JP2016524691A - 血小板同種抗原タイピング及び血小板抗体試験 - Google Patents

Abstract

本発明はヒト血小板上のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡｓ）を検出する方法、ＨＰＡｓに対するヒト抗体を検出する方法及び該方法を行うための診断試験デバイスに関する。【選択図】なし

Description

本発明はヒト血小板上のヒト血小板同種抗原（Human Platelet Alloantigens；ＨＰＡｓ）を検出する方法、ＨＰＡｓに対するヒト抗体を検出する方法及び該方法を行うための診断試験デバイスに関する。

輸血は全世界で日常的な療法である。通例、全血ではなく血液の特定の成分のみが輸血される。血液は液体部分及び細胞部分からなる。液体部分は血漿と呼ばれ、多数のタンパク質を含有する。血漿は新鮮若しくは凍結全血漿、又は血漿から生化学的手段によって精製された血漿成分の形で治療剤として使用され、特定の治療剤として与えられる。それぞれの例は、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）等の免疫グロブリン又は血液凝固因子である。血液の細胞画分には赤血球、白血球及び血小板という３タイプの細胞が含まれる。赤血球輸血は血液バンクの治療用細胞製剤の大半を占め、濃厚血小板（platelet Concentrates）がそれに続くが、その数は濃厚赤血球（red cell concentrates）のおよそ１０分の１である。

血液製剤は個々のドナーから得られ、徹底した診断検査に供される。細胞の表面抗原はドナーによって異なるため、第１の群の試験はこれらの抗原を決定することである。これらは既知の血液型であり、主要抗原ＡＢＯ及び３０種を超える他の微量抗原が既知であり、記載されている。さらに、血清及び／又は血漿がこれらの抗原に対する抗体について試験される。通常行われる第２の群の試験は、ドナー血液における感染性疾患の有無についての試験である。これは治療用輸血が病原因子を保有しないことを確かめるためである。これらの試験は一般にＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶに対する抗体についての血漿スクリーニング、ＴｏＲＣＨパネル試験、及び病原体特異的なタンパク質についての血漿抗原試験、例えばＨＩＶ ｐ２４抗原試験等の抗体試験の組合せによって行われる。特定の国のスクリーニングプラクティスに応じて、抗原試験及び抗体試験を増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡ／ＲＮＡ増幅に基づくウイルス核酸についての核酸試験によって補うことができる。

治療用血小板については、全ての血清学的及びＡＢＯ血液型試験を濃厚赤血球と同様に行う。しかしながら、血小板は血液型抗原だけでなく、その表面上に付加的な追加の抗原を保有する。これらの抗原はヒトによって異なり、適合しないヒト個体に輸血した場合に同種免疫を引き起こす。患者におけるこれらの同種抗原及びこれらの同種抗原に対する抗体についての検査は通常は行われていない。この理由は、同種抗原を決定するのに好適な診断検査並びに抗体検出に好適な実際的方法及び試験の欠如である。

血小板同種抗原は血小板の膜糖タンパク質の二対立遺伝子多型（biallelic polymorphisms）から生じる。これらの多型は主要な生物学的結果を有しない糖タンパク質において単一アミノ酸変化を起こす。しかしながら、不適合血小板の輸血時には同種免疫が起こり、下記の臨床症状が生じる可能性がある。同種免疫の別の発生源は、妊婦が胎児の不適合の血小板に由来する同種抗原に対する予防接種を受けた場合の妊娠時にも見られる。血小板に対する同種抗体は臨床症状を生じる一発生源であるが、血小板減少症を生じる血小板に対する自己抗体も存在する。

血小板同種抗原はよく研究されたタンパク質であり、関連同種抗原のほとんどが記載されている。ＨＰＡ−１〜ＨＰＡ−１５を表すＨＰＡの一般的命名法が存在する。より一般的な対立遺伝子を「ａ」、あまり一般的でない対立遺伝子を「ｂ」と指定することが慣例となっている。既知の全てのＨＰＡの中でも、ＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂ抗原が最も免疫原性の同種抗原であり、合わせて白色人種における臨床例の９５％超を占める。アジア集団においては、ＨＰＡ−４同種免疫が関連のある問題である。他の抗血小板糖タンパク質抗体も存在するが、それほど多くはない。血液バンクについては、ＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂ陰性の濃厚血小板を提供することは抗血小板抗体に起因する３つの症状、すなわち新生児同種免疫血小板減少症（ＮＡＩＴ）、血小板不応状態（ＰＲ）又は輸血後紫斑病（ＰＴＰ）のうち１つを有する患者のより良好な治療の機会を与えることから意味がある。

現在の血小板抗原タイピング（antigen typing：抗原判定）は患者及び選択された血小板ドナーについてのみ行われる。研究所では通例、自家製の遺伝子型決定アッセイ及び表現型検査アッセイが用いられる。最も顕著な血小板同種抗原はＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂである。少数のＨＰＡ−１ａタイピング試験が表現型検査によって行われているが、このアプローチは広くは用いられていない。表現型検査アッセイが見られない理由の１つは、血小板表現型を決定するのに好適なモノクローナルタイピング試薬の欠如及び表現型検査の長期にわたる退屈な手順である。現在、ＨＰＡ−１ａタイピング用のモノクローナル抗体は１つしか存在せず、日常的業務には広く適合していない。

血小板の血液バンクスクリーニングは、第１にレシピエント患者に対する安全性の改善によって利益を生み、第２に間違った患者へのコストの大きい血小板製剤の不適当な無用の献血を回避するという２つの主な利点を有する。

血小板抗体診断はＮＡＩＴ、ＰＲ及びＰＴＰ等の血小板抗体に起因する疾患を有する患者の血液サンプルに対して行われる。血小板抗原のモノクローナル抗体固定化（Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigen；ＭＡＩＰＡ）アッセイ又は血小板免疫蛍光試験（Platelet Immune Fluorescence Test；ＰＩＦＴ）等の現行の血小板抗体試験は複雑な細胞試験であるため、利用可能な市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断（ＩＶＤ）製品は非常に少数である。専門的な血小板研究所のみが自家製の診断検査を用いてこれらの試験を行っている。通常の血液バンクは一般にこれらの試験を行っていないため、これらの専門研究所が他の血液バンクに対して血小板免疫学のサービスを提供している。

したがって、本発明の根底にある技術的課題はヒト血小板上のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）を検出する方法、血小板抗原に対するヒト抗体を検出する方法及び該方法を行うための診断試験デバイスを提供することである。上記方法は簡単に行われ、コスト効率がよく、短時間で結果をもたらすものとされる。

上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施の形態によって達成される。

特に、第１の側面では、本発明はサンプル中に含有されるヒト血小板上の少なくとも１つのヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）を検出する第１の方法に関し、これは、
（ａ）少なくとも抗体が結合した少なくとも１つの表面を提供する工程であって、該抗体が検出対象の上記少なくとも１つのＨＰＡを保有する糖タンパク質に対するものである工程と、
（ｂ）上記サンプル中に含有される血小板を溶解し、該血小板の膜タンパク質を可溶化する工程と、
（ｃ）上記表面と工程（ｂ）の溶解及び可溶化した上記サンプルとを接触させる工程であって、該サンプル中に含有されるそれぞれの糖タンパク質を、工程（ａ）の上記抗体への特異的結合によって上記表面に固定化する工程と、
（ｄ）上記表面と蛍光標識抗体とを接触させる工程であって、該抗体が検出対象の上記少なくとも１つのＨＰＡに対するものであり、該抗体、上記サンプル中に含有されるそれぞれの糖タンパク質、及び工程（ａ）の上記抗体が表面結合複合体を形成する工程と、
（ｅ）上記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
（ｆ）上記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
（ｇ）上記少なくとも１つのＨＰＡを、工程（ｆ）において測定される上記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
を含む。

この側面では、「検出」という用語は特に限定されず、対象のＨＰＡの定性的測定のみを含むものではなく、その定量的決定を明白に含むものである。この関連で、「定性的」とは本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける対象のＨＰＡの有無の決定を意味し、「定量的」という用語は本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける検出対象のＨＰＡの含量又は量の測定を意味する。

本発明の上記の第１の方法によって検出されるＨＰＡは特に限定されず、当該技術分野で既知である。少なくとも１つのＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−２ａ、ＨＰＡ−２ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ、ＨＰＡ−５ｂ、ＨＰＡ−６ａ、ＨＰＡ−６ｂ、ＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、ＨＰＡ−８ａ、ＨＰＡ−８ｂ、ＨＰＡ−９ａ、ＨＰＡ−９ｂ、ＨＰＡ−１０ａ、ＨＰＡ−１０ｂ、ＨＰＡ−１１ａ、ＨＰＡ−１１ｂ、ＨＰＡ−１２ａ、ＨＰＡ−１２ｂ、ＨＰＡ−１３ａ、ＨＰＡ−１３ｂ、ＨＰＡ−１４ａ、ＨＰＡ−１４ｂ、ＨＰＡ−１５ａ及びＨＰＡ−１５ｂからなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、少なくとも１つのＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される。更により好ましくは、少なくとも１つのＨＰＡはＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される、すなわちＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂを検出する。

本発明の上記の第１の方法によると、少なくとも１つのＨＰＡが検出される。このため、２以上のＨＰＡ、例えば２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のＨＰＡを検出することもできる。これらの実施の形態では、それに応じた数の表面を工程（ａ）において供給する、例えば２つのＨＰＡを検出する場合、２つの表面を供給する。さらに、工程（ａ）において供給した全ての表面を工程（ｃ）及び（ｄ）において接触させ、検出対象のＨＰＡに対するそれぞれの蛍光標識抗体を工程（ｄ）において使用する。さらに、全ての表面結合複合体を工程（ｅ）において励起し、工程（ｆ）において測定し、それぞれのＨＰＡの全てを工程（ｇ）において検出する。

本発明の上記の第１の方法において分析するサンプルは、血小板を含有する又は含有する疑いがあるサンプルである限りにおいて特に限定されない。上記サンプルは、例えばバフィーコート又は濃厚血小板等の血小板を含有する抗凝固処理全血又はそれに由来する血液製剤であるのが好ましい。

上で規定される本発明の第１の方法によると、抗凝固処理全血は好ましくは最終試験において例えば１０％超、例えば２５％超、３３％超、５０％超又は更には８０％超の濃度で使用され得る。

しかしながら驚くべきことに、本発明の上記の第１の方法において抗凝固処理全血サンプルを使用して、信頼性の高い優れた試験結果を得ることが可能である。全血サンプルを最終試験において２５％を超える濃度で使用すると、望ましくない生化学的相互作用のために非特異的シグナルが生じる可能性があることが明らかである。しかしながら予想外なことに、非常に低い生化学的バックグラウンドが観察され、依然として特異的かつ選択的に血小板糖タンパク質を検出することが可能であった。更により重要なことには、本発明の上記の第１の方法によって、互いに１つの単一アミノ酸多型しか異ならない糖タンパク質を高い感度で検出及び区別することが可能であることに留意されたい。さらに、溶解全血溶液、すなわちヘモグロビン、赤血球及び他の血液細胞に由来する細胞質タンパク質、並びに多量のヒト血漿タンパク質中の大過剰の潜在的フルオロフォアの存在下であっても特異的シグナルをもたらす試験の能力は驚くべきものである。全血サンプルの任意の成分に起因する自己蛍光シグナルは観察されない。４℃で保管した場合に全血中で生じる生物学的分解プロセスがアッセイシグナルに顕著な影響を与えないことも注目に値する。４℃で１年超にわたって保管した血液サンプルはアッセイに使用することができ、正確な結果をもたらす。これが更に、保管及び経年時の自己蛍光現象の欠如及び血小板糖タンパク質の安定性も示される。

「表面を接触させる」又は「上記表面を接触させる」という用語は、この側面において使用される場合、例えば抗体、ブロッキング剤、抗体−抗原複合体又は本発明の方法において生じ得る他の複合体で飽和した表面の接触に関することを意図する。例えば上記の第１の方法の工程（ｃ）では表面が抗体及び任意にブロッキング剤で飽和しており、したがって実際には接近可能でないため、サンプルが実際には表面ではなく、表面に結合した工程（ａ）の抗体又は任意にブロッキング剤と接触することが当業者には理解される。しかしながら上記の用語は、表面を見るだけで、任意の所与の時点で該表面に実際に何が結合するかを知ることになる本発明に取り組む実践者の巨視的観点を反映するために選ばれる。

本発明の上記の第１の方法において提供される表面は、特に限定されず、当該技術分野で既知の材料で作られる。かかる材料は好ましくはガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックである。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。上記の表面は例えばキュベット、又はマイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルのような凹形容器の内部であるのが好ましい。かかるキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜１００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの液体の反応容量を有する。キュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、本発明の上記の第１の方法の工程（ａ）の抗体が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て（one-way disposable）測定カートリッジであり得る。

この側面で使用される場合、「結合した」という用語は、工程（ａ）の抗体が吸収（直接吸収）によって表面に付着していることを意味するのが好ましい。しかしながら、該抗体は架橋要素、例えば更なる抗体又は抗原等のタンパク質を介して表面に結合していてもよい。上記抗体は共有結合によって表面に結合していてもよい。これは例えばカルボジイミドでの変換によるアクリレート表面を用いて生じさせることができる。さらに、本発明の意味における「結合した」という用語は表面又は別のリガンドへの付着を含み、例えばイオン相互作用、極性相互作用又は非極性相互作用に基づく相互作用のような共有相互作用及び非共有相互作用の両方を含む。

この側面では、工程（ａ）の抗体を通常の方法によって表面上に配置することができる。例えば、上記抗体を表面上にコーティングすることができる。この工程の後、表面を好ましくは別の溶液で処理され、上記抗体に付着していない表面上の部位は例えば別のタンパク質又はデタージェント（detergent：洗浄剤）等の化学化合物によってブロッキングされているか又はブロッキングされる。

本発明の上記の第１の方法によると、工程（ａ）の抗体は複合体を形成することができ、この複合体は該抗体に加えて、工程（ｄ）の蛍光標識抗体及び検出対象のＨＰＡを保有する糖タンパク質を少なくとも含む。工程（ａ）の抗体が表面に結合することで、検出対象のＨＰＡを保有する糖タンパク質を含む複合体が表面に「固着し」、すなわち表面に固定され、フルオロフォアを含有する工程（ｄ）の抗体でマーキングすることによって同時に検出することができる。

本発明の上記の第１の方法の工程（ａ）の抗体は、少なくとも１つの検出対象のＨＰＡを保有する糖タンパク質に対する限りにおいて、すなわち該糖タンパク質に特異的に結合する限りにおいて特に限定されない。好適な抗体は当該技術分野で既知であり、例えば市販のものであり得る。かかる抗体はそのアイソタイプ又は起源に関して特に限定されない。この関連で例示的な抗体は例えばネズミ（mirine）ＩｇＧ抗体であり得る。この点において対象の糖タンパク質は当該技術分野で既知であり、特にｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩａＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ及びＨＬＡ／β−２−ミクログロブリンを含む。この点において使用することができる特定の抗体はモノクローナル抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａ抗体ＲＦＧＰ５６及びモノクローナル抗ｇｐＩａＩＩａ抗体ＡＫ７である。他の好適な抗体は例えば抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａクローンＰ２ Ｉｍｍｕｎｔｅｃｈ又は抗ｇｐＩａＩＩａクローンＧｉ９及びＹ４１８である。当業者であれば多くのより好適な抗体を見出すことができる。

さらに、本発明の上記の第１の方法の工程（ｄ）の蛍光標識抗体は、検出対象のＨＰＡに対する限りにおいて、すなわち該ＨＰＡに特異的に結合する限りにおいて特に限定されない。好適な抗体はそのアイソタイプ及び起源に関して特に限定されず、当該技術分野で既知である。さらに、上記抗体の蛍光標識は、光源のエバネッセント場によって励起された場合に蛍光を発することができる限りにおいて特に限定されない。好適な蛍光標識は当該技術分野で既知である。好ましい実施の形態では、上記蛍光標識はアロフィコシアニン（allo-phycocyanine；ＡＰＣ）である。

本発明の上記の第１の方法の好ましい実施の形態では、工程（ａ）の抗体及び工程（ｄ）の抗体は異なる特異性を有する、すなわち異なるエピトープに結合する。

本発明の上記の第１の方法の特定の実施の形態では、工程（ａ）の抗体及び工程（ｄ）の抗体は交換することができる、すなわち工程（ａ）の抗体は少なくとも１つの検出対象のＨＰＡに対するものであり、工程（ｄ）の蛍光標識抗体は少なくとも１つの検出対象のＨＰＡを保有する糖タンパク質に対するものである。この特定の実施の形態では、上記抗体及び蛍光標識は上で規定した通りである。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語はそれぞれの抗体自体のみを指すものではなく、該抗体の任意のフラグメント及び誘導体も、該フラグメントが同じエピトープに特異的に結合する能力を保持する限りにおいて含む。それぞれのフラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。さらに、抗体又は抗体フラグメントの代わりに、エピトープに特異的に結合する能力を有する任意の他の巨大分子を使用することができる。かかる巨大分子としては、例えばヌクレオチドアプタマー、ペプチドアプタマー、ナノボディ、アフィボディ（affibodies）、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、フィロマー（phylomers）、ＡｄＮｅｃｔｉｎ及びプロテインＡが挙げられる。

本発明の上記の第１の方法によると、工程（ｂ）でサンプル中に含有される血小板を溶解し、該血小板の膜タンパク質を可溶化する。溶解及び可溶化のための方法及び作用物質は特に限定されず、当該技術分野で既知である。これらとしては、例えばＴｗｅｅｎ ２０（ポリソルベート２０；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）又はＮＰ４０（ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール）等の好適な濃度の界面活性剤による上記血小板の処理が挙げられる。

本発明の概略的な実施の形態によると、（コーティングした）血小板をパパイン又はブロメライン等の特異的な酵素で処理して、抗原エピトープのアベイラビリティを改善することができる。例えば本発明によると、血小板を（例えば低浸透圧により）溶解し、続いてパパイン及び／又はブロメラインで少なくとも部分的に消化して抗原アベイラビリティを改善し、更には単に血小板でコーティングした膜を得るために血小板由来の細胞質タンパク質を分解及び除去することができる。

本発明の更なる概略的な実施の形態によると、血小板を本発明の方法のいずれかにおいて使用する前にデタージェントで処理しない。これは血小板糖タンパク質の重要なエピトープがデタージェントによって破壊されるのを有利に防ぐ。このため本発明によると、上及び以下で規定される方法において未変性（native）血小板抗原を用いるのが概して好ましい。

本発明の上記の第１の方法では、工程（ｃ）及び（ｄ）は続けて又は同時に行うことができる。特に、好ましい実施の形態では、工程（ｄ）の蛍光標識抗体は工程（ｂ）において形成される溶解及び可溶化溶液中に含有され、そのためそれぞれの溶液を表面と接触させることで工程（ｃ）及び（ｄ）を同時に行うことができる。

好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第１の方法は３回以上、より好ましくは２回以上の液体操作工程を必要としない。この関連で、「液体操作工程」という表現は本明細書で使用される場合、概して作用部位から及び／又は作用部位へと液体を移動、除去又は添加する任意の工程を含む。例えば本発明による液体操作工程は、例えばピペット操作によって液体をキュベット、マイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルへと添加すること、又は液体をかかるウェルから取り出すことを含む。さらに、別の好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第１の方法は任意の洗浄工程を含まない。

特に、本発明の第１の方法は好ましくは工程（ｄ）の蛍光標識抗体等の過剰な反応物を含有する容量を除去する、及び／又は工程（ａ）の抗体及び／又は測定対象の複合体が結合した表面を洗浄する任意の工程を必要としない。これにより、本発明の上記の第１の方法は有利に加速して所望の測定結果が迅速に得られ、この方法を行う際の廃液の蓄積及び操作上の誤りが回避される。

この関連で、本発明の更なる実施の形態では、上で規定した第１の方法は一工程方法である。本発明によると、「一工程」方法とは、複合体形成反応を１回のみ行うことを意味し、これは概して所望の測定結果を得るために操作者が１回のみ又は多くとも２回の液体操作工程を行う必要がある。このため、最初の複合体形成後のより多くの試薬の添加等の更なる反応工程が有利に回避される。

さらに、本発明の更なる実施の形態は液体撹拌を含まない上で規定した方法に関する。この関連で、「液体撹拌」という表現は特に限定されず、自然拡散を除く液体中で生じる任意のタイプの撹拌を含む。例えば、本発明の意味における液体撹拌は振盪、ポンピング、かき混ぜ、超音波撹拌等を含む。自然発生的な拡散を除く任意の液体撹拌を回避することで、この方法を単純かつ効果的に行うことができ、これによりそれぞれの撹拌デバイスを含む複雑な技術的構成が回避される。

上で規定される第１の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｇ）において決定される結果は工程（ｃ）の開始から３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。本発明によると、定性的又は定量的な結果は溶解及び可溶化したサンプル並びに工程（ｄ）の蛍光標識抗体を含有する溶液を工程（ａ）の抗体が結合した表面と接触させてから３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。好ましくは、結果は９分以内、８分以内又は７分以内に得られる。更なる例としては６分以内、５分以内又は４分以内の期間が挙げられる。

本発明の上記の第１の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｅ）の前に、上記表面を工程（ｄ）の抗体の蛍光標識の吸収域及び／又は発光域において吸収する少なくとも１つの色素（dye）と接触させる。本発明によると容量中のフルオロフォア、すなわち表面結合複合体の一部でないフルオロフォアの励起は、表面と接触して配置される溶液に該フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域で吸収を有する少なくとも１つの色素が添加されている場合に抑制することができる。容量に添加した色素の吸収は上記フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域と調和する。個々の一色素又は色素の混合物を使用することができる。フルオロフォアの吸収域は概して使用する光源の波長と相関する。色素がこの特別な範囲に吸収極大を有する必要はなく、吸収スペクトルのショルダーは十分である可能性がある。例えば、ＡＰＣ又はＣｙ５のようなフルオロフォアを使用する場合、使用される色素は例えばＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ ＦＣＦのように６００ｎｍ〜７００ｎｍの間に吸収を有し得る。この点において使用することができる色素の別の例はＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌａｃｋ ＢＮである。添加する色素の濃度は溶液中の各々の色素の吸収係数及び放射光の周波数の両方に応じて異なる。色素の濃度は、透過光が基本的に表面から０．１ｍｍ以内で９０％超の吸光度（absorbance）の程度まで吸収され得るように色素に応じて調整することができる。

本発明の上記の第１の方法の工程（ｅ）〜（ｇ）によると、該方法の工程（ａ）〜（ｄ）で生成する表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起し、該複合体から発される蛍光を測定し、少なくとも１つの対象のＨＰＡを測定される発された蛍光に基づいて検出し、陽性の蛍光シグナルは上記複合体の存在、ひいては少なくとも１つの対象のＨＰＡの存在を示す。

この関連で「光源」という用語は本明細書で使用される場合、特に限定されず、エバネッセント場を生じ、工程（ｄ）の抗体に結合したフルオロフォアを励起するのに適した任意の光源を含む。例えば、単色光を光源として使用してもよい。好ましくはフルオロフォアの発光を妨げず、好ましくは色素の吸収バンドと交差する波長を有する光を使用するものとする。６３５ｎｍの波長の光を発するレーザーが光源として特に好ましい。

本発明の上記の第１の方法は、欧州特許第１０７９２２６号、欧州特許第１２０４８５６号及び欧州特許第１３７１９６７号に記載されるように、結合したフルオロフォアのエバネッセント場励起を用いて生体分子を分析し、結合事象をリアルタイムに直接測定する新たな技術に基づくものである。このエバネッセント場バイオセンサーの機能原理は、表面結合分析物と溶液中のリガンドとの非共有相互作用による相互作用である。溶液中のリガンドは蛍光分子に共有結合する。蛍光分子の好ましい励起は例えばレーザーダイオードによって生じるようなコヒーレント光であり、続いて発された光子を検出する。これに好適なフルオロフォアは例えばＣｙ５、Ａｌｅｘａ色素、Ｄｙｌｉｇｈｔ又は集光性タンパク質アロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。

生化学的反応はＥＬＩＳＡウェルと形態及び寸法が同様であり、付加的な光学的実体（optical entity）を底部に有する小ウェルにおいて行われる。ＥＬＩＳＡと同様に、バイオセンサーウェル及びその光学的底部部分は例えばポリスチレンのような熱可塑性材料の射出成形によって作製される。ＥＬＩＳＡ法とエバネッセントバイオセンサー法との大きな違いは溶液中のリガンドの標識である。ＥＬＩＳＡでは標識は酵素であり、エバネッセント技術ではリガンドは蛍光分子で標識される。結合したフルオロフォア、すなわちエバネッセント表面に固定化された分析物に結合する溶液中の蛍光性リガンドの測定は、エバネッセント場励起原理を用いて、結合した蛍光標識リガンドの特異的な励起によって達成される。結合したフルオロフォアの選択的な励起は光学的構成を用いた光のエバネッセント場によって起こり、ウェルの底部に位置するおよそ２００ｎｍ厚の液体層の特異的な励起が生じ、結合表面上の溶液中に過剰に存在する蛍光標識リガンドを励起しない。エバネッセント場に存在する蛍光標識リガンドのみが励起され、光子を放出する。この方法は可溶性リガンドと固定化リガンドとの結合反応のリアルタイムでの観察を可能にする。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検査に用いられる大抵の免疫アッセイは、バイオマーカーの結果を得るためにインキュベーション時間、洗浄、二次若しくは三次試薬又は溶液の添加を含む長く単調な手順を有するが、エバネッセントバイオセンサーはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイを短時間で行うことを可能にする。ＥＬＩＳＡの自動化又はビーズベースの免疫アッセイについての複雑なコストのかかる計装は、エバネッセントバイオセンサーを診断用途に用いる場合に要求されず、必要とされない。

関連する側面では、本発明は、少なくとも工程（ａ）の抗体が結合した少なくとも１つの表面を含む本発明による上記の第１の方法を行うための第１の診断試験デバイスに関する。

この側面では、表面、工程（ａ）の抗体、工程（ｂ）において使用される好適な溶解剤及び可溶化剤、並びに工程（ｄ）の蛍光標識抗体は上で規定した通りである。さらに、上で与えられる定義は本発明のこの側面にも適用される。

好ましくは本発明の上記の第１の診断試験デバイスはキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジの形態であり、好ましくはガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックで作られる。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。プラスチックキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜１００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの反応容量を有する。本発明のキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。

この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、工程（ａ）の抗体が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て測定カートリッジであり得る。

この関連で、典型的な試験カートリッジは多数のウェルを有し、多数のアッセイを並行して行うことができる。それぞれの例としては、試験の性能を制御するための陽性及び陰性の内部対照を任意に含む、幾つかの同種抗原の同時のタイピングが挙げられる。別の例は１つ又は複数の同種抗原のタイピング及び検量線の同時の確立であり得る。

別の態様では、本発明は、サンプル中のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を検出する第２の方法であって、
（ａ）少なくともヒト血小板又は血小板膜画分が結合した少なくとも１つの表面を供給する工程であって、該血小板又は血小板膜画分上に存在する対象の上記ＨＰＡが既知である工程と、
（ｂ）上記表面と上記サンプルとを接触させる工程であって、上記サンプル中に含有される上記血小板又は血小板膜画分上に存在する上記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ａ）の上記血小板又は血小板膜画分への特異的結合によって上記表面上に固定化する工程と、
（ｃ）上記表面と蛍光標識検出剤とを接触させる工程であって、該検出剤が上記血小板又は血小板膜画分上に存在する上記ＨＰＡに対するヒト抗体に特異的に結合し、該検出剤、上記サンプル中に含有されるそれぞれのヒト抗体、及び工程（ａ）の上記ヒト血小板又は血小板膜画分が表面結合複合体を形成する工程と、
（ｄ）上記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
（ｅ）上記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
（ｆ）上記血小板又は血小板膜画分上に存在する上記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ｅ）において測定される上記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
を含む、方法に関する。

この態様では、「検出」という用語は特に限定されず、対象のＨＰＡに対するヒト抗体の定性的測定のみを含むものではなく、その定量的決定を明白に含むものである。この関連で、「定性的」とは本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける対象の抗体の有無の決定を意味し、「定量的」という用語は本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける検出対象の抗体の含量又は量の測定を意味する。

本発明の上記の第２の方法による検出対象の抗体は特に限定されず、ＨＰＡに対する任意の抗体を含む。上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−２ａ、ＨＰＡ−２ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ、ＨＰＡ−５ｂ、ＨＰＡ−６ａ、ＨＰＡ−６ｂ、ＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、ＨＰＡ−８ａ、ＨＰＡ−８ｂ、ＨＰＡ−９ａ、ＨＰＡ−９ｂ、ＨＰＡ−１０ａ、ＨＰＡ−１０ｂ、ＨＰＡ−１１ａ、ＨＰＡ−１１ｂ、ＨＰＡ−１２ａ、ＨＰＡ−１２ｂ、ＨＰＡ−１３ａ、ＨＰＡ−１３ｂ、ＨＰＡ−１４ａ、ＨＰＡ−１４ｂ、ＨＰＡ−１５ａ及びＨＰＡ−１５ｂからなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される。更により好ましくは、上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される、すなわちＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂに対する抗体を検出する。

本発明の上記の第２の方法によると、１つのＨＰＡ又はそれ以上のＨＰＡに対する抗体、例えば異なるＨＰＡに対する２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の抗体が検出される。これらの実施の形態では、それに応じた数の表面を工程（ａ）において供給する、例えば２つのＨＰＡに対する抗体を検出する場合、２つの表面を供給する。さらに、工程（ａ）において供給した全ての表面を工程（ｂ）及び（ｃ）において接触させる。さらに、全ての表面結合複合体を工程（ｄ）において励起し、工程（ｅ）において測定し、それぞれの抗体の全てを工程（ｆ）において検出する。

この関連で、本発明の上記の第２の方法は多重方法として行うことができる、すなわち２つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又はそれ以上の異なる血小板又は血小板膜画分を、例えば全てのＨＰＡ又は血小板同種抗原がカバーされ得るように表面上の異なる位置にコーティングすることができる。例えば本発明によると、単一マイクロチップを、対象の全てのＨＰＡをカバーするような血小板又はそのフラグメントの選択を用いる、上で規定される第２の方法に使用することができ、これによりサンプル中の抗ＨＰＡ抗体の簡単かつ迅速な決定が可能となる。

本発明の上記の第２の方法において分析されるサンプルは、ＨＰＡに対する抗体を含有する又は含有する疑いがあるサンプルである限りにおいて特に限定されない。該サンプルは血漿及び血清からなる群から選択されるのが好ましい。

「表面を接触させる」又は「上記表面を接触させる」という用語は、この側面において使用される場合、例えば血小板若しくは血小板膜画分、ブロッキング剤、血小板−抗体複合体又は本発明の方法において生じ得る他の複合体で飽和した表面の接触に関することを意図する。例えば上記の第２の方法の工程（ｂ）では表面がヒト血小板又は血小板膜画分及び任意にブロッキング剤で飽和しており、したがって実際には接近可能でないため、サンプルが実際には表面ではなく、表面に結合した工程（ａ）のヒト血小板若しくは血小板膜画分又は任意にブロッキング剤と接触することが当業者には理解される。しかしながら上記の用語は、表面を見るだけで、任意の所与の時点で該表面に実際に何が結合するかを知ることになる本発明に取り組む実践者の巨視的観点を反映するために選ばれている。

本発明の上記の第２の方法において準備される表面は、特に限定されず、当該技術分野で既知の材料で作られる。好ましくはかかる材料はガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックである。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。上記の表面は例えばキュベット、又はマイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルのような凹形容器の内部であるのが好ましい。かかるキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜１００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの反応容量を有する。キュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、本発明の上記の第２の方法の工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て測定カートリッジであり得る。

この側面で使用される場合、「結合した」という用語は、工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分が吸収（直接吸収）によって表面に付着していることを意味するのが好ましい。しかしながら、該ヒト血小板又は血小板膜画分は架橋要素、例えば抗体、例えばｇｐＶＩ又はβ−２−ミクログロブリン等の通常の血小板表面抗原に対する抗体のようなタンパク質を介して表面に結合していてもよい。別の可能性は血小板又は血小板膜画分をビオチン化し、それらをアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした表面に結合することであり得る。上記ヒト血小板又は血小板膜画分は共有結合によって表面に結合していてもよい。これは例えばカルボジイミドでの変換によるアクリレート表面を用いて生じさせることができる。さらに、本発明の意味における「結合した」という用語は表面又は別のリガンドへの付着を含み、例えばイオン相互作用、極性相互作用又は非極性相互作用に基づく相互作用のような共有相互作用及び非共有相互作用の両方を含む。

この側面では、工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分を通常の方法によって表面上に配置することができる。例えば、上記ヒト血小板又は血小板膜画分を表面上にコーティングすることができる。この工程の後、表面を好ましくは別の溶液で処理し、上記ヒト血小板又は血小板膜画分に付着していない表面上の部位が例えばタンパク質によってブロッキングされているか又はブロッキングされる。

本発明の上記の第２の方法によると、工程（ａ）の血小板又は血小板膜画分は複合体を形成することができ、この複合体は上記血小板又は血小板膜画分に加えて、工程（ｃ）の蛍光標識検出剤及び検出対象のＨＰＡに対するヒト抗体を少なくとも含む。工程（ａ）の血小板又は血小板膜画分が表面に結合することで、上記複合体が表面に「固着し」、すなわち表面に固定され、フルオロフォアを含有する工程（ｃ）の蛍光標識検出剤でマーキングすることによって同時に検出することができる。

本発明の上記の第２の方法の工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分は、該血小板又は血小板膜画分上に存在する対象のＨＰＡが既知であるヒト血小板又は血小板膜画分が使用される限りにおいて特に限定されない。例としては、ＨＰＡ−１ａに対する抗体を検出する場合、ＨＰＡ−１ａ陽性のヒト血小板又は血小板膜画分を工程（ａ）において使用する必要がある。既知のＨＰＡを保有するヒト血小板又は血小板膜画分を得る方法は特に限定されず、当該技術分野で既知である。血小板膜画分を生成する一方法は例えば血小板を例えば化学的及び／又は機械的に溶解し、膜画分をその溶解性に基づいて水性バッファー中で精製することである。代替手段は膜をその密度に基づいて例えば超遠心分離による重力場での沈降によって精製することである。膜を調製する別の方法はスクロース密度遠心分離である。この方法では、固体スクロースを低張細胞溶解物に好ましくは７０％の濃度まで添加する。次いで、混合物を好ましくは超遠心分離機で遠心分離し、膜をスクロース溶液上に浮遊させる。膜を浮遊させる最小スクロース濃度は３５％であり、これにより７０％スクロース溶解物を５５％スクロースクッション及び５５％クッションの上の３５％クッションと重層することによって段階勾配を得ることができる。代替手段は、小膜状リポソームを超音波処理及び／又はフレンチプレスによって生成し、続いて任意にサイジング工程を行うことである。この関連で、「血小板膜画分」という用語は本明細書で使用される場合、幾つかの実施の形態では血小板由来リポソームを包含する。血小板由来リポソームを生成する又は得る手段は特に限定されず、当該技術分野で既知である。

さらに、本発明の上記の第２の方法の工程（ｃ）の蛍光標識検出剤は、上記血小板又は血小板膜画分上に存在するＨＰＡに対するヒト抗体に特異的に結合することができる限りにおいて特に限定されない。

特定の一実施の形態では、上記検出剤はヒト抗体に対する蛍光標識抗体である。この実施の形態では上記抗体は特に限定されず、好適な抗体は当該技術分野で既知であり、例えば市販のものであり得る。かかる抗体はそのアイソタイプ又は起源に関して特に限定されない。この関連で例示的な抗体は例えばネズミＩｇＧ抗体であり得る。さらに、この実施の形態では上記抗体の蛍光標識は、光源のエバネッセント場によって励起された場合に蛍光を発することができる限りにおいて特に限定されない。好適な蛍光標識は当該技術分野で既知である。好ましい実施の形態では、上記蛍光標識はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。

この関連で本発明の全態様に関して、驚くべきことに、例えば１ｍｌ当たり５μｇ〜２０μｇというむしろ高い濃度で存在する可溶性蛍光標識リガンドはＩｇＧ等の免疫グロブリンの２つの結合部位に結合せず、ひいては免疫グロブリンを不活性化せず、期待シグナルを低減又は消失させることがない。この影響が低いＩｇＧ濃度で特に予想されるという予想に反して、かかる問題は観察されなかった。したがって有利なことに、例えば溶液１ｍｌ当たり０．１μｇ〜２００μｇ、１μｇ〜１００μｇ又は２μｇ〜５０μｇ（例えば１ｍｌ当たり約１０μｇ）というむしろ高い濃度で標識抗原を使用することが可能であり、例えば１ｍｌ当たり１ｎｇ〜１５００ｎｇ、１０ｎｇ〜１０００ｎｇ若しくは２０ｎｇ〜５００ｎｇ、又はそれ以下（例えば１ｍｌ当たり約１００ｎｇ以下）という顕著に低い濃度であってもＩｇＧを検出することができる。

別の特定の実施の形態では、上記検出剤は、蛍光標識血小板又は血小板膜画分であり、該血小板又は血小板膜画分が工程（ａ）の上記血小板又は血小板膜画分と同じＨＰＡを保有する。前者は、蛍光標識されている以外は工程（ａ）の血小板又は血小板膜画分と同一であるのが好ましい。この実施の形態では、上記血小板又は血小板膜画分の蛍光標識は、光源のエバネッセント場によって励起された場合に蛍光を発することができる限りにおいて特に限定されない。好適な蛍光標識は当該技術分野で既知である。好ましい実施の形態では、上記蛍光標識は血小板膜と結合する親油性蛍光色素、例えばカルボシアニン誘導体である。好適な親油性色素及び血小板の標識化方法は特に限定されず、当該技術分野で既知である。例示的な色素はebiosienceのCellVue色素シリーズ又はMolecular Probesから入手可能な色素である。代替的には、血小板を、血小板表面抗原に対する蛍光標識抗体を介して、又は血小板若しくは血小板膜画分のビオチン化及び蛍光標識アビジン若しくはストレプトアビジンとの相互作用を介して、標識することができる。

この関連で、本発明の上記の第２の方法では、全て共通して物理的プロセス又はデタージェントの可溶化活性によって変性されていない未変性糖タンパク質が存在する、血小板若しくは血小板フラグメント又は血小板由来リポソームが主に使用されることに留意することが重要である。これは特に、本質的にコンフォメーションの制限された形態で存在することが多く、物理的処理、結合事象又は更にはデタージェント処理等の活性化の際にコンフォメーションが変化し、続いて不活性化血小板上に存在する抗原としてのその機能及び特徴の点で異なる形態の未変性糖タンパク質となる血小板糖タンパク質について重要である。

本発明の上記の第２の方法の工程（ｃ）の検出剤との関連で使用される場合、「抗体」という用語はそれぞれの抗体自体のみを指すものではなく、該抗体の任意のフラグメント及び誘導体も、該フラグメントが同じエピトープに特異的に結合する能力を保持する限りにおいて含む。それぞれのフラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。さらに、抗体又は抗体フラグメントの代わりに、エピトープに特異的に結合する能力を有する任意の他の巨大分子を使用することができる。かかる巨大分子としては、例えばヌクレオチドアプタマー、ペプチドアプタマー、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、フィロマー、ＡｄＮｅｃｔｉｎ及びプロテインＡが挙げられる。

本発明の上記の第２の方法において検出されるＨＰＡに対するヒト抗体は特に限定されず、好ましくはＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体及びＩｇＭ抗体からなる群から選択される。この関連で、上記方法によって検出される抗体は主に同種抗体である。このように、療法は工程（ａ）の適切な血小板を選ぶことによって指向することができる。しかしながら、上記抗体は工程（ａ）で示される同種抗原プロファイルと関連しない自己抗体であってもよい。それぞれの自己抗体が、通例妊娠により生じる予め形成された抗ＨＰＡ−１ａ抗体が発展して自己抗体となるＰＴＰの原因となる。

本発明の上記の第２の方法では、工程（ｂ）及び（ｃ）は続けて又は同時に行うことができる。特に、好ましい実施の形態では、表面を接触させる前に工程（ｃ）の蛍光標識検出剤を任意に希釈したサンプルと合わせることができ、それぞれの溶液を表面と接触させる場合に工程（ｂ）及び（ｃ）を同時に行う。したがって、工程（ｂ）及び（ｃ）を同時に行うためには、表面を任意に希釈したサンプルと接触させるだけでよい。

好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第２の方法は３回以上、より好ましくは２回以上の液体操作工程を必要としない。この関連で、「液体操作工程」という表現は本明細書で使用される場合、概して作用部位から及び／又は作用部位へと液体を移動、除去又は添加する任意の工程を含む。例えば本発明による液体操作工程は、例えばピペット操作によって液体をキュベット、マイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルへと添加すること、又は液体をかかるウェルから取り出すことを含む。さらに、別の好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第２の方法は任意の洗浄工程を含まない。

特に、本発明の第２の方法は好ましくは工程（ｃ）の蛍光標識検出剤等の過剰な反応物を含有する容量を除去する、及び／又は工程（ａ）の血小板又は血小板膜画分及び／又は測定対象の複合体が結合した表面を洗浄する任意の工程を必要としない。これにより、本発明の上記の第２の方法は有利に加速して所望の測定結果が迅速に得られ、この方法を行う際の廃液の蓄積及び操作上の誤りが回避される。

この関連で、本発明の更なる実施の形態では、上で規定した第２の方法は一工程方法である。本発明によると、「一工程」方法とは、概して所望の測定結果を得るために操作者が１回のみ又は多くとも２回の液体操作工程を行う必要がある複合体形成反応を１回のみ行うことを意味する。このため、最初の複合体形成後のより多くの試薬の添加等の更なる反応工程が有利に回避される。

さらに、本発明の更なる実施の形態は液体撹拌を含まない上で規定した方法に関する。この関連で、「液体撹拌」という表現は特に限定されず、自然拡散を除く液体中で生じる任意のタイプの撹拌を含む。例えば、本発明の意味における液体撹拌は振盪、ポンピング、かき混ぜ、超音波撹拌等を含む。自然発生的な拡散を除く任意の液体撹拌を回避することで、この方法を単純かつ効果的に行うことができ、これによりそれぞれの撹拌デバイスを含む複雑な技術的構成が回避される。

上で規定される第２の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｆ）において決定される結果は工程（ｂ）の開始から３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。本発明によると、定性的又は定量的な結果はサンプル及び工程（ｃ）の蛍光標識検出剤を含有する溶液を工程（ａ）の血小板又は血小板膜画分が結合した表面と接触させてから３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。好ましくは、結果は９分以内、８分以内又は７分以内に得られる。更なる例としては６分以内、５分以内又は４分以内の期間が挙げられる。

本発明の上記の第２の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｄ）の前に、上記表面を工程（ｃ）の検出剤の蛍光標識の吸収域及び／又は発光域において吸収する少なくとも１つの色素と接触させる。本発明によると容量中のフルオロフォア、すなわち表面結合複合体の一部でないフルオロフォアの励起は、表面と接触して配置される溶液に該フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域で吸収を有する少なくとも１つの色素が添加されている場合に抑制することができる。容量に添加した色素の吸収は上記フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域と調和する。個々の一色素又は色素の混合物を使用することができる。フルオロフォアの吸収域は概して使用する光源の波長と相関する。色素がこの特別な範囲に吸収極大を有する必要はなく、吸収スペクトルのショルダーは十分である可能性がある。例えば、ＡＰＣ又はＣｙ５のようなフルオロフォアを使用する場合、使用される色素は例えばＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ ＦＣＦのように６００ｎｍ〜７００ｎｍの間に吸収を有し得る。この点において使用することができる色素の別の例はＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌａｃｋ ＢＮである。添加する色素の濃度は溶液中の各々の色素の吸収係数及び放射光の周波数の両方に応じて異なる。色素の濃度は、透過光が基本的に表面から０．１ｍｍ以内で９０％超の吸光度の程度まで吸収され得るように色素に応じて調整することができる。

本発明の上記の第２の方法の工程（ｄ）〜（ｆ）によると、該方法の工程（ａ）〜（ｃ）で生成する表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起し、該複合体から発される蛍光を測定し、対象のＨＰＡに対するヒト抗体を測定される発された蛍光に基づいて検出し、陽性の蛍光シグナルは上記複合体の存在、ひいては対象のＨＰＡに対するヒト抗体の存在を示す。

この関連で「光源」という用語は本明細書で使用される場合、特に限定されず、エバネッセント場を生じ、工程（ｃ）の検出剤に結合したフルオロフォアを励起するのに適した任意の光源を含む。例えば、単色光を光源として使用してもよい。好ましくはフルオロフォアの発光を妨げず、好ましくは色素の吸収バンドと交差する波長を有する光を使用するものとする。６３５ｎｍの波長の光を発するレーザーが光源として特に好ましい。

本発明の上記の第２の方法は、欧州特許第１０７９２２６号、欧州特許第１２０４８５６号及び欧州特許第１３７１９６７号に記載されるように、結合したフルオロフォアのエバネッセント場励起を用いて生体分子を分析し、結合事象をリアルタイムに直接測定する新たな技術に基づくものである。このエバネッセント場バイオセンサーの機能原理は、表面結合分析物と溶液中のリガンドとの非共有相互作用による相互作用である。溶液中のリガンドは蛍光分子に共有結合する。蛍光分子の好ましい励起は例えばレーザーダイオードによって生じるようなコヒーレント光であり、続いて発された光子を検出する。これに好適なフルオロフォアは例えばＣｙ５、Ａｌｅｘａ色素、Ｄｙｌｉｇｈｔ又は集光性タンパク質アロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。

生化学的反応はＥＬＩＳＡウェルと形態及び寸法が同様であり、付加的な光学的実体を底部に有する小ウェルにおいて行われる。ＥＬＩＳＡと同様に、バイオセンサーウェル及びその光学的底部部分は例えばポリスチレンのような熱可塑性材料の射出成形によって作製される。ＥＬＩＳＡ法とエバネッセントバイオセンサー法との大きな違いは溶液中のリガンドの標識である。ＥＬＩＳＡでは標識は酵素であり、エバネッセント技術ではリガンドは蛍光分子で標識される。結合したフルオロフォア、すなわちエバネッセント表面に固定化された分析物に結合する溶液中の蛍光性リガンドの測定は、結合した蛍光標識リガンドのエバネッセント場励起原理を用いた特異的な励起によって達成される。結合したフルオロフォアの選択的な励起は、ウェルの底部に位置するおよそ２００ｎｍ厚の液体層の特異的な励起を生じ、結合表面上の溶液中に過剰に存在する蛍光標識リガンドを励起しない光学的構成を用いた光のエバネッセント場によって起こる。エバネッセント場に存在する蛍光標識リガンドのみが励起され、光子を放出する。この方法は可溶性リガンドと固定化リガンドとの結合反応のリアルタイムでの観察を可能にする。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検査に用いられる大抵の免疫アッセイは、バイオマーカーの結果を得るためにインキュベーション時間、洗浄、二次若しくは三次試薬又は溶液の添加を含む長く単調な手順を有するが、エバネッセントバイオセンサーはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイを短時間で行うことを可能にする。ＥＬＩＳＡの自動化又はビーズベースの免疫アッセイについての複雑なコストのかかる計装は、エバネッセントバイオセンサーを診断用途に用いる場合に要求されず、必要とされない。

関連の側面では、本発明は、本発明による上記の第２の方法を行うための第２の診断試験デバイスであって、少なくとも工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分が結合した少なくとも１つの表面を含み、該血小板又は血小板膜画分上に存在するＨＰＡが既知である、第２の診断試験デバイスに関する。

この側面では、表面、工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分、及び工程（ｃ）の蛍光標識検出剤は上で規定した通りである。さらに、上で与えられる定義は本発明のこの側面にも適用される。

驚くべきことに、また予想外に、エバネッセント場の幾何学的寸法及び典型的な血小板の寸法を考慮すると、エバネッセント場の高さが２００ｎｍであり、検知表面のコーティングに使用される血小板の直径が１μｍ〜４μｍであっても、シグナルを観察することができる。コーティングされた血小板及び血小板膜のごく少数がエバネッセント場内にあり、したがって吸収の結果として蛍光シグナルを発することができる一方で、２μｍ〜３μｍの血小板及び血小板表面抗原の大部分がエバネッセント場外にある。これにより、生物学的分析物の寸法に対するシステムのむしろ高い安定性が示される。さらに予想に反して、細胞／微生物（例えばレジオネラ菌及びサルモネラ菌等の細菌）の全体及び／又は大細胞フラグメントを本発明のアッセイにおいて使用することが効果的に可能である。これによりはるかに容易なサンプル調製が可能となり、許容可能な分析物に関してより多用途のシステムが提供される。

さらに、コーティングされた血小板及び血小板フラグメントが、ＥＬＩＳＡ試験の標識として一般に使用される酵素であるペルオキシダーゼ及びホスファターゼ等の酵素及び酵素活性に富んでいることにも留意すべきである。これらの内因性酵素は酵素標識由来のシグナルと重なり、望ましくないバックグラウンドシグナルを生じる。しかしながら、（例えば波長６３５ｎｍでの）エバネッセント励起を用いた蛍光検出により、これらの汚染酵素に起因する任意の問題が全て回避される。

本発明の上記の第２の診断試験デバイスはキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジの形態であり、好ましくはガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックで作られる。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。プラスチックキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜１００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの反応容量を有する。本発明のキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。

この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、工程（ａ）のヒト血小板又は血小板膜画分が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て測定カートリッジであり得る。

この関連で、典型的な試験カートリッジは多数のウェルを有し、多数のアッセイを並行して行うことができる。

本発明の更なる概略的な実施の形態によると、上述の血小板コーティング試験カートリッジは、該コーティング試験カートリッジに対してスクロース洗浄工程を用い、続いて任意に風乾工程をおこなうことによって保存される。驚くべきことに、この手順により極めてロバストな試験がもたらされる。

別の態様では、本発明は、サンプル中のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を検出する第３の方法であって、
（ａ）少なくとも１回の血小板抗原のモノクローナル抗体固定化（ＭＡＩＰＡ）アッセイを行い、対象のＨＰＡを保有する少なくとも１つの血小板糖タンパク質、該少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体、及び上記ＨＰＡに対する対象のヒト抗体で作られる少なくとも１つの３分子複合体を生成する工程であって、該ヒト抗体が上記サンプル中に含有される工程と、
（ｂ）上記少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体に対する抗体が少なくとも結合した少なくとも１つの表面を供給する工程と、
（ｃ）上記表面と上記３分子複合体とを接触させる工程であって、該３分子複合体を工程（ｂ）の上記抗体への特異的結合によって該表面に固定化する工程と、
（ｄ）上記表面とヒト抗体に対する蛍光標識抗体とを接触させる工程であって、該蛍光標識抗体、上記３分子複合体及び工程（ｂ）の上記抗体が表面結合複合体を形成する工程と、
（ｅ）上記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
（ｆ）上記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
（ｇ）上記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ｆ）において測定される上記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
を含む、方法に関する。

この側面では、「検出」という用語は特に限定されず、対象のＨＰＡに対するヒト抗体の定性的測定のみを含むものではなく、その定量的決定を明白に含むものである。この関連で、「定性的」とは本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける対象の抗体の有無の決定を意味し、「定量的」という用語は本明細書で使用される場合、特定のサンプルにおける検出対象の抗体の含量又は量の測定を意味する。

本発明の上記の第３の方法による検出対象の抗体は特に限定されず、ＨＰＡに対する任意の抗体を含む。上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−２ａ、ＨＰＡ−２ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ、ＨＰＡ−５ｂ、ＨＰＡ−６ａ、ＨＰＡ−６ｂ、ＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、ＨＰＡ−８ａ、ＨＰＡ−８ｂ、ＨＰＡ−９ａ、ＨＰＡ−９ｂ、ＨＰＡ−１０ａ、ＨＰＡ−１０ｂ、ＨＰＡ−１１ａ、ＨＰＡ−１１ｂ、ＨＰＡ−１２ａ、ＨＰＡ−１２ｂ、ＨＰＡ−１３ａ、ＨＰＡ−１３ｂ、ＨＰＡ−１４ａ、ＨＰＡ−１４ｂ、ＨＰＡ−１５ａ及びＨＰＡ−１５ｂからなる群から選択されるのが好ましい。より好ましくは、上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ、ＨＰＡ−１ｂ、ＨＰＡ−３ａ、ＨＰＡ−３ｂ、ＨＰＡ−４ａ、ＨＰＡ−４ｂ、ＨＰＡ−５ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される。更により好ましくは、上記ＨＰＡはＨＰＡ−１ａ及びＨＰＡ−５ｂからなる群から選択される、すなわちＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂに対する抗体を検出する。

本発明の上記の第３の方法によると、１つのＨＰＡ又はそれ以上のＨＰＡに対する抗体、例えば異なるＨＰＡに対する２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の抗体が検出される。これらの実施の形態では、２回以上のＭＡＩＰＡアッセイを工程（ａ）において行い、それに応じた数の表面を工程（ｂ）において供給する、例えば２つのＨＰＡに対する抗体を検出する場合、２つの表面を供給する。さらに、工程（ｂ）において準備した全ての表面を工程（ｃ）及び（ｄ）において接触させる。さらに、全ての表面結合複合体を工程（ｅ）において励起し、工程（ｆ）において測定し、それぞれの抗体の全てを工程（ｇ）において検出する。

ＭＡＩＰＡアッセイは自己抗体の検出にも有用であり、これも本発明の範囲内である。患者血小板を、単にマウスモノクローナル抗体で感作した後、３分子複合体を洗浄及び可溶化することによって結合ヒトＩｇＧについて検査する。

代替的には、１つの血小板糖タンパク質に対する１つの抗体だけでなく、それぞれの数の血小板糖タンパク質に対する２つ、３つ、４つ又はそれ以上の抗体を使用するＭＡＩＰＡアッセイを工程（ａ）において行うことができる。例としては、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩａＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ及びＨＬＡ／β−２−ミクログロブリンに対する抗体を１回の反応で使用することができ、該抗体、全てのそれぞれの糖タンパク質及び該糖タンパク質上に存在するＨＰＡに対するサンプル中に含有される全てのヒト抗体の３分子複合体が１回の反応で形成される。そして、これらの３分子複合体を本発明の上記の第３の方法において更に分析することができる。

この関連で、ＭＡＩＰＡアッセイ及び該アッセイを用いてそれぞれの３分子複合体を生成する方法は特に限定されず、当該技術分野で既知である。好ましくは、上記ＭＡＩＰＡアッセイは、
（ａ１）ヒト血小板又は血小板膜画分と、少なくとも１つのＨＰＡを保有する少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体とを接触させる工程と、
（ａ２）上記ヒト血小板又は血小板膜画分とサンプルとを接触させる工程であって、該サンプル中に含有される上記ＨＰＡに対するヒト抗体を該ＨＰＡに結合する工程と、
（ａ３）血小板を使用する場合に該血小板を溶解する工程と、
（ａ４）上記少なくとも１つの血小板糖タンパク質、上記ヒト抗体及び工程（ａ１）の上記抗体で作られる少なくとも１つの３分子複合体を可溶化する工程と、
を含む。

この関連で、血小板の溶解及び少なくとも１つの３分子複合体の可溶化は、本発明の第１の方法で血小板の溶解及び膜タンパク質の可溶化について上記されるように行うことができる。

さらに、好ましい実施の形態では、工程（ａ１）の抗体及び工程（ａ２）のヒト抗体は異なる特異性を有する、すなわち異なるエピトープに結合する。

本発明の上記の第３の方法において分析されるサンプルは、ＨＰＡに対する抗体を含有する又は含有する疑いがあるサンプルである限りにおいて特に限定されない。該サンプルは血漿及び血清からなる群から選択されるのが好ましい。

「表面を接触させる」又は「上記表面を接触させる」という用語は、この側面において使用される場合、例えば抗体、ブロッキング剤又は本発明の方法において生じ得る複合体で飽和した表面の接触に関することを意図する。例えば上記の第３の方法の工程（ｃ）では表面が抗体及び任意にブロッキング剤で飽和しており、したがって実際には接近可能でないため、３分子複合体が実際には表面ではなく、表面に結合した工程（ｂ）の抗体又は任意にブロッキング剤と接触することが当業者には理解される。しかしながら上記の用語は、表面を見るだけで、任意の所与の時点で該表面に実際に何が結合するかを知ることになる本発明に取り組む実践者の巨視的観点を反映するために選ばれている。

本発明の上記の第３の方法において供給される表面は、特に限定されず、当該技術分野で既知の材料で作られる。好ましくはかかる材料はガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックである。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。上記の表面は例えばキュベット、又はマイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルのような凹形容器の内部であるのが好ましい。かかるキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜２００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの反応容量を有する。キュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、本発明の上記の第３の方法の工程（ｂ）の抗体が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て測定カートリッジであり得る。

この側面で使用される場合、「結合した」という用語は、工程（ｂ）の抗体が吸収（直接吸収）によって表面に付着していることを意味するのが好ましい。しかしながら、該抗体は架橋要素、例えば更なる抗体又は抗原等のタンパク質を介して表面に結合していてもよい。上記抗体は共有結合によって表面に結合していてもよい。これは例えばカルボジイミドでの変換によるアクリレート表面を用いて生じさせることができる。さらに、本発明の意味における「結合した」という用語は表面又は別のリガンドへの付着を含み、例えばイオン相互作用、極性相互作用又は非極性相互作用に基づく相互作用のような共有相互作用及び非共有相互作用の両方を含む。

この側面では、工程（ｂ）の抗体を通常の方法によって表面上に配置することができる。例えば、上記抗体を表面上にコーティングすることができる。この工程の後、表面を好ましくは別の溶液で処理し、上記抗体に付着していない表面上の部位が例えば別のタンパク質によってブロッキングされているか又はブロッキングされる。

本発明の上記の第３の方法によると、工程（ｂ）の抗体は複合体を形成することができ、この複合体は該抗体に加えて、工程（ａ）で生成する３分子複合体及び工程（ｄ）の蛍光標識抗体を少なくとも含む。工程（ｂ）の抗体が表面に結合することで、工程（ａ）で生成する３分子複合体を含む複合体が表面に「固着し」、すなわち表面に固定され、フルオロフォアを含有する工程（ｄ）の抗体でマーキングすることによって同時に検出することができる。

本発明の上記の第３の方法の工程（ｂ）の抗体は、上記少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体に対する限りにおいて、すなわち該抗体に特異的に結合する限りにおいて特に限定されない。好適な抗体は当該技術分野で既知であり、例えば市販のものであり得る。かかる抗体はそのアイソタイプ又は起源に関して特に限定されない。この関連で例示的な抗体は例えばネズミＩｇＧ抗体であり得る。

さらに、本発明の上記の第３の方法の工程（ｄ）の蛍光標識抗体は、ヒト抗体に対する限りにおいて、すなわち該ヒト抗体に特異的に結合する限りにおいて特に限定されない。好適な抗体はそのアイソタイプ又は起源に関して特に限定されず、当該技術分野で既知である。さらに、上記抗体の蛍光標識は、光源のエバネッセント場によって励起された場合に蛍光を発することができる限りにおいて特に限定されない。好適な蛍光標識は当該技術分野で既知である。好ましい実施の形態では、上記蛍光標識はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。

本発明の上記の第３の方法の特定の実施の形態では、工程（ｂ）の抗体及び工程（ｄ）の抗体は交換することができる、すなわち工程（ｂ）の抗体はヒト抗体に対するものであり、工程（ｄ）の蛍光標識抗体は少なくとも１つの糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体に対するものである。この特定の実施の形態では、上記抗体及び蛍光標識は上で規定した通りである。

本発明の上記の第３の方法の上記の工程（ｂ）、（ｄ）及び（ａ１）の抗体との関連で使用される場合、「抗体」という用語はそれぞれの抗体自体のみを指すものではなく、該抗体の任意のフラグメント及び誘導体も、該フラグメントが同じエピトープに特異的に結合する能力を保持する限りにおいて含む。それぞれのフラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。さらに、抗体又は抗体フラグメントの代わりに、エピトープに特異的に結合する能力を有する任意の他の巨大分子を使用することができる。かかる巨大分子としては、例えばヌクレオチドアプタマー、ペプチドアプタマー、ナノボディ、アフィボディ、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、フィロマー、ＡｄＮｅｃｔｉｎ及びプロテインＡが挙げられる。

本発明の上記の第３の方法において検出されるＨＰＡに対するヒト抗体は特に限定されず、好ましくはＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体及びＩｇＭ抗体からなる群から選択される。

本発明の上記の第３の方法では、工程（ｃ）及び（ｄ）は続けて又は同時に行うことができる。特に、好ましい実施の形態では、表面を接触させる前に工程（ｄ）の蛍光標識抗体を工程（ａ）において形成される少なくとも１つの３分子複合体を含有する溶液と合わせることができ、それぞれの溶液を表面と接触させる場合の工程（ｃ）及び（ｄ）を同時に行う。したがって、工程（ｃ）及び（ｄ）を同時に行うためには、表面を工程（ａ）において形成される少なくとも１つの３分子複合体を含有する溶液と接触させるだけでよい。

好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第３の方法は３回以上、より好ましくは２回以上の液体操作工程を必要としない。この関連で、「液体操作工程」という表現は本明細書で使用される場合、概して作用部位から及び／又は作用部位へと液体を移動、除去又は添加する任意の工程を含む。例えば本発明による液体操作工程は、例えばピペット操作によって液体をキュベット、マイクロタイタープレート若しくは試験カートリッジのウェルへと添加すること、又は液体をかかるウェルから取り出すことを含む。さらに、別の好ましい実施の形態によると、本発明の上記の第３の方法は任意の洗浄工程を含まない。

特に、本発明の第３の方法は好ましくは工程（ｄ）の蛍光標識抗体等の過剰な反応物を含有する容量を除去する、及び／又は工程（ｂ）の抗体及び／又は測定対象の複合体が結合した表面を洗浄する任意の工程を必要としない。これにより、本発明の上記の第３の方法は有利に加速して所望の測定結果が迅速に得られ、この方法を行う際の廃液の蓄積及び操作上の誤りが回避される。

この関連で、本発明の更なる実施の形態では、上で規定した第３の方法は一工程方法である。本発明によると、「一工程」方法とは、概して所望の測定結果を得るために操作者が１回のみ又は多くとも２回の液体操作工程を行う必要がある複合体形成反応を１回のみ行うことを意味する。このため、最初の複合体形成後のより多くの試薬の添加等の更なる反応工程が有利に回避される。

さらに、本発明の更なる実施の形態は液体撹拌を含まない上で規定した方法に関する。この関連で、「液体撹拌」という表現は特に限定されず、自然拡散を除く液体中で生じる任意のタイプの撹拌を含む。例えば、本発明の意味における液体撹拌は振盪、ポンピング、かき混ぜ、超音波撹拌等を含む。自然発生的な拡散を除く任意の液体撹拌を回避することで、この方法を単純かつ効果的に行うことができ、これによりそれぞれの撹拌デバイスを含む複雑な技術的構成が回避される。

上で規定される第３の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｇ）において決定される結果は工程（ｃ）の開始から３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。本発明によると、定性的又は定量的な結果はサンプル及び工程（ｄ）の蛍光標識抗体を含有する溶液を工程（ｂ）の抗体が結合した表面と接触させてから３０分以内、好ましくは２０分以内、より好ましくは１０分以内に得られる。好ましくは、結果は９分以内、８分以内又は７分以内に得られる。更なる例としては６分以内、５分以内又は４分以内の期間が挙げられる。

本発明の上記の第３の方法の更なる実施の形態によると、工程（ｅ）の前に、上記表面を工程（ｄ）の抗体の蛍光標識の吸収域及び／又は発光域において吸収する少なくとも１つの色素と接触させる。本発明によると容量中のフルオロフォア、すなわち表面結合複合体の一部でないフルオロフォアの励起は、表面と接触して配置される溶液に該フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域で吸収を有する少なくとも１つの色素が添加されている場合に抑制することができる。容量に添加した色素の吸収は上記フルオロフォアの吸収域及び／又は発光域と調和する。個々の一色素又は色素の混合物を使用することができる。フルオロフォアの吸収域は概して使用する光源の波長と相関する。色素がこの特別な範囲に吸収極大を有する必要はなく、吸収スペクトルのショルダーは十分である可能性がある。例えば、ＡＰＣ又はＣｙ５のようなフルオロフォアを使用する場合、使用される色素は例えばＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ ＦＣＦのように６００ｎｍ〜７００ｎｍの間に吸収を有し得る。この点において使用することができる色素の別の例はＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌａｃｋ ＢＮである。添加する色素の濃度は溶液中の各々の色素の吸収係数及び放射光の周波数の両方に応じて異なる。色素の濃度は、透過光が基本的に表面から０．１ｍｍ以内で９０％超の吸光度の程度まで吸収され得るように色素に応じて調整することができる。

本発明の上記の第３の方法の工程（ｅ）〜（ｇ）によると、該方法の工程（ａ）〜（ｄ）で生成する表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起し、該複合体から発される蛍光を測定し、対象のＨＰＡに対するヒト抗体を測定される発された蛍光に基づいて検出し、陽性の蛍光シグナルは上記複合体の存在、ひいては対象のＨＰＡに対するヒト抗体の存在を示す。

この関連で「光源」という用語は本明細書で使用される場合、特に限定されず、エバネッセント場を生じ、工程（ｄ）の抗体に結合したフルオロフォアを励起するのに適した任意の光源を含む。例えば、単色光を光源として使用してもよい。好ましくはフルオロフォアの発光を妨げず、好ましくは色素の吸収バンドと交差する波長を有する光を使用するものとする。６３５ｎｍの波長の光を発するレーザーが光源として特に好ましい。

本発明の上記の第３の方法は、欧州特許第１０７９２２６号、欧州特許第１２０４８５６号及び欧州特許第１３７１９６７号に記載されるように、結合したフルオロフォアのエバネッセント場励起を用いて生体分子を分析し、結合事象をリアルタイムに直接測定する新たな技術に基づくものである。このエバネッセント場バイオセンサーの機能原理は、表面結合分析物と溶液中のリガンドとの非共有相互作用による相互作用である。溶液中のリガンドは蛍光分子に共有結合する。蛍光分子の好ましい励起は例えばレーザーダイオードによって生じるようなコヒーレント光であり、続いて発された光子を検出する。これに好適なフルオロフォアは例えばＣｙ５、Ａｌｅｘａ色素、Ｄｙｌｉｇｈｔ又は集光性タンパク質アロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。

生化学的反応はＥＬＩＳＡウェルと形態及び寸法が同様であり、付加的な光学的実体を底部に有する小ウェルにおいて行われる。ＥＬＩＳＡと同様に、バイオセンサーウェル及びその光学的底部部分は例えばポリスチレンのような熱可塑性材料の射出成形によって作製される。ＥＬＩＳＡ法とエバネッセントバイオセンサー法との大きな違いは溶液中のリガンドの標識である。ＥＬＩＳＡでは標識は酵素であり、エバネッセント技術ではリガンドは蛍光分子で標識される。結合したフルオロフォア、すなわちエバネッセント表面に固定化された分析物に結合する溶液中の蛍光性リガンドの測定は、結合した蛍光標識リガンドのエバネッセント場励起原理を用いた特異的な励起によって達成される。結合したフルオロフォアの選択的な励起は、ウェルの底部に位置するおよそ２００ｎｍ厚の液体層の特異的な励起を生じ、結合表面上の溶液中に過剰に存在する蛍光標識リガンドを励起しない光学的構成を用いた光のエバネッセント場によって起こる。エバネッセント場に存在する蛍光標識リガンドのみが励起され、光子を放出する。この方法は可溶性リガンドと固定化リガンドとの結合反応のリアルタイムでの観察を可能にする。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断検査に用いられる大抵の免疫アッセイは、バイオマーカーの結果を得るためにインキュベーション時間、洗浄、二次若しくは三次試薬又は溶液の添加を含む長く単調な手順を有するが、エバネッセントバイオセンサーはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイを短時間で行うことを可能にする。ＥＬＩＳＡの自動化又はビーズベースの免疫アッセイについての複雑なコストのかかる計装は、エバネッセントバイオセンサーを診断用途に用いる場合に要求されず、必要とされない。

関連の側面では、本発明は、少なくとも工程（ｂ）の抗体が結合した少なくとも１つの表面を含む本発明による上記の第３の方法を行うための第３の診断試験デバイスに関する。

この側面では、表面、工程（ｂ）の抗体及び工程（ｄ）の蛍光標識抗体は上で規定した通りである。さらに、上で与えられる定義は本発明のこの側面にも適用される。

本発明の上記の第３の診断試験デバイスはキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジの形態であり、好ましくはガラス又はプラスチック、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリシクロオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート及び／又はこれらのプラスチックの混合物及びブレンド等のプラスチックで作られる。原則として、可視範囲の光を基本的に吸収しない任意のプラスチックが好適である。一実施の形態では、プラスチックは例えば散乱光に起因する発光を取り除くために明るい青色に染色されていてもよい。プラスチックキュベット、マイクロタイタープレート及び試験カートリッジは射出成形によって安価に得ることができ、好ましくは１μｌ〜４００μｌ、特に好ましくは５μｌ〜２００μｌ、最も好ましくは１０μｌ〜４０μｌの反応容量を有する。本発明のキュベット、マイクロタイタープレート又は試験カートリッジは一体となっているのが好ましい。

この関連で、「試験カートリッジ」という表現は特に限定されず、工程（ａ）の抗体が結合し、それぞれの溶液又は反応物と接触し得る表面を与えるために使用することができる任意の物体を含む。例えば試験カートリッジは、特定の測定要件に対して予め調整した多数の完全に分離した測定ウェルを含む使い捨て測定カートリッジであり得る。

この関連で、典型的な試験カートリッジは多数のウェルを有し、多数のアッセイを並行して行うことができる。

最後の側面では、本発明は、サンプル中の（ｉ）サンプル中に含有されるヒト血小板上の少なくとも１つのヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）、及び（ｉｉ）ヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を同時検出する第４の方法であって、
（ａ）本発明の上記の第１の方法を行う工程と、
（ｂ）本発明の上記の第２又は第３の方法を行う工程と、
を含む、方法に関する。

この側面では、上記方法について上に示す全ての好ましい実施の形態及び定義が適用される。

本願では、エバネッセントバイオセンサー技術に基づく抗体アッセイのための診断血小板抗原タイピングの方法及び試験を記載した。本発明は、わずか１回又は２回の単純な操作で行われ、１０分以内に結果をもたらす血小板表現型検査アッセイ及び抗体アッセイを提供する。本発明は精緻な計装、又は実践者側での血小板免疫学の深い知識を必要としない。アッセイフォーマットは独自の製品であり、１０分以内にエンドユーザーに結果を与えるものである。幾つかの実施の形態によるアッセイを行うためには、利用者はサンプルを添加し、バイオセンサーリーダーで測定するだけでよい。これが唯一必要とされる手作業の工程であり、洗浄及びピペット操作等の任意の更なる操作なしに結果を利用可能である。

抗原タイピングアッセイ及び抗体検出アッセイの試験フォーマットを示す図である。（Ａ）抗原タイピングアッセイのアッセイフォーマット。抗糖タンパク質抗体（ａ）をウェルの底部のセンサー表面に固定化する。サンプルに由来する血小板膜糖タンパク質（ｂ）を、一工程アッセイにおいてフルオロフォア（星印）で共有結合的に修飾された糖タンパク質対立遺伝子特異的試薬（ｃ）と結合する。（Ｂ）一工程及び二工程抗体アッセイのアッセイフォーマット。糖タンパク質（ｄ）を保有する血小板（ａ）をセンサー表面に固定化し、患者サンプル中の抗体（ｂ）と反応させる。これらを蛍光抗免疫グロブリン抗体（ｃ）で検出する。（Ｃ）代替的な一工程及び二工程抗体アッセイのアッセイフォーマット。糖タンパク質（ｄ）を保有する血小板（ａ）をセンサー表面に固定化し、患者サンプル中の抗体（ｂ）と反応させる。これらを同じ糖タンパク質（ｄ）を保有する蛍光標識血小板（ｃ）で検出する。 ＭＡＩＰＡベースアッセイのアッセイスキームを示す図である。ＭＡＩＰＡアッセイは、血小板とヒト血漿由来の抗糖タンパク質抗体及びＩｇＧとを結合する細胞アッセイパート（Ａ）並びに検出パート（Ｂ）を有する。（Ａ）血小板糖タンパク質（ｂ）を有する血小板（ａ）を分析対象のヒト血漿サンプル（ｅ）と接触させる。ヒト抗血小板抗体（ｄ）の結合が起こり、抗血小板抗体が低減又は枯渇した血清（ｆ）が残る。過剰なヒト血漿を手作業で洗い流す。続いて、血小板表面上の上記糖タンパク質に結合する検査対象の血小板糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｃ）を添加する。通例、４つの異なる糖タンパク質に対する４回の反応をｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩａＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ及びＨＬＡ／β−２−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体を用いて行う。複合体が形成された後、（ｂ）及び（ｃ）が相互作用し、過剰な非結合モノクローナル抗体（ｃ）を手作業で洗い流す。溶解バッファーを含有するデタージェントを使用することで、糖タンパク質特異的抗体（ｃ）、血小板糖タンパク質（ｂ）及びヒト免疫グロブリン（ｄ）からなる３分子複合体を可溶化する。（Ｂ）一工程エバネッセントアッセイにおける３分子複合体（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の検出。抗マウスＩｇＧ抗体（ｇ）をバイオセンサーウェルの底部に固定化し、３分子分析物複合体（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）とインキュベートし、抗ヒト免疫グロブリンフルオロフォアコンジュゲート（ｈ）で検出する。 ＨＰＡ−１ａタイピングアッセイによって得られる結果を示す図である。ＨＰＡ−１ａ陽性及びＨＰＡ−１ａ陰性の血液サンプルを、市販のＨＰＡ−１ａタイピングアッセイ（DiaMed，Cressier FR，Switzerland）（ＯＤ ６３０ｎｍ、ｘ軸）及び本発明によるエバネッセントバイオセンサーアッセイ（蛍光ｄＣ ｃｐｓ、ｙ軸）の両方で試験した。 ＨＰＡ−５ｂタイピングアッセイによって得られる結果を示す図である。既知のＨＰＡ−５ｂ陽性及びＨＰＡ−５ｂ陰性の血液サンプルを、本発明によるエバネッセントバイオセンサーアッセイ（蛍光ｄＣ ｃｐｓ、ｙ軸）で試験した。 ＥＬＩＳＡベースＭＡＩＰＡアッセイ及び本発明のＭＡＩＰＡアッセイを示す図である。図５は、ＥＬＩＳＡ検出シグナル（ｘ軸の光学密度ＯＤ ６３０ｎｍ）及び本発明によるエバネッセントバイオセンサー結果（ｙ軸の蛍光ｄｃ ｃｐｓ）のいずれかによるＭＡＩＰＡアッセイの比較を示す。 ＥＬＩＳＡベースＭＡＩＰＡアッセイ及び本発明のＭＡＩＰＡアッセイを示す図である。図６は、４つの糖タンパク質を個々のチューブ及び本発明によるエバネッセントバイオセンサーＭＡＩＰＡで試験するＭＡＩＰＡアッセイの比較を示す。エバネッセントバイオセンサー試験については、４つの個々の血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩａＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ及びＨＬＡと反応する４つの異なるモノクローナル抗体を１つのチューブで合わせ、全ての考え得る同種抗原を表す血小板のプールと結合させた。検出を先に記載したようにエバネッセントバイオセンサーで行う。ＥＬＩＳＡ検出シグナル（ｘ軸の光学密度ＯＤ ６３０ｎｍ）及びバイオセンサー結果（ｙ軸の蛍光ｄｃ ｃｐｓ）。 二工程抗体アッセイを示す図である。図１Ｂに示すスキームに従って行った二工程抗体アッセイの結果。ＨＰＡ−１ａ陽性又はＨＰＡ−１ａ陰性の表現型を有する血小板（各々の２つのサンプル）をバイオセンサー表面にコーティングし、様々な濃度の希釈抗ヒトＨＰＡ−１ａモノクローナル抗体と反応させた。ウェルを洗浄し、結合したヒト化抗ＨＰＡ−１ａ抗体を二次抗ヒトＩｇＧフルオロフォアコンジュゲートで検出する。ｘ軸に抗ＨＰＡ−１ａ濃度、ｙ軸に蛍光ｄＣ ｃｐｓとして観察されたシグナルを示す。 二工程抗体アッセイを示す図である。図８は図１Ｂに示すスキームに従い、図７に示す例と本質的に同一の二工程抗体アッセイの結果を示す。６つのヒト血漿サンプルを、エバネッセントバイオセンサーにコーティングしたＨＰＡ−１ａ陽性の血小板及びＨＰＡ−１ａ陰性の血小板に対して試験した。ｘ軸は個々の血漿を示し、得られるシグナルをｙ軸にプロットする。 一工程抗体アッセイを示す図である。図９は洗浄工程を省略し、図７に示す二工程アッセイを一工程アッセイとして行う同一のアッセイフォーマットを示す。ＨＰＡ１ａ＋５ｂ＋血小板、ＨＰＡ１ａ−５ｂ−血小板及び０と示す非コーティング対照の３回のコーティングを行った。得られるシグナルをｙ軸に蛍光ｄｃ ｃｐｓとして示す。 トキソプラズマ症（Toxoplasmose）抗体に対する二重抗原抗体サンドイッチアッセイを示す図である。この試験はトキソプラズマ症抗原をバイオセンサー表面にコーティングすることによって行い、トキソプラズマ症抗原の別のアリコートを溶液中のＡＰＣで標識する。ＩｇＧは生体機能的であり、一方のアームが結合したトキソプラズマ症抗原と反応し、個々のＩｇＧの他方のアームがＡＰＣ標識抗原と反応する。このため、カートリッジの形成とともにシグナルが生じる。驚くべきことに、これは一工程アッセイとして作用する。トキソプラズマ症抗体標準の滴定をｘ軸、１０分の蛍光シグナルをｙ軸に示す。必要に応じて約５ＩＵに下がった感度が見られる。

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これに限定されるものではない。

実施例１：
ＨＰＡ−１ａタイピングアッセイ
ＨＰＡ−１ａエバネッセントバイオセンサー試験を、抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａ抗体コーティング表面（抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａモノクローナル抗体ＲＦＧＰ５６）、１部のＥＤＴＡ抗凝固処理血、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした抗ＨＰＡ−１ａ特異的抗体を含有する２部の検出混合物を反応させることによって行う。

エバネッセントバイオセンサーチップをＲＦＧＰ５６のＰＢＳ溶液でコーティングする。コーティングを、ＲＦＧＰ５６原液（stock solution）を１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液まで希釈し、この溶液３０μｌを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートすることによって行う。次いで、コーティング溶液を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、最後に５０μｌのブロッキング溶液をウェルに添加する。ブロッキング溶液はＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液であり、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する。ブロッキングは室温でおよそ１時間であり、ブロッキング溶液を除去し、測定対象のサンプル溶液を添加することによって終了させる。１部のＥＤＴＡ血を４．５％ＢＳＡ、３％スクロース、１５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０８％Ｔｗｅｅｎ２０、０．９％ＮＰ４０、０．７５％ＰＥＧ６０００、１．５％ＰＶＰＫ９０、０．２ｍｇ／ｍｌのＩＩＲ及び０．０６％Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌａｃｋ ＢＮを添加したＰＢＳバッファー中７．５μｇ／ｍｌの抗ＨＰＡ−１ａ ＡＰＣを含有する２部の検出バッファーと混合した。２５μｌの混合物をコーティングウェルに入れ、蛍光を欧州特許第１０７９２２６号、欧州特許第１２０４８５６号、欧州特許第１３７１９６７号に記載のエバネッセントバイオセンサー機器及びデバイスを用い、１０分間にわたってリアルタイムで測定した。

測定された光子の増加は整数として与えられ、１つの特定のウェルについて反応の最初の１０分間に計数された光子の増加である。１つのウェルにおいて測定された光子の増加は、０秒時から６００秒時までの光子の変化とし、測定単位カウント毎秒（又は「ｃｐｓ」と省略される）を用いる「デルタカウント値」（ｄｃ）として与えられる。１つの特定のウェルから放出される光子を一定の時間間隔の生化学的反応において測定し、各測定は１秒間であるが、測定点に１０ミリ秒〜２０秒の間の任意の値を使用してもよい。測定された光子をグラフのｙ軸にｘ軸の時間に対してプロットし、この手順を各ウェルについて個別に行う。次いで、線形回帰曲線をリーダー機器のソフトウェアによって作成し、１０分間の観察時間当たりの光子の平均増加を自動的に算出する。

１秒間に測定される光子数である２３０９９カウント毎秒（ｃｐｓ）のｄｃは、１０分間の測定中にこの特定のウェルについて測定された光子の数が２３０９９ｃｐｓ増加していることを意味する。経時的な光子の増加であるｄｃ（ｃｐｓ）は、ここではサンプル中の分析物の量の尺度である。

比較のために、血液サンプルをDiaMed（Cressier FR，Switzerland）のＨＰＡ−１ａタイピングアッセイによって分析した。図３に示す結果は、ｘ軸にＯＤ６３０ｎｍとしてDiaMedのＨＰＡ−１ａタイピングアッセイによる結果、ｙ軸にエバネッセントバイオセンサーで得られる蛍光結果をプロットすることによって得られる。既知の表現型を有する２００個を超える血液サンプルを試験したが、不一致は観察されなかった。

実施例２：
ＨＰＡ−５ｂタイピングアッセイ
本発明によるエバネッセントバイオセンサーシステムを用いた単純なＨＰＡ−５ｂタイピングアッセイを、抗ｇｐＩａＩＩａ抗体コーティング表面（抗ｇｐＩａＩＩａモノクローナル抗体ＡＫ７）、１部のＥＴＤＡ抗凝固処理血、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした抗ＨＰＡ−５ｂ特異的抗体を含有する２部の検出混合物を反応させることによって行う。方法及びバッファーはＨＰＡ−１ａタイピングについての実施例１と同じであった。

ＨＰＡ ５ａ及び５ｂについて既知の表現型を有する１００個を超える血液サンプルを試験し、結果を図４に示す。ＨＰＡ−５ａａ陰性血小板とＨＰＡ−５ａｂ陽性血小板との間に明らかな解離が見られた。既知の表現型とエバネッセントバイオセンサーアッセイによって得られる結果との間に不一致は観察されなかった。ＨＰＡ−５ｂｂ及びＨＰＡ５ａａ血小板を用いた試験によってアッセイの特異性を確認する。

実施例３：
エバネッセント検出を用いたＭＡＩＰＡアッセイ
ＭＡＩＰＡアッセイは、図２Ａに略述されるような抗糖タンパク質抗体及び検出対象のヒト血漿又は血清由来の抗体で血小板を感作する細胞アッセイパートと、図２Ｂに示される検出パートとを有する。

血小板糖タンパク質（ｂ）を有する血小板（ａ）を、検査対象の血小板糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（ｃ）と反応させる。通例、４つの異なる糖タンパク質に対する４回の反応をｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩａＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ及びＨＬＡ／β−２−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗体を用いて行う。（ｂ）及び（ｃ）の相互作用によって複合体が形成された後、分析対象のヒト血漿又は血清サンプル（ｅ）を添加すると、ヒト抗ＨＰＡ抗体（ｄ）の結合が起こり、抗血小板抗体が低減又は枯渇した血清（ｆ）が残る。過剰なヒト血漿を手作業で洗い流す。溶解バッファーを含有するデタージェントを使用することで、糖タンパク質特異的抗体（ｃ）、血小板糖タンパク質（ｂ）及びヒト免疫グロブリン（ｄ）で作られる３分子複合体を可溶化する。

次いで、３分子複合体（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の検出を本発明による一工程エバネッセントアッセイにおいて行う。抗マウスＩｇＧ抗体（ｇ）を実施例１に記載のように１０μｇ／ｍｌでバイオセンサーウェルの底部に固定化し、過剰な試薬を洗い流し、続いてブロッキング工程を行う。次いでコーティングされた抗体の安定性を改善するために、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、続いて２％スクロース溶液で２回洗浄する。次いで、バイオセンサーウェルを風乾し、使用するまで乾かしておく。試験を行うために、抗体でコーティングした血小板を２％ＢＳＡ、０．２５％ＰＶＰ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．９％ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ、０．０９％ＮａＮ_３を含有するバッファーで可溶化する。次いで、溶解物に０．０４％Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌａｃｋ ＢＮ及び５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ ＡＰＣコンジュゲート（Jackson）を添加し、蛍光バイオセンサー機器において１０分間測定する。

１００個を超える血清サンプルを、ＥＬＩＳＡ検出を用いた従来のＭＡＩＰＡ又は本発明によるエバネッセントバイオセンサー検出によって行われる４００個をはるかに上回る個々の測定点で測定した。ｘ軸に確立されたＭＡＩＰＡアッセイによる結果、ｙ軸にエバネッセントバイオセンサーによって得られる蛍光結果をプロットした図５に結果を示す。２つの方法の相関は０．８４であり、検出方法間の不一致は観察されない。

実施例４：
エバネッセント検出を用いたＭＡＩＰＡアッセイ − 一チューブＭＡＩＰＡ
ＭＡＩＰＡアッセイでは通常４つの個々のチューブが使用され、各チューブに血小板糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を添加する、すなわちチューブ１に抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａ抗体を使用し、チューブ２に抗ｇｐＩａＩＩａ抗体を使用し、チューブ３に抗ｇｐＩｂＩＸ抗体を使用し、第４のチューブに抗ＨＬＡ抗体を使用する。エンドユーザーは４つの個々のアッセイを用いた抗体スクリーニング試験を行う必要がある。複雑さを低減するために、アッセイを単一チューブ抗体スクリーニングアッセイとして行い、血小板のプールに４つの糖タンパク質特異的モノクローナル抗体のプールを添加し、結合を本発明によるエバネッセントバイオセンサーアッセイによって分析した。方法及びバッファーはその他の点では実施例３に与えるものと同一であった。

１００個の血清サンプルを、ＥＬＩＳＡ検出を用いた従来のＭＡＩＰＡ又は本発明によるエバネッセントバイオセンサー検出によって測定した。ｘ軸に確立されたＭＡＩＰＡアッセイによる結果、ｙ軸にエバネッセントバイオセンサーによって得られる蛍光結果をプロットした図６に結果を示す。２つの方法の相関は０．８４であり、２つの検出方法間の不一致は観察されない。４回の個々のチューブ反応及びＥＬＩＳＡ検出を用いた従来のＭＡＩＰＡと比較して、新たな方法では４つ全てのモノクローナル抗体を含む単一のチューブ及び得られる３分子複合体のエバネッセント検出を用いる。この新たな方法の利点は、同一の感度でのアッセイの細胞パート及び検出パートの高度に低減された作業負荷である。これにより今回、従来のＭＡＩＰＡに必要とされるものの３分の１の時間、必要とされるものの４分の１の操作工程及び取扱い手順のはるかに低減された複雑さで行われる、エバネッセントバイオセンサー検出の改良された単一チューブＭＡＩＰＡが可能となる。このため新たなフォーマットは、抗血小板抗体の抗体スクリーニング試験として好適である。

実施例５：
ＨＰＡ−１ａ抗体アッセイ
本発明によるエバネッセントバイオセンサーシステムを用いた単純なＨＰＡ−１ａ抗体アッセイを、血小板でコーティングしたバイオセンサー表面と抗ＨＰＡ−１ａモノクローナル抗体とを反応させることによって行い、過剰な非結合抗ＨＰＡ−１ａ抗体を洗い流した後、結合抗ＨＰＡ−１ａ画分の検出を二次抗ヒトＩｇＧ ＡＰＣ標識抗体を用いて行う。

血小板によるバイオセンサーのコーティングは、血小板をＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中１μｌ当たり約１５００００の洗浄した血小板をＰＢＳ中、室温で１時間コーティングすることによって行う。これに続いて３回のＰＢＳ洗浄、及び１０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファー中での室温で１時間の低張溶解を行う。次いで、ＰＢＳによる３回の洗浄、及び３７℃で１時間のパパインによる部分プロテアーゼ消化（ID-Papain、DiaMed，Cressier，Switzerland）を行い、続いてＰＢＳによる３回の洗浄の後、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで１時間のブロッキング工程を行う。ウェルをＰＢＳで３回、１％スクロースで２回洗浄した後、風乾させると、すぐに使える状態となる。

結合アッセイでは、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で希釈した様々な量の抗ＨＰＡ−１ａモノクローナル抗体をバイオセンサー表面上で１０分間試験し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、結合した抗ＨＰＡ−１ａ ＩｇＧを１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＦＣＳ １ｍｌ当たり５μｇの抗ヒトＩｇＧ ＡＰＣ（Jackson）ＩｇＧによって検出する。測定はエバネッセントバイオセンサーを用いた１０分間の実施例１と同様である。

図７に示す結果はｘ軸に抗ＨＰＡ １ａ抗体の濃度、ｙ軸にエバネッセントバイオセンサーによって得られる蛍光ｄｃ ｃｐｓでの蛍光結果をプロットすることによって得られる。血小板遺伝子型１ａ及び１ｂに関する特異性は正確である。低濃度で線形用量応答曲線が観察され、１μｇ／ｍｌを超える抗体濃度でプラトーに達する。

センサー表面への血小板の固定化は多くの異なる固定化技術によって達成することができる。例えば物理的吸収による直接コーティングが可能であり、他の可能性は例えば抗ｇｐＩＩｂＩＩＩａクローンＲＦＧＰ５６等の抗血小板表面タンパク質抗体をコーティングすること、又は無傷全血小板をビオチン化することにより血小板表面タンパク質のビオチン化を生じさせ、続いてアビジンバイオセンサー表面に結合することである。デキストランコーティング及び共有結合、又はポリ−Ｌ−リシンコーティングに続く静電結合及び／又は共有結合は、この点における技術的可能性のほんの一例である。抗ＨＰＡ−５ｂ又は抗血小板自己抗体等の他の抗血小板抗体を、同じ方法を用いて検出することができる。

実施例６：
ヒト血漿サンプルを用いたＨＰＡ−１ａ抗体アッセイ
実施例５に記載のＨＰＡ−１ａ抗体アッセイの性能を、少数のヒト血清を用いて更に評価した。アッセイ作成及び試験方法及びバッファーは実施例５に記載した通りである。エバネッセントバイオセンサーシステムを、血小板でコーティングしたバイオセンサー表面と抗ＨＰＡ−１ａモノクローナル抗体とを反応させることによって実行し、過剰な非結合抗ＨＰＡ−１ａ抗体を洗い流した後、結合抗ＨＰＡ−１ａ画分の検出を二次抗ヒトＩｇＧ ＡＰＣ標識抗体を用いて行う。

結合アッセイでは６つの異なるヒト血漿の１％希釈物を、ＨＰＡ１ａ陽性又はＨＰＡ１ａ陰性血小板でコーティングした血小板コーティングバイオセンサーと結合するその能力について試験した。ヒト血漿サンプルは４つの陰性ヒト血漿、並びにLyon EFS platelet reference laboratory（Lyon France）による陽性対照及び陰性対照であり、陽性血漿ではＭＡＩＰＡのＯＤは０．７、陰性血漿ではＯＤは０．１未満である。この０．１というＯＤはＭＡＩＰ陽性のカットオフ値であるか、又はカットオフ値より７倍強いシグナルである。

図８は、ＨＰＡ−１ａ陽性血小板と強く反応し、ＨＰＡ−１ａ陰性血小板に対してはバックグラウンド反応しか有しない抗ＨＰＡ−１ａ陽性血清を示す。シグナル対ノイズ比はＭＡＩＰＡの結果と同様である。ＨＰＡ１ａ陰性対照血清及び他の陰性血清は、バックグラウンドレベルを超える任意の反応を生じなかった。

実施例７：
ＨＰＡ−１ａ抗体の一工程抗体アッセイ
血小板抗体アッセイを行う上での利便性を更に改善するために、血小板バイオセンサーを上記のように血小板をウェルにコーティングし、乾燥させることによって作製した。

次いで、１部の血漿を１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した２００部のＦＣＳに取ることで実施例６の標識ヒト血漿Ｍを希釈することによってアッセイを行った。２つのサンプルを調製し、第１のサンプルには血漿Ｍを使用し、第２のサンプルには抗ヒトＨＰＡ−１ａ抗体をスパイクした。抗ヒトＩｇＧ ＡＰＣ（Jackson）を最終濃度２０μｇ／ｍｌまで添加し、混合物を血小板コーティングバイオセンサーによって分析した。ＨＰＡ１ａ陽性血小板、ＨＰＡ１ａ陰性血小板、並びにバイオセンサー及び機器バックグラウンドの陰性対照として空の非コーティングウェルの３つの異なるコーティングをこのアッセイに使用した。混合物をウェルにピペット注入し、上記の実施例で概説されるようにエバネッセントバイオセンサー機器において１０分間測定し、結果を記録した。

図９にはスパイクした血漿Ｍを用いるＨＰＡ１ａ＋血小板でコーティングしたバイオセンサーのシグナルのみを示し、スパイクしていない血漿Ｍは陰性の結果をもたらした。ＨＰＡ１ａ陰性血小板バイオセンサー及びバイオセンサー単独は、バックグラウンドシグナルのみを生じた。これにより、一工程抗体アッセイでの本発明によるエバネッセントバイオセンサー試験の感度及び特異性が確認される。ＨＰＡ−１ａ同種抗原タイピングの例によって、エバネッセント法が全ての血小板同種抗原タイピング及び抗体試験に好適であることが実証された。

実施例８（参照例）
トキソプラズマ症についての一工程二重抗原抗体アッセイを、トキソプラズマを細胞培養物中で増殖させ、培養物由来の抗原を反復超音波処理及び遠心分離工程（DiaMed Eurogen，Turnhout，Belgium）によって精製することによって行う。抗原は粒状物（particular matter）の形態であり、そのまま使用する。１アリコートを１０μｇ／ｍｌでバイオセンサーチップのコーティングに使用する。第２のアリコートを記載のようにＡＰＣで標識する。２部の抗トキソプラズマ症ＩｇＧ標準を取り、トリス緩衝１％カゼイン、３％ＢＳＡ及び０．９％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１０μｇ／ｍｌのトキソプラズマ症抗原−ＡＰＣを含む１部の３倍濃縮検出ミックスと混合することによって試験を行う。この混合物をトキソプラズマ症抗原でコーティングしたウェルに移し、測定する。結果を図１０に示す。

Claims (13)

1. サンプル中に含有されるヒト血小板上の少なくとも１つのヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）を検出する方法であって、
   （ａ）少なくとも抗体が結合した少なくとも１つの表面を供給する工程であって、該抗体が検出対象の前記少なくとも１つのＨＰＡを保有する糖タンパク質に対するものである工程と、
   （ｂ）前記サンプル中に含有される血小板を溶解し、該血小板の膜タンパク質を可溶化する工程と、
   （ｃ）前記表面と工程（ｂ）の溶解及び可溶化した前記サンプルとを接触させる工程であって、該サンプル中に含有されるそれぞれの糖タンパク質を、工程（ａ）の前記抗体への特異的結合によって前記表面に固定化する工程と、
   （ｄ）前記表面と蛍光標識抗体とを接触させる工程であって、該抗体が検出対象の前記少なくとも１つのＨＰＡに対するものであり、該抗体、前記サンプル中に含有されるそれぞれの糖タンパク質、及び工程（ａ）の前記抗体が表面結合複合体を形成する工程と、
   （ｅ）前記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
   （ｆ）前記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
   （ｇ）前記少なくとも１つのＨＰＡを、工程（ｆ）において測定される前記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
   を含む、方法。
2. 前記ＨＰＡがＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂである、請求項１に記載の方法。
3. ２つ以上のＨＰＡを検出する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法を行うための診断試験デバイスであって、少なくとも工程（ａ）の抗体が結合した少なくとも１つの表面を備える、診断試験デバイス。
5. サンプル中のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を検出する方法であって、
   （ａ）少なくともヒト血小板又は血小板膜画分が結合した少なくとも１つの表面を供給する工程であって、該血小板又は血小板膜画分上に存在する対象の前記ＨＰＡが既知である工程と、
   （ｂ）前記表面と前記サンプルとを接触させる工程であって、前記サンプル中に含有される前記血小板又は血小板膜画分上に存在する前記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ａ）の前記血小板又は血小板膜画分への特異的結合によって前記表面上に固定化する工程と、
   （ｃ）前記表面と蛍光標識検出剤とを接触させる工程であって、該検出剤が前記血小板又は血小板膜画分上に存在する前記ＨＰＡに対するヒト抗体に特異的に結合し、該検出剤、前記サンプル中に含有されるそれぞれのヒト抗体、及び工程（ａ）の前記ヒト血小板又は血小板膜画分が表面結合複合体を形成する工程と、
   （ｄ）前記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
   （ｅ）前記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
   （ｆ）前記血小板又は血小板膜画分上に存在する前記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ｅ）において測定される前記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
   を含む、方法。
6. 前記ＨＰＡがＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂである、請求項５に記載の方法。
7. 工程（ｃ）の前記蛍光標識検出剤が、
   （ｉ）ヒト抗体に対する蛍光標識抗体、及び、
   （ｉｉ）蛍光標識血小板又は血小板膜画分、ここで該血小板又は血小板膜画分は工程（ａ）の前記血小板又は血小板膜画分と同じＨＰＡを保有する、
   からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
8. 請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法を行うための診断試験デバイスであって、少なくともヒト血小板又は血小板膜画分が結合した少なくとも１つの表面を含み、該血小板又は血小板膜画分上に存在するＨＰＡが既知である、診断試験デバイス。
9. サンプル中のヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を検出する方法であって、
   （ａ）少なくとも１回の血小板抗原のモノクローナル抗体固定化（ＭＡＩＰＡ）アッセイを行い、対象のＨＰＡを保有する少なくとも１つの血小板糖タンパク質、該少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体、及び前記ＨＰＡに対する対象のヒト抗体で作られる少なくとも１つの３分子複合体を生成する工程であって、該ヒト抗体が前記サンプル中に含有される工程と、
   （ｂ）前記少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体に対する抗体が少なくとも結合した少なくとも１つの表面を供給する工程と、
   （ｃ）前記表面と前記３分子複合体とを接触させる工程であって、該３分子複合体を工程（ｂ）の前記抗体への特異的結合によって該表面に固定化する工程と、
   （ｄ）前記表面とヒト抗体に対する蛍光標識抗体とを接触させる工程であって、該蛍光標識抗体、前記３分子複合体及び工程（ｂ）の前記抗体が表面結合複合体を形成する工程と、
   （ｅ）前記表面結合複合体を光源のエバネッセント場によって励起する工程と、
   （ｆ）前記表面結合複合体から発される蛍光を測定する工程と、
   （ｇ）前記ＨＰＡに対するヒト抗体を、工程（ｆ）において測定される前記発された蛍光に基づいて検出する工程と、
   を含む、方法。
10. 前記ＨＰＡがＨＰＡ−１ａ及び／又はＨＰＡ−５ｂである、請求項９に記載の方法。
11. ＨＰＡに対する２つ以上のヒト抗体を検出する、請求項５〜７、９及び１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 請求項９及び１０、並びに請求項９及び１０に従属する限りにおいて請求項１１のいずれか一項に記載の方法を行うための診断試験デバイスであって、少なくとも１つの血小板糖タンパク質に対する少なくとも１つの抗体に対する抗体が少なくとも結合した少なくとも１つの表面を備える、診断試験デバイス。
13. サンプル中の、（ｉ）サンプル中に含有されるヒト血小板上の少なくとも１つのヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）、及び（ｉｉ）ヒト血小板同種抗原（ＨＰＡ）に対するヒト抗体を同時検出する方法であって、
    （ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
    （ｂ）請求項５〜７及び９〜１１のいずれか一項に記載の方法を行う工程と、
    を含む、方法。

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