KR100305306B1 - 건식화학캐스케이드면역분석법및친화도분석법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분석물의 존재에 대하여 분석할 샘플을 캐스케이드 반응 개시제에 결합된 분석물(합텐, 항원, 항체, 수용체, 또는 상보적 상보적 폴리뉴클레오티드), 상기 분석물과 반응성인 항원 또는 다른 결합 쌍 파트너, 및 자성 입자들로 이루어 진 건조 시약과 접촉시켜, 반응 챔버 중에서 분석 혼합물을 생성하는 단계, 분석 혼합물을 인큐베이션시키는 단계, 분석 혼합물에 진동 자장 또는 가동 정자장을 인 가하는 단계, 캐스케이드 반응 개시제를 활성화하여 캐스케이드 반응을 개시하는 단계, 진동 또는 가동 정자장에 대한 자성 입자의 감응을 모니터링하여 시간 변동 시그널을 제공하는 단계, 및 그 시간 변동 시그널을 분석하여 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계로 이루어진 친화도 분석의 수행 방법 및 분석을 수행하는 장 치 및 분석을 수행하기 위한 분석 시스템에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

건식 화학 캐스케이드 면역분석법 및 친화도 분석법

[기술 분야]

본 발명은 건식 화학 방식으로 면역분석법을 포함한 결합 쌍 분석법을 수행하는 방법에 관한 것이다.

[배경 기술]

많은 결합 쌍 분석법이 있다. 이들은 다양한 형태의 면역분석법, DNA 및 RNA 프로브 분석법, 및 생물학상으로 중요한 각종의 기타 리간드-수용체 분석법을 포함한다. 중요할 수 있는 특정 항원 또는 항체의 정량적 측정을 제공하는 면역분석법이 현재 이용가능하다. 이러한 형태의 분석법 중에는 효소-면역분석법이 있다[문헌 : Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol. 22, 1984, pp. 895-904; Monroe, Analytical Chemistry, Vol. 56, No. 8, 1984, pp.921a-93la; 및 Wisdom, Clin. Chem. 22/8, 1976, 1243-1255 참조]. 이 효소 면역분석법에서, 효소는 측정될 샘플 중의 것과 동일한 항원-항체 쌍중 하나의 성분에 결합되는 라벨 또는 마커로서 사용된다. 이어서, 효소 결합된 항원/항체는 그의 보체 항체/항원의 제한된 공급 때문에 결합 지리를 위해 샘플 항원/항체와 경쟁하게 된다.

결합 쌍 분석법은 변환기 또는 측정 시스템에 어떻게든 연결되어야 측겅치 또는 결과값을 얻을 수 있다. 상기 형태의 모든 분석법은 다른 시스템에 연결되어 측정치를 제공한다. 효소 면역분석법의 상기 예에서, 샘플 항원/항체의 농도는 비색법, 화학발광법, 형광법, 또는 생물발광법과 같은 다양한 방법을 사용하여 효소 활도를 측정함으로써 간접적으로 측정된다.

통상의 면역분석법, 더 일반적으로는 통상의 결합 쌍 분석법이 가지고 있는 문제점은 이들 시스템이 하기 세 가지의 명확한 단점을 가지고 있다는 것이다.

1) 이들은 전혈을 정량적으로 측정할 수 없다 효소 면역분석법의 질은 측정될 항원 또는 합텐의 순도에 대부분 의존하기 때문에, 특히 전혈 샘플을 분석하는 데에 유용하지는 않다. 또한, 전혈은 광도 측정시 광학적 간섭을 발생시키고, 시스템으로부터 유용한 시그널을 찾아내는 가능성을 최소화시킨다.

2) 이들은 분석 시간이 길다는 단점을 갖고 있다. 반응은 느리고 결과를 얻는데 오랜 시험 시간이 걸린다.

3) 이들은 다단계로 수행된다. 이들은 수동으로 수행되는 경우 노동 집약적이거나 또는 다수의 인큐베이션, 세척, 샘플링, 및 시약 첨가 단계를 자동화하기 위한 고가의 복잡한 계기화를 필요로 한다.

자성 입자 검색 방법은 전혈 샘플 상에 형성되는 혈액 응고화에 관한 건식 화학 역학적 측정법을 편리하게 한다는 것을 보여준다[오버하트(Oberhardt)의 미국 특허 제4,847,340호 및 5,110,727호 참조]. 자성 입자 검색 방법에서, 측정된 양의 혈액 샘플을 자성 입자 및 적어도 하나의 건조 시약의 배합물을 함유하는 반응 슬라이드에 가한다. 샘플과 건조 시약 사이의 반응 및 가동 또는 진동 자장의 인가시에, 자성 입자의 움직임을 모니터링하여 응혈 종점을 탐지하여 응혈 시간을 얻는다. 이는 전혈 및 기타 측정이 어려운 생물학적 샘플에 있어서 편리하고 정량적인 측정을 수행할 수 있는 매우 소수의 방법론 중의 하나라는 점에서 중요하다.

그러나, 면역분석법, 및 더 일반적으로는 상이한 형태의 결합 쌍 분석법에 이와 같은 기법을 사용하기 위해서는, 존재하는 분석 시스템을 면역학적 또는 결합 쌍 "전단"과 결합시키기 위한 방법을 찾아야 한다.

한 가지 가능한 해결책은 자성 입자에 항체 또는 항원을 직접적으로 결합시키는 것일 것이다. 그러나, 자성 입자에 항체 또는 항원을 결합시키는 것이 면역 반응을 판독할 수 있는 시스템을 제공하지만, 모든 입자가 응집되어 그들의 열역학적 자유 에너지를 최소화함으로써 안정하지만 응집된 시스템을 제공하는 특성 때문에 이러한 시스템은 재현성이 있는 건식 화학 포맷에는 사용하기 어렵다. 예를 들어, 자성 라텍스는 자성 검색법으로 정량화하기에는 어렵다. 표면 항원 또는 항체 분자와 사용하는 경우, 이들 입자는 열등한 재현성을 갖는다. 표면 결합된 면역 분자와 함께 다른 형태의 자성 입자를 사용하는 것은 완전히 성공적이지는 않았다. "수동" 모드에서 마그네타이트(Fe₃O₄) 입자를 표면 항체 또는 항원을 사용하지 않고 사용하는 것이 또한 고려되어 왔는데, 수동 입자를 기초로 한 실시가능한 분석 시스템의 개발은 거의 성공적이기 못하였다.

수동 입자 기법이 개념상으로는 훌륭하지만, 어떻게 면역 또는 결합 쌍 "전단"을 이전에 응고 또는 섬유소 용해 분석의 측정을 위해서만 사용되었던 자성 입자 검색 기법에 연결시킬 수 있는지는 명백하지 않다.

효소-결합된 응고 분석법은 항체 또는 항원에 결합된 효소를 사용하도록 제안 되었고, 여기서 사용된 효소는 응고 캐스케이드 반응 시스템에서의 활성 인자이다[참조 : 문헌 Doellgast et al. Analytical Biochemistry, 147, (1985) 529-534; 152, (1986) 199-207; 162, (1987) 102-114; 167, (1987) 97-105; and 184, (1990) 375-380; Clin. Chem. 34/2, (1988) 294-299; 및 도엘가스트(Doellgast)의 미국 특허 제 4,668,621호를 참조]. 그러나, 제안된 각 시스템에서 1 회 이상의 분리, 세척, 및 희석 단계, 또는 장 시간의 샘플 분석 시간이 요구된다.

또한, 도엘가스트(Doellgast) 등은 플라스미노겐 활성화제(예, t-PA)의 활성을 측정하기 위한 효소-결합된 섬유소 분해 분석법을 제안하였다[Thrombosis Research, 59, (1990) 723-733]. 그러나, 상기 응고 분석법의 경우에서와 같이, 다단계 분리, 세척, 및 희석 단계가 분석을 수행하는 데에 요구된다. 블레이크(Blake) 등은 응고 캐스케이드 또는 다른 캐스케이드 시스템에 기초한 면역분석법을 제안하였다[Clin Chem. (1984) 30/9 1452-14156]. 이 시스템은 입체 장해를 이용하지만 분리 및 세척 단계는 사용하지 않는다. 그러나, 이 시스템은 비색법에 기초하므로 전혈 샘플 또는 희석된 혈액 샘플의 분석에는 부적합하다. 현재에는 DNA/RNA 프로브 또는 다른 결합 쌍 분석법과 유사한 시도를 한 예는 없었다.

따라서, 전혈 샘플에 사용하기 위한, 정량적이고 사용하기 용이하며 고속이고 감도가 높으며 또한 편리한 결합 쌍 분석 시스템을 제공하는 것이 매우 바람직하다.

[발명의 설명]

따라서, 본 발명의 목적은 생물학적으로 분석이 어려운 샘플에 사용하기 위한, 정량적이고 사용하기 용이하며 고속이고 감도가 높으며 또한 편리한 결합 쌍 분석 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 결합 쌍 중 하나의 구성원에 결합되어 활성화시 반응 캐스케이드를 개시함으로써 분리 또는 세척 단계없이 목적하는 결합 쌍 구성원의 측정을 가능하게 하는, 생물학적으로 분석이 어려운 샘플에서 사용하기 위한 결합 쌍 분석 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개시제가 혈액 응고 캐스케이드 또는 용혈 캐스케이드의 효소인, 상기한 바의 결합 쌍 분석 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전혈 시스템에 유용한 면역분석 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색 방법을 이용하는, 심장혈관 질환을 치료하는 데에 사용되는 치료적 약물(예, 디곡신, 퀴니딘, 리도카인, 메실레틴, 소탈롤, 이미프라민, 프로파페논, 시벤졸린, 엔카이니드, 플레카이니드, 인데카이니드, 모리시진, 펜티사미드, 토카이니드, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 펜부톨롤, 아미오다론, 베타니딘, 메오벤틴, 베프리딜, 딜티아젬 및 다른 항부정맥성 약물)과 같은 소분자를 위한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 아포리포프로테인 A-1, 아포리포프로 테인 B-100, 아포리포프로테인 E, 리포프로테인 Lp(a), IgM과 같은 면역글로불린, 피브리노겐 등과 같은 대분자를 위한 신속하고 편리한 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, CKMB, 미오글로빈, 피브리노겐, 플라스미노겐, 트로포닌, PAI-1, 트롬보모둘린, 및 트롬빈-안티트롬빈 복합체와 같은 주요 심장혈관계 단백질을 위한 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 혈소판 또는 특이적 수용체(즉, IIb IIIa 등); 적혈구 또는 특이적 항원(즉. Rho); 백혈구, 또는 특이적 항원(즉, 조직적합성 항원); 또는 박테리아 세포, 바이러스, 리켓시아, 곰팡이, 또는 효모와 같은 세포 성분 또는 그들의 표면 항원성 또는 수용체 분자를 위한 편리한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, HIV 항원, 후천성 면역 결핍증(AIDS)에서의 CD4/CD8 및 PAN T, 및 전립선 암에서의 전립선 특이적 항원(PSA)과 같이 주요 검진 및 질병 치료법에 사용하기 위한 신속하고 편리한 정량적 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 인슐린, T4, T3, ACTH, hCG, TSH, 안 지오텐신 II 등과 같은 호르몬을 위한 신속하고 편리한 진단용 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 기타 이테그린과 같은 접착 수용체, 글리코스아미노글리칸, 프로테오글리칸, 아넥신, 세포 체질 성분, 시토킨, 성장 인자 등과 같은 세포내 또는 세포외의 시그널 또는 구조적 인자를 위한 신속하고 편리한 진단용 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 세포 및 바이러스 내의 유전자 물질에서 발견되는 것과 같은 특이적 폴리뉴클레오티드를 위한 신속하고 편리한 진단용 시험법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 혈액 이외의 분석이 어려운 생물학적 샘플, 예를 들어 폐 세정 또는 타액을 위한 편리하고 신속한 진단용 시험법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 소의 혈액 응고 캐스케이드, 소의 젖 응고 캐스케이드, 인간 또는 소의 섬유소분해 캐스케이드, 돼지의 캐스케이드, 곤충의 혈액 응고 캐스케이드 또는 참게 혈임파 캐스케이드와 같은 인간의 혈액 응고 이외의 가능한 캐스케이드 시스템을 기초로 한 혈액 또는 분석이 어려운 다른 생물학적 샘플을 위한 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 혈액 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 빌레브란드(von Willebrand) 인자 및 그의 콜라겐 수용체 및 혈소판 GPIb 수용체, 트롬빈 및 트롬보모둘린, 아세틸콜린 및 그의 수용체 등과 같은 리간드 또는 수용체를 위한 신속하고 편리한 정량적 진단용 분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭을 위한 응고 캐스케이드 및 응고 종말점의 탐지를 위한 자성 입자 검색법을 이용하는, 의학적 진단 결정을 용이하게 하기 위하여, 평행하게 연결된 반응 슬라이드 샘플 웰에 샘플을 1 회 적용하여 개별 분석이 수행되는 다중 반응 용적을 만드는, 상이하지만 관련이 있는 분석물을 위한 면역분석법과 같은 친화도 분석법의 패널을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 반응 슬라이드, 및 회전 자장과 광학 탐지 및 발광 수단을 이용하는 장치로 이루어진 건식 화학 정량적 친화도 분석법을 수행하기 위한 편리하고 효과적인 시스템을 제공하는 것이다.

이들 및 다른 목적은 분석물의 존재를 분석하고자 하는 샘플을 반응 캐스케이드 개시제에 결합된 분석물(합텐, 단백질, 항체, 수용체, 또는 상보적 폴리뉴클레오티드와 같은 소분자 또는 대분자), 상기 분석물과 반응성인 항체, 및 자성 입자를 함유하는 건조 시약과 접촉시켜 반응 챔버 중에서 분석 혼합물을 형성하고, 이 분석 혼합물을 인큐베이션시키고, 분석 혼합물에 진동 또는 가동 정자장을 인가하고, 반응 캐스케이드 개시제를 활성화하여 반응 캐스케이드를 개시하고, 진동 또는 회전 자장에 대한 자성 입자의 감응을 모니터링하여 시간 변동 시그널을 얻고, 이 시간 변동 시그널을 분석하며 샘플 중의 분석물의 농도를 측정하는 것으로 이루어진 친화도 분석법을 수행하는 방법의 발견에 의해 달성되었다.

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 보다 완전한 이해 및 그에 부수하는 많은 장점은 첨부하는 도면과 함께 고려하는 경우에 하기의 상세한 설명을 참고함으로써 더 잘 이해할 수 있는 것으로 용이하게 알 수 있을 것이다.

제1도는 기재 지지체(30), 반응 플레이트 또는 스페이서(20) 및 반응 덮개(10), 및 샘플 웰(64), 통로(61), 및 반응 챔버(62)(여기서, 통로(61) 및 반응 챔버(62)는 반응 용적(66)을 이룸)을 나타내는 본 발명에 유용한 반응 슬라이드(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,849,340호 및 동 제5,110,727호에 기재됨)의 전개도이다.

제2도는 조립된 반응 슬라이드의 평면도이다.

제3도는 샘플 웰(64) 위의 샘플 유입구(14)에 뤼에(Luer)-형 어댑터(15)가 부착 된 것을 보여준다.

제4(a) 및 4(b)도는 샘플을 통로(61)을 통하여 샘플 웰(64) 중으로 그리고 반응 챔버(62) 중으로 도입하는 다른 두 가지 방법을 나타내는데, (a)도는 샘플 유입구(14) 상의 압력을 통한 것이고 (b)도는 통기구(76) 상의 진공을 통한 것이다.

제5도는 본 발명의 결합 쌍 분석 방법에 사용할 수 있는 입체 분석 방법의 개략도를 나타낸다.

제6도는 본 발명의 결합 쌍 분석 방법에 사용할 수 있는 배제 분석 방법의 개략도를 나타낸다.

제7도는 실시예 1에서와 같은, 자성 입자를 갖춘 반응 슬라이드 기법을 사용하여 얻은 소의 트롬빈의 표준 곡선을 나타낸다.

제8(a) 및 8(b)도는 실시예 2에서와 같은, 자성 입자를 갖춘 반응 슬라이드 기법을 사용하여 얻은 인자 Xa의 표준 곡선을 나타낸다.

제9(a) 및 9(b)도는 실시예 3에서와 같은, 자성 입자를 갖춘 반응 슬라이드 기법을 사용하여 얻은 러셀(Russell) 살모사 독액의 표준 곡선을 나타낸다.

제10도는 건식 화학 반응 슬라이드로부터 인자 Xa를 분석하는데에 있어서 응혈 시간을 측정하기 위하여 실시예 1의 기구를 사용하여 광이극관 증폭기로부터 얻은 결과를 나타낸다.

제11(a), 11(b) 및 11(c)도는 독립적으로 시약으로 충전되고, 프로세싱되며, 건조되는 개개의 반응 슬라이드가 분석 패널을 제공하기 위하여 어떻게 각각 통상의 캐리어상에 합해지고 통상의 샘플로부터 얻은 샘플로 충전될 수 있는지를 보여준다.

[본 발명을 수행하기 위한 최선의 방식]

본 발명은

- 분석물의 존재를 분석할 샘플을 반응 캐스케이드 개시제에 공유결합된 분석물, 분석물과 반응성인 항체, 및 자성 입자들로 이루어진 건조 시약과 접촉시켜, 반응 챔버 중에서 분석 혼합물을 형성하는 단계;

- 상기 분석 혼합물을 인큐베이션시키는 단계;

- 상기 분석 혼합물에 자장을 인가하는 단계;

- 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화하여 반응 캐스케이드를 개시하는 단계;

- 자성 입자의 감응을 광학 수단으로 모니터링하여 광학 진동 시그널을 제공하는 단계 ; 및

- 상기 광학 진동 시그널을 분석하여 샘플 중의 상기 분석물의 농도를 결정하는 단계로 이루어진 친화도 분석의 수행 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 면역분석법을 포함한 광범위한 결합 쌍 분석법에 사용된다. 본 발명의 방법을 사용하여 수행할 수 있는 분석법 형태 중의 몇 가지의 예는 가용성 항원을 위한 면역분석법, 세포 면역분석법, 비-면역화법인 다양한 형태의 수용체

- 리간드 분석법, 및 DNA 및 RNA 프로브법이 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 반응 슬라이드 상에서 수행되는 데, 이의 한 가지 예가 제1도에 도시되어 있다. 반응 슬라이드는 지지체 구성원(30)으로 이루어지는데, 여기에 반응 플레이트 또는 스페이서(20)이 부착된다. 반응 챔버(62)는 반응 플레이트의 중심부에 있는 재료의 일부를 제거함으로써 반응 플레이트(20)내에 있는 것으로 정의된다. 재료를 반응 플레이트의 최소 치수 또는 두께를 통하여 제거 또는 "천공"하는 경우, 제3 구성 요소 또는 덮개(10)은 반응 챔버의 천공을 형성하는데 이용된다. 반응 슬라이드로 이루어진 2, 3 이상의 구성 요소는 여러가지 방법으로 함께 결합될 수 있다[예로서 오버하트(Oberhardt)의 미국 특허 제4,849,340호 및 제5,110,727호 참조]. 반응 챔버(62) 중에 자성 입자, 개시제-결합 분석물, 및 분석물에 대해 반응성인 항체를 포함하는 건조 시약 물질이 배치된다. 분석을 수행하기 위하여 필요한 것은 시험 기구 내에 시험 카드를 배치하는 것, 샘플 한 방울(피펫 소량)을 샘플 웰(64)에 가하는 것 그리고 샘플을 이송 통로(61)에 넣어 반응 챔버(62)를 충전시킴으로써 반응을 일으키고 반응을 완결한 후 결과를 얻는 것이다.

적당한 샘플 슬라이드는 오버하트에 의한 미국 특허 제5,110,727호에 개시되어 있는데, 이는 이러한 슬라이드의 상세한 설명 및 그의 제조 방법을 포함하고 있으며 이를 본 명세서에서의 참고문헌으로 채택한다.

분석할 샘플은 샘플을 직접적으로 샘플 웰 또는 반응 챔버 중으로 배치하는 임의의 방법으로 반응 슬라이드에 가할 수 있다. 적당한 수단으로는 마이크로피펫, 피펫, 뤼에-경사형 시린지 및 모세관을 포함한다. 바람직한 수단은 피펫 및 뤼에- 경사형 시린지이다. 뤼에-경사형 시린지를 사용하는 것은 제3도에 나타낸 바와 같이 샘플 웰에 넣을 때 뤼에 어댑터를 부착시켜 반응 슬라이드를 변형시켜야 함을 필요로 한다.

건조 시약 물질은 통상적으로 개시제-결합 분석물, 분석물에 대해 반응성인 항체, 및 자성 입자를 포함한다. 실행될 구체적인 분석법 및 구체적인 반응 캐스케이드에 따라, 효소, 기질, 활성제, 중화제, 및 완충제와 같은 다른 성분들이 존재할 수 있다.

샘플을 반응 슬라이드의 샘플 웰(64)에 가하자 마자, 샘플은 이송 통로(61)을 통하여 반응 챔버(62)로 옮겨져서 건조 시약과 반응하기 시작한다. 바람직한 실시태양에서, 샘플을 샘플 웰(64)에서 반응 챔버(62)로 이송하기 위한 원동력은 모세관 치수를 갖는 통로(61) 및 반응 챔버(62)로 야기된 모세관 작용이다[문헌 : 오버하트의 미국 특허 제5 110 727호에 개시되어 있음].

다른 실시태양에서, 샘플을 이동시키기 위한 원동력은 반응 챔버(62)의 통기구(76)에 진공 원을 가하거나(제4(a)도 참조) 또는 샘플 웰(64)의 유입구(14)에서 압력을 가함으로써 가능하다(제4(b)도 참조). 가해진 진공 또는 압력의 정도는 각각 대기압으로부터 충분한 음의 값 또는 양의 값으로 벗어나서 샘플을 샘플 웰로부터 반응 챔버로 이동시키는데, 바람직하게는 대기압 보다 5-10 mm 미만이거나 또는 그 이상이다.

진공 또는 압력 방법을 사용하기 위하여, 제4(a) 및 4(b)도에 나타낸 바와 같이 소수성 막(51)을 반응 챔버(62)의 통기구(76) 상에 설치하는 것이 바람직하다. 소수성 막은 기체 투과성이지만, 액체 불투과성이다. 바람직한 막은 0.5 내지 3 mil 두께, 35 내지 55 % 다공도 및 0.02 내지 0.06 마이크론의 공극 크기, 더 바람직하게는 1 mil 두께, 45 % 다공도 및 0.04 마이크론의 공극 크기의 막이다. 이러한 막의 예로는 CELGARD 2500(제조원 Hoechst Celanese Corp.)이라는 명칭의 막이다. 또한, 샘플 웰로부터 반응 챔버에 이르는 도관이 습윤화되지 않거나 또는 최소로 습윤화 되어 액체를 이송하기 위한 모세관 작용을 자동적으로 제공하지 않아야 한다. 상기 적절한 습윤 정도는 플라스틱 재료의 선정에 의해 또는 액체/고체 경계면에 큰 접촉각을 갖는 피복물을 사용함으로써 달성할 수 있다.

케스케이드 시스템 생화학은 본 발명의 분석 시스템의 "백 엔드"를 위한 기본이다. 캐스케이드는 일련의 반응인데, 여기서 첫 반응의 생성물은 두 번째 반응 등에 서의 생성물 형성을 촉매화한다. 캐스케이드 시스템은 두 개의 효소적 단계 정도로 적은 단계를 가질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 캐스케이드 시스템의 몇 가지 예로는 : 사람 또는 포유동물 혈액 응고 캐스케이드에서 지모겐을 효소의 활성 형태로 전환시키는 것 ; 참게의 혈임파에서의 유사 생화학적 캐스케이드 ; 및 곤충의 혈액 응고 캐스케이드가 있다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 추가의 캐스케이드 시스템은 인간의 플라스모겐 활성제/플라스노겐 시스템과 같은 용혈 캐스케이드이다. 일반적으로, 캐스케이드 시스템에서 양이 더 많아질수록, 분석 측정법에서 나타나는 증폭의 정도는 더 증가한다. 캐스케이드 시스템의 증폭이 커질수록, 결합 쌍 분석의 감도도 커진다. 그러나, 인간의 혈액 응고 캐스케이드에서의 인자 X의 농도에서조차, 본 발명은 2-단계 캐스케이드에 대한 리터 당 X_a의 0.1 피코몰 만큼 낮은 정도의 감도를 제공한다. 따라서, 거의 모든 상업적으로 중요한 면역분석법을 실행하는데에 충분한 감도가 존재할 것이다. 3-단계 캐스케이드에서, 감도는 리터 농도 당 펨토몰(femtomole)로 증가될 것이다. 리터 당 3.6 피코몰의 감도로 샘플 25 ml를 수용하는 반응 챔버에서, 약 10^-l8몰의 분석물이 이론상으로 탐지될 것이다. 이 것은 DNA 및 RNA 프로브 분석법에 요구되는 범위 내이고, 여기서 10⁷내지 10⁹의 분자의 후 복제 탐지가 바람직하다. DNA 또는 RNA, 또는 일반적으로, 폴리뉴클레오티드의 분석법에서, 주어진 스트랜드 및 그의 상보적 스트랜드는 결합 쌍을 구성할 것이다. 몇 가지 분석법에서는, 캐스케이드에서의 최종 효소, 트롬빈만을 사용하는 것도 충분할 수 있다. 이 경우에, 높은 감도는 요구되지 않을 것이다.

이 캐스케이드 시스템에 더하여, 입체 또는 배제 매카니즘이 선택되어 결합 쌍 으로부터 얻어진 시그날을 응고 캐스케이드 중으로 결합시킨다. 입체 매카니즘이 선택되는 경우, 균질 분석을 얻을 것이다 ; 즉, 유리 및 결합된 분석물을 분리하는 것은 작동 단계로서 또는 기구에 의하여 수행된 단계로서 필수적이지는 않을 것이다. 입체 매카니즘은 통상적으로 저분자량의 분석물을 위하여 선택된다. 배제 매카니즘은 반응 슬라이드에 대한 내부 결합 분석물이 없는 분리법을 세척 단계없이 이용한다. 이러한 접근법은 통상적으로 고분자량의 분석물 또는 세포 요소를 분석하기 위하여 선택된다.

입체 또는 배제 결합 매카니즘의 선택에 이어서, 캐스케이드 반응은 두 가지 방법으로 개시될 수 있다 : 개시 분자를 캐스케이드를 위한 반응 성분들을 함유하는 챔버 중으로 단순 유입시키거나 또는 트리거(trigger) 개시제를 사용하는 것이 그것이다. 트리거 개시제는 그 캐스케이드를 위한 반응 성분과 접촉되어 배치되거나 또는 접촉되도록 이동되고 자외광 또는 열적 펄스의 형태와 같은 외부 에너지를 유입함으로써 또는 단계적 작용으로서 활성화되거나 "트리거"될 때까지 어떤 반응도 수행하지 않는다. 트리거 개시제를 사용하는 것은 캐스케이드 반응이 개시되기 전에 혼합이 완결되도록 하고 그렇게 함으로써 보다 정밀성을 갖춘 그리고 필요하다면 간편성을 갖춘 분석법을 제공하게 한다.

상기한 바와 같이, 된 발명의 방법은 다양한 종을 분석하는 데에 사용할 수 있다. 이들은 일반적으로 다음 세 가지 부류로 나눌 수 있다 : (1) 저분자량 종(≤ 2,000 달톤), 및 (2) 고분자량 종(≥ 2,000 달톤) 및 세포 요소. 이들 각각을 하기에 설명한다.

I. 저분자량 종(< 2,000 달톤)의 분석법

이 실시태양에서, 결합 쌍으로부터 시스템으로 시그널을 이송하기 위하여 입체 또는 배제 매카니즘을 선택한다. 분석물-개시제 결합체를 이용하는 입체 매카니즘에서, 결합 쌍 반응 후에 개시제 작용에 입체 장애가 발생하는 경우 균질 분석을 얻을 것이다. 개시제가 결합 쌍의 비-분석물 구성원에 화학적으로 대신 부착되는 경우, 이 개시제의 화학적 부착이 결합 쌍의 비-분석물 구성원 상의 결합 위치에 근접하고 분석물이 그의 결합 쌍 보체에 결합될 때 개시제 작용의 입체 장애가 발생한다는 조건에서 입체 매카니즘이 사용될 수 있다. 제5도 및 6도는 입체 및 배제 매 카니즘의 개략도를 나타낸다.

[입체 매카니즘]

입체 분석법에서, 분석물의 유리(비결합) 결합 쌍 파트너는 분석물의 복사체에 화학적으로 결합된(그의 상보성 결합 쌍 파트너와 반응성임) 개시제와 함께 건조 시약에 사용되거나, 또는 다르게는 단지 분석물의 결합 쌍 파트너에 화학적으로 결합된 개시제가 사용된다. 주요 샘플을 첨가하고 소정 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 개시제를 열 또는 광과 같은 에너지를 유입함으로써 활성화시킨다.

인큐베이션 기간 동안, 샘플이 목적하는 분석물을 조금도 함유하지 않는다면, 개시제에 결합된 분석물 복사체는 상응하는 결합 쌍 파트너와 반응한다. 따라서 이 반응은 캐스커이드 반응을 개시함으로써 활성화된 개시게를 입체적으로 차단하고 이어서 이 캐스케이프는 차단되거나 또는 크게 감속된다. 또한 개시제가 분석물의 결합 쌍 파트너에 결합되는 경우 및 샘플이 분석물을 함유하지 않는 경우, 개시제는 입체적으로 장해되지 않아서 캐스케이드 반응이 개시되고 재빨리 수행된다.

그러나, 샘플이 목적하는 분석물을 함유하는 경우, 이 유리 분석물은 인큐베이션 기간 동안에 그의 결합 쌍 파트너와 반응하기 위한 개시제-결합 분석물과 효과적으로 경쟁한다. 따라서, 개시제가 활성화되면, 이어서 그의 결합 쌍 파트너와 반응하지 않는 결합 분석물을 함유하는 개시제는 유리되어 캐스케이드 반응을 개시한다. 이어서 캐스케이드 반응의 속도는 활성 비차단 개시제의 양에 비례하거나 또는 샘플 내에 존재하는 분석물의 양에 정비례한다. 따라서, 샘플 중의 분석물의 농도가 높아질수록, 캐스케이드 반응은 빨라지고 그 역도 성립한다.

또한, 개시제에 결합된 분석물의 결합 쌍 파트너가 건조 시약 중에 사용되는 경우, 샘플 분석물이 존재한다면, 이는 결합 쌍 파트너와 반응하고, 그에 부착되며 따라서 활성화되거나 또는 트리거되는 경우, 개시제를 입체적으로 장해하며, 캐스케이드 반응 개시를 방지한다. 본 실시태양에서, 샘플로부터 분석물의 첨가 후 그리고 개시제의 활성 후의 캐스케이드 반응의 속도는 본 샘플에 존재하는 분석물의 양에 역비례한다. 따라서, 이 경우에, 샘플 내의 분석물의 농도가 높아질수록 캐스케이드 반응은 천천히 일어나고 그 역도 성립한다.

[배재 매카니즘]

배제 분석법에서, 고체 지제체-결합 분석물 결합 쌍 파트너가 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 결합 쌍 파트너는 반응 슬라이드 중 반응 챔버의 표면에 또는 혼합시키기 위하여 사용된 자성 입자에, 또는 자장이 인가될 때 자성 입자에 의하여 재빠르게 현탁액 중으로 들어가는 비자성 입자(예, 유리질 비드(bead)) 에 공유결합될 수 있다. 따라서 사용된 건조 시약 시스템은 예를 들어. 입체 분석법에서와 동일한 타입의 분석물-결합 개시제와 함께 결합 항체를 포함한다. 샘플을 건조 시약을 함유하는 반응 슬라이드에 가한 다음 반응을 인큐베이션시키고 액체 반응 용액을 고체 지지체로부터 분리하고 캐스케이드 시스템의 잔존 성분에 가하고 캐스케이드 반응 시간을 측정한다.

목적하는 샘플이 어떤 유리 분석물도 함유하지 않는 경우, 인큐베이션 동안에 분석물-결합 개시제는 그의 표면-부착 결합 쌍 파트너와 반응한다. 고체 지지체로 부터 액체를 분리하고 액체를 캐스케이드 반응 시스템의 잔류 성분에 가하면, 고체 지지체에 결합된 항체에 의하여 분석물-결합 개시제의 포획 때문에 캐스케이드 반응은 크게 감소되거나 심지어 중단된 것 같이 보인다.

그러나, 목적하는 샘플이 유리 분석물을 함유하는 경우, 유리 분석물은 결합 항체와 반응하는 동안 개시제에 결합된 분석물과 효과적으로 경쟁한다. 따라서, 액체를 고체 지지체로부터 분리하고 캐스케이드의 잔류 성분에 가하는 경우, 캐스케이드 반응은 액체 내에 존재하는 개시제의 양에 비례하거나 또는 원래의 샘플 내의 유리 분석물의 농도에 정비례하는 속도로 진행된다.

반응 슬라이드 기법을 사용하여 고체 지지체로부터 액체를 분리하는 것을 달성 하는 많은 방법들이 있음을 알 수 있을 것이다. 통상적으로 액체는 밸브 또는 통기구를 개방할 때의 모세관 작용에 의하여 또는 반응 챔버의 가요성 상부의 피스톤의 압력으로 물리적으로 펌핑시킴으로써 또는 압력 또는 진공원에 연결된 오리피스를 반응 슬라이드 상의 적절한 오리피스와 접촉되도록 이동시킴으로써 발생한 압력 또는 진공 펌핑에 의하여 이동될 것이다. 이들 방법 중의 일부가 본 명세서에 개시되어 있다. 다른 것들은 미국 특허 제4,849,340호에서 찾을 수 있을 것이다. 제1 챔버 내의 자성 입자는 우측 모먼트에서 자장을 인가하고 수송이 완결될 때까지 그 자장을 지속시킴으로써 제2 반응 챔버 중으로 이송되는 액체와 함께 이동되는 것이 방지될 것이다.

저분자량 분석물의 탐지를 위한 배제 매카니즘을 사용하는 다른 실시태양에서, 분석물 복사체는 고체 지지체에 직접적으로 또는 연결 분자를 통하여 부착될 수 있고, 결합 쌍 파트너는 상기 개시제에 결합된다. 이 실시태양에서, 분석물은 개시제- 결합 파트너 결합체에 결합하여 결합체가 용액 내에 잔존하도록 하고 그리하여 분석물이 부착된 고체 지지체에 대하여 그의 결합을 예방한다. 따라서, 액체를 고체 지지체로부터 분리하고 캐스케이드의 잔존 성분에 가하는 경우, 캐스케이드 반응은 액체 내에 존재하는 개시제의 양에 비례하거나 또는 원래의 샘플 내의 샘플 분석물의 농도에 정비례하는 속도로 진행된다.

배제 매카니즘을 실행하기 위한 다른 방법은 액체 흡수 모듈(또는 LAM)을 사용하여 반응 챔버의 액체 내용물을 분리하는 것이다. 이것은 반응 챔버의 공기 통기구 부분과 접촉된 흡수재 구성원이다(참조: 미국 특허 제4,849,340호). 반응 챔버로부터 액체를 추출하는 것은 임의로는, 편리하게는 기구로 수행할 수 있는 세척 단계, 이어서 캐스케이드 반응을 개시하고, 마지막으로 추가의 캐스케이드 성분을 가한 후에 반응 챔버 내의 결합 개시제를 함유하는 결합체로 트리거함으로써 가능하다. 그러나, 이 실행 방법은 일반적으로 보다 많은 단계를 포함하고 바람직하지 않다. 본 발명의 방법에서는, 속도 제한 성분이 결합 쌍 반응의 하나의 구성원에 연결된 개시제 성분이 되도록 모든 캐스케이드 성분은 과량으로 사용되어야 한다. 예를 들어, 인간의 혈액 응고 캐스케이드가 시스템의 기재로서 사용되는 경우, 효소, 공인자, 기질, 및 활성제와 같은 모든 추가의 캐스케이드 성분은 과량으로서 존재하여 반응에 영향을 미치는 샘플로부터 이들 동일 성분의 결핍을 방지하여야 한다. 더구나, 샘플 내에 존재할 수 있는 천연 개시제는 건조 시약형 내에 함유된 제제에 의해 중화시킬 수 있다. 또한, 천연 개시제는 분석법을 수행하기 이전에 고정 양으로 모든 샘플을 희석시킴으로써 효과적으로 중화시킬 수 있다. 그러나, 이 방법은 추가 단계를 포함하고 희석 인자와 동량에 의해 분석물 탐지 감도를 감소시킨다.

개시제라 칭해지는 캐스케이드 시스템 내의 제1 성분은 이것이 유리 형태로는 샘플 내에 존재하지 않는 것이라는 점에서 선택하여야 한다. 예를 들어, 인자 X_a에 대한 전구체인 인자 X, 및 트롬빈에 대한 전구체인 프로트롬빈이 혈액 중에 통상적으로 존재한다. 그러나, 통상적으로는 인자 X_a또는 트롬빈 어느 것도 혈액 샘플 내에 존재하지 않는다. 트롬빈 또는 X_a중의 어느 것이 존재하는 경우라면, 이들은 혈액 중의 중성 개시제와 결합되어 불활성이 된다. 따라서, 인자 X_a및 트롬빈은 혈액 응고 캐스케이드 시스템이 사용되는 경우 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 개시제이다.

시약중, 개시제는 결합 쌍의 하나의 구성원에 화학적으로 결합되거나 또는 연결제를 통하여 공유결합되어 결합 쌍의 상기 구성원의 결합체 형태를 형성한다. 몇 가지 경우로, 먼저 배제 매카니즘이 사용되는 경우, 개시제는 긴 연결제(예, 비오틴-아비딘)에 연결됨으로써 분석물 또는 결합 쌍 파트너로부터 거리를 두고 위치될 수 있다. 다른 경우에, 개시제는 분석물 또는 결합 쌍 파트너에 인접하여 위치될 수 있다. 모든 경우, 결합체 형태가 사용된다. 따라서, 이 결합 쌍 반응에서의 상기 결합체의 반응 정도는 입체 또는 배제 매카니즘 중의 어느 것을 사용하여서도 캐스케이드 반응에 전도되어 분석 측정량을 얻게 한다. 더구나, 본 발명에서, 이 결합체는 바람직하게는 실질적으로 균질하게 혼합된 자성 입자를 함유하는 건식 화학 제형 내에 포함된다. 어떤 경우에는, 동일한 건식 화학법에서 샘플을 가하기 전에 상호작용하는 것을 피하기 위하여 분석물과 결합 쌍 파트너를 분리하는 것이 바람직 할 수 있다. 이들 경우에, 분석물 및 결합 파트너는 반응 챔버 내에서 물리적으로 분리될 수 있다, 그러나, 또한 어떤 경우에는 건식 화학 포맷으로 전환하기 전에 분석물 복사체와 그의 결합 파트너를 의도적으로 반응시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 분석법을 실행하는 동안에 샘플 분석물에 의한 복사체의 치환을 여전히 가능하게 할 것이고, 반응 시간을 연장하고 가능하게는 대류성 혼합의 증대를 요구함으로써 비분석물 중에 의한 비특이적 결합을 감소시킬 것이다. 또한 건식 화학 제형에 포함되는 것은 완충제 및 가능하게는 상기한 바와 같은 캐스케이드 시스템의 다른 성분일 수 있다.

개시제 및 그의 결합 쌍 구성원은 여러가지 방법으로 분석 시스템에서 사용할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 트리거 개시제가 사용된다. 트리거 개시제는 비록 통상적으로는 샘플 내에 존재할 수 없지만 불활성 형태로 시약내에 포함되고 열적 펄스 또는 열적 단계 작용에 의하여, 광자성(예, 광 에너지, 즉, 가시광, 자외광 또는 적외광) 펄스 또는 단계 작용에 의하여 또는 전기 에너지, 음파 에너지, 또는 개시제를 예정된 인큐베이션 시간 후에 활성 형태로 전환시키는데 충분한 다른 에너지를 유입함으로써 활성화시킬 수 있다. 트리거 개시제를 사용하는 것은 사실상 이들 반응을 연속적으로 수행시킨다는 점에서, 캐스케이드 반응으로부터 친화도 반응을 보다 잘 분리하기 위한 개선 작용을 한다. 본 발명에서, 트리거 개시제는 예를 들어 사용된 캐스케이드 시스템의 성분들로부터 선택된 개질된 효소일 수 있다. 이 개질된 효소는 캐스케이드 시스템에 초기에 배치되거나 또는 캐스케이드 시스템에 나중에 배치될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 트리거 개시제는 분석 결합 쌍의 하나의 구성원에 부착된다. 결합 쌍 구성원들 사이의 상호작용을 위한 인큐베이션 후, 개시제는 트리거되어 캐스케이드 반응을 개시하므로 개시제는 캐스케이드의 출발점이다.

다른 실시태양에서, 결합 쌍의 하나의 구성원에 결합된 효소는 프로트롬빈과 같은 지모겐인데, 이는 캐스케이드 반응을 일으키기 위하여 캐스케이드 내에 다음으로 높은 효소를 필요로 한다. 이 실시태양에서, 트리거 개시제는 결합 쌍의 구성원에 결합된 지모겐 보다 캐스케이드에서 더 높은 농도로 존재하는 효소 중의 임의의 하나일 수 있다. 또한, 캐스케이드 반응은 캐스케이드의 활성 효소 중으로 개시제를 트리거시킴으로써 개시될 것이다.

적합한 트리거 개시제의 예로는, 매우 협소한 범위에서 pH가 변화됨으로써 활성화되는 효소들을 들 수 있다(참조 : Mahler and Cordes, Biological Chemistry, Harper and Row, N.Y., 1966, pp. 263-267) 또한 일반적으로 효소는 그들의 효소적 반응에서 최적 pH 및 최적 온도를 나타내는 것으로 공지되어 있다(Mahder and Corses, pp. 263-277). 기질 결합의 열역학적 변화는 효소의 조야형 및 조작 변이체 에서 발생할 것이다. 극도의 벗어남은 효소적 반응을 위한 아레니우스 플롯에서 빈번하게 찾을 수 있고 속도 결정 단계에서의 온도의 변화 또는 효소 용매 상호작용의 총 특성의 변화로부터 발생할 수 있다. 변이는 효소 용매 쉘 또는 국소 구조 때문에 에너지 변화를 발생시킬 수 있다(참조 : Wells, et al. Biochemistry, 1991, 30, 5151-5l56).

효소는 특정 제한점 이상으로 온도를 승온시키면 더 활성적이 될 것이다. 이 제한점 이하에서는, 효소는 상당히 덜 활성적이고 그들 각각의 기질 분자를 바람직 한 속도로 처리할 수 없다. 효소의 화학적 개질은 화학적으로 개질되는 기를 주어진 파장에서 충분한 강도의 광에 노출시켜 분열시킴으로써 활성적(또는 비활성적)이 되는 것으로 공지된 형태를 의미한다(문헌: Porter et al, J Am. Chem Soc., (1989), 111, 7616; Biochem. (1990), 29, 4871 and 8042; Photochem. and Photobiol. (1990), 51, 37-43; Porter et al. 미국 특허 제5,114,851호). 그러나, 이러한 화학적으로 개질된 효소를 사용하는 것은 반응 매질 중으로 분열된 생성물을 도입할 수 있고 그리 하여 본 발명의 캐스케이드 반응 또는 캐스케이드 시간 측정을 방해한다. 불활성화 되었거나 또는 화학적 시약을 가하거나 또는 일정 pH 범위 내에 둠으로써 활성화시킨 효소 또한 공지되었지만, 이들은 결합 쌍 반응을 일으키고 분석물을 측정할 수 있는 부가적 화학 성분의 도입을 필요로 하고 부가의 단계를 필요로 하기 때문에 덜 유용하고 트리거로서도 덜 실용적이다(참조 : Blake et at., Clin. Chem. (1984), 30/9, 1452-l456; Siddigi et al. 미국 특허 제4,960,693호; Toyomaki et al., 미국 특허 제4,985,354호, Enomoto 미국 특허 제5,093,693호; 및 Hall et al. 유럽특허 출원 제0123,265호).

본 발명의 시스템을 기재로 한 트리거 개시제에서, 샘플 및 시약 중의 결합 쌍막은 샘플을 건조 시약에 가한 후 초기 인큐베이션 동안의 상호작용에 자유롭다. 이 때에 강제 대류 혼합이 바람직하게는 자성 입자의 진동 또는 순환 번역에 의해 일어날 수 있어서 개시제를 트리거하고 캐스케이드 반응을 개시하기 전에 결합 쌍반응이 진행되게 하고, 바람직하다면 평형에 가까운 조건을 제공하게 한다. 소정 시간에서, 이 트리거 반응은 시험 기구로 자동적으로 수행할 수 있다.

다른 실시태양에서는 비트리거 포맷의 개시제가 사용된다. 이 경우, 두 단계 또는 두 개의 구획 분석 결과를 얻는다. 샘플 및 개시제-결합-쌍-막-결합체를 강제 대류 혼합으로, 바람직하게는 자성 입자의 진동 또는 회전으로 소정 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 반응 혼합물을 모세관 작용 또는 펌핑으로 제2 챔버로 보내는데, 여기서 잔존하는 응고 캐스케이트 시스템의 성분은 자성 입자와 함께 건조 형태 바람직하게는 본질적으로 균질하게 혼합된 형태로 존재한다. 비록 필수적이지는 않지만, 제1 챔버 내에서 혼합시키기 위하여 사용된 자성 입자는 그 챔버 내에 자성적으로 보유되고 단지 샘플만 기구에 의하여 개시되었을때 제2 챔버 중으로 이동한다. 헤파린과 같은 제1 챔버 중의 억제제는 개시제가 캐스케이드 반응을 개시하는 것을 막는다. 이어서, 제1 챔버의 개시제는 제2 챔버에서 중화된다. 예를 들어, 헤파린은 폴리브렌 또는 프로타민으로 중화될 것이다. 이어서 자성 입자를 진동 또는 회전 자장 및 광탐지기를 사용하여 검색한다. 이 광탐지기는 바람직하게는 광 방출 이극관 원, 더 바람직하게는 900 nm에서 방출되는 이극관 원이 부착된 것이 사용된다. 응고 반응이 진행되어 겔을 형성한다. 피브린 응혈 형성과 관련된 곡선의 응혈 시간 또는 다른 특성은 종말점 또는 역학률을 측정하는데에 사용할 수 있다. 진동 시스템의 진동 피크값에 도달하기 위하여 시간에 따라 나타낸 응혈 시간이 사용될 것이다. 혈액 응고 시간을 결정하는데 있어서의 이러한 자성 입자의 용도는 오버하트의 미국 특허 제4,849,340호 및 제5,110,727호에 개시된 방법에 따라 수행될 것인데, 자성 입자 진동의 검색에 의한 응고 시간의 측정 및 이들 측정을 수행하기 위한 기구에 대한 부분을 본 명세서에서 참고문헌으로 채택한다. 바람직하게는, 고도의 대류 장에서의 응혈 시간은 회전 자장에 의하여 구동된 순환 번역 시스템에서의 반응 기선 반사율 측정값으로부터 "리프트 오프(lift off)함"으로써 측정할 수 있다. 이 경우, 응혈 시간 종말점에 도달함에 따라 자성 입자는 응집된다.

트리거 시스템에서, 모든 성분들은 바람직하게는 자성 입자를 함유하는 단일 반응 챔버 내의 건식 화학 혼합물 내에 배치될 수 있다. 이는 동일한 챔버 내에서 발생하는 측정 및 모든 반응을 가능케 하는 바람직한 실시태양이고 가장 간단한 시스템이다. 상기한 경우에서와 같이, 응고는 응혈 시간으로 판독될 것이다.

다른 실시태양으로, 응혈 시간 대신에 용혈 개시 시간이 사용될 수 있다(참조 : Oberhardt el at Dry Reagent Technology for Rapid, Convenient Measurements of Blood Coagulation and Fibrinolysis, Clin. Chem. 37, 520-526, 1991). 그러나, 용혈 기개 시스템은 캐스케이드 증폭이 적기 때문에 감도가 작을 것이다.

분석물와 농도를 측정하기 위하여, 응혈 시간 또는 용혈 개시 시간은 표준 곡선 으로부터의 농도의 관점에서 판독할 수 있다. 이는 기구에 의하여 자동적으로 수행 될 수 있을 것이다.

저분자량 종 분석 실시태양은 약 324 달톤의 심장계 약제인 퀴니딘의 분석으로 하기에 상세하게 설명할 것이다.

인자 X_a의 열적 활성가능 변이체를 개시제로서 선택하는데, 이는 목적하는 분석물, 즉, 퀴니딘에 결합된다. 이 퀴니딘은 X_a변이체 분자에 결합되어, 퀴니딘-특이적 항체와 인큐베이션됨과 동시에, 항체의 퀴니딘에 대한 겹합이 X_a변이체의 활성 자리를 방해하게 한다. 그렇지 않으면, 효소는 영향을 받지 않는다.

자성 입자로서 완충제 및 마그네타이트로서의 HEPES 또는 OWRENS와 배합 된, 상기한 X_a변이체-퀴니딘 결합체, 항-퀴니딘 항체의 고정량, 과량의 프로트롬빈, 피브리노겐, 포스포리피드, 및 인자 V, Va 및 혈소판 인자 3에 대한 과량의 억제제 (항체)를 함유하는 반응 슬라이드를 제조하였다. 이 혼합물을 반응 슬라이드의 반응 용적(챔버) 중에 가하고 동결건조시켜 건식 화학 반응 슬라이드를 제조하였다.

퀴니딘 분석을 수행하기 위하여, 반응 슬라이드를 기구 내에 배치하고 이 분석 시스템에서는 통상적으로 37℃인 작업 온도로 자동적으로 조정하였다. 한 방울의 혈액을 반응 슬라이드 및 샘플 웰에 가하였다. 혈액이 유입되어 반응물을 용해시킨다. 대류를 발생시키는 진동 자장을 인가하고 반응물을 혼합함으로써 자성 입자를 가동시켰다. 이 기간 동안에, 항-퀴니딘 항체는 X_a변이체-퀴니딘 결합체 상의 퀴니딘 및 샘플 내에 존재할 수 있는 퀴니딘에 결합된다. 결합체 및 반응에 따라 발생하는 샘플 퀴니딘 사이의 항체 고정량의 분포는 소정 인큐베이션 기간 동안에 계속된다. 이 인큐베이션의 말기에서, 온도 고정 점을 재빨리 8 ℃/분으로 증가시키고 여기서 X_a변이체가 구조적 변화를 수행하고 활성적이게 한다. 이 점에서, X_a효소는 활성 X_a효소의 농도에 비례하는 속도로 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하기 시작한다. 항체에 의하여 입체적으로 불활성화된 X_a효소는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하지 않거나 또는 극도로 낮거나 또는 무시할 수 있는 속도로 전환시킨다. 그러므로, 항체와 반응하지 않는 X_a-퀴니딘 결합체의 농도는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환율을 결정한다. 생성된 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환하여 화학적 시그널을 보다 증폭시킨다 피브린 형성이 임계 단계에 이르렀을 때, 응혈 또는 종말점은 자성 입자 움직임의 변화로 탐지할 수 있다. 열적 트리거에서부터 응혈 종말점으로의 경과 시간이 응혈 시간이다. 따라서, 응혈 시간은 샘플 내의 퀴니딘에 비례한다. 샘플 내에서의 실제적 퀴니딘 농도는 특정 다수의 반응 슬라이드에 대한 측정 기구에 저장된 표준 곡선으로부터 자동적으로 판독할 수 있다. 이 값은 바람 직하다면 혈액 세포가 차지하는 반응 용적의 비율을 보정함으로써 혈장 퀴니딘 농도로 전환시킬 수 있다. 통상적으로 헤마토크릿에 등가인 혈액 중의 총 세포 용적에 대한 보정 계수를 기구의 컴퓨터 메모리에 압력하거나 또는 이 전환을 단순 차트로부터 수행할 수 있다.

II. 고분자량 종(> 2,000 달톤) 및 세포 요소의 분석법

큰 분자량의 분석물, 폴리뉴클레오티드, 리포프로테인 및 세포를 분석하기 위하여, 분석물(즉, 항체, 수용체, 또는 상보적 폴리뉴클레오티드)의 두 개의 결합 쌍 파트너를 이용하는 시스템에서의 효소-결합 쌍 결합체를 사용하는 다른 실시태양을 사용하였는데, 여기서 결합 쌍 파트너 중 하나는 개시제에 결합되고 임의의 표면에 부착되지 않으며 나머지 하나는 개시제에 결합되지 않고 표면에 부착된다. 분석물의 두 개의 결합 쌍 파트너 각각은 분석물의 상이한 영역에 결합되고 모두 분석물에 동시에 결합할 수 있다. 이 실시태양은 배제 및 트리거됨을 기초로 한다. 이 시스템에서, 제1 결합 쌍 파트너는 고체 지지체에 공유 결합된다. 이 지지체는 반응 슬라이드 기재 재료 또는 반응 용적 중으로 대류하도록 연속적으로 가동되는 자성 입자 중 어느 것일 수 있다. 제1 결합 쌍 파트너는 과량으로 이용가능하고 분석물 분자 또는 세포의 1 이상의 영역에 결합된다. 제2 결합 쌍 파트너는 분석물 분자 또는 세포의 상이한 영역에 결합한다. 이 제2 결합 쌍 파트너는 응고 효소의 형태로 트리거 개시제에 결합된다. 이 효소는 제2 반응 챔버 중에서, 상기한 바와 같이 에너지 활성가능하다. 피브리노겐, 칼슘, 프로트롬빈과 같은 캐스케이드 성분 및 혈액 응고 캐스케이드 시스템의 다른 성분들은 Fe₃O₄와 같은 자성 입자를 함유하는 건조 시약 중의 제2 챔버 내에 존재한다. 제1 챔버 내에서 소정 인큐베이션 시간 후에, 통기구 덮개 또는 밸브를 열어 액체가 제2 챔버 중으로 들어가게 한다. 제1 챔버가 샘플 웰인 경우, 이어서 제2 챔버는 실질적으로 제1 챔버 및 단지 모세관 챔버가 된다. 액체가 모세관 챔버 중으로 유동되는 경우, 제1 챔버의 자성 입자는 액체와 함께 유동되지 않고 영구 자석 또는 D.C. 전자장을 통하여 변하지 않고 유지된다. 따라서, 단지 비결합 제 2 결합 쌍 파트너 분자만이 모세관 챔버로 들어갈 수 있다. 이 결합 쌍 파트너는 개시께 또는 혈액 응고 캐스케이드 경우의 인자 X_a와 같은 응고 효소에 결합되는데, 트리거될 때까지 불활성 상태가 유지된다. 이어서, 이 효소는 열 또는 자외광과 같은 에너지를 가함으로써 트리거되고 따라서 응고 캐스케이드를 개시한다. 따라서, 응혈 시간은 현재의 활성 개시제의 잔존 유리 농도에 반비례하므로 분석물의 농도에는 정비례한다. 이어서 분석물의 농도를 얻어진 응혈 시간을 사용하여 표준 곡선으로부터 판독한다.

고분자량 종의 실시태양을 아포리포프로테인 B-100, 아테롬성 동맥경화증의 위험과 관련된 거대 리포프로테인 분자, 및 급성 심근 경색의 마커인 CKMB에 대한 분석법으로 하기에서 설명한다.

[아포리포프로테인 B 분석법]

연결 밸브 또는 통기구 덮개를 사용하여 챔버가 2개인 건조 반응 슬라이드를 제조하므로, 요구될 때 제1 챔버로부터 액체를 기구에 의하여 제2 챔버로 이송시킬 수 있다(본 명세서에서 참고문헌으로 채택한 미국 특허 제4,849,340호 및 제5,110,727호에서 찾을 수 있는 반응 슬라이드). 제1 챔버에는 아포리포프로테인 B-100(아포 B) 분자의 특정 에피토프에 대해 특이성을 갖는 모노클 로날 항체에 결합된 소정량의 트롬빈 및 모노클로날 항체에 의하여 표적화되는 것 보다 아포 B 분자 상에서의 상이한 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 공유 결합된 폴리클로날 항체를 함유하는 자성 입자로 이루어진 건식 화학 혼합물이 있다. 트롬빈은 화학적으로 불활성화되지만, 자외광 조사로 활성화될 수 있다. 폴리클로날 항체는 입자의 매우 큰 표면 영역에 대하여 다량으로 분포된다. 제2 챔버에는 피브리노겐, 항체가 없는 자성 입자 또는 그들에 결합된 다른 제제 및 완충제(예, HEPES) 로 이루어진 건식 화학 시약이 있다. 건식 화학 시약을 만들기 위하여, 각 반응 챔버를 액체 시약 혼합물로 충전하고 총 반응 슬라이드를 동결건조시킨다.

아포 B에 대한 분석을 위하여, 반응 슬라이드를 분석 기구 내에 놓고 두 챔버를 37℃의 일정 온도로 자동 조절한다. 이어서 샘플을 샘플 웰 내에 초과량으로 가하고, 제1 챔버를 충전시키고 건조 시약을 용해시킨다. 회전 자장은 입자를 대류 혼합되게 하고 소정 인큐베이션 시간 동안 계속 혼합하였다. 이 시간 동안에, 입자상의 항체는 본질적으로 샘플 내의 모든 아포 B에 결합된다. 동시에, 트롬빈-항체 결합체의 일부는 존재하는 아포 B 분자의 수에 비례하여 아포 B에 선택적으로 결합된다. 따라서, 아포 B는 이중 결합된다. 소정 인큐베이션 시간이 종료되면 통기구 덮개를 열거나 또는 밸브를 활성화하여 반응 액체를 제2 챔버 중으로 옮긴다. 자성 입자는 제1 챔버의 아래 영역에서 D.C. 전자석의 활성화에 의하여 억제시킨다. 이어서 유리 트롬빈-항체 결합체를 함유하는 액체는 제2 챔버 중으로 이동하여 제2 건조 시약을 용해시킨다. 제2 챔버 중의 자성 입자는 소정의 짧은 시간 동안 회전 자장에 의하여 대류 모드로 구동된 다음 자외광의 단계 기능은 내부 UV 램프로부터 반응 슬라이드의 제2 챔버로 전달되거나 또는 다르게는 내부 플래쉬 튜브로부터의 일련의 플래쉬에 의하여 이동된다. 바로 이 때에, 트롬빈을 활성화하여 피브리 노겐을 피브린으로 전환시키는 응고 캐스케이드에서의 최종 단계를 개시한다. 가동 자성 입자는 광탄지기에 의하여 900 nm에서 모니터링되고 시그널 프로세싱 순환기와 연결된다. 입자 가동 신호는 응혈 종점의 정확한 측정을 가능하게 한다. UV 조사로부터 응혈 혼합까지의 경과 시간은 샘플에서의 아포 B의 농도에 비례하고 표준 곡선으로부터 판독 가능하다.

[CKMB 분석]

연결 밸브 또는 통기구 덮개를 사용하여 두 개의 챔버 건조 화학 시약을 함유하는 반응 슬라이드를 제조하므로 요구될 때, 제1 챔버로부터 액체를 분석 기구에 의하여 제2 챔버로 이송시킬 수 있다. 제1 챔버에는 심근 단백질 CKMB의 "B" 영역에 특이적인 초과량의 항체로 이루어진 건식 화학 시약 혼합물이 있다. 이 항체를 자성 산화철(Fe₃O₄) 입자에 공유 결합시켜, 각 입자의 표면적의 상당한 부분을 항체로 피복하였다. 잔존 입자 표면를 "차단"하거나 또는 결합 반응에 참가 시킴으로써 수동적으로 중화시킨다. 차단은 소의 혈청 알부민(BSA), 카제인, 또는 목적하는 반응에 참가하지 않는 다른 단백질로 나머지 표면을 피복함으로써 달성할 수 있다. CKMB의 B-영역에 대한 입자-결합 항체에 더하여, 또한 M-영역에 대한 제2 항체의 특정량이 결합체의 형태로 존재한다. 이 결합체는 러셀 살모사 독액 (RVV)에 공유 결합된 M-영역 특이적 항체로 이루어진다 RVV는 응혈 인자 X를 X_a로 전환하는 뱀의 독액이다. 이 반응 속도는 인자 V의 존재에서 증가한다. 샘플은 CKMB (심근형)를 함유하지만 또한 간섭성 물질 CKMM(골격근형) 및 CKBB(뇌형)를 함유한다. CKMM 및 CKBB의 존재하의 CKMB의 분석은 다음 방법으로 수행할 수 있다.

이 샘플을 모세관 챔버인 제1 챔버 중으로 도입한다. 샘플은 혈장, 혈청, 또는 전혈 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 존재하는 응고 캐스케이드 억제제를 표출화하기 위하여 제1 챔버로 가하기 전에 샘플을 완충제 또는 억제 혈장으로 희석시킨다. 샘플을 제1 챔버로 넣을 때, 시약은 용해되고 자성 입자는 유리되어 1800 - 3600 RPM으로 회전하는 자장 중으로 이동한다. 이는 실질적인 대류를 일으키고 입자상의 B-특이적 항체에 대한 CKMB및 CKBB의 결합을 증대시킨다. M-특이적 항체-RVV 결합체는 CKMB에 결합하고, 이는 CKMB에 결합된 입자 및 또한 가용성 CKMM에 부착된다. 대류는 소정 시간 동안 계속된다. 이어서, 통기구 덮개를 자동적으로 개폐하거나, 또는 기구를 사용하여 밸브를 열고, 반응 액체의 일부를 제2 챔버 중으로 넣고 충전하는데, 바람직하게는 제1 챔버 보다 용적을 작게 차지하도록 한다. 제1 챔버 중의 자성 입자는 회전 자장에 의하여 억제되거나 또는 다르게는 D.C. 자장의 활성화에 의하여 제1 반응 챔버의 하부로 내려가게 된다.

제2 챔버에서, 반응 액체는 응혈 인자 X, 인자 V, 포스포리피드, 프로트롬빈, 칼슘, 피브리노겐, HEPES 또는 OWRENS와 같은 완충제, 및 피복되지 않거나 또는 (BSA로 피복함으로써) 차단될 수 있는 자성 산화철 입자로 이루어진 건조 시약을 재빠르게 용해시킨다. 자성 입자를 회전 자장 또는 진동 자장에 의해 가동시킨다. 가동 자성 입자를 광탐지기로 모니터링하고 광 방출 이극관으로 900 nm에서 발광시킨다. 입자 가동은 응혈 종말점을 정확하게 결정한다. 응혈 시간은 제2반응 챔버로 들어가는 액체 내에 존재하는 RVV에 결합된 항체의 농도에 따라 역 변환한다. 이 항체-결합 RVV는 비결합 형태로 존재하거나 또는 CKMM 분자에 결합될 수 있다. 제2 챔버로 들어가지 않는 RVV에 결합된 항체는 자성 입자 상의 제1 B-영역 특이적 항체에 의하여 포획된 CKMB(CKBB가 아님) 분자에 결합된 것이다. 따라서, 제2 반응 챔버 중에서 측정한 응혈 시간은 샘플 중의 CKMB의 농도에 직접적으로 관련된다.

CKMB에 대한 상기한 형태의 분석에서, 또한 X_a분자 또는 자외광에 노출될때까지 효소로서 작용하는 것이 억제된 X_a분자로 분석법을 수행할 수 있다. 이 트리거는 건식 화학 시약이 용해되고 잘 혼합된 후에 제2 반응 챔버 중에서 수행될 것이고, 보다 정밀하고 재현가능성이 있는 분석법을 제공할 것이다.

상기한 2-챔버 분석법을 희석된 혈청, 혈장 또는 전혈과 같은 희석된 샘플을 사용하여 수행할 수 있다. 이는 개별 환자 샘플 중 응혈 인자에서의 상이점을 최소화 하기 위한 퀴니딘 분석 실시예에서 사용한 것과는 다른 방법이다. 하기하는 분석법에서, 혼주 혈장 샘플을 개별 응혈 인자(예, X, V, 포스포리피드, 프로트롬빈, 및 피브리노겐) 대신에 건조 시약으로서 사용할 수 있다.

아테롬성동맥경화증을 위한 스크리닝, 심근경색 등의 시험을 제공하는 등과 같은, 분석 패널을 제공하는 것이 바람직한 경우, 배합된 상이한 시약을 함유하는 반응 요소를 이용하는 것이 종종 필요하다. 반응 요소를 결합하기 위한 중요한 도전은 상이한 반응 성분, 상이한 건조 시간, 건식 화학 제형에서의 상이한 온도 등을 필요로 할 것이다. 패널 시험을 달성하기 위한 한 가지 방법은 통상의 샘플 웰을 패널 내에서 모두 시험하기 위하여, 그들의 통상의 개별적 제조 방법들의 상세한 설명에 따라 개별 반응 슬라이드 요소를 제조하고 프로세싱하고 나중에 이들을 결합된 포맷으로 재결합하는 것이다. 이는 제11(a)도, (b), 및 (c)도에 예시한 바와 같이 달성된다. 제11(a)도에서, 반응 슬라이드(117), (118), (119) 및 (120)은 연결 인자(121) 및 캐리어 카드(122)와 용이하게 결합된다. 반응 슬라이드와 결합될 때의 연결 인자(121)을 제11(b)도에 나타낸다. 샘플 웰(1)은 연결 인자(121)의 상부 표면에 위치하고 배출구 포트(제11(a)도의 206, 204, 204', 및 206')는 121의 하부 표면 및 반응 슬라이드(117, 118. 119 및 120) 상부 표면 상의 샘플 유입구 포트(101, 102, 103, 및 104)의 경계면 상에 각각 위치한다. 배출구 포트는 연결 인자(121) 하부 표면을 개별 반응 슬라이드(117, 118, 119 및 120)의 상부 표면에 연결시킴으로써 유체 밀집 배열 상태의 유입구 포트와 경계면을 이룬다. 반응 슬라이드 인자는 캐리어 카드(122) 상의 슬롯(125, 126, 127 및 128) 중으로 개별적으로 고정시킬 수 있고 초음파 용접, 용매 결합, 접착제 등을 사용하여 카드에 직접적으로 장착시킬 수 있다. 최종 어셈블리(124)는 연결 인자(121)을 포함할 수 있고 또한 유사한 방법으로 캐리어 카드(122)에 직접적으로 장착될 수 있다.

제11(c)도의 최종 형상에서, 패널은 용이하게 작동될 수 있다. 샘플을 샘플 웰 (201)에 가하는 경우, 이는 (모세관 작용, 압력, 진공, 또는 시린지 충전기를 통하여) 도관(202) 상으로 이동되고 이어서 도관(203 및 203')로 그리고 배출구 포트(204 및 204'), 도관(205 및 205'), 및 (206 및 206')에 분기된다. 배출구 포트(204 및 204')에서 샘플은 유입구 포트(102 및 103)으로 들어갈 것이고, 반응 슬라이드(118 및 119) 상에서 도관(106 및 107)을 통하여 각각 전진하고, 개개의 반응 챔버(110및 111)을 충전시키고, 공기 통기구(114 및 115)[이는 모세관 작용이 반응 슬라이드를 충전시키기 위한 구동력으로 사용되지 않는 경우, 소수성 막(도시하지 않음)으로 피복될 수 있음]에서 유체 흐름을 중지할 것이다. 유사하게, 샘플 충전 도관(205 및 205')는 배출구 포트(206 및 206')로 전진할 것이고 영역(101, 105, 및 109)를 통하여 역경유 하여 113 및 104, 108 및 112에서 중지되고, 반응 슬라이드(117 및 120)내의 116에서 각각 중지된다.

선행기술의 다른 동결건조법을 적용하는 경우, 개별적 기저 상에서 분석 화합물의 프로세싱 및 건조를 제공함과 동시에 다수회의 시험 또는 패널 가능성을 달성하는 것은 난이하거나 또는 불가능한 것이다(참조 : Schembi, et al., Clin. Chem., 38/9, 1665-1670 (1992)).

본 발명을 일반적으로 개시하였으며 보다 상세한 이해는 구체적인 실시예를 참고로 함으로써 얻을 수 있는데, 본 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 다르게 지시하지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되어서는 안된다.

[실시예]

1) 캐스케이드 개념을 설명하기 위하여. 한 쪽 끝에 인접한 8 × 3 mm 개환 통기구 및 6.3 mm 직경의 원형 샘플 웰 중으로 개환되어 있는 다른 끝에 2 mm로 테이퍼링된 9 mm 목 영역을 갖춘 10 × 8 × 0.178 mm의 정방형 모세관 공극으로 이루어 진 플라스틱 막으로부터 반응 슬라이드를 형성하였다. 기판은 불투명하고 백색이고, 덮개 및 스페이서는 투명하였다. 기판 및 덮개는 0.25 mm 두께이고 스페이서는 0.178 mm 두께였다. 900 nm에서 피크 광 출력값을 갖는 LED 광원 및 광탐지기 및 D.C 증폭기를 사용하여 900 nm에서의 광 산란/반사에 의해 자성 입자 앙상블 가동을 측정하기 위하여 빈 반응 슬라이드를 기구 중에 배치하였다. 반응 슬라이드 를 향하는 두 개의 6.35 mm 영역 극편을 갖춘 700 가우스의 U-형 알니코(alnico) 자석을 사용하여 진동 자장을 발생시켰다. 이 자석을 자석의 중심에서 천공된 공극을 통하여 D.C. 모터의 축에 부착시켜 중심 축에 대하여 2400 RPM으로 회전하도록 하였다. 이 극편을 반응 슬라이드 기판 아래의 5 mm 아래의 거리에 위치시켰다. 반응 슬라이드의 온도를 자석 및 반응 슬라이드 사이에 위치시킨 전기 스트립 히터를 사강하여 37℃로 유지하였다.

현탁된 자성 산화철 입자의 응고 및 피브린 응혈에서의 포획이 광 산란 및 흡광을 점진적으로 감소시키고 결과적으로 카드 기판으로부터의 배경 반사는 증가시키기 때문에, 정렬과 동시에 혈액 응고 반응을 측정하였다.

건식 화학 반응 슬라이드는 반응 슬라이드의 반응 용적에 0.5 % 소의 혈청 알부민(BSA), 10 nm 염화칼슘 및 0.1 % 3,400 달톤 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중 0.3 마이크론의 평균 입경을 갖는 Fe₃O₄(자성 산화철) 7 mg/ml의 현탁액을 배치하고 액상 질소 내에서 -195℃로 동결시킴으로서 제조하였다. 이 방법으로 반응 슬라이드를 제조하고 이어서 초기 선반 온도 -45℃의 동결건조 장치 중에서 동결건조시켰다. 생성된 건조 반응 슬라이드를 실온으로 만들고 건조제를 함유하는 지프록 (Ziplock) 자루 내어 포장하고 사용시까지 4℃에서 저장하였다.

자성 입자 검색 시스템에 면역 "전단"의 부재하에 응고 캐스케이드 시스템을 사용하여 얻을 수 있는 감도를 측정하기 위하여, 캐스케이드 반응을 다음과 같이 시험하였다: Owrens 완충제 중 트롬빈 용액 3 μl를 반응 슬라이드의 목으로 가하였다. 제2 단계에서, 7.3 마이크로몰의 소의 피브리노겐 27 μl를 가하고, 트롬빈 용액 3 μl 중에서 플러싱하였다. 이 액체를 반응 챔버 중으로 가하고, 자성 입자를 건조 시약으로부터 분리하고 생성된 물질을 회전 혼합시켰다. 트롬빈 농도에 따라 소정 시간 후에, 혈장 내의 피트리노겐을 응혈시켰다. 응혈의 진행 정도를 상기한 바와 같이 광학적으로 측정하고 종점을 용이하게 결정하였다. 제7도는 소의 트롬빈 농도에 대한 응혈 시간의 플롯을 보여주는데, 여기서 1nM/ℓ 만큼 적은양의 트롬빈이 탐지될 것이다.

2) 2-단계 캐스케이드를 설명하기 위하여, 반응 슬라이드를 실시예 1에서와 같이 제조하고, 동일한 분석 기구를 사용하였다. 이 때, 100mM 염화칼슘 중의 인자 X_a및 Owrens 완충제의 용액을 사용하였다. 이 용액 3μl를 피펫으로 취하여 반응 슬라이드의 목으로 넣었다. 제2 단계에서, 재구성된 혼주 혈장 27 μl를 가하고, X_a용액 3 μl에서 플러싱하였다. 이 액체를 반응 챔버 중으로 넣을 때, 자성 입자는 대류를 유발하는 시약으로부터 분리하였다. 자성 입자를 상기한 바와 같은 응고 종점을 측정하는 수단으로 사용하였다. 제8(a)도 및 제8(b)도는 인자 X_a농도에 대한 응혈 시간의 플롯을 나타낸다. 가한 혈장 샘플이 충분한 농도의 모든 캐스케이드 성분을 포함하는 경우, 즉, 동결건조된 혈장이 지질(1:15 토끼의 뇌 세파린, Sigma Chemi Cal Co.) 및 5 ㎍/ml의 소의 인자 V(Enzyme Research Laboratories, Inc.)로 강화되는 경우, 감도는 리터 당 X_a0.1 pM이다. 캐스케이드 반응을 위한 표준 곡선을 리터 당 X_a약 1 nM 보다 낮거나 동일한 감도로 만드는 것이 이 시스템에서 가능하다. 이는 몇 가지 캐스케이드 성분(예, 인자 V)의 농도를 최소화함으로써 달성되고 최선의 면역분석법을 위한 충분한 고유 감도를 제공할 것이다.

3) 3-단계 캐스케이드를 설명하기 위하여, 반응 슬라이드를 실시예 1에서와 같이 제조하고 동일한 분석 기구를 사용하였다.

이 실험에서, Owrens 완충제로 희석시킨 러셀 살모사 독액(RVV) 용액을 사용하였다. 이 용액 3 μl를 피펫으로 취하여 반응 슬라이드의 목으로 넣었다. 제2단계에서, 1:15 지질로 강화시킨 재구성된 혼주 혈장 27 μl를 가하고 RVV 용액 3 μl에서 플러싱하였다. 응고 종말점으로부터, 실시예 1 및 2에서와 같이 표준 곡선을 만들었다. 샘플 희석 곡선 중의 마지막 3 점은 지질-강화시킨 많은 혈장으로 얻을 수 있으므로 별도의 그래프 상에 나타내었다. 제9(a)도 및 제9(b)도는 이 시스템으로 감도가 리터 당 약 2.5 pM 보다 작거나 또는 동일한 캐스케이드 반응을 위한 표준 곡선을 얻는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 이는 아마도 실시예 2에서와 같이 혈장에 인자 V를 가함으로써 개선시킬 수 있다.

4) 개시제로서 작용이 억제된 효소를 설명하기 위하여, 인자 X_a를 알파-메틸-2-히드록시-4-디에틸아미노신남산(AMHDAC)로 불활성화시켰다. 이 화합물의 제조를 위해서는 문헌[Porter and Brunhke, Photochemistry and Photobiology, 51(1), 37-43, 1990]을 참고한다. 억제 및 광분해 반응을 다음과 같이 수행하였다: 희미한 광 또는 암실 적광 조건하에서, AMHDAC 2 mg을 메틸 알코올 2 ml 중에 용해시켰다. 이 용액 100 μl 분획을 100 mM의 염화칼슘을 포함하는 900 μl의 50/50 TRIS/메틸 알코올에 가하였다. 이 용액 202 μl 분획을 100 mM의 염화칼슘을 포함하는 TRIS 298 ㎖에 가하였다. 이 최종 용액의 한 분획을 100 mM의 염화칼슘을 포함하는 Owrens 완충제 중 1.5 × 10^-6몰 인자 X_a의 동일 용적에 가하였다. 최종 용액은 효소를 억제시키기 위하여 과량의 AMHDAC를 함유하였다. 이 반응을 혼합물 3 μl로 반응 슬라이드의 목을 충전시키고 이어서 혈장 27 μl를 첨가함으로써 30 내지 90 초마다 어두운 곳에서 분석하였다. 완전한 억제는 응혈 시간이 250 초 보다 큰 것으로서 정의하였다. 재활성화시키기 위하여, 이 용액 3 μl를 실시예 1의 반응 슬라이드 중에 배치하고 혼주 혈장 27 μl를 가하였다. 응혈 반응은 나타나지 않았다. 시험 카드를 기구로부터 제거하고 "6" 피크 강도 540 μw(마이크로와트)/cm²및 11 cm 길이의 통합 여과된 장 파장 자외광 튜브를 365 nm 4 와트로 2 초 동안 조사하였다. 이 광을 반응 슬라이드의 평면 모세관 반응 용적을 통하여 직사하였다. 이 카드를 즉시 기구로 돌리고 응혈 종점을 15 초에서 측정하였다.

따라서, 자성 입자 검색 시스템을 감도를 증대시키기 위한 캐스케이드 반응 시스템 및 결합-쌍 분석법, 또는 면역분석법 내에서의 캐스케이드 시스템을 위한 활성가능 개시제와 함께 결합시킴으로써, 빠르고, 사용하기 용이한 분석 시스템, 예를 들어, 환자가 떠나기 전에 의사의 사무실에서 결과를 제공할 수 있는, 통상적으로 비교가능한 감도의 통상의 번역분석법에서 수시간이 걸리는 것과는 달리 3 분 미만내에 제공할 수 있는 분석 시스템을 얻는다. 또한, 본 발명에 의하여 달성된 감도는 실질적으로 모든 시판 면역분석법에 대해 충분하고 결합 쌍 분석법의 다른 형태에 대해서도 충분한 범위내이다.

5) Fe₃O₄, BSA 및 PEG에 더하여, 용액을 영화칼슘에서 10 mM 및 인자 X_a에서 32 nM로 조정하는 것을 제외하고는 반응 슬라이드를 실시예 1에서와 같이 제조 하였다. 반응 슬라이드를 실시예 1에서와 같이 제조하고 이어서 실시예 1에서 사용된 기구로 시험하였다. 시험시에, 표준 시트레이트화 혈장 샘플을 반응 용적을 충전시키기에 충분한 과량으로 반응 슬라이드 샘플 웰에 단순히 가하였다. 생성된 파형을 제10도에 나타내는데, 70 초의 응혈 시간을 나타낸다. t = 0에서, 샘플을 가하여 시약을 용해시킨다 t = 70 초에서, 광학 시그널이 증가하여, 응고 종말점에 다 다르는 것을 나타낸다. 감응은 진동 또는 교류 자장으로 얻은 것과는 상이한데, 여 기서 광학 시그널은 응고 종점에서 감소한다.

명백하게, 본 발명의 많은 개질 및 변형이 상기한 관점에서 볼 때 가능하다 첨부되는 청구범위의 범위 내라면, 본 발명은 명세서에서 상세하게 설명한 바와 다르게 실시될 수도 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (86)

1. a) 분석물(analyte)의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 용혈 캐스케이드(Iytic cascade) 및 응고 캐스케이드(coagulation cascade)로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 상기 분석물을 포함하는 분석물- 접합된 개시제, 2) 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너, 및 3) 자성 입자들을 포함하는 건조 시약과 접촉시킴으로써, (i) 상기 분석물에 결합된 상기 결합 쌍 파트너, (ii) 상기 분석물-접합된 개시제에 결합된 상기 결합쌍 파트너, 및 (iii) 비결합 분석물-접합된 개시제를 포함하는 분석 혼합물을 형성하고, 상기 분석 혼합물에서 결합쌍 상호작용을 상기 반응 캐스케이드와 커플링하기 위해 입체 매카니즘(steric mechanism) 또는 배제 매카니즘(exclusion mechanism) 중의 하나가 선택되며, 상기 입체 매카니즘에서, 결합쌍 파트너가 분석물-접합된 개시제와 결합할 때, 반응 캐스케이드 개시제에 의한 반응 캐스케이드 개시가 입체적으로 차단됨으로써, 비결합 분석물-접합된 개시제의 양에 정비례하여 샘플 내 상기 분석물의 양에 정비례하는 반응 캐스케이드 속도를 제공하고, 상기 배제 매카니즘에서, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너는 고체 지지체에 결합하고, 상기 샘플 내에 존재하는 임의의 분석물은 상기 결합 쌍 파트너와의 반응을 위해 분석물-접합된 개시제와 경쟁하며, 상기 비결합 분 석물-접합된 개시제에 의한 반응 캐스케이드의 개시는 샘플 내 상기 분석물의 양에 정비례하는 반응 캐스케이드 속도를 제공하는 단계; b) 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우, (i) 상기 분석물에 결합된 상기 결합쌍 파트너 및 (ii) 상기 분석물-접합된 개시제에 결합된 상기 결합쌍 파트너를 함유하는 고체 지지체를, (iii) 상기 비결합 분석물-접합된 개시제로부터 분리하는 단계; c) (i) 상기 입체 매카니즘이 사용될 경우는 상기 분석 혼합물 또는 (ii) 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우는 상기 비결합 분석물-접합된 개시제 중의 하나를 1종 이상의 캐스케이드 성분과 인큐베이트함으로써 인큐베이션 혼합물을 형성하고, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제의 초기 반응을 상기 반응 캐스케이드의 속도-제한 단계로 만들기에 충분한 양으로 존재하며, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제에 의한 개시 후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기에 충분하고, 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되거나, 또는 상기 입체 매카니즘이 사용될 경우 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 전에 상기 건조 시약 중에 존재하거나 또는 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되는 것 중의 하나인 단계; d) 상기 분석 혼합물에 대하여 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 교류 자장을 인가하는 단계; e) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화시켜 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스케이드는 피브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계; f) 상기 자성 입자들의 자장에 대한 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계; 및 g) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드 개시제를 광 또는 열에 노출하여 활성화시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드 개시제가 반응 챔버의 제1부분으로부터 상기 반응 챔버의 제2 부분으로, 상기 입체 매카니즘이 사용되는 경우에는 상기 분석 혼합물의 이송에 의해 활성화되고, 상기 배제 매카니즘이 사용되는 경우에는 상기 비결합 분석물 접합된 개시제의 이송에 의해 활성화되며, 이 때 상기 개시제가 활성화되는 것을 방지하기 위하여 1종 이상의 억제제가 상기 제1 부분에 존재하고, 상기 1종 이상의 억제제를 중화시키고 상기 개시제를 활성화시키기 위해 1 종 이상의 중화제가 상기 제2 부분에 존재하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 항체인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체가 분석이 수행되는 반응 슬라이드의 표면인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체가 상기 자성 입자들인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체가 비자성 입자들인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드 개시제가 상기 반응 캐스케이드의 효소인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 광학 수단이 광탐지기 및 광-방출원을 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 광-방출원이 900 nm 광-방출 이극관(light- emitting diode)인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 자장이 회전 자장인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 자장이 진동 자장인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 자장이 가동 정자장인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 응고 캐스케이드가 인간 혈액 응고 캐스케이드, 소 혈액 응고 캐스케이드, 돼지 혈액 응고 캐스케이드, 소젖 응고 캐스케이드, 참게 혈임파 캐스케이드 및 곤충 혈액 응고 캐스케이드로 구성된 군으로 부터 선택되는 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분이 혼주 혈장 샘플로서 제공되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드가 포유동물의 혈액 응고 캐스케이드인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 수용체 분자인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 입체 매카니즘이 사용되는 방법.
19. 제17항에 있어서, 상기 배제 매카니즘이 사용되는 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 리간드인 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 건조 시약이 인자 IXa 접합체를 함유하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 분석물이 2000 달톤 미만의 저분자량 분자인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 분석물이 항부정맥 약제인 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 분석물이 합텐인 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 분석물이 펩타이드인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 항체이고, 상기 분석물이 세포 표면 항원인 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 항체 또는 항원이고, 상기 분석물이 각각 항원 또는 항체인 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 건조 시약이 트롬빈 접합체를 함유하는 방법.
29. 제1항에 있어서, 상기 건조 시약이 인자 X_a접합체를 함유하는 방법.
30. 제1항에 있어서, 상기 건조 시약이 인자 IX_a접합체를 함유하는 방법.
31. 제1항에 있어서, 상기 건조 시약이 러셀(Russell's) 살모사 독액 접합체를 함유하는 방법.
32. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 건조 시약과 접촉시키는 단계 이전에 상기 샘플을 희석하는 단계를 더 포함하는 방법.
33. a) 분석물의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 상기 분석물에 특이적으로 결합하며, 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된, 결합쌍 파트너를 포함하는 파트너- 접합된 개시제, 및 2) 자성 입자들을 포함하는 건조 시약과 접촉시킴으로써, (i) 상기 분석물에 결합된 상기 파트너-접합된 개시제, 및 (ii) 비결합 파트너-접합된 개시제를 포함하는 분석 혼합물을 형성하고, 상기 분석 혼합물에서 결합쌍 상호작용을 상기 반응 캐스케이드와 커플링하기 위해 입체 매카니즘이 선택되며, 상기 입체 매카니즘에서, 상기 파트너-접합된 개시제가 상기 분석물과 결합할 때 반응 캐스케이드 개시제에 의한 반응 캐스케이드 개시가 입체적으로 차단됨으로써, 비결합 파트너-접합된 개시제의 양에 정비례하여 샘플 내 상기 분석 물의 양에 반비례하는 반응 캐스케이드 속도를 제공하는 단계; b) 상기 분석 혼합물과 1종 이상의 캐스케이드 성분을 인큐베이트함으로서 인큐베이션 혼합물을 형성하고, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제의 초기 반응을 상기 반응 캐스케이드의 속도-제한 단계로 만들기에 충분한 양으로 존재하며, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제에 의한 개시 후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기에 충분하고, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 전에 상기 건조 시약 중에 존재하거나 또는 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되는 것 중의 하나인 단계; c) 상기 분석 혼합물에 대하여 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 교류 자장을 인가하는 단계 ; d) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화시켜 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스제이드는 피브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계 ; e) 상기 자성 입자들의 자장에 대한 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계 ; 및 f) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.
34. - 반응 챔버를 갖는 반응 슬라이드 ; - 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 분석용 분석물, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너 및 자성 입자들을 포함하는, 상기 반응 챔버 내에 함유된 건조 시약; - 상기 반응 캐스케이드를 개시 후 완결시키기 위한 1종 이상의 추가적인 캐스케이드 성분의 유효량; - 자장 생성 수단 및 광학 수단 ; - 및 샘플 내 분석물의 농도를 결정하기 위하여, 상기 자장 생성 수단에 의해 생성된 자장 내 자성 입자들의 반응을 나타내는 상기 광학 수단으로부터의 시그널을 증폭 및 프로세싱하기 위한 수단을 포함하는 친화도 분석 수행용 키트.
35. 제34항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 항체 또는 항원인 키트.
36. 제34항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 수용체 또는 리간드인 키트.
37. 제34항에 있어서, 상기 광학 수단이 근적외선 부근의 광조사원 및 탐지 수단을 포함하는 키트.
38. 제37항에 있어서, 상기 개시제가 광 활성화 개시제이고, 상기 광학 수단이 개시제의 활성화를 위한 자외선 광원을 더 포함하는 키트.
39. a) 1개 이상의 결합 부위를 갖는 분석물의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 상기 분석물의 제1 결합 부위에 특이적으로 결합하며, 고체 지지체 상에 고정된 제1 결합쌍 파트너, 및 2) 상기 분석물의 제2 결합 부위에 특이적으로 결합하며, 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 제2 결합쌍 파트너를 포함하는 제1 건조 시약과 접촉함으로써 제1 반응 챔버 내에 분석 혼합물을 형성하는 단계; b) 상기 분석 혼합물을 인큐베이트함으로서 (a) 제1 결합쌍 파트너/분석물/접합된 제2 결합쌍 파트너의 고정화 복합체 및 (b) 유리(free) 접합된 제2 결합쌍 파트너를 형성하는 단계 ; c) 상기 유리 접합된 제2 결합쌍 파트너를, 자성 입자들 및 개시 후 완결시키기 위한 1종 이상의 추가적인 캐스케이드 성분의 유효량을 포함하는 제2 건조 시약을 함유하는 제2 반응 챔버로 이송하는 단계; d) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화시켜 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스제이드는 피브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계; e) 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 인가된 교류 자장에 대한 상기 자성 입자들의 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계; 및 f) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 아포리포프로테인 B이고, 제1 결합 쌍 파트너가 아포리포프로테인 B의 제1 에피토프에 특이적인 폴리클로날 항체이며, 상기 개시제가 트롬빈이고, 상기 개시제에 결합된 상기 제2 항체가 아포리포프로테인 B의 제2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체이며, 상기 고체 지지체가 자성 입자들이고, 상기 추가의 캐스케이드 성분이 피브리노겐이며, 상기 제2 건조 시약이 완충제를 더 포함하고, 상기 유리 접합된 제2 결합쌍 파트너를 상기 제2 반응 챔버로 이송하기 바로 전에 자장을 인가함으로써 상기 제1 건조 시약의 상기 고체 지지체가 상기 제1 반응 챔버 내에 보유되는 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 CKMB이고, 상기 제1 결합쌍 파트너가 CKMB의 "B" 영역 에피토프에 특이적인 항체이며, 상기 고체 지지체가 자성 입자들이고, 상기 개시제가 러셀 살모사 독액이며, 상기 제2 결합쌍 파트너가 CKMB의 "M" 영역 에피토프에 특이적인 항체이고, 상기 제2 건조 시약의 상기 1종 이상의 추가의 캐스케이드 성분이 응혈 인자 X, 인자 V, 포스포리피드, 프로트롬빈, 칼슘 및 피브리노겐이면, 상기 제2 건 조 시약이 완충제를 더 포함하고, 상기 유리 접합된 제2 결합쌍 파트너를 상기 제2 반응 챔버로 이송하기 바로 전에 자장을 인가함으로써 상기 제1 건조 시약의 고체 지지체가 상기 제1 반응 챔버 내에 보유되는 방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 개시제의 활성화 단계가 상기 반응 캐스케이드 개시제에 자외선 광을 조사하는 단계를 포함하는 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가의 캐스케이드 성분이 혼주 혈장 샘플로서 제공되는 방법.
44. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 항원이고, 상기 제1 결합쌍 파트너가 폴리클로날 항체이고, 상기 제2 결합쌍 파트너가 모노클로날 항체인 방법.
45. 제39항에 있어서, 상기 건조 시약이 인자 IX_a접합체를 함유하는 방법.
46. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 2000 달톤을 초과하는 고분자량의 분자, 세포, 세포 단편 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
47. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 아포리포프로테인인 방법.
48. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 단백질인 방법.
49. 제39항에 있어서, 상기 분석물이 리포프로테인, 아포리포프로테인, 호르몬, 효소, 외재성 세포 시그널 및 구조적 요소, 내재성 세포 시그널 및 구조적 요소 및 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
50. 제39항에 있어서, 상기 건조 시약이 트롬빈 접합체를 함유하는 방법.
51. 제39항에 있어서, 상기 건조 시약이 러셀 살모사 독액 접합체 또는 인자 IX_a접합체를 함유하는 방법.
52. 제39항에 있어서, 상기 건조 시약이 인자 X_a접합체를 함유하는 방법.
53. 제39항에 있어서, 상기 샘플을 건조 시약과 접촉시키는 단계 이전에 샘플을 희석하는 단계를 더 포함하는 방법.
54. a) 1개 이상의 결합 부위를 갖는 분석물의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 상기 분석물의 제1 결합 부위에 특이적으로 결합하며, 고체 지지체 상에 고정된 제1 결합쌍 파트너, 및 2) 상기 분석물의 제2 결합 부위에 특이적으로 결합하며, 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이 드용 개시제이고 트리거될 수 있는 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 제2 결합쌍 파트너를 포함하는 건조 시약과 접촉함으로써 반응 챔버 내에 분석 혼합물을 형성하는 단계; b) 상기 분석 혼합물을 인큐베이트함으로서 (a) 제1 결합쌍 파트너/분석물/접합된 제2 결합쌍 파트너의 고정화 복합체 및 (b) 유리 접합된 제2 결합쌍 파트너를 형성하는 단계; c) 상기 유리 접합된 제2 결합쌍 파트너를 세척액으로 세척하여 상기 반응 챔버로 부터 제거함으로써, 상기 반응 챔버 내에 상기 제1 결합쌍 파트너/분석물/접합된 결합쌍 파트너의 고정화 복합체, 자성 입자들 및 잔류의 상기 세척액을 제공하는 단계 ; d) 개시 후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기 위해 1종 이상의 추가의 캐스케이드 성분 유효량을 상기 반응 챔버에 제공하는 단계; e) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 트리거하여 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스케이드는 피브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계; f) 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 인가된 교류 자장에 대한 상기 자성 입자들의 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계; 및 g) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 분석물의 농도를 결정 하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.
55. 제54항에 있어서, 상기 트리거 단계가 상기 반응 캐스케이드 개시제에 자외선 광을 조사하는 단계를 포함하는 방법.
56. 제54항에 있어서, 상기 분석물이 항원이고, 상기 제1 결합쌍 파트너가 폴리클로날 항체이고, 상기 제2 결합쌍 파트너가 모노클로날 항체인 방법.
57. - 2개의 반응 챔버를 갖는 반응 슬라이드; - 분석물의 제1 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 고체 지지체 상에 고정화된 제1 결합쌍 파트너, 및 상기 분석물의 제2 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 제 2 결합쌍 파트너를 포함하는, 제1 반응 챔버 내의 제1 건조 시약; 및 자성 입자들 및 개시 후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기 위한 1종 이상의 추가의 캐스케이드 성분 유효량을 포함하는 제2 반응 챔버 내의 제2 건조 시약을 포함하는 상기 각 반응 챔버에 함유된 건조 시약; 및 - 자장 생성 수단 및 광학 수단을 포함하는 친화도 분석 수행용 키트.
58. 제57항에 있어서, 상기 광학 수단이 근적외선 부근의 광조사원 및 탐지 수단을 포함하는 키트.
59. 제57항에 있어서, 상기 개시제가 광 활성화 개시제이고, 상기 광학 수단이 개시제의 활성화를 위한 자외선 광원을 더 포함하는 키트.
60. a) 하기 성분을 포함하는 반응 슬라이드; 1) 분석할 샘플을 넣기 위한 샘플 웰; 2) 상기 샘플 웰에 연결되어 유체 소통 상태에 있는 1개 이상의 반응 챔버 ; 및 3) 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 분석물, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너 및 1종 이상의 응고 캐스케이드 시약을 포함하는, 상기 1개 이상의 각 반응 챔버에 함유된 건조 화학 시약 및 자성 입자들; b) 1개 이상의 회전 자장 생성 수단; c) 광조사 수단 및 탐지 수단을 포함하는 1개 이상의 광학 탐지 시스템; 및 d) 샘플 내 1개 이상의 분석물의 농도를 결정하기 위하여, 상기 회전 자장 내에서의 자성 입자들의 반응을 나타내는 상기 각 광학 탐지 시스템으로부터의 시그널을 증폭 및 프로세싱하기 위한 1개 이상의 수단을 포함하는 친화도 분석 수행용 진단 시스템.
61. 제60항에 있어서, 상기 반응 슬라이드의 상기 샘플 웰이, 각각 상이한 건식 화학 제제, 각 개별 반응 챔버용 회전 자장을 생성하는 다수의 상기 수단, 각 개별 반응 챔버용 다수의 광학 탐지 시스템, 및 샘플 내의 다수의 분석물의 분석을 위한 증폭 및 시그널 프로세싱 수단을 포함하는, 평행하게 배열된 반응 챔버와 유체 소통 상태에 있는 것인 진단 시스템.
62. 제60항에 있어서, 상기 반응 챔버에 자외선 광을 전달하기 위한 수단을 더 포함하는 진단 시스템.
63. 제60항에 있어서, 상기 1개 이상의 반응 챔버들 각각이 친화도 반응 수행용 제1 챔버, 응고 캐스케이드 반응 수행용의 상기 제1 챔버와 인접하여 유체 소통 상태에 있는 제2 챔버, 상기 제1 챔버로부터 상기 인접한 제2 챔버로 액체를 이송하기 위한 수단, 및 각 챔버용 회전 자장을 포함하는 것인 진단 시스템.
64. 제61항에 있어서, 샘플 내의 다수의 분석물을 분석하기 위하여, 친화 도 반응 수행용의 평행하게 배열된 제1 챔버들, 응고 캐스케이드 반응을 수행하기 위하여 각 제1 챔버로부터 액체를 상기 각 제1 챔버에 인접하여 유체 소통 상태에 있는 제2 챔버로 이송하기 위한 수단, 각 챔버 내의 자성 입자들, 및 각 챔버용 회전 자장을 포함하는 진단 시스템.
65. 제64항에 있어서, 상기 평행하게 배열된 반응 챔버들이 개별적으로, 아테롬성 동맥경화증의 위험을 평가하기 위하여, 아포 B-100, 아포 A-1 및 아포(a) 각각의 분석을 위한 건조 시약 제제를 함유하는 것인 진단 시스템.
66. 제64항에 있어서, 상기 평행하게 배열된 반응 챔버들이 개별적으로, 급성 심근 경색의 확인을 위하여, CKMB, 트로포닌 T, 미오글로빈, 피브리노펩티드 A 및 퍼브리노겐 각각의 분석을 위한 건조 시약 제제를 함유하는 것인 진단 시스템.
67. 제60항에 있어서, 온도 조절을 위한 가열 수단, 및 반응 슬라이드와 샘플의 동정을 위한 수단을 더 포함하는 진단 시스템.
68. 제60항에 있어서, 상기 반응 챔버 내의 소수성 막으로 덮힌 통기구, 및 상기 샘플 휄로부터 상기 반응 챔버로 샘플을 이동시키기 위한 원동력을 제공하기 위하여 상기 통기구에 진공을 가하는 수단을 더 포함하는 진단 시스템.
69. 제60항에 있어서, 상기 샘플 웰 내의 유입구, 상기 반응 챔버 내의 소수성 막으로 덮힌 통기구, 및 상기 샘플 웰로부터 상기 반응 챔버로 샘플을 이동시키기 위한 원동력을 제공하기 위하여 상기 유입구에 압력을 가하는 수단을 더 포함하는 진단 시스템.
70. 제60항에 있어서, 상기 샘플 웰 내의 뤼에(Luer) 어댑터가 부착된 유입구, 상기 반응 챔버 내의 소수성 막으로 덮힌 통기구, 및 상기 샘플 웰로부터 상기 반응 챔버로 샘플을 이동시키기 위한 원동력을 제공하기 위하여 액체 샘플에 압력을 가하기 위한 상기 뤼에 어댑터에 도킹된 시린지 수단을 더 포함하는 진단 시스템.
71. a) 하기 성분을 포함하는 반응 패널 시험 카드; 1) 분석할 샘플을 넣기 위한 샘플 웰, 2) 샘플 웰에 연결되어 유체 소통 상태에 있는 다수의 반응 챔버, 및 3) 적어도 1종이 (i) 반응 캐스케이드 개시제에 접합된 분석물, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너 및 자성 입자들, 또는 (ii) 상기 분석물에 특이적으로 결합하고 반응 캐스케이드 개시제에 접합되어, 상기 결합 쌍 파트너에 대한 상기 분석물의 결합이 개시제 분자의 작용을 입체적으로 방해하는 결합쌍 파트너 및 자성 입자들 중의 하나를 반드시 포함하고, 또한 적어도 1종이 응고 캐스케이드 시약을 반드시 포함하는, 각 반응 챔버에 함유된 1 종 이상의 건조 화학 시약 혼합물, 및 자성 입자들; b) 1개 이상의 회전 자장 생성 수단; c) 광조사 수단 및 탐지 수단을 포함하는 1개 이상의 광학 탐지 시스템; 및 d) 샘플 내 분석물의 농도를 결정하기 위하여, 상기 1개 이상의 회전 자장 내에서의 자성 입자들의 반응을 나타내는 상기 광학 탐지 시스템으로부터의 시그널을 증폭 및 프로세싱하기 위한 수단을 포함하는 친화도 분석 수행용 진단 시스템.
72. 제71항에 있어서, 상기 다수의 반응 챔버 각각에 함유된 각 건조 화학 시약을, 상기 패널 시험 카드상에 배치되어 상기 샘플 웰에 연결되기 전에 상기 다수의 반응 챔버 중 나머지에 함유된 다른 건조 화학 시약의 제조 조건과 다른 제조 조건에 두는 것인 시스템.
73. a) 분석물의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드의 자이모겐에 접합된 상기 분석물을 포함하는 분석물 -접합된 자이모겐, 2) 상기 분석물과 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너, 3) 상기 반응 캐스케이드용 개시제이며, 상기 반응 캐스케이드에서 상기 자이모겐보다 상위의 반응 캐스케이드로부터의 임의의 효소인 반응 캐스케이드 개시제, 및 4) 자성 입자들을 포함하는 건조 시약과 접촉시킴으로써, 반응 챔버 내에 (i) 상기 분석물에 결합된 상기 결합쌍 파트너, (ii) 상기 분석물-접합된 자이모겐에 결합된 상기 결합쌍 파트너, (iii) 비결합 분석물-접합된 자이모겐 및 (iv) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 포함하는 분석 혼합물을 형성하고, 상기 분석 혼합물에서 결합쌍 상호작용을 상기 반응 캐스케이드와 커플링하기 위해 입체 매카니즘 또는 배제 매카니즘 중의 하나가 선택되며, 상기 입체 매카니즘에서, 결합쌍 파트너가 분석물-접합된 자이모겐과 결합할때, 자이모겐이 반응 캐스케이드에 관여하는 것이 입체적으로 차단됨으로써, 반응 캐스케이드 개시제의 활성화 후, 반응 캐스케이드가 상기 비결합 분석물- 접합된 자이모겐의 양에 정비례하여 샘플 내 상기 분석물의 양에 정비례하는 반응 캐스케이드 속도로 진행되며, 상기 배제 매카니즘에서, 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 결합쌍 파트너는 고체 지지체에 결합하고, 상기 샘플 내에 존재하는 임의의 분석물은 상기 결합 쌍 파트너와의 반응을 위해 분석물-접합된 자이모겐과 경쟁하며, 상기 반응 캐스케이드 개시제의 활성화에 의한 반응 캐스케이드의 개시가 상기 비결합 분석물-접합된 자이모겐의 양에 정비례하고 그리하여 샘플내 상기 분석물의 양에 정비례하는 반응 캐스케이드 속도를 제공하는 단계; b) 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우,(i) 상기 분석물에 결합된 상기 결합쌍 파트너 및 (ii) 상기 분석물-접합된 자이모겐에 결합된 상기 결합쌍 파트너를 함유 하는 고체 지지체를,(iii) 상기 비결합 분석물-접합된 자이모겐 및 상기 반응 캐스케이드 개시제로부터 분리하는 단계; c) (i) 상기 입체 매카니즘이 사용될 경우는 상기 분석 혼합물, 또는 (ii) 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우는 상기 비결합 분석물-접합된 자이모겐 및 반응 캐스케이드 개시제 중의 하나를 1종 이상의 캐스케이드 성분과 인큐베이트함으로써 인큐베이션 혼합물을 형성하고, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 반응 캐스케이드 개시제에 의해 활성화된 상기 자이모겐의 초기 반응을 상기 반응 캐스케이드의 속도-제한 단계로 만들기에 충분한 양으로 존재하며, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 개시후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기에 충분하고, 상기 배제 매카니즘이 사용될 경우 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되거나, 또는 상기 입체 매카니즘이 사용될 경우 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 전에 상기 건조 시약 중에 존재하거나 또는 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되는 것 중의 하나인 단계; d) 상기 분석 혼합물에 대하여 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 교류 자장을 인가하는 단계; e) 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화시켜 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스케이드는 피브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계; f) 상기 자성 입자들의 자장에 대한 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계; 및 g) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 상기 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.
74. 제73항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드 개시제가 상기 분석물에 결합한 상기 자이모겐보다 반응 캐스케이드에서 상위에 있는 트리거될 수 있는 효소인 것인 방법.
75. 제73항에 있어서, 상기 반응 캐스케이드 개시제를 광 또는 열에 노출하여 활성화시키는 방법.
76. 제73항에 있어서, 상기 결합쌍 파트너가 항체인 방법.
77. 제73항에 있어서, 상기 입체 매카니즘이 사용되는 방법.
78. 제76항에 있어서, 상기 배제 매카니즘이 사용되는 방법.
79. 제76항에 있어서, 상기 광학 수단이 광탐지기 및 광-방출원을 포함하는 방법.
80. 제79항에 있어서, 상기 광-방출원이 900nm 광-방출 이극관인 방법.
81. 제73항에 있어서, 상기 자장이 회전 자장인 방법.
82. 제73항에 있어서, 상기 자장이 진동 자장인 방법.
83. 제73항에 있어서, 상기 자장이 가동 정자장인 방법.
84. 제73항에 있어서, 상기 응고 캐스케이드가 인간 혈액 응고 캐스케이드, 소 혈액 응고 캐스케이드, 돼지 혈액 응고 캐스케이드, 소 젖 응고 캐스케이드, 참게 혈임파 캐스케이드 및 곤충 혈액 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
85. 제73항에 있어서, 상기 샘플을 건조 시약과 접촉시키는 단계 이전에 샘플을 희석하는 단계를 더 포함하는 방법.
86. a) 분석물의 존재를 분석할 샘플을 하기 성분 1) 상기 분석물에 특이적으로 결합하며, 용혈 캐스케이드 및 응고 캐스케이드로 구성된 군으로부터 선택되는 반응 캐스케이드용 개시제인 반응 캐스케이드 개시제에 접합되는, 결합쌍 파트너를 포함하는 파트너-접합된 개시제, 및 2) 자성 입자들을 포함하는 건조 시약과 접촉시킴으로써, 반응 챔버 내에 (i) 비결합 파트너- 접합된 개시제, 및 (ii) 상기 분석물에 결합된 상기 파트너-접합된 개시제를 포함하는 분석 혼합물을 형성하고, 상기 입체 매카니즘이, 상기 분석 혼합물에서 결합쌍 상호작용을 상기 반응 캐스케이드와 커플링하기 위해 선택되어, 파트너-접합된 개시제가 상기 분석물에 결합할 때 반응 캐스케이드 개시제에 의한 반응 캐스케이드 개시가 입체적으로 차단됨으로써, 상기 비결합 파트너-접합된 개시제의 양에 정비례하여 샘플 내 상기 분석물의 양에 반비례하는 반응 캐스케이드 속도를 제공하는 단계; b) 상기 분석 혼합물과 1종 이상의 캐스케이드 성분을 인큐베이트함으로서 인큐베이션 혼합물을 형성하고, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제의 초기 반응을 상기 반응 캐스케이드의 속도-제한 단계로 만들기에 충분한 양으로 존재하며, 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 개시제에 의한 개시 후 상기 반응 캐스케이드를 완결시키기에 충분하고, 또한 상기 1종 이상의 캐스케이드 성분은 상기 접촉 단계 전에 상기 건조 시약 중에 존재하거나 또는 상기 접촉 단계 후에 상기 분석 혼합물에 첨가되는 것 중의 하나인 단계; c) 상기 분석 혼합물에 대하여 진동 자장, 회전 자장 및 가동 정자장으로 구성된 군으로부터 선택되는 교류 자장을 인가하는 단계; 상기 반응 캐스케이드 개시제를 활성화시켜 상기 반응 캐스케이드를 개시하고, 상기 반응 캐스케이드가 응고 캐스케이드인 경우 응고 캐스케이드는 퍼브린 클롯의 형성으로 진행되고, 상기 반응 캐스케이드가 용혈 캐스케이드인 경우 용혈 캐스케이드는 피브린 클롯의 용혈에 의해 진행되는 단계; e) 상기 자성 입자들의 자장에 대한 반응을 광학 수단에 의해 모니터링하여 시간 변동 광학 시그널을 제공하는 단계; 및 f) 상기 시간 변동 광학 시그널을 분석하여 상기 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는 친화도 분석 수행 방법.