the polypeptide antigen may be immobilized on latex particles or the like, reacted with a specimen, and the amount of aggregation of the particles may be measured by absorbance or the like.
  • the sample to which the method of the present invention is applied is a sample separated from a subject, preferably a blood sample (whole blood, plasma, serum, etc.).
  • the sample may be used after appropriately diluted as necessary.
  • all antigens are mixed and immobilized on a plate, or immobilized on separate wells, and this is used as a specimen. You may make it react.
  • all the antigens may be mixed and immobilized on the particles, or the particles each having the antigen immobilized alone may be mixed and the particles may be reacted with the specimen.
  • all antigens may be mixed and electrophoresed, then transferred to a membrane, and reacted with a specimen.
  • the mixed antigen may be immobilized on the particles, or the particles each having the antigen immobilized alone may be mixed and reacted with the specimen.
  • the antigen polypeptides (a) to (c) and (g) to (o) described above can be provided as detection reagents for Chlamydia pneumoniae infection.
  • the antigen polypeptides (p) to (r) can be provided as detection reagents for Chlamydia spp. Infections including Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis infection.
  • These reagents may contain only the above-described polypeptide, or may further contain other components useful for stabilizing the polypeptide.
  • the antigen polypeptide can also be provided in a form immobilized on a solid phase such as a plate or particle.
  • the detection reagent can be provided as an anti-pneumonitis chlamydia antibody measurement kit or an anti-chlamydia antibody measurement kit in combination with other reagents as appropriate.
  • Other reagents necessary for immunoassays are well known.
  • a labeled anti-immunoglobulin antibody used as a secondary antibody may further be included.
  • the labeled antibody can be at least one of an anti-IgA antibody, an anti-IgG antibody, and an anti-IgM antibody.
  • All of these three labeled antibodies may be included, or any one labeled antibody may be included and provided as an IgA detection kit, an IgG detection kit, or an IgM detection kit. Alternatively, it can be provided as a kit for detecting the early infection stage of the initial infection, which contains labeled anti-IgA antibody and anti-IgM antibody.
  • the labeled antibodies may be included in a mixed state or may be included separately.
  • the present invention also provides an antibody or antigen-binding fragment thereof having a neutralizing activity that binds to the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 233 by an antigen-antibody reaction and suppresses infection with Chlamydia pneumoniae.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 233 is the amino acid sequence of the protein Cpj0939 encoded by the genome of C. pneumoniae J138 strain.
  • the base sequence of the pneumonia chlamydia gene encoding this is shown in SEQ ID NO: 234.
  • the inventors of the present application have found for the first time that an antibody against Cpj0939 has a neutralizing activity to suppress infection with Chlamydia pneumoniae.
  • the anti-Cpj0939 neutralizing antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the production method of the polyclonal antibody and the monoclonal antibody itself is a well-known conventional method.
  • the anti-Cpj0939 neutralizing polyclonal antibody immunizes animals (except humans) with a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 233 or a partial fragment thereof together with an appropriate adjuvant, and obtains antiserum from blood collected from the animals. Thus, it can be obtained by purifying the polyclonal antibody in the antiserum. Immunization is usually carried out several times over several weeks in order to increase the antibody titer in the immunized animal.
  • the antibody in the antiserum can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, affinity column purification, or the like.
  • the anti-Cpj0939 neutralizing monoclonal antibody can be prepared, for example, by a well-known hybridoma method. Specifically, a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 233 or a partial fragment thereof is immunized to an animal (excluding humans) together with an appropriate adjuvant, and antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes are collected from the animal. This is fused with myeloma cells to prepare a hybridoma, and a hybridoma that produces an antibody that binds to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 233 is selected. The hybridoma is proliferated and cultured in anti-Cpj0939 from the culture supernatant. Japanese monoclonal antibodies can be obtained.
  • polypeptide used as an immunogen or a partial fragment thereof can be prepared by conventional methods such as chemical synthesis and genetic engineering techniques. Further, polypeptides described in (d) to (f) described later may be used.
  • the chemical synthesis method examples include Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. Moreover, it can also synthesize
  • a method for producing a polypeptide by a genetic engineering technique is also well known. Specifically, for example, C. pneumoniae J138 strain is infected with an appropriate host cell such as HEp-2 cells, and the basic body (EB) of Pneumoniae is recovered from the infected cells using a concentration gradient such as Urografin. Then, a pneumoniae genomic DNA is extracted from this EB and subjected to PCR using a primer designed based on the base sequence encoding Cpj0939 shown in SEQ ID NO: 234, whereby a polynucleotide encoding the full length or part of Cpj0939 Can be prepared.
  • an appropriate host cell such as HEp-2 cells
  • EB basic body
  • Urografin a concentration gradient
  • a pneumoniae genomic DNA is extracted from this EB and subjected to PCR using a primer designed based on the base sequence encoding Cpj0939 shown in SEQ ID NO: 234, whereby a polynucleotide encoding
  • a desired polypeptide can be obtained by incorporating the prepared polynucleotide into an appropriate vector, expressing it in an appropriate expression system, and collecting and purifying it.
  • the vectors used and various expression systems are also well known.
  • Various vectors, host cells, reagents, kits Can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • C. pneumoniae strains are also commercially available and distributed, and can also be obtained separately from infected patients, so they are easily available.
  • the neutralizing antibody of the present invention is prepared using as an immunogen a Cpj0939 fragment consisting of the region of aa140-156 in SEQ ID NO: 233 bound to an adjuvant.
  • the region of aa140-156 of Cpj0939 is an epitope.
  • the expression “the region of aa140-156 is an epitope” includes not only that the full length of aa140-156 is an epitope, but also that some regions within the region of aa140-156 are epitopes. Is included.
  • the neutralizing antibody of the present invention is not limited to this specific example.
  • An antigen-binding fragment can be prepared from an anti-Cpj0939 neutralizing antibody by a conventional method.
  • Antigen-binding fragment means an antibody fragment that maintains the binding property (antigen-antibody reactivity) of the antibody to the corresponding antigen, such as an Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment of an immunoglobulin, for example. To do. Antibody fragments that maintain binding to Cpj0939 can exhibit neutralizing activity in the same way as complete antibodies. Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments can be obtained by treating monoclonal antibodies with proteolytic enzymes such as papain and pepsin, as is well known.
  • the antigen-binding fragment is not limited to the Fab fragment or the F (ab ′) 2 fragment, and may be any fragment that maintains the binding property with the corresponding antigen. It may be prepared.
  • an antibody in which a single chain fragment of variable region (scFv) is expressed in Escherichia coli by genetic engineering techniques can be used.
  • the method for producing scFv is also well known.
  • the hybridoma mRNA produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and PCR is performed using primers specific to immunoglobulin H chain and L chain.
  • ScFv by amplifying globulin H chain gene and L chain gene, ligating them with a linker, adding an appropriate restriction enzyme site and introducing it into a plasmid vector, transforming E. coli, and recovering scFv from E. coli Can be produced.
  • Such scFv is also included in the scope of the neutralizing antibody of the present invention as an “antigen-binding fragment”.
  • Anti-Cpj0939 neutralizing antibodies include chimeric antibodies and humanized antibodies (non-human-derived antibodies in which the sequence in the CDR region is replaced with the corresponding sequence of human antibodies), human antibodies (non-human animals or human cell lines). The same antibody as that produced in the human body).
  • Methods for producing chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies have been established as methods well known in the art.
  • human antibodies can be prepared by immunizing non-human animals such as mice genetically modified to produce human antibodies with Cpj0939 or a partial fragment thereof.
  • the anti-Cpj0939 neutralizing antibody or antigen-binding fragment thereof is useful as a medicament, for example, a therapeutic or prophylactic agent for pneumoniae chlamydia infection.
  • the therapeutic or prophylactic agent can appropriately contain a pharmaceutically acceptable carrier, an adjuvant, and the like as necessary.
  • the method for administering the therapeutic or prophylactic agent can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the age, weight, sex, and general health condition of the administration subject. Although it can be administered by any route of oral administration and parenteral administration (for example, intravenous administration, arterial administration, topical administration), it is preferably parenteral administration. Dosage forms for oral and parenteral administration and methods for their production are well known to those skilled in the art.
  • the dose and frequency of administration of the therapeutic or prophylactic agent can be appropriately determined by those skilled in the art according to the age, weight, sex, severity of infection, etc. of the patient.
  • the dosage of the neutralizing antibody can be about 0.1 mg / Kg to about 50 mg / Kg, for example, about 1 mg / Kg to 10 mg / Kg.
  • the administration frequency can be, for example, 1 to several times a day, or once every several days or weeks.
  • the present invention also provides a therapeutic or prophylactic agent for pneumonia chlamydial infection, comprising as an active ingredient at least one polypeptide selected from the group consisting of the following (d) to (f).
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 233.
  • e A polypeptide comprising a partial region of 7 or more consecutive residues in the polypeptide of (d) and capable of inducing protective immunity against Chlamydia pneumoniae.
  • the polypeptide (e) above is a fragment of the antigen protein Cpj0939.
  • the size of the fragment is 7 residues or more, preferably 10 residues or more, more preferably 15 residues or more, and further preferably 30 residues or more.
  • a Cpj0939 fragment consisting of the region of aa140-156 in SEQ ID NO: 233 can be used.
  • polypeptide of (f) above consists of an amino acid sequence in which a small number of amino acid residues are substituted, deleted or inserted in the polypeptide of (d) or (e), and the sequence identity with the original polypeptide Is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • a polypeptide consisting of an arbitrary amino acid sequence can induce protective immunity against Chlamydia pneumoniae infection is confirmed by, for example, a Chlamydia pneumoniae infection test using HEp-2 cells, as shown in the Examples. Can do. Specifically, the antibody is purified from antiserum obtained by immunizing a rabbit using the polypeptide as an immunogen. In the presence of this antibody, HEp-2 cells are inoculated with C. pneumoniae. If the infection rate of C. pneumoniae to HEp-2 cells decreases compared to the infection rate in the absence of antibody, it can be determined that the polypeptide can induce protective immunity against pneumoniae chlamydia infection. .
  • the ability of the polypeptide to induce protective immunity against Chlamydia pneumoniae infection can be confirmed by immunization / attack tests using experimental animals such as immunized mice.
  • immunization / attack tests using experimental animals such as immunized mice.
  • mice about 1 to 10 mg / kg of the polypeptide is mixed with an adjuvant and injected subcutaneously into mice 2 to 3 times at 3 week intervals.
  • the control group is non-immunized.
  • mice are challenged by nasal inoculation with C. pneumoniae (108 IFU / mouse).
  • the ability to induce protective immunity is assessed by re-isolating C. pneumoniae from lung tissue.
  • the polypeptide injection group since C. pneumoniae is not significantly reisolated compared to the control group, it can be determined whether or not the polypeptide can induce protective immunity.
  • the polypeptides (d) to (f) can be used in a form to which an arbitrary amino acid sequence or the like is added.
  • a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) or bovine serum albumin (BSA) may be bound.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • the polypeptide contained in the therapeutic or prophylactic agent of the present invention for example, a polypeptide obtained by binding a Cpj0939 fragment consisting of the region of aa140-156 in SEQ ID NO: 233 and KLH can be used.
  • the polypeptide contained in the agent for treating or preventing pneumoniae chlamydia infection can be prepared by conventional methods such as chemical synthesis and genetic engineering techniques.
  • the therapeutic or prophylactic agent for Chlamydia pneumoniae infection containing the polypeptide can appropriately contain a pharmaceutically acceptable carrier, an adjuvant, or the like as necessary.
  • the administration method can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the age, weight, sex, and general health condition of the administration subject. Although it can be administered by any route of oral administration and parenteral administration (for example, intravenous administration, arterial administration, topical administration), it is preferably parenteral administration. Dosage forms for oral and parenteral administration and methods for their production are well known to those skilled in the art.
  • the dose and frequency of administration of the therapeutic or prophylactic agent can be appropriately determined by those skilled in the art according to the age, weight, sex, health status, etc. of the administration subject.
  • the dosage of the polypeptide may be about 0.1 mg / Kg to about 50 mg / Kg, for example, about 1 mg / Kg to 10 mg / Kg.
  • the frequency of administration can also be determined appropriately by those skilled in the art. Repeat administration if necessary. For example, a total of 3 administrations can be performed per week. Alternatively, boosting injections can be made 8-12 weeks after the first immunization and a second boosting 16-20 weeks.
  • C. pneumoniae-specific antibodies (IgA, IgG and IgM) in the serum are Hitachi Chemical C. pneumoniae from Hitachi Chemical Co., Ltd., which uses two commercially available ELISA kits, ie, soluble EB outer membrane mixture (excluding LPS) as an antigen.
  • pneumoniae-ELISA plus Medac kit for IgA and IgG detection
  • Medac Diagnostika, Germany using the kit (for detection of IgA, IgG and IgM) and the purified cell wall membrane protein group as a specific antigen. Evaluation was performed using a pneumoniae-sELISA Medac kit (for IgM detection). Assays and calculations were performed according to manufacturer's instructions. As a negative control, a total of 8 serum samples from healthy 0-year-old children without C. pneumoniae infection were used.
  • Genomic DNA was obtained from the basic body (EB) of C. pneumoniae J138 strain infected with HEp-2 cells as follows (J. Biol. Chem. 276: 13490-13498, 2001).
  • C. pneumoniae-infected HEp-2 cells were harvested from 20 6-well plastic dishes. After washing the cells with phosphate buffered saline (PBS), 1 ml of 0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA solution was added to each well, and the cells were incubated at 37 ° C. for 3 minutes. During repeated PBS washing, detached cells were collected by centrifugation at 3,000 ⁇ g and carefully suspended in 30 ml of SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate pH 7.2, 5 mM L-glutamate). The suspended cells were freeze-thawed (first -80 ° C, 30 minutes, then left at 25 ° C).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells were disrupted by 15 stroke treatment with a glass-Teflon homogenizer, and then centrifuged at 800 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant was collected in another tube, and 8 ml of TKCl buffer (30% (v / v) Urografin solution in 20 mM Tris-HCl pH 7.5, and 150 mM KCl) was layered on the supernatant.
  • the precipitate was suspended in 8 ml of SPG buffer, 5 ⁇ g / ml DNase I and 10 mM MgCl 2 were added, and the mixture was incubated at 25 ° C.
  • the EB pellet was suspended in 300 ⁇ L of TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA), centrifuged at 12,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and again suspended in 300 ⁇ L of TE buffer. This EB suspension was stored at ⁇ 80 ° C. until use. The protein concentration in the EB suspension was about 1 mg / mL.
  • the upper layer was collected, mixed with 0.1 mg / ml DNase-free RNase A, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After extraction with TE saturated phenol / chloroform four times, 2 M ammonium acetate and 70% ethanol were added to precipitate the DNA, followed by centrifugation. After rinsing with 70% ethanol, the precipitate was dissolved in 50 ⁇ L of TE buffer. A total of about 20 ⁇ g of genomic DNA was finally obtained.
  • the vector was introduced into MTY483 (Tabuchi et al., Supra) and transformed.
  • Yeast cells retaining ORF tagged with GFP were cultured overnight at 30 ° C. in 3 ml medium (SC-Ura / glucose containing 20 ⁇ g / mL doxycycline).
  • the culture was diluted, adjusted to an OD600 of 0.2 in 10 mL of 20 ⁇ g / mL doxycycline-containing SC-Ura / glucose medium, and cultured at 30 ° C. until the OD600 was 1.5 or less.
  • the culture was washed twice with doxycycline-free SC-Ura / glucose twice, resuspended in 5 mL of doxycycline-free SC-Ura / glucose medium to an OD600 of 1.0, and further cultured at 30 ° C for 5 hours did.
  • Protein extraction Yeast cells expressing GFP-tagged Cpj protein were collected and resuspended in 1 mL of PBS. Trichloroacetic acid (TCA) was added to a final concentration of 10% and the cells were incubated on ice for 15 minutes and centrifuged to precipitate. TCA-treated cells were washed twice with 1 mL ice-cold acetone and dried. Dissolve the dried cells in 50 ⁇ L of Urea-SDS cracking buffer (6 M urea, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) (5 minutes x 2 pulses at 5 minutes at 50 ° C) Total protein was extracted. 10 ⁇ g of total protein was separated by 10% SDS-PAGE.
  • TCA Trichloroacetic acid
  • the gel was electroblotted onto a PVDF membrane (0.45 ⁇ m), and the membrane was blocked with blocking buffer (prepared with PBS containing 5% skim milk and 0.1% Tween 20 (PBS-T)) for 1 hour at room temperature.
  • the antibody was incubated overnight at 4 ° C. with human serum.
  • the membrane was then washed 4 times with PBS-T for 15 minutes. Binding of the primary antibody was probed with a horseradish peroxidase (HRP) labeled secondary antibody.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Secondary antibodies used were: goat anti-human IgA + IgG + IgM immunoglobulin (KPL, Maryland, USA) and goat anti-human IgA (Monosan, Netherlands), IgG (Invitrogen, California, USA) And IgM (Invitrogen, California, USA) immunoglobulin. All secondary antibodies were diluted 1: 3,000 and used at room temperature for 2 hours. After washing 4 times, immunoreaction spots were visualized by LAS-1000 imaging system at Immobilon Western (Millipore, Massachusetts, USA). After detection of the immune reaction spot, the membrane was treated with anti-GFP antibody (J. Cell Sci. 123: 756-766, 2010) (used at 1: 5,000 dilution) and HRP-labeled anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA) ( Probed again at 1: 5,000 dilution).
  • anti-GFP antibody J. Cell Sci. 123: 756-766, 2010
  • HRP-labeled anti-rabbit IgG Cell Signal
  • M indicates male and F indicates female.
  • the +, ⁇ , and-next to the numerical values are the results of determining the presence or absence of infection based on the criteria shown in the instructions attached to each kit. Specifically,-is negative (hitazyme: index ⁇ 0.9, Medac: IgA, IgG ⁇ 22, IgM ⁇ 0.9), + is positive (hitazyme: index> 1.1, Medac: IgA, IgG> 28, IgM> 1.1) , ⁇ indicates false positives (Hitazyme: index 0.9-1.09, Medac: IgA, IgG 22-28, IgM 0.9-1.1).
  • the paired serum (sample No. 5-2) was found to have a positive IgM titer with the Medac kit.
  • IgM titers of paired sera (samples No. 7-1, No. 7-2) were positive in both the kits of Hitachizyme and Medac.
  • Sera from patients 6 and 8 were IgM antibody negative in both kits.
  • the serum samples from these patients 6 and 8 were collected after the acute symptoms improved, but it is probably because the IgM titer was low and the IgG titer was relatively high.
  • Immunoscreening for novel C. pneumoniae antigens To identify new C. pneumoniae antigens, GFP-tagged C. pneumoniae pairs using the yeast S. cerevisiae gene expression system under control of the Tet-off promoter (Tabuchi et al., Supra) Immunoscreening was performed using mixed sera mixed with a total of 13 serum samples collected from 8 patients, expressing the ORF, as primary antibodies.
  • C. pneumoniae strain J138 encoded by the genome including all transmembrane domains and hydrophobic regions deduced from each amino acid sequence, but with 455 unique ORFs, excluding the N-terminal signal peptide as appropriate GFP-tagged proteins were examined and subjected to exhaustive immunoscreening to identify new antigens.
  • the yeast cell extract expressing GFP-tagged C. pneumoniae ORF was examined by Western blot assay, and the GFP-tagged fusion protein was detected with an anti-GFP antibody. The expression level of the protein was different for each yeast clone (FIG. 1A), and the expression was confirmed in a total of 398 ORFs.
  • the molecular weights of the recombinant proteins derived from Cpj1056 and Cpj1070 were calculated to be 55 kDa and 77 kDa, respectively, and these values were in good agreement with the molecular weight expected from the C. pneumoniae ORF sequence fused with GFP.
  • the other six GFP-tagged C. pneumoniae proteins in FIG. 1 were not detected by any of the four types of secondary antibodies used here, and were negative.
  • Cpj0230, Cpj0268, Cpj0525 and Cpj0531 were detected in two of these isotype-specific immunoglobulins.
  • Cpj 0186, Cpj0308, Cpj0572, Cpj0783 and Cpj0896 were positive for all four anti-human immunoglobulins.
  • Cpj0148, Cpj0186, Cpj0229, Cpj0230, Cpj0308, Cpj0499, Cpj0525, Cpj0531, Cpj07572, Cpj0783, Cpj0810 and Cpj0896 were detected by IgA in patient samples.
  • Serum sample No. 3-2 was negative for IgG antibody in the kit of Hitozyme and negative for IgA and IgG in the kit of Medac, but the reaction was detected with anti-IgA immunoglobulin secondary antibody against Cpj0068. Also, Cpj0068, Cpj0178, Cpj0186, Cpj0230, Cpj0677, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0727, Cpj0810, Cpj1004 and pCpj1004 and Cpj1056 were detected with anti-IgG immunoglobulin secondary antibodies.
  • serum sample No. 3-2 showed IgA for Cpj0068, Cpj0068, Cpj0178, Cpj0230, Cpj0677, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0727, Cpj0810, Cpj1004 and IgG, and Cpj1056.
  • Serum sample No. 3-2 was positive for IgM antibody by the Hitachizyme ELISA kit, but no positive clone was detected by anti-IgM immunoglobulin as the secondary antibody.
  • Serum sample No. 4-3 was negative for IgA antibody in both Hitachizyme and Medac ELISA kits, but anti-IgA immunoglobulin secondary antibody against Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0677, Cpj0726 and pCpj0726 and Cpj0727 A reaction was detected.
  • Serum sample No. 5-2 was IgA antibody negative with Medac ELISA kit and IgG negative with both Hitachizyme and Medac ELISA kits, but Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0230, Cpj0369, Cpj0677, Cpj0726, Cpj0726, Anti-IgA immunoglobulin secondary antibody detected against Cpj0727 and Cpj0783, and anti-IgG immunoglobulin secondary antibody against Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0677, Cpj0678, Cpj0706, Cpj0727 and Cpj0810 Was detected.
  • Serum sample No. 6 was negative for IgM antibodies in both the Hitachizyme and Medac ELISA kits, but Cpj0068, Cpj0577, Cpj0726, Cpj0727, and Cpj0810 were detected with anti-IgM immunoglobulin secondary antibodies.
  • Serum sample No. 8 was negative for IgM antibodies in both the Hitachizyme and Medac ELISA kits, but the reaction against Cpj0507, Cpj0577 and Cpj0727 was detected with an anti-IgM immunoglobulin secondary antibody.
  • Fig. 4 shows a summary of the positive ORF data, the C. trachomatis gene ortholog and its homology (identity).
  • C. pneumoniae antigens of 58 ORF of the C. pneumoniae gene at least one of patient serum sample primary antibodies, and an isotype-specific anti-IgA, anti-IgG, or anti-IgM immunoglobulin secondary antibody , A positive signal was detected.
  • the other 19 C. pneumoniae antigens were not detected as reacting with each serum sample (FIGS. 3 and 4).
  • Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0369, Cpj0383, Cpj0507, Cpj0572, Cpj0677, Cpj0726, Cpj727, Cpj783, Cpj809 and Cpj810 were detected by one or more of the three antibodies.
  • 11 of the 39 C.jpneumoniae antigens (Cpj0147, Cpj0159, Cpj0178, Cpj0268, Cpj0308, Cpj0472, Cpj06678, Cpj0678, Cpj1056, Cpj10tra) (FIG. 4).
  • Cpj0147, Cpj0159, Cpj0178, Cpj0268, Cpj0308, Cpj0472, Cpj06678, Cpj0678, Cpj1056, Cpj10tra (FIG. 4).
  • C. pneumoniae antigens that did not react with any of the individual serum samples but were clearly detected with mixed sera, 9 C. pneumoniae antigens (Cpj0067, Cpj0181, Cpj0214, Cpj0224, Cpj0225 , Cpj0339, Cpj0355, Cpj0356 and Cpj0457) also lacked orthologs in the C. trachomatis genome (FIG. 4). These 20 C. pneumoniae antigens suggest that they are very specific for C. pneumoniae.
  • the obtained antibody fraction was dialyzed with PBS to obtain a purified anti-Cpj0939 antibody.
  • the binding of the purified antibody to Cpj0939 was confirmed by immunoassay using recombinant Cpj0939 prepared by a conventional method as an antigen.
  • C. pneumoniae J138 strain is added to HEp-2 cells cultured in a 6-well culture plate, and centrifuged at 2,400 rpm (7603 xg) for 60 minutes, so that J138 strain is added to HEp-2 cells. Infected. Then, in 1 mg / ml cycloheximide-containing minimal medium (MEM, Nissui Pharmaceutical) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco BRL Life Technologies), incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere. Bacteria were grown. The infected cells were freeze-thawed and then sonicated to recover the cells.
  • MEM cycloheximide-containing minimal medium
  • Gibco BRL Life Technologies heat-inactivated fetal bovine serum
  • the J138 cells are suspended in SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate pH 7.2, 5 mM L-glutamate) (cell density: about 6.0 x 10 5 / SPG 1 ml), and anti-Cpj0939 antibody is added to 200 ⁇ L of this suspension. 20 ⁇ L (25 ⁇ g), 200 ⁇ L rabbit IgG 20 ⁇ L (25 ⁇ g), and 200 ⁇ L PBS ( ⁇ ) 20 ⁇ L, respectively, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 5 shows the results of relative evaluation of the number of infected cells when the cells pretreated with the anti-Cpj0939 antibody were used, with the number of infected cells when the cells pretreated with rabbit IgG were used as 100%.
  • Treatment with anti-Cpj0939 antibody reduced the number of infected cells to 20% of rabbit IgG treatment, and it was confirmed that anti-Cpj0939 antibody has a neutralizing activity to prevent infection of target cells with C. pneumoniae .

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Abstract

肺炎クラミジア初感染患者をも感度良く検出でき、簡便に実施することができる、肺炎クラミジア感染の検出方法、及び肺炎クラミジア感染の治療や予防等に有用な新規な手段が開示されている。本願発明者は、小児8名の肺炎クラミジア感染者患者血清を用いて肺炎クラミジアJ138株の機能未知タンパク質との反応性を鋭意検討し、市販のELISAキットよりも高い抗肺炎クラミジア抗体検出感度を達成しうる５８の抗原分子を同定した。また、Cpj0939に対する抗体が肺炎クラミジアの細胞への感染を抑制する中和活性を有することを見出し、新規中和抗体及び抗原ペプチドワクチンを提供した。

Description

クラミジアニューモニエ抗原及びその利用
　本発明は、肺炎クラミジア感染の検出方法、及び抗肺炎クラミジア中和抗体に関する。
　肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae、旧学名はChlamydia pneumoniae）は、偏性細胞内寄生性グラム陰性菌に分類される細菌であり、呼吸器感染症を引き起こす起因菌である（非特許文献１）。持続感染を起こし、動脈硬化や喘息など多彩な病態への関与が示唆されている。
　肺炎クラミジアは市中肺炎の10%程度と関連していると推定される。肺炎はインフルエンザ、マイコプラズマ等各種の病原菌に起因しており、肺炎の原因菌の早期同定と治療のためには迅速な原因菌の診断法が重要である。
　肺炎クラミジア感染の診断方法として、現在のところ、HeLa229, McCoy, HEp2などの細胞系を使用した分離培養、PCRによる核酸検出、EIA法やMicroimmunofluorescence （Micro-IF）法による抗体価測定が行なわれている（非特許文献２）。
　分離培養によって肺炎クラミジア感染を診断する方法は、診断までに時間を要し、検出感度も低い。また、PCRによって核酸を検出する方法は、実施者の熟練した技術や培養のための設備等を要するため、簡便に実施することができない。
　Micro-IF法によって検体中の肺炎クラミジア抗体を検出する方法は、米国の疾病対策センターが血清診断検査の標準的方法として推奨しているが、手技が難しく、より容易に感染を検出する方法の開発が望まれている。
　EIA法による抗体検出法は、簡便に実施できるため、血清診断方法として好ましい。現在市販されているELISAキットでは、抗原として外膜蛋白やリポ多糖（ＬＰＳ）を利用している。しかしながら、これらのELISAキットでは、初感染者血清との反応がMicro-IF法と乖離するという問題がある。
　また、EIA法による抗体検出のために上記外膜蛋白やＬＰＳ以外の抗原が同定されている（非特許文献３）。しかしながら、これら抗原は、IgG型抗体を検出するために同定されており、非特許文献３には、初感染患者の感染初期に誘導されるIgM型抗体やIgA型抗体の検出について何ら記載されていない。
　肺炎クラミジア初感染者血清との反応がMicro-IF法と乖離せず、初感染者も安定して感度良く検出できる簡便な診断方法の開発が望まれている。
　肺炎クラミジアは小児での初感染から成人の再感染が生ずる。また、肺炎クラミジアと動脈硬化との関連も注目されており、感染初期での初期治療に失敗すると持続感染に進行し動脈硬化の原因となる可能性がある。このため感染初期での効果的な排除治療が重要である。このような状況下では、現在治療剤として用いられている抗生剤のみならず、感染防御ワクチンも有効となるが、満足できる感染防御ワクチンは知られていない。
Grayston JT, et. al., "A new respiratory tract pathogen: Chlamydia pneumoniae strain TWAR." J Infect Dis. 1990 Apr;161(4):618-25. Kuo CC, et al., "Chlamydia pneumoniae (TWAR)." Clin Microbiol Rev. 1995 Oct;8(4):451-61. Hongliang C., et. al., "Serodiagnosis of Chlamydia pneumoniae infection." J Clin. Lab. Anal. 2010;24:55-61
　従って、本発明の目的は、肺炎クラミジア初感染患者をも感度良く検出でき、簡便に実施することができる、肺炎クラミジア感染の検出方法を提供することにある。
　また、本発明の目的は、肺炎クラミジア感染の治療や予防等に有用な新規な手段を提供することにある。
　本願発明者は、小児8名の肺炎クラミジア感染者患者血清を用いて肺炎クラミジアJ138株の機能未知タンパク質との反応性を鋭意検討し、市販のELISAキットよりも高い検出感度を達成しうる５８の抗原分子を同定するとともに、これら５８分子にはIgM型及び／又はIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応するものがあり、それら分子は初感染患者の感染初期の検出に利用し得ること、さらに、クラミジアタンパク質Cpj0939に対する抗体が肺炎クラミジアの細胞への感染を抑制する中和活性を有することを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、下記(a)～(c)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgM型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法を提供する。
(a) 配列番号３６，４，９，１８，１５，３，２２，２３，３０，３５，４２，４３，４５，６，２８，２４，２５，３２，３４，４７，４８，５３，８，２１，２７，３７，１，２６，３１，３３，３９，４９，５２及び５４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b) (a)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(c) (a)又は(b)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　また、本発明は、下記(g)～(i)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法を提供する。
(g) 配列番号３６，４，９，１８，３，２４，３９，２２，４６，５４，５８，４５，４７，４８，２８，１４，２３，２９，３０，３４，４０，４４，１３，３１，３２，５３，５，４２及び４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h) (g)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(i) (g)又は(h)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　また、本発明は、下記(j)～(l)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgG型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法を提供する。
(j) 配列番号３，２２，３９，４２，４３，４８，５２，５４，５８，１４，３０，７，２４，２９，３５，４１，４７，５３，５６，１５，５７，４５，５０，５１，５５，２，１０～１２，１９，２０，１６，１７，２３，２５，４，９，１８，２８，３４，３６，３７，４４及び４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(k) (j)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(l) (j)又は(k)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　さらに、本発明は、上記(a)～(c)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む、検体中の抗肺炎クラミジア抗体を測定するための抗肺炎クラミジア抗体測定キットを提供する。
　また、本発明は、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと抗原抗体反応により結合し、肺炎クラミジアの感染を抑制する中和活性を有する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬及び肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、下記(d)～(f)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを含有する、肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤を提供する。
(d) 配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(e) (d)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
(f) (d)又は(e)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
　本発明により、ヒトの免疫系が認識可能な肺炎クラミジア由来のタンパク質分子が特定され、従来のELISAキットよりも安定して高感度に肺炎クラミジアを検出可能にする抗原分子が特定された。わずか８名の患者血清を調べただけでも、従来のELISAキットとの検出感度の違いが明確に確認されている。本発明によれば、検出感度が高く、その上で免疫グロブリンのアイソタイプ特異性も考慮された、初感染者も網羅できる簡便な検査方法が提供できる。また、本発明により、肺炎クラミジアの新規中和抗体が提供された。該中和抗体は、肺炎クラミジアの宿主細胞への感染を大幅に抑制することができる。そのため、該中和抗体及び生体内で該中和抗体を免疫誘導できる肺炎クラミジア由来のタンパク質分子は、肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤として非常に有用である。
肺炎クラミジア感染患者由来の混合血清を用いたウエスタンブロットにより、肺炎クラミジア抗原をスクリーニングした結果の一例を示す図である。１３の血清はそれぞれ1:200希釈して混合した。Aの図の下部に１次抗体として使用した抗体を、B～Eの各図の下部に２次抗体として使用した抗体を示す。 混合血清との反応が確認された５８の抗原タンパク質のリストである。反応が確認された抗原－血清の組み合わせを黒色で示した。 ５８の抗原タンパク質と、感染患者由来の個々の血清との反応性をまとめた図である。反応が確認された抗原－血清の組み合わせを黒色で示した。 C. トラコマティスのオルソログをまとめた図である。C. ニューモニエタンパク質との同一性（homology）及び各抗原が反応した患者血清の数を併せて表中に示す。また、右端のグラフは、ウエスタンブロットアッセイにおける頻度（％）を示す。 抗Cpj0939抗体によるC. ニューモニエの細胞感染の阻害効果を示すグラフである。
　下記(m)～(o)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドは、肺炎クラミジア感染の検出のための抗原として使用することができる。
(m) 配列番号１～５８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(n) (m)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(o) (m)又は(n)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM型抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　(m)のポリペプチドを表１に示す。これら５８分子のポリペプチドは、肺炎クラミジア（クラミジア・ニューモニエ）ゲノムにコードされているタンパク質である。実施例において各肺炎クラミジアタンパク質を調製する際にコード領域の増幅に使用したプライマーも併せて示す。C. トラコマティスにオルソログが存在するタンパク質については、オルソログ名及び肺炎クラミジアタンパク質との同一性（全長同士の比較による）を併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表1の推定kDaは、各ORFのアミノ酸配列から推定される分子量を示す。実測kDaは、後述する実施例において、各ORFをGFP融合タンパク質として発現させた際に実際に検出された各組換えタンパク質の分子量から、GFPの分子量（約27kDa）を差し引いた分子量を示す。なお、実施例では、Cpj0068、Cpj0214、Cpj0230、Cpj0301、Cpj0783、Cpj0819、Cpj0874、Cpj0884及びCpj0945は、各全長ORFからシグナルペプチドを除いた領域をGFP融合タンパク質として発現させている。
　上記５８の肺炎クラミジアタンパク質は、肺炎クラミジア急性初感染と診断された小児患者８名由来の混合血清を１次抗体として用いたウエスタンブロット解析により、結合反応が検出された抗原タンパク質である。これらの抗原タンパク質のうちの少なくとも１種を用いて免疫測定を行なうことで、肺炎クラミジア感染患者の体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導された抗肺炎クラミジア抗体（IgA、IgG、又はIgM抗体）を従来のキットよりも感度良く検出できる。抗肺炎クラミジアIgGだけではなく、初感染の初期に生じるIgA及びIgMも感度良く検出できるので、肺炎クラミジア初感染の検出にも非常に有用である。
　上記５８分子の抗原タンパク質のうち、下記表２に示す３９分子については、小児患者８名由来の個々の血清サンプルとの反応性が確認されている。本発明の範囲は、特定の８患者での結果のみに限定されるものではないが、これら３９の抗原タンパク質は、本発明の検出方法で抗原として使用するポリペプチドの好ましい例ということができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２の中でもとりわけ、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）及びCpj0308（配列番号１８）の４種は、様々な患者由来の検体中の抗肺炎クラミジア抗体（IgG、IgA及びIgM）を検出可能であり、またC. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジア感染、とりわけ初感染を特異的かつ高精度に検出できる抗原として特に好ましく使用できる。
　上記(n)のポリペプチドは、表１に示した５８の抗原タンパク質の断片である。該断片のサイズは７残基以上、好ましくは１０残基以上である。この分野において、約７残基以上のサイズのポリペプチドであれば抗原性を発揮することが知られている。従って、このような断片もまた、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM型抗体と抗原抗体反応により結合し得るため、上記５８の抗原タンパク質と同様に、肺炎クラミジア感染の検出のための抗原として使用可能である。ただし、断片のサイズがあまりに少ないと、検体中に含まれる目的外の抗体とも交叉反応してしまう可能性が高くなる。従って、免疫測定の精度を高める観点からは、ポリペプチド断片のサイズは、好ましくは３０残基以上、より好ましくは４０残基以上、あるいは全長の半分以上が好ましい。
　上記(o)のポリペプチドは、(m)又は(n)のポリペプチドにおいて少数のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、もとのポリペプチドとの配列の同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であるポリペプチドである。(o)のポリペプチドのサイズは７残基以上である。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、このような修飾されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM抗体と抗原抗体反応により結合し得るため、上記５８の抗原タンパク質と同様に、肺炎クラミジア感染の検出のための抗原として使用可能である。例えば、表１又は表２に示した抗原タンパク質又はその断片において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、(o)のポリペプチドの好ましい例の１つである。
　ここで、アミノ酸配列の同一性とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、(m)又は(n)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、測定対象の抗体との結合性を維持できる可能性が高くなる。
　なお、任意のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、肺炎クラミジアタンパク質に対し生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するかどうかは、例えば、既知の肺炎クラミジア感染患者から分離した血清等の試料とそのポリペプチドとを反応させることで容易に確認できる。血清中に存在する抗体とポリペプチドとの結合が確認できれば、該ポリペプチドは上記した反応性を有すると判断できる。
　肺炎クラミジア感染の検出のためには、(m)～(o)のポリペプチドのうち少なくとも１種を用いればよいが、検出感度を高める観点からは２種以上のポリペプチドを適宜組み合わせて抗原として使用することが好ましい。(m)～(o)のうちの２種以上のポリペプチドを抗原として用いるとは、例えばCpj0068（配列番号１）及びCpj0147（配列番号２）を例に説明すると、(1) 配列番号１からなるポリペプチド、その断片、又はこれらいずれかと９０％以上の同一性を有するポリペプチドと、(2) 配列番号2からなるポリペプチド、その断片、又はこれらいずれかと９０％以上の同一性を有するポリペプチドとを使用することを「２種のポリペプチドを抗原として用いる」という。抗原として用いるポリペプチドの種類数は適宜選択することができ、例えば３種、５種、あるいは１０種以上を抗原として使用してもよい。
　また、(m)～(o)のポリペプチドのうち少なくとも１種と、肺炎クラミジア抗原として公知のタンパク質、例えば外膜蛋白又はリポ多糖（ＬＰＳ）とを組み合わせて使用してもよい。
　表１に示した５８分子のうち、検体中のIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と反応する分子は、肺炎クラミジア感染、特に初感染患者の感染初期を診断するための抗原として有用である。すなわち、本発明は、下記(a)～(c)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgM型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法を提供する。
(a) 配列番号３６，４，９，１８，１５，３，２２，２３，３０，３５，４２，４３，４５，６，２８，２４，２５，３２，３４，４７，４８，５３，８，２１，２７，３７，１，２６，３１，３３，３９，４９，５２及び５４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b) (a)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(c) (a)又は(b)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　（a）のポリペプチドは、後述する実施例において、患者8名由来の血清サンプルを混合した混合血清又は個々の血清サンプル中のIgM型抗肺炎クラミジア抗体との反応性が確認されている（図２、図３）。
　これら抗原のうち、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj0268（配列番号１５）、Cpj0068（配列番号３）、Cpj0369（配列番号２２）、Cpj0379（配列番号２３）、Cpj0507（配列番号３０）、Cpj0577（配列番号３５）、Cpj0726（配列番号４２）、Cpj0727（配列番号４３）、Cpj0783（配列番号４５）、Cpj0159（配列番号６）、Cpj0472（配列番号２８）、Cpj0383（配列番号２４）、Cpj0405（配列番号２５）、Cpj0531（配列番号３２）、Cpj0572（配列番号３４）、Cpj0809（配列番号４７）、Cpj0810（配列番号４８）及びCpj0896（配列番号５３）は、小児患者８名由来の個々の血清サンプル中のIgM型抗体との反応性が確認されている（図３）。本発明の範囲は、特定の８患者での結果のみに限定されるものではないが、これら抗原タンパク質は、本発明の検出方法におけるIgM型抗体を検出するための抗原として使用するポリペプチドの好ましい例ということができる。
　また、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj0268（配列番号１５）、Cpj0159（配列番号６）、Cpj0472（配列番号２８）、Cpj0181（配列番号８）、Cpj0356（配列番号２１）、Cpj0457（配列番号２７）及びCpj0678（配列番号３７）は、C. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジアの感染、とりわけ初感染の感染初期を特異的かつ高精度に検出できる抗原として好ましく使用できる。
　さらに、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）及びCpj0268（配列番号１５）の５種は、複数の患者由来の検体中のIgM型の抗肺炎クラミジア抗体を検出可能であり、またC. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジア感染、とりわけ初感染の感染初期を特異的かつ高精度に検出できる抗原として特に好ましく使用できる。
　表１に示した５８分子のうち、検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と反応する分子もまた、肺炎クラミジア感染、特に初感染患者の感染初期を診断するための抗原として有用となり得る。すなわち、本発明は、下記(g)～(i)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法も提供する。
(g) 配列番号３６，４，９，１８，３，２４，３９，２２，４６，５４，５８，４５，４７，４８，２８，１４，２３，２９，３０，３４，４０，４４，１３，３１，３２，５３，５，４２及び４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h) (g)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(i) (g)又は(h)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　（g）のポリペプチドは、後述する実施例において、患者8名由来の血清サンプルを混合した混合血清又は個々の血清サンプル中のIgA型抗肺炎クラミジア抗体との反応性が確認されている（図２、図３）。
　これら抗原のうち、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj0068（配列番号３）、Cpj0383（配列番号２４）、Cpj0706（配列番号３９）、Cpj0369（配列番号２２）、Cpj0808（配列番号４６）、Cpj0945（配列番号５４）、Cpj1070（配列番号５８）、Cpj0783（配列番号４５）、Cpj0809（配列番号４７）、Cpj0810（配列番号４８）、Cpj0472（配列番号２８）、Cpj0230（配列番号１４）、Cpj0379（配列番号２３）、Cpj0499（配列番号２９）、Cpj0507（配列番号３０）、Cpj0572（配列番号３４）、Cpj0708（配列番号４０）、Cpj0751（配列番号４４）、Cpj0726（配列番号４２）及びCpj0727（配列番号４３）は、小児患者８名由来の個々の血清サンプル中のIgA型抗体との反応性が確認されている（図３）。本発明の範囲は、特定の８患者での結果のみに限定されるものではないが、これら抗原タンパク質は、本発明の検出方法におけるIgA型抗体を検出するための抗原として使用するポリペプチドの好ましい例ということができる。
　またCpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj1070（配列番号５８）及びCpj0472（配列番号２８）は、C. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジアの感染、とりわけ初感染の感染初期を特異的かつ高精度に検出できる抗原として好ましく使用できる。
　さらに、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）及びCpj0308（配列番号１８）の４種は、様々な患者由来の検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体を検出可能であり、またC. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジア感染、とりわけ初感染を特異的かつ高精度に検出できる抗原として特に好ましく使用できる。
　また、後述する実施例に示すように、従来のIgA抗体検出用ELISAキットでは検出されなかった血清サンプルにおいて、Cpj0068（配列番号３）, Cpj0147（配列番号４）, Cpj0186（配列番号９）, Cpj0308（配列番号１８）, Cpj0383（配列番号２４）, Cpj0677（配列番号３６）, Cpj0726（配列番号４２）及びCpj0727（配列番号４３）に対しては抗IgA免疫グロブリン2次抗体で反応が検出されていることから、これら抗原は検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体を検出するのに有用である。
　表１に示した５８分子のうち、検体中のIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と反応する分子もまた、肺炎クラミジアの感染を診断するための抗原として有用である。すなわち、本発明は、下記(j)～(l)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgG型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法も提供する。
(j) 配列番号３，２２，３９，４２，４３，４８，５２，５４，５８，１４，３０，７，２４，２９，３５，４１，４７，５３，５６，１５，５７，４５，５０，５１，５５，２，１０～１２，１９，２０，１６，１７，２３，２５，４，９，１８，２８，３４，３６，３７，４４及び４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(k) (j)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(l) (j)又は(k)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　（j）のポリペプチドは、後述する実施例において、患者8名由来の血清サンプルを混合した混合血清又は個々の血清サンプル中のIgG型抗肺炎クラミジア抗体との反応性が確認されている（図２、図３）。
　これら抗原のうち、Cpj0068（配列番号３）、Cpj0369（配列番号２２）、Cpj0706（配列番号３９）、Cpj0726（配列番号４２）、Cpj0727（配列番号４３）、Cpj0810（配列番号４８）、Cpj0884（配列番号５２）、Cpj0945（配列番号５４）、Cpj1070（配列番号５８）、Cpj0230（配列番号１４）、Cpj0507（配列番号３０）、Cpj0178（配列番号７）、Cpj0383（配列番号２４）、Cpj0499（配列番号２９）、Cpj0577（配列番号３５）、Cpj0711（配列番号４１）、Cpj0809（配列番号４７）、Cpj0896（配列番号５３）、Cpj1022（配列番号５６）、Cpj0268（配列番号１５）、Cpj1056（配列番号５７）、Cpj0783（配列番号４５）、Cpj0827（配列番号５０）、Cpj0874（配列番号５１）、Cpj1004（配列番号５５）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj0572（配列番号３４）、Cpj0677（配列番号３６）、Cpj0678（配列番号３７）、Cpj0751（配列番号４４）及びCpj0808（配列番号４６）は、小児患者８名由来の個々の血清サンプル中のIgG型抗体との反応性が確認されている。本発明の範囲は、特定の８患者での結果のみに限定されるものではないが、これら抗原タンパク質は、本発明の検出方法におけるIgG型抗体を検出するための抗原として使用するポリペプチドの好ましい例ということができる。
　またCpj1070（配列番号５８）、Cpj0178（配列番号７）、Cpj0268（配列番号１５）、Cpj1056（配列番号５７）、Cpj0067（配列番号２）、Cpj0214（配列番号１０）、Cpj0224（配列番号１１）、Cpj0225（配列番号１２）、Cpj0339（配列番号１９）、Cpj0355（配列番号２０）、Cpj0147（配列番号４）、Cpj0186（配列番号９）、Cpj0308（配列番号１８）、Cpj0472（配列番号２８）、Cpj0677（配列番号３６）及びCpj0678（配列番号３７）は、C. トラコマティス（Chlamydia trachomatis）にこれらと相同な遺伝子が存在しないことから、肺炎クラミジアの感染を特異的かつ高精度に検出できる抗原として好ましく使用できる。
　(b), (h), (k)のポリペプチドには、上記の(n)の定義が同様に当てはまり、また、(c), (i), (l)のポリペプチドには、上記の(o)の定義が同様に当てはまる。(a)～(c)、(g)～(i)、(j)～(l)もまた、(m)～(o)と同様に、少なくとも１種のポリペプチドを用いればよいが、検出感度を高める観点からは２種以上のポリペプチドを適宜組み合わせて抗原として使用することが好ましい。
　肺炎クラミジア感染、とりわけ初感染の感染初期を診断するためには、Cpj0677（配列番号３６），Cpj0147（配列番号４），Cpj0186（配列番号９），Cpj0308（配列番号１８）及びCpj0268（配列番号１５）から選択される2種以上のポリペプチドを適宜組み合わせて、IgM型抗体及びIgA型抗体の少なくともいずれか一方を検出することが特に好ましい。
　さらにまた、表１に示した５８分子のうち、トラコマティスにオルソログが存在する分子は、肺炎クラミジア（C. ニューモニエ）及びC. トラコマティスを含むクラミジア属細菌の感染を広く検出するための抗原として有用であり得る。当該知見に基づくクラミジア属細菌感染の検出方法は、例えば、下記(p)～(r)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中の抗クラミジア抗体を測定することを含む。
(p) 配列番号１、３、５、１３、１４、１６、１７、２２－２６、２９－３５、３８－５６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(q) (p)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内でクラミジア属細菌のタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
(r) (p)又は(q)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内でクラミジア属細菌のタンパク質に対し誘導されたIgA、IgG又はIgM抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
　ここでいう「クラミジア属細菌」には、クラミドフィラ（Chlamydophila）属及びクラミジア（Chlamydia）属の両者が包含される。
　(p)のポリペプチドは、トラコマティスにオルソログが存在する抗原タンパク質である。表１に示したオルソログの同一性は、本願における同一性の定義の通り、全長同士で比較した同一性であるが、血清中の抗体が認識するのは抗原タンパク質中の概ね７残基程度の短い領域（エピトープ）であるから、血清中の抗体の対応抗原とは全長の同一性が低くとも、部分的に同一性の高い領域が含まれるポリペプチドを抗原として用いれば、血清中の該抗体を検出することができる。オルソログ間には、通常、部分的に同一性が高い領域が存在するので、トラコマティスにオルソログが存在する肺炎クラミジアタンパク質（上記(p)）、その７残基以上の断片（上記(q)）、又はこれらと同一性９０％以上のポリペプチド（上記(r)）を抗原として使用すれば、トラコマティスをはじめ他のクラミジア属細菌に対し生体内で誘導された抗体も測定することができる。全長の同一性が高い（例えば、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上）オルソログが存在する肺炎クラミジアタンパク質は、他のクラミジア属細菌のオルソログとの間で同一性が高い部分領域が存在する可能性がより高く、例えばCpj0379（配列番号23）、Cpj0525（配列番号31）、Cpj0533（配列番号33）、Cpj0577（配列番号35）、Cpj0706（配列番号39）及びCpj0884（配列番号52）は(p)のポリペプチドの好ましい例として挙げることができるが、これらに限定されない。
　(q)及び(r)のポリペプチドには、それぞれ上記の(n)及び(o)の定義が同様にあてはまる。任意のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、クラミジア属細菌のタンパク質に対し生体内で誘導された抗クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するかどうかは、例えば、既知のクラミジア感染患者（肺炎クラミジア感染患者やC. トラコマティス感染患者など）から分離した血清等の試料とそのポリペプチドとを反応させることで容易に確認できる。血清中に存在する抗体とポリペプチドとの結合が確認できれば、該ポリペプチドは上記した反応性を有すると判断できる。
　(p)～(r)もまた、(m)～(o)と同様に、少なくとも１種のポリペプチドを用いればよいが、検出感度を高める観点からは２種以上のポリペプチドを適宜組み合わせて抗原として使用することが好ましい。また、肺炎クラミジアを包含するクラミジア属細菌の感染を検出できることが知られている他の公知の抗原を組み合わせて使用してもよい。
　本発明で抗原として使用するポリペプチドは、好ましくは人工のポリペプチドである。「人工のポリペプチド」とは、化学合成、遺伝子工学的手法その他の方法で人為的に製造されたポリペプチドであり、例えば肺炎クラミジアに感染した細胞内で肺炎クラミジアゲノムから発現し産生されたタンパク質を回収したものは包含されない。
　５８種の抗原タンパク質のアミノ酸配列及びこれらをコードする各塩基配列は、配列番号１～５８に記載した通りである。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、配列番号１～５８とは異なるアミノ酸配列からなる(c)，(i)，（l），（o）,（r）のようなポリペプチドであっても、それをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に特定できる。本発明で抗原として用いるポリペプチドは、これらの配列情報に基づき、いずれの方法によっても製造することができる。
　化学合成法の具体例としては、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等を挙げることができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。化学合成の場合は、アミノ酸配列のみに基づいて所望のポリペプチドを合成できる。
　遺伝子工学的手法によるポリペプチドの作製方法も周知であり、簡単に記載すると、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、適当な発現系を使用して発現させ、これを回収・精製することにより、目的とする抗原ポリペプチドを組換えポリペプチドとして得ることができる。使用する宿主細胞の種類に応じて、組換えポリペプチドは各種の翻訳後修飾（N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化など）を受け得るが、そのような翻訳後修飾された形態のポリペプチドも、肺炎クラミジアタンパク質に対し生体内で誘導された抗体との反応性を有する限り、本発明の方法で抗原として使用できる。
　例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド（Cpj0001）を遺伝子工学的手法で作製する場合、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５９）は、例えば、C. ニューモニエJ138株をHEp-2細胞等の適当な宿主細胞に感染させ、この感染細胞からUrografin等の濃度勾配を利用してニューモニエの基本小体（EB）を回収し、このEBからニューモニエのゲノムDNAを抽出し、配列番号117及び118に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCRを行なうことで調製できる。また、所望のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて、又は上記の通りに調製したDNAに常法により適宜変異を導入して得ることができる。調製したポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、適当な発現系にて発現させ、これを回収・精製することで、所望のポリペプチドを得ることができる。用いるベクターや各種の発現系（細菌発現系、酵母細胞発現系、哺乳動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、無細胞発現系など）も周知であり、種々のベクターや宿主細胞、試薬類、キットが市販されているため、当業者であれば適宜選択して使用することができる。C. ニューモニエ株も市販・分譲されており、また、感染患者から分離して得ることもできるので、入手は容易である。
　免疫測定自体はこの分野で周知である。免疫測定を反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法等があり、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定（EIA）、ビオチン免疫測定等がある。また、抗原を用いた抗体検査法も各種の手法が知られており、具体例としては、これらに限定されないが、EIA（ELISA、CLEIA（化学発光酵素免疫測定法）、ウエスタンブロット等）、凝集法（ラテックス凝集法等）、補体結合反応（CF）等が挙げられる。本発明の方法で検体中の抗肺炎クラミジア抗体等の抗クラミジア抗体を測定する際には、公知の免疫測定法のいずれを用いてもよい。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量及び半定量が包含される。
　抗クラミジア抗体を定量したい場合には、抗クラミジア抗体を種々の濃度で含む濃度既知の標準試料について、ポリペプチド抗原を用いて免疫測定を行ない、標識からのシグナル量と標準試料中の抗クラミジア抗体濃度との相関関係をプロットして標準曲線を作成すればよい。抗クラミジア抗体濃度が未知の検体について、同様に免疫測定を行ない、標識からのシグナル量を測定し、測定されたシグナル量をこの標準曲線に当てはめることで、検体中の抗クラミジア抗体を定量することができる。
　免疫測定において用いる際には、上記したポリペプチド抗原は、任意のアミノ酸配列が片末端又は両末端に付加された形態で（そのような付加配列を含んだアミノ酸配列から成るポリペプチドとして）使用することができる。この分野において、異なるタンパク質と融合させた融合タンパク質であっても、一方のタンパク質を認識する抗体で検出可能であることは広く知られた事実である。従って、このような形態で上記ポリペプチドを用いても、検体中の抗クラミジア抗体を免疫測定することができる。他のタンパク質との融合タンパク質の形態で用いた場合でも、その融合タンパク質の中で抗クラミジア抗体の抗原として機能しているのは上記ポリペプチドの部分であるから、「ポリペプチドを抗原として用いる」ことに包含される。このように、上記ポリペプチド抗原を任意のアミノ酸配列が片末端又は両末端に付加された形態で用いる場合も、本発明の方法に包含される。ポリペプチドに付加されるアミノ酸配列は、何らかの機能性タンパク質又はその機能性断片を構成するものであってよいし、リンカー等の生理活性のない配列であってもよい。組換えポリペプチドの場合は、製造工程でGSTやHis等のタグ配列が付加されることがあるが、そのようなタグ配列が付加されたままの状態であっても抗原として使用可能である。
　例えば、ELISAやCLEIAの場合には、上記ポリペプチド抗原を、それぞれプレートまたは粒子等に固相化し、これを試料と反応させて検体中の抗クラミジア抗体を固相上に捕捉し、洗浄後、酵素標識された抗免疫グロブリン抗体（例えば抗IgA抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体など）と反応させ、洗浄後、基質物質を添加する。酵素反応量に基づき、固相上に捕捉された抗クラミジア抗体を測定することができる。ウエスタンブロットの場合には、上記ポリペプチド抗原を電気泳動後メンブレンに転写し、このメンブレンを検体と反応させた後、上記と同様に酵素等で標識された抗免疫グロブリン抗体と反応させればよい。初感染者も確実に検出するためには、標識２次抗体として、抗IgM抗体及び抗IgA抗体の少なくともいずれか一方を使用することが望ましい。
　凝集法の場合には、例えばラテックス粒子等に上記ポリペプチド抗原を固定化し、これを検体と反応させ、粒子の凝集量を吸光度等により測定すればよい。
　本発明の方法が適用される検体は、被検者から分離された検体であり、好ましくは血液検体（全血、血漿、血清等）である。検体は、必要に応じ適宜希釈して使用してよい。
　上記ポリペプチドの２種以上を用いて免疫測定を行なう場合、例えばELISAであれば、抗原を全て混合してプレートに固相化するか、又は別個のウェルにそれぞれ固相化し、これを検体と反応させてもよい。CLEIAの場合には、抗原を全て混合して粒子に固相化するか、又は抗原をそれぞれ単独で固相化した粒子を混合し、この粒子を検体と反応させてもよい。ウエスタンブロットの場合には、例えば抗原を全て混合して電気泳動した後にメンブレンに転写し、これを検体と反応させてもよい。凝集法の場合には、混合した抗原を粒子に固定化するか、又は抗原をそれぞれ単独で固定化した粒子を混合し、この粒子を検体と反応させてもよい。
　上記した(a)～(c)，(g)～(o)の抗原ポリペプチドは、肺炎クラミジア感染の検出試薬として提供することができる。また、(p)～(r)の抗原ポリペプチドは、肺炎クラミジアやC. トラコマティスの感染を含むクラミジア属細菌感染の検出試薬として提供することができる。これらの試薬は、上記したポリペプチドのみを含んでいてもよいし、ポリペプチドの安定化等に有用な他の成分をさらに含んでいてもよい。さらにまた、抗原ポリペプチドがプレートや粒子等の固相上に固定化された形態で提供することもできる。
　上記検出試薬は、他の試薬類等と適宜に組み合わせて、抗肺炎クラミジア抗体測定キットないしは抗クラミジア抗体測定キットとして提供することができる。免疫測定に必要な他の試薬類は周知である。例えば、ELISA等のサンドイッチアッセイキットの場合、２次抗体として用いる標識抗免疫グロブリン抗体をさらに含み得る。この標識抗体は、抗IgA抗体、抗IgG抗体及び抗IgM抗体のうちの少なくともいずれかであり得る。これら３つの標識抗体を全て含んでいてもよいし、あるいは、いずれか１つの標識抗体を含み、IgA検出用キット、IgG検出用キット又はIgM検出用キットとして提供することもできる。あるいは、標識された抗IgA抗体及び抗IgM抗体を含んだ、初感染の感染初期を検出するキットとして提供することもできる。複数の標識抗体を含む場合、標識抗体は混合された状態で含まれていてもよいし、また別個に含まれていてもよい。
　また、本発明は、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと抗原抗体反応により結合し、肺炎クラミジアの感染を抑制する中和活性を有する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
　配列番号２３３に示すアミノ酸配列は、C. ニューモニエJ138株のゲノムにコードされるタンパク質Cpj0939のアミノ酸配列である。これをコードする肺炎クラミジア遺伝子の塩基配列を配列番号２３４に示す。本願発明者らは、Cpj0939に対する抗体が肺炎クラミジアの感染を抑制する中和活性を有することを初めて見出した。
　本発明の抗Cpj0939中和抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の作製方法自体は周知の常法である。
　抗Cpj0939中和ポリクローナル抗体は、例えば、配列番号２３３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片を適宜アジュバントと共に動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から採取した血液から抗血清を得て、該抗血清中のポリクローナル抗体を精製することで得ることができる。免疫は、被免疫動物中での抗体価を上昇させるため、通常数週間かけて複数回行なう。抗血清中の抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、アフィニティーカラム精製等により行なうことができる。
　抗Cpj0939中和モノクローナル抗体は、例えば、周知のハイブリドーマ法により作製することができる。具体的には、配列番号２３３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分断片を適宜アジュバントと共に動物（ヒトを除く）に免疫し、該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、配列番号２３３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から抗Cpj0939中和モノクローナル抗体を得ることができる。
　免疫原として用いるポリペプチド又はその部分断片は、化学合成、遺伝子工学的手法等の常法により作製できる。また、後述する(d)～(f)に記載されたポリペプチドを用いてもよい。
　化学合成法の具体例としては、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等を挙げることができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。化学合成の場合は、アミノ酸配列のみに基づいて所望のポリペプチドを合成できる。
　遺伝子工学的手法によるポリペプチドの作製方法も周知である。具体的には、例えば、C. ニューモニエJ138株をHEp-2細胞等の適当な宿主細胞に感染させ、この感染細胞からUrografin等の濃度勾配を利用してニューモニエの基本小体（EB）を回収し、このEBからニューモニエのゲノムDNAを抽出し、配列番号２３４に示すCpj0939をコードする塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行なうことで、Cpj0939の全長又は一部をコードするポリヌクレオチドを調製できる。調製したポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、適当な発現系にて発現させ、これを回収・精製することで、所望のポリペプチドを得ることができる。用いるベクターや各種の発現系（細菌発現系、酵母細胞発現系、哺乳動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、無細胞発現系など）も周知であり、種々のベクターや宿主細胞、試薬類、キットが市販されているため、当業者であれば適宜選択して使用することができる。C. ニューモニエ株も市販・分譲されており、また、感染患者から分離して得ることもできるので、入手は容易である。
　下記実施例では、配列番号２３３中のaa140-156の領域からなるCpj0939断片をアジュバントと結合させたものを免疫原として用いて本発明の中和抗体を作製している。この中和抗体の具体例では、Cpj0939のaa140-156の領域がエピトープである。ここで、「aa140-156の領域がエピトープである」という表現には、aa140-156の全長がエピトープであることのみならず、aa140-156の領域内の一部の領域がエピトープであることも包含される。もっとも、本発明の中和抗体はこの具体例に限定されるものではない。
　抗Cpj0939中和抗体から常法により抗原結合性断片を調製することができる。「抗原結合性断片」とは、例えば免疫グロブリンのFab断片やF(ab')2断片のような、当該抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。Cpj0939への結合性を維持した抗体断片は、完全抗体と同様に中和活性を発揮できる。Fab断片やF(ab')2断片は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Fab断片やF(ab')2断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域 (scFv: single chain fragment of variable region) を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。scFvの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からscFvを回収することによりscFvを作製することができる。このようなscFvも「抗原結合性断片」として本発明の中和抗体の範囲に包含される。
　また、抗Cpj0939中和抗体は、キメラ抗体やヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域中の配列がヒト抗体の相当する配列で置換されたもの）、ヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）であってもよい。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法は、この分野で周知の方法として確立している。例えば、ヒト抗体は、ヒト抗体を産生できるように遺伝的に改変されたマウス等の非ヒト動物にCpj0939又はその部分断片を免疫して調製可能である。
　抗Cpj0939中和抗体又はその抗原結合性断片は、医薬、例えば肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤として有用である。該治療又は予防剤には、必要に応じて薬剤的に許容される担体等やアジュバント等を適宜含有させることができる。該治療又は予防剤の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態によって当業者が適宜決定できる。経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知である。該治療又は予防剤の投与量及び投与頻度は、患者の年齢、体重、性別、感染症の重篤度等に応じて当業者が適宜決定できる。特に限定されないが、中和抗体の投与量は、約0.1mg/Kg～約50mg/Kg程度、例えば約1mg/Kg～10mg/Kg程度であり得る。投与頻度は、例えば１日に１～数回、あるいは数日ないしは数週間に１回であり得る。
　また、本発明は、下記(d)～(f)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有する、肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤を提供する。
(d) 配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(e) (d)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
(f) (d)又は(e)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
　上記(e)のポリペプチドは、抗原タンパク質Cpj0939の断片である。該断片のサイズは７残基以上、好ましくは１０残基以上、より好ましくは１５残基以上、さらに好ましくは３０残基以上である。例えば、配列番号２３３中のaa140-156の領域からなるCpj0939断片を用いることができる。
　上記(f)のポリペプチドは、(d)又は(e)のポリペプチドにおいて少数のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列からなり、もとのポリペプチドとの配列の同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であるポリペプチドである。
　なお、任意のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、肺炎クラミジア感染に対する感染防御免疫を誘導できるかどうかは、例えば、実施例に示すように、HEp-2細胞を用いた肺炎クラミジア感染試験によって確認することができる。具体的には、該ポリペプチドを免疫原としてウサギを免疫して得た抗血清から抗体を精製する。この抗体の共存下、HEp-2細胞にC. pneumoniaeを接種する。抗体非共存下での感染率と比較して、HEp-2細胞に対するC. pneumoniaeの感染率が低下すれば、該ポリペプチドは肺炎クラミジア感染に対する感染防御免疫を誘導できる、と判断することができる。
　また、免疫マウス等の実験動物を用いた免疫・攻撃試験によっても、ポリペプチドの肺炎クラミジア感染に対する感染防御免疫誘導能を確認することができる。マウスを用いて評価する場合は、該ポリペプチド約1～10ｍｇ／ｋｇをアジュバントと混合して、3週間隔で2～3回、マウスの皮下に注射する。対照群は非免疫とする。2～3回注射してから約2～4週間後に、マウスにC.ニューモニエ（108個IFU/マウス）を点鼻接種することにより攻撃する。攻撃してから約１～2週間後に、肺組織からC.ニューモニエを再分離することにより感染防御免疫誘導能を評価する。該ポリペプチド注射群においては、対照群に比べて有意にC.ニューモニエが再分離されないことから、該ポリペプチドが感染防御免疫を誘導できるかどうかを判定することができる。
　上記(d)～(f)のポリペプチドは、任意のアミノ酸配列等が付加された形態で使用することができる。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）やウシ血清アルブミン（BSA）等のキャリア蛋白を結合したものでもよい。本発明の治療又は予防剤に含有されるポリペプチドとして、例えば、配列番号２３３中のaa140-156の領域からなるCpj0939断片とKLHとを結合させたものを用いることができる。
　肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤に含有されるポリペプチドは、化学合成、遺伝子工学的手法等の常法により作製できる。
　該ポリペプチドを含有する肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤は、必要に応じて薬剤的に許容される担体等やアジュバント等を適宜含有させることができる。投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、一般的な健康状態によって当業者が適宜決定できる。経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができるが、好ましくは非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知である。該治療又は予防剤の投与量及び投与頻度は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等に応じて当業者が適宜決定できる。特に限定されないが、該ポリペプチドの投与量は、約0.1mg/Kg～約50mg/Kg程度、例えば約1mg/Kg～10mg/Kg程度であり得る。投与頻度も当業者が適宜決定できる。必要がある場合には、投与を繰り返す。例えば、１週間毎に合計３回の投与を行うことができる。あるいは増強のための注射を、最初の免疫接種後８～１２週目に、そして２回目の増強を１６～２０週目に行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
患者及び血清サンプル
　川崎医科大学付属病院にてクラミジア・ニューモニエ（Chlamydophila pneumoniae、C. pneumoniae）急性初感染と臨床診断された患者８名（年齢４歳～１１歳、男児５名、女児３名）から採取した血清を使用した。該血清中のC. pneumoniae特異抗体（IgA、IgG及びIgM）は、市販のELISAキット２種、すなわち、可溶性EB外膜混合物（LPSを除く）を抗原とする日立化成工業社のヒタザイムC. ニューモニエキット（IgA、IgG及びIgM検出用）と、精製された細胞壁膜タンパク質群を特異抗原として用いた独国Medac Diagnostika社製のC. pneumoniae-ELISA plus Medacキット（IgA及びIgG検出用）及びC. pneumoniae-sELISA Medacキット（IgM検出用）とを用いて評価した。アッセイ及び計算は製造者の指示書に従って実施した。ネガティブコントロールとして、C. ニューモニエ感染のない健常な0歳児由来の血清サンプル計８個を用いた。
系統及び培地
　組換えDNA技術に用いた酵素は製造者が推奨する使用方法の通りに用いた。標準的な組換えDNA技術及び酵母の遺伝的手法を実施した。増殖培地は既報の論文（Tabuchiら、Biosci Biotechnol Biochem. 2009 Oct;73(10):2261-7）と同じものを使用した。使用した酵母菌S. cerevisiae系統はMTY483であった（Tabuchiら、上掲）。Gateway（商品名）ベクターの構築及び増幅には大腸菌DB3.1（Invitrogen社、米国カリフォルニア州）を使用し、他のプラスミド構築物については大腸菌DH5αを宿主細胞として用いた。
C. ニューモニエ感染細胞からのEB及びゲノムDNAの調製
　ゲノムDNAは、HEp-2細胞に感染させたC. ニューモニエJ138株の基本小体（EB）から以下のようにして得た（J. Biol. Chem. 276: 13490-13498, 2001）。
　C. ニューモニエ感染HEp-2細胞を６ウェルプラスチックディッシュ２０個から収穫した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄後、各ウェルに0.05％トリプシン、0.53 mM EDTAの溶液1 mlを加え、細胞を37℃で3分間インキュベートした。PBS洗浄を繰り返す間、剥離した細胞は3,000 x gで遠心して回収し、30 mlのSPGバッファー（0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate pH 7.2, 5 mM L-glutamate）中に注意深く懸濁した。懸濁した細胞を凍結融解処理した（はじめに-80℃、30分、次いで25℃で放置）。さらに、ガラス－テフロン（登録商標）ホモジナイザーで15ストローク処理して細胞を破壊し、次いで800 x gで4℃、10分間遠心した。上清を他のチューブに回収し、8 mlのTKClバッファー（20 mM Tris-HCl pH 7.5中30 % (v/v) Urografin溶液、及び150 mM KCl）を上清の上に重層した。43,000 x gで4℃、60分間遠心した後、沈殿を8 mlのSPGバッファーに懸濁し、5μg/ml DNase I及び10 mM MgCl2を加え、25℃で30分間インキュベートした。次いで、これを不連続なUrografin勾配（TKClバッファー中Urografin濃度40％を13 ml、44％を8 ml、52％を5 ml）上に重層し、43,000 x gで4℃、60分間遠心した。44-52 % Urografin界面に集まったEBバンドを回収し、3倍量のSPGバッファーで希釈し、さらに35,000 x gで4℃、30分間遠心した。EBのペレットを300μLのTEバッファー（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA）に懸濁し、12,000 x gで4℃、10分間遠心し、再度300μLのTEバッファーに懸濁した。このEB懸濁液は使用時まで－80℃で保存した。EB懸濁液中のタンパク質濃度は約1 mg/mLであった。
　該EB懸濁液（300μL）をバッファー（25 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.2 mg/ml proteinase K）中で56℃、1時間インキュベートした後、300μLのTE飽和フェノールを加え、チューブを十分に振とうした。次いで、300μLのCHCl3を加えて5分間振とうし、12,000 x gで25℃、10分間遠心した。上層及び界面を他のチューブに移し、400μLのTE飽和フェノール／クロロホルムを加えて十分に混合し、遠心した。上層及び界面を400μLのクロロホルムと混合して遠心した。上層を回収して0.1 mg/ml DNase-free RNase Aと混合し、37℃で1時間インキュベートした。TE飽和フェノール／クロロホルムで4回抽出した後、2 M酢酸アンモニウム及び70％エタノールを加えてDNAを沈殿させ、遠心した。70％エタノールでリンス後、沈殿を50μLのTEバッファーに溶解した。最終的に合計約20μgのゲノムDNAが得られた。
C. pneumoniae J138のクラミジア遺伝子のクローニング及びクラミジアタンパク質の発現
　Tet-offプロモーター制御下の酵母S. cerevisiae内遺伝子発現系を用いた。機能未知のものを含むC. pneumoniae J138株由来の455遺伝子のORFを、J138のゲノムDNAを鋳型として、上記表１の通りに配列表に示したプライマーを用いてそれぞれ増幅し、pMT830ベクター（Tabuchiら、上掲）にクローニングした。このベクター系によれば、目的のタンパク質（ここではクラミジアのタンパク質）をそのC末端でGFPと融合した形態で発現させることができる。該ベクターはMTY483（Tabuchiら、上掲）に導入して形質転換した。GFPでタグしたORFを保持する酵母細胞を3 mlの培地（20μg/mL doxycycline含有SC-Ura / glucose）にて30℃、一夜培養した。培養物を希釈し、10 mLの20μg/mL doxycycline含有SC-Ura / glucose培地中でOD600が0.2になるように調整し、OD600が1.5以下になるまで30℃で培養した。培養物をdoxycycline不含のSC-Ura / glucoseで2回洗浄し、doxycycline不含のSC-Ura / glucose培地5 mL中でOD600が1.0になるように再懸濁し、さらに30℃、5時間培養した。
タンパク質の抽出
　GFPタグされたCpjタンパク質を発現する酵母細胞を回収し、1 mLのPBSに再懸濁した。終濃度10％となるようにトリクロロ酢酸（TCA）を加え、細胞を氷上で15分間インキュベートし、遠心して沈殿させた。TCA処理した細胞を1 mLの氷冷アセトンで2回洗浄し、乾燥させた。乾燥細胞を50μLのUrea-SDSクラッキングバッファー (6 M urea, 1 % SDS, 50 mM Tris-HCl, pH7.5) 中でガラスビーズ破砕し（50℃にて5分間隔で5分間×2パルス）、トータルタンパク質を抽出した。10μgのトータルタンパク質を10％ SDS-PAGEで分離した。ゲルをPVDFメンブレン（0.45μm）上にエレクトロブロットし、メンブレンをブロッキングバッファー（5 % スキムミルク、0.1％ Tween 20を含むPBS（PBS-T）で調製）で室温にて1時間ブロッキングした後、1次抗体としてヒト血清とともに4℃、一夜インキュベートした。次いで、メンブレンをPBS-Tで4回、15分間洗浄した。1次抗体の結合をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識2次抗体でプローブした。2次抗体は以下のものを使用した：ヤギ抗ヒトIgA+IgG+IgM免疫グロブリン（KPL、米国メリーランド州）、並びにヤギ抗ヒトIgA（Monosan、オランダ国）、IgG (インビトロジェン、米国カリフォルニア州）及びIgM (インビトロジェン、米国カリフォルニア州) 免疫グロブリン。2次抗体は全て1:3,000で希釈して室温2時間で使用した。4回洗浄後、免疫反応スポットをImmobilon Western (ミリポア, 米国マサチューセッツ州)にてLAS-1000 imaging systemにより可視化した。免疫反応スポットの検出後、メンブレンを抗GFP抗体（J. Cell Sci. 123: 756-766, 2010）（1:5,000希釈で使用）及びHRP標識抗ウサギIgG（Cell Signaling Technology, 米国マサチューセッツ州）（1:5,000希釈で使用）で再度プローブした。
結果
使用した患者血清の特徴づけ
　C. pneumoniae初感染と臨床診断された患者8名から13の血清サンプルを採取した。血清サンプルは2つの異なるタイプのELISAキットで検査した。そのデータを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表3において、Mは男性、Fは女性を示す。数値横の＋、±、－は、各キットに添付の指示書に示された判定基準に基づき感染の有無を判定した結果である。具体的には、－は陰性（ヒタザイム：index <0.9、Medac：IgA, IgG <22、IgM <0.9）、＋は陽性（ヒタザイム：index >1.1、Medac: IgA, IgG >28、IgM >1.1）、±は擬陽性（ヒタザイム：index 0.9-1.09、Medac: IgA, IgG 22-28、IgM 0.9-1.1）を示す。
　ヒタザイムとMedacのELISAキットを用いた血清学的検査の結果では、検査対象の患者全員がC. pneumoniae感染陽性であった。患者3, 4, 5及び7由来のサンプルはペア血清であった。患者3由来のペア血清（サンプルNo. 3－1及びNo. 3－2）は、ヒタザイムのELISAキットではIgM抗体陽性であったが、MedacのELISAキットではIgM抗体陰性であった。患者4からは治療過程で血清サンプルを3回採取したが、それらは全ていずれのキットでもIgM抗体陽性であった。患者5由来の血清サンプル（サンプルNo. 5-1）はヒタザイムのキットによるとIgM抗体陽性であったが、MedacのキットではIgA、IgG及びIgM抗体いずれも陰性であった。ペア血清（サンプルNo. 5-2）の方は、MedacのキットでIgM力価が陽性であることが判明した。患者7では、ペア血清（サンプルNo. 7-1, No. 7-2）のIgM力価がヒタザイム、Medacいずれのキットでも陽性であった。患者6及び8由来の血清は、両キットでIgM抗体陰性であった。これら患者6及び8由来の血清サンプルは、急性症状が改善した後に採取したサンプルであったが、IgM力価が低くIgG力価が比較的高かったのはそのためだと考えられる。これらの結果は、市販の2種類のC. pneumoniae抗体検出用ELISAキットで用いられている抗原分子、すなわち、可溶性EB外膜（ヒタザイム）及び細胞壁膜タンパク質群（Medac）が、抗体力価、特にIgM抗体力価における差異と変動の原因であることを示唆している。
新規C. pneumoniae抗原の免疫スクリーニング
　新規C. pneumoniae抗原を同定するため、Tet-offプロモーター制御下の酵母S. cerevisiae遺伝子発現系（Tabuchiら、上掲）を用いてGFPタグされたC. pneumoniae組換えORFを発現させ、8名の患者から採取した計13の血清サンプルを混合した混合血清を1次抗体として使用し、免疫スクリーニングを行なった。
　C. pneumoniae J138株のゲノムにコードされる、各アミノ酸配列から推定される膜貫通ドメイン及び疎水性領域の全てを含むがN末端のシグナルペプチドは適宜除いた455の固有のORFを有する455種のGFPタグされたタンパク質について検討し、新規抗原を同定するための網羅的免疫スクリーニングに付した。組換えタンパク質の発現の確認のため、GFPタグしたC. pneumoniae ORFを発現する酵母細胞抽出物をウエスタンブロットアッセイで調べ、GFPタグした融合タンパク質を抗GFP抗体で検出した。タンパク質の発現レベルは各酵母クローン毎に相違しており（図1A）、発現が確認されたのは計398のORFであった。なお、メンブレンには様々な酵母タンパク質もブロットされており、血清プローブ中に酵母タンパク質に対する抗体が相当量含まれていればウエスタンブロットのバックグラウンドが高くなるが、4歳～11歳の児童由来の血清にはそのような相当量の抗S. cerevisiae抗体が含まれていないことが明らかになった（図1A）。このことは、ヒト抗C. pneumoniae免疫グロブリンにより認識されるC. pneumoniae抗原を、実質的に低レベルバックグラウンドの条件下、ブロット上で特異的に検出可能であることを意味している。
　次いで、13の血清サンプルを混合した混合血清を1次抗体とし、4種の免疫グロブリンを2次抗体として使用してウエスタンブロットアッセイを行なった。13の血清サンプルは、C. pneumoniae初感染と臨床診断され、2種類のELISAキット（表3）にて抗C. pneumoniae抗体力価が種々に示された患者から採取したサンプルであった。ウエスタンブロットの結果の一例を図1に示す。
　図1の例では、抗ヒトIgA+IgG+IgM免疫グロブリンを2次抗体として使用した場合にCpj1070 ORFを発現する酵母クローンで陽性シグナルが検出された（図1B）。Cpj1070は抗ヒトIgG免疫グロブリンに対しても陽性であったが（図1D）、抗ヒトIgA及びIgM免疫グロブリンに対しては陰性であった（図1C, 1E）。
　また、図１の例では、Cpj1056も陽性シグナルが検出された。このORFは、ヤギ抗ヒトIgA+IgG+IgM、抗ヒトIgA、又は抗ヒトIgM免疫グロブリンを２次抗体として使用した場合には陰性であったが、抗ヒトIgG免疫グロブリンに対しては明らかに陽性であった（図1D）。
　Cpj1056及びCpj1070由来の組換えタンパク質の分子量はそれぞれ55 kDa及び77 kDaと算出され、これらの数値はGFPが融合したC. pneumoniae ORF配列から予想される分子量とよく合致していた。図１中の他の6つのGFPタグC. pneumoniaeタンパク質は、ここで用いた4種類の2次抗体のいずれでも検出されず、陰性であった。
　C. pneumoniae J138ゲノム中の455のORFのうち、抗GFP抗体によりGFPタグ融合組換えクローンの発現が確認されたのは398のORFであった。他の57のORFの発現は、ここで用いた条件下では抗GFP抗体で検出できなかったが、その理由は現時点では不明である。GFPタグの発現が確認された398のORFのうち、上記の混合血清との反応で陽性シグナルが確認されたのは計58のORFであった。この58のORFの結果を図2に示す。
　また、これら58のORFについて、本アッセイにて各ORFをGFP融合タンパク質として発現させた際に実際に検出された各組換えタンパク質の分子量から、GFPの分子量（約27ｋDa）を差し引いた分子量を実測ｋDaとして、表1（上掲）に示す。
　2次抗体として抗ヒトIgA+IgG+IgM免疫グロブリンを用いると29のORFが検出され、抗ヒトIgAを用いると12のORFが検出され、抗ヒトIgGを用いると41のORFが検出され、抗ヒトIgMを用いると24のORFが検出された。Cpj0507, Cpj0577, Cpj0681, Cpj0708及びCpj0751は、アイソタイプ特異的な抗ヒト免疫グロブリンを2次抗体として使用すると検出されなかったが、アイソタイプ非特異的な抗ヒトIgA+IgG+IgM免疫グロブリンでは検出された。これは、用いた2次抗体のヒト免疫グロブリンに対する親和性の違いによると考えられる。
　これらとは逆に、Cpj0001, Cpj0067, Cpj0068, Cpj0148, Cpj0178, Cpj0181, Cpj0214, Cpj0224, Cpj0225, Cpj0229, Cpj0230, Cpj0268, Cpj0288, Cpj0301, Cpj0339, Cpj0355, Cpj0356, Cpj0442, Cpj0457, Cpj0525, Cpj0531, Cpj0533, Cpj0711, Cpj0819, Cpj0827, Cpj0874, Cpj1004, Cpj1022及びCpj1056は、アイソタイプ非特異的な抗ヒトIgA+IgG+IgM免疫グロブリンでは検出されなかったが、アイソタイプ特異的な抗ヒト免疫グロブリン（抗IgA, IgG, IgM）のうちの1つで検出された。Cpj0230, Cpj0268, Cpj0525及びCpj0531は、これらアイソタイプ特異的免疫グロブリンのうちの2つで検出された。Cpj 0186, Cpj0308, Cpj0572, Cpj0783及びCpj0896は、4種類の抗ヒト免疫グロブリンの全てに対して陽性であった。特に、Cpj0148, Cpj0186, Cpj0229, Cpj0230, Cpj0308, Cpj0499, Cpj0525, Cpj0531, Cpj0572, Cpj0783, Cpj0810及びCpj0896は、患者試料中のIgAによって検出された。同様に、Cpj0067, Cpj0068, Cpj0147, Cpj0178, Cpj0186, Cpj0214, Cpj0224, Cpj0225, Cpj0230, Cpj0268, Cpj0288, Cpj0301, Cpj0308, Cpj0339, Cpj0355, Cpj0369, Cpj0379, Cpj0383, Cpj0405, Cpj0472, Cpj0499, Cpj0572, Cpj0677, Cpj0678, Cpj0706, Cpj0711, Cpj0726, Cpj0727, Cpj0783, Cpj0808, Cpj0809, Cpj0810, Cpj0827, Cpj0874, Cpj0884, Cpj0896, Cpj0945, Cpj1004, Cpj1022, Cpj1056及びCpj1070は、IgGによって検出され、 Cpj0001, Cpj0147, Cpj0159, Cpj0181, Cpj0186, Cpj0268, Cpj0308, Cpj0356, Cpj0379, Cpj0442, Cpj0457, Cpj0525, Cpj0531, Cpj0533, Cpj0572, Cpj0677, Cpj0678, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0783, Cpj0819, Cpj0884, Cpj0896及びCpj0945は、IgMによって検出された。
各患者による抗原認識
　上記のC. pneumoniae抗原の網羅的免疫スクリーニングでは13の血清サンプルを混合して混合プローブとして使用したが、免疫系による抗原認識は個々の患者間で大きく変わり得る。そこで、各抗原分子の患者各人に対する反応性の詳細を検討した。
　上記免疫スクリーニングで陽性シグナルが得られた58のORFに由来するクローンと、ELISAキットにて1次抗体として比較的高い力価を示した血清サンプル（表3中のアスタリスクで示したサンプル）を用いて本検討を行なった。
　1次抗体としての血清と2次抗体としての免疫グロブリンのアイソタイプとの組み合わせにより検出される抗原の数には大きな変動があった（図3）。
　Cpj0001, Cpj0067, Cpj0148, Cpj0181, Cpj0214, Cpj0224, Cpj0225, Cpj0229, Cpj0288, Cpj0301, Cpj0339, Cpj0355, Cpj0356, Cpj0442, Cpj0457, Cpj0525, Cpj0533, Cpj0681及びCpj0819の19のORFは、ここで用いた、1次抗体と2次抗体とのいずれの組み合わせによっても反応が検出されなかった。
　これは、個々の血清サンプルが反応液中で200倍希釈されているのに対し、混合血清では13の血清サンプルを混合しているため、混合血清の反応液中の血清濃度が、個々の血清サンプルの濃度の13倍高いことによるものと考えられる。これら19クローンも、個々の血清サンプル濃度を高めることによって個々の血清サンプルと反応すると考えられ、抗クラミジア抗体の検出に有用な抗原である。
　血清サンプルNo. 3-2は、ヒタザイムのキットではIgG抗体陰性であり、MedacのキットではIgA及びIgG抗体陰性であったが、Cpj0068に対しては抗IgA免疫グロブリン2次抗体で反応が検出され、またCpj0068, Cpj0178, Cpj0186, Cpj0230, Cpj0677, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0727, Cpj0810, Cpj1004及びCpj1056に対しては抗IgG免疫グロブリン2次抗体で反応が検出された。
　これらの結果から、血清サンプルNo. 3-2が、Cpj0068に対するIgAと、Cpj0068, Cpj0178, Cpj0186, Cpj0230, Cpj0677, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0727, Cpj0810, Cpj1004及びCpj1056に対するIgGとを含むことが示された。血清サンプルNo. 3-2は、ヒタザイムELISAキットでIgM抗体に陽性であったが、2次抗体である抗IgMイムノグロブリンによって検出される陽性クローンはなかった。
　血清サンプルNo. 4-3は、ヒタザイム及びMedac両ELISAキットでIgA抗体陰性であったが、Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0383, Cpj0677, Cpj0726及びCpj0727に対しては抗IgA免疫グロブリン2次抗体で反応が検出された。
　血清サンプルNo. 5-2は、Medac ELISAキットでIgA抗体陰性であり、ヒタザイム及びMedac ELISAキットの両方でIgG陰性であったが、Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0230, Cpj0369, Cpj0677, Cpj0706, Cpj0726, Cpj0727及びCpj0783に対しては抗IgA免疫グロブリン2次抗体で反応が検出され、Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0677, Cpj0678, Cpj0706, Cpj0727及びCpj0810に対しては抗IgG免疫グロブリン2次抗体で反応が検出された。
　血清サンプルNo. 6は、ヒタザイム、Medacの両ELISAキットでIgM抗体陰性であったが、Cpj0068, Cpj0577, Cpj0726, Cpj0727及びCpj0810に対しては抗IgM免疫グロブリン2次抗体で反応が検出された。
　血清サンプルNo. 8は、ヒタザイム、Medacの両ELISAキットでIgM抗体陰性であったが、Cpj0507, Cpj0577及びCpj0727に対しては抗IgM免疫グロブリン2次抗体で反応が検出された。
　陽性ORFのデータと、C. トラコマティス（C. trachomatis）遺伝子オルソログ及びそのhomology（同一性）をまとめたものを図４に示す。C. pneumoniae遺伝子の58 ORFのうちの39個のC. pneumoniae抗原において、患者血清サンプル1次抗体のうちの少なくともいずれかと、アイソタイプ特異的抗IgA、抗IgG、又は抗IgM免疫グロブリン2次抗体と、の組み合わせで陽性シグナルが検出された。他の19個のC. pneumoniae抗原は、各血清サンプルとの反応が検出されなかった（図３及び４）。Cpj0068, Cpj0147, Cpj0186, Cpj0308, Cpj0369, Cpj0383, Cpj0507, Cpj0572, Cpj0677, Cpj0726, Cpj727, Cpj783, Cpj809及びCpj810は、１個又は複数の血清試料中の3つのアイソタイプの抗体により検出された。さらに、39個のC. pneumoniae抗原のうちの11抗原分子（Cpj0147, Cpj0159, Cpj0178, Cpj0186, Cpj0268, Cpj0308, Cpj0472, Cpj0677, Cpj0678, Cpj1056, Cpj1070）について、C. trachomatisゲノムにオルソログが存在しないことを見出した（図４）。個々の血清サンプルのいずれとも反応しなかったが混合血清とは明確な反応が検出された19個のC. pneumoniae抗原のうち、9個のC. pneumoniae 抗原（Cpj0067, Cpj0181, Cpj0214, Cpj0224, Cpj0225, Cpj0339, Cpj0355, Cpj0356及びCpj0457）もまた、C. trachomatisゲノムにオルソログが存在しなかった（図４）。これら20個のC. pneumoniae抗原は、C. pneumoniaeに極めて特異的であることを示唆している。
抗Cpj0939抗体の作製
　C. pneumoniaeタンパク質Cpj0939（配列番号２３３）に対する抗体を作製した。Cpj0939の部分ペプチド（配列番号２３３のaa140-156、N末端にはアジュバント結合のためCysを付加）を常法により化学合成し、HPLC精製後、ペプチドのシステイン残基のSH基を利用してキーホールリンペットヘモシアニンを結合させた。これを免疫原としてウサギを免疫した。計6回の追加免疫を行ない、全採血して抗血清を得た。該抗血清から、SulfoLink Kit（PIERCE社）を用いて特異抗体を精製した。カラムをPBSで洗浄後、抗血清をアプライし、PBSで洗浄した。流出液のOD280を測定し、ODが測定されなくなるまで洗浄した。次いで、0.1 M グリシン－HCl pH2.7をカラム容量の4倍量添加し、抗体を溶出させた（フラクションで分取）。溶出した抗体は、氷中に置き、1 M Tris-HCl pH8.0で速やかに中性域に戻した（フラクションの約1/3量を添加、pH試験紙で中和を確認）。抗体の溶出操作を再度繰り返した後、0.1 M グリシン－HCl pH2.3をカラム容量の4倍量添加し、溶出液を回収後（フラクションで分取）、各フラクションのOD280を測定して抗体を回収した。得られた抗体画分をPBSで透析し、精製抗Cpj0939抗体を得た。該精製抗体のCpj0939との結合性は、常法により作製した組換えCpj0939を抗原とする免疫測定により確認した。
抗Cpj0939抗体がC. pneumoniae感染に及ぼす影響
　抗Cpj0939抗体で前処理したHEp-2細胞にC. pneumoniaeを接種し、感染率にどのような影響があるか検討した。
　まず菌体の前処理として、６ウェル培養プレートで培養したHEp-2細胞にC. pneumoniae J138株を加え、2,400 rpm (7603 x g) で６０分間遠心することで、HEp-2細胞にJ138株を感染させた。次いで、10％熱不活化ウシ胎児血清（Gibco BRL Life Technologies）を添加した1 mg/mlシクロヘキシミド含有最小培地（MEM、日水製薬）中で、5％CO2雰囲気下、37℃でインキュベートし、細菌を増殖させた。感染細胞を凍結融解後、超音波破砕することで菌体を回収した。このJ138菌体をSPGバッファー（0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate pH 7.2, 5 mM L-glutamate）に懸濁し（細胞密度約6.0 x 105/SPG 1ml）、この懸濁液200μLに抗Cpj0939抗体を20μL（25μg）、200μLにウサギIgGを20μL（25μg）、200μLにPBS(-)を20μLそれぞれ加え、37℃で30分間インキュベートした。
　別途24ウェル培養プレートで培養していたHEp-2細胞から培養液を取り除き、抗Cpj0939抗体、ウサギIgG又はPBS(-)と共にインキュベートしたJ138菌体懸濁液を200μL/ウェル加え、60分間遠心することでHEp-2細胞にJ138を感染させた。培養液をSPGバッファーに置き換え（1 ml/ウェル）、5％CO2雰囲気下で37℃、72時間インキュベートした。インキュベート後の細胞を抗クラミジアLPS抗体（デンカ生研）で免疫染色し、1視野あたりの感染細胞数をカウントした。ウサギIgGで前処理した菌体を用いたときの感染細胞数を100％とし、抗Cpj0939抗体で前処理した菌体を用いたときの感染細胞数を相対評価した結果を図５に示す。抗Cpj0939抗体処理により、ウサギIgG処理の20％にまで感染細胞数が減少しており、抗Cpj0939抗体には標的細胞へのC. pneumoniaeの感染を阻止する中和活性があることが確認された。

Claims (16)

  1. 　下記(a)～(c)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgM型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法。
    (a) 配列番号３６，４，９，１８，１５，３，２２，２３，３０，３５，４２，４３，４５，６，２８，２４，２５，３２，３４，４７，４８，５３，８，２１，２７，３７，１，２６，３１，３３，３９，４９，５２及び５４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    (b) (a)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
    (c) (a)又は(b)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
  2. 　前記(c)のポリペプチドが、前記(a)又は(b)のポリペプチドと９５％以上の同一性を有する請求項１記載の方法。
  3. 　前記(c)のポリペプチドが、前記(a)又は(b)のポリペプチドと９８％以上の同一性を有する請求項２記載の方法。
  4. 　前記(a)のポリペプチドが、配列番号３６，４，９，１８，１５，６，２８，８，２１，２７及び３７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１記載の方法。
  5. 　前記(a)のポリペプチドが、配列番号３６，４，９，１８及び１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項４記載の方法。
  6. 　前記(a)のポリペプチドが、配列番号３６，４，９及び１８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項４記載の方法。
  7. 　前記ポリペプチドのうちの２種以上を抗原として用いる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　下記(g)～(i)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgA型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法。
    (g) 配列番号３６，４，９，１８，３，２４，３９，２２，４６，５４，５８，４５，４７，４８，２８，１４，２３，２９，３０，３４，４０，４４，１３，３１，３２，５３，５，４２及び４３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    (h) (g)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
    (i) (g)又は(h)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgA型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
  9. 　下記(j)～(l)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、生体から分離された検体中のIgG型の抗肺炎クラミジア抗体を測定することを含む、肺炎クラミジア感染の検出方法。
    (j) 配列番号３，２２，３９，４２，４３，４８，５２，５４，５８，１４，３０，７，２４，２９，３５，４１，４７，５３，５６，１５，５７，４５，５０，５１，５５，２，１０～１２，１９，２０，１６，１７，２３，２５，４，９，１８，２８，３４，３６，３７，４４及び４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    (k) (j)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
    (l) (j)又は(e)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgG型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
  10. 　下記(a)～(c)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む、検体中の抗肺炎クラミジア抗体を測定するための抗肺炎クラミジア抗体測定キット。
    (a) 配列番号３６，４，９，１８，１５，３，２２，２３，３０，３５，４２，４３，４５，６，２８，２４，２５，３２，３４，４７，４８，５３，８，２１，２７，３７，１，２６，３１，３３，３９，４９，５２及び５４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    (b) (a)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
    (c) (a)又は(b)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、生体内で肺炎クラミジアタンパク質に対し誘導されたIgM型の抗肺炎クラミジア抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチド。
  11. 　配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと抗原抗体反応により結合し、肺炎クラミジアの感染を抑制する中和活性を有する抗体又はその抗原結合性断片。
  12. 　配列番号２３３に示されるアミノ酸配列中の第140番～第156番アミノ酸の領域からなるポリペプチドを動物（ヒトを除く）に免疫することにより作製される請求項１１記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  13. 　請求項１１又は１２記載の抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬。
  14. 　請求項１１又は１２記載の抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤。
  15. 　下記(d)～(f)から成る群より選択される少なくとも１種のポリペプチドを有効成分として含有する、肺炎クラミジア感染症の治療又は予防剤。
    (d) 配列番号２３３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    (e) (d)のポリペプチド中の連続する７残基以上の部分領域からなり、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
    (f) (d)又は(e)のポリペプチドと９０％以上の同一性を有し、７残基以上のサイズを有し、かつ、肺炎クラミジアに対する感染防御免疫を誘導できるポリペプチド。
  16. 　前記ポリペプチドが、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列中の第140番～第156番アミノ酸の領域を含む、請求項１５記載の治療又は予防剤。
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