KR20040047144A - 미소체적 검출 방법 및 장치 - Google Patents

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KR20040047144A
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Abstract

본 발명은 샘플 중의 표적 물질과 그 표적 물질에 결합할 수 있는 수용체 사이에 친화성 반응을 행하기 위한 미소체적 반응 용기 내에 작은 면적의 멤브레인을 이용하는 친화성 반응의 미소체적 분석 방법으로서,
(1) 샘플의 미소체적을 채취하고, 샘플 중의 표적 물질이 멤브레인에 부착될 수 있도록 멤브레인에 적재(loading)하는 단계;
(2) 표적 물질과 결합할 수 있는 항체(수용체)를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 부착시키는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하면서 미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣는 단계;
(3) 상기 멤브레인에 부착된 표적 물질이 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합하여 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 반응 용기 내의 멤브레인을 배양하는 단계; 및
(4) 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
를 포함하는 미소체적 분석 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 미소체적 분석 방법을 실행하기 위한 장치를 제공한다.

Description

미소체적 검출 방법 및 장치 {MICROVOLUME DETECTING METHOD AND DEVICE}
본 발명은 미소체적 분석(microvolume assay)을 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히 본 발명은 면역검정(immunoassay)과 같은 친화성 반응(affinity reaction)에 대한 분석을 제공한다.
표적 물질(target substance)의 존재를 측정하기 위해 반응수용체(receptor) 및 표적 물질에 의해 수행되는 친화성 반응 분석기술 지시약(indicator)이 수년에 걸쳐 개발되어 왔다. 예를 들면 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 면역검정과 같이, 방사능 표지, 형광성 지시약 또는 다른 색원체(chromogenic) 지시약이 표적 물질의 존재를 측정하기 위한 표지로서 이용된다.
단클론 항체 및 기타 항체에 대한 도트-면역결합 분석법(dot-immunobinding assay)이 제시되어 있다. 그러한 분석 형태의 원리는 다음과 같다: 항원의 희석 용액 또는 현탁액을 니트로셀룰로오스 여과지 상에 점적하고, 테스트 항체 및 제1 항체에 대한 과산화물-접합(peroxide-conjugated) 제2 항체를 사용하여 도트를 배양한다. 포지티브 반응은 착색된 도트로서 검출된다. 이 분석의 장점은 (1) 분석에 필요한 항원 및 항체의 양이 적은 점, 및 (2) 니트로셀룰로오스 여과지가 거의 흰색의 바탕색을 제공하므로 포지티브 반응의 색이 용이하게 관찰되는 점이다. 참고 자료로는 Analytical Biochemistry, 119, 142-147(1982)가 있다. 그러나, 면역검정의 단점은 (1) 분석을 실행하기 위해 희석, 배양 및 세척 등의 20 단계 이상이 포함되는 복잡한 기법인 점, 및 (2) 시간 소모가 많은 점이다. 표준 분석을 실행하는 데 20시간 이상이 걸린다.
미국 특허 제4,774,177호에는 샘플 내의 항체 또는 항원의 존재를 검출하기 위한 또 다른 면역검정법이 제시되어 있다. 이 방법은 약 3mm 직경의 미세한 크기의 스폿이 안정적으로 결합된 일차 리간드(primary ligand)(헵틴 또는 항체)를 가진 니트로셀룰로오스 담체를 활용한다. 일차 리간드의 항체 결합 자리를 제외한결합 자리를 블록킹하기 위해 일차 리간드를 위해 비특이적 글로불린을 함유하는 액체로 상기 니트로셀룰로오스 담체를 처리한다. 항체를 함유하는 것으로 예상되는 액체 샘플(약 50㎕)을 니트로셀룰로오스 담체 상의 스폿에 적용한다. 다음에 니트로셀룰로오스 담체를 실온에서 충분한 시간 동안 배양하여 샘플 중에 존재할 수 있는 모든 항체가 일차 리간드에 결합하여 리간드-항체 컴플렉스(comples)를 형성하도록 한다. 이 과정에는 약 6분이 걸린다. 이어서 상기 컴플렉스에 표지된 항글로불린을 첨가하고 실온에서 약 3분간 배양하여 표지된 항글로불린이 항체-리간드 컨플렉스에 결합하도록 한다. 니트로셀룰로오스 담체를 세척하여 분석을 완결하기 위해 적합한 발색제(color developer)에 적용할 수 있도록 만든다. 그러나 상기 방법의 단계가 복잡하다. 만일 용기(container)가 준비되어 있지 않은 상태에서 니트로셀룰로오스 담체에 액체를 직접 첨가하여 항글로불린-항체-리간드 컴플렉스를 형성할 경우에는 액체는 통상 배양 과정 중에 건조된다.
본 발명은 이상과 같은 종래의 방법이 가지는 많은 결점을 극복하고 미소체적 검출법의 취급이 보다 편리하고 보다 빠르며 보다 민감한 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 샘플 중의 표적 물질과 그 표적 물질에 결합할 수 있는 수용체 사이에 친화성 반응을 행하기 위한 미소체적 반응 용기 내에 작은 면적의 멤브레인을 이용하는 친화성 반응의 미소체적 분석 방법으로서,
(1) 샘플의 미소체적을 채취하고, 샘플 중의 표적 물질이 멤브레인에 부착될 수 있도록 멤브레인에 적재(loading)하는 단계;
(2) 표적 물질과 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 부착시키는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하면서 미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣는 단계;
미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣고 표적 물질과 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 운반하는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하는 단계;
(3) 상기 멤브레인에 부착된 표적 물질이 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합하여 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 반응 용기 내의 멤브레인을 배양하는 단계; 및
(4) 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
를 포함하는 미소체적 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 미소체적 분석 방법을 실행하기 위한 장치를 제공하는 것이다.
도 1은 본 명세서의 실시예 3에 예시된 호박 황색 모자이크 바이러스(zucchini yellow mosaic virus)를 6.4(B), 3.2(C), 1.6(D), 0.8(E), 0.4(F), 0.2(G), 및 0.1(H) ng/㎕ 함유하는 테스트 샘플 및 건강한 호박 조직(A)에서 얻은 유체를 도식적으로 나타내는 그림이다. 본 발명의 방법에 적용한 테스트 샘플의 양은 0.2㎕이다.
도 2는 본 명세서의 실시예 4에 예시된 호박 황색 모자이크 바이러스를 6.4(B), 3.2(C), 1.6(D), 0.8(E), 0.4(F), 및 0.2(G) ng/㎕ 함유하는 테스트 샘플 및 건강한 호박 조직(A)에서 얻은 유체를 도식적으로 나타내는 그림이다. 본 발명의 방법에 적용한 테스트 샘플의 양은 0.5㎕이다.
상기 "친화성 반응"이란 용어는 한 쌍의 분자로서, 분자 중 하나가 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직에 특이적으로 결합하는 영역을 표면상에 또는 캐비티(cavity) 내에 가지는 것으로 정의된다. 특이적 결합 쌍의 멤버는 항원 및 항체, 상보적 핵산 단편 또는 서로의 특정 공간 및 극성 조직을 인식할 수 있는 한 쌍의 단백질을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
상기 "친화성 반응 분석"이란 용어는 면역검정 또는 혼성화 검출 방법과 같은 친화성 반응 분석의 목적을 수행하는 분석으로 정의된다. 본 발명의 실시예는 직접 검출 면역검정 또는 샌드위치 면역검정을 포함하되 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 분석은 예를 들면 효소 면역검정과 같은 친화성 결합의 분광측광 특성(spectrophotometric property)을 측정하기 위한 신호 생성 시스템을 이용할 수 있다.
상기 "표적 물질"이란 용어는 비제한적으로 리간드, DNA, RNA 항원, 병원균, 수용체 단백질, 바이오틴(biotin) 또는 아비딘(avidin)과 결합한 다른 물질 또는 다른 물질과 특정 친화성 반응을 갖는 임의의 물질을 포함하는 다른 물질과 상호 반응할 수 있는 임의의 물질을 의미한다.
상기 "수용체"란 용어는 표적 물질을 인식하고 그것과 결합할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 수용체의 예로서는 DNA, RNA 항체, 항원, 헵틴, 핵산 단편, 단백질 또는 단백질 단폄, 수용체 단편, 바이오틴 또는 아비딘과 결합한 다른 물질 또는 다른 물질과 특정 친화성 반응을 갖는 임의의 다른 물질을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 미소체적 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특징은 검출을 위해 테스트 샘플의 미소체적만을 필요로 하며, 편리하고 신속하며 민감한 검출이 가능한 점이다.
본 발명의 이론은 Michaelis-Menten 동역학(kinetics)을 기초로 한다. 특정 친화성 상호반응을 설명하기 위한 예로서 항원-항체 컴플렉스가 이용된다(테스트 샘플이 항원임).
Ag = 항원; Ab = 항체; [O] = 대상 O의 농도
라 설정하면,
컴플렉스 = 항원-항체 특이적 인식(결합)에 의해 형성된 컴플렉스;
Ag + Ab →컴플렉스
다음에, 해리 상수(dissociation constant),K d는 다음과 같이 표현된다:
K d= [Ab] × [Ab] / [컴플렉스]
대부분의 항원-항체 반응에 대해,K d는 대략 1×10-9M이며, 이것은 반응물의 총농도가 1×10-9M 이상일 때 Ag 및 Ab는 컴플렉스를 형성하는 경향을 가지는 것을 의미한다. 따라서, 항원의 농도가 매우 낮으면, Ag-Ab 컴플렉스가 형성되는 방향으로 반응을 계속 유도하기 위해 Ab의 농도를 증가시킬 수 있다. 특별한 최소체적 설계를 함으로써 유효 농도는 추가의 비용을 들이지 않고 Ab의 용이하게 증가될 수 있다. 또한, 반응물의 농도를 증가시킴으로써 테스트 스트립(strip)의 속도 및 민감성도 향상될 수 있다. 이것은 Michaelis-Menten 식에 의해 하기와 같이 표현된다:
V = Vmax[S]/([S] +K m)
상기 식에서, V 및 Vmax는 각각 반응 속도 및 최대 반응 속도를 나타내며; [S]는 기질(substrate)의 농도를 나타내며,K m은 정상 상태에서의 반응의 해리 상수를 나타낸다.
반응률을 개선하기 위한 본 발명의 이론은 Michaelis-Menten 식에 의해 하기와 같이 예시될 수 있다:
V = Vmax[Ag]/([Ag] +K d)
상기 식에서, V 및 Vmax는 각각 반응 속도 및 최대 반응 속도를 나타내며; [Ag]는 기질의 농도를 나타내며,K d는 친화성 반응의 해리 상수를 나타낸다.
상기 식을 역전(invert)시킴으로써 Lineweaver-Burk식이 얻어진다:
1/V =Kd/Vmax[Ag] + 1/Vmax
따라서, 상기 식으로부터 기질의 농도 [Ag]가 증가되면 Vmax[Ag]가 최대치에 접근하게 되고; 그에 따라Kd/Vmax[Ag]가 영(0)에 가까워지고, 1/V는 1/Vmax에 가까워진다. 즉, 반응 속도 V가 Vmax에 가까워진다. 따라서, 반응액의 최소 체적 및 키트 내의 표지된 항체의 농도가 더 높은 것을 이용하는 본 발명의 특별한 설계에 의하면, 검출 속도 및 민감성이 최대치에 접근한다.
본 발명의 방법은 간단하고 신속한 분석을 통해 표적 물질의 매우 낮은 농도를 측정하는 방법을 제공하는 점에서 종래의 방법과 다르다. 종래의 면역검정은 그 실행에 8시간이 걸리기도 하지만 본 발명에 따른 방법은 수분 내지 1시간 이내에 분석을 수행할 수 있게 한다. 본 발명은 또한 단순한 프로토콜 및 편리한 취급성을 가지므로 종래의 방법보다 우수하다.
본 발명은 샘플 중의 표적 물질과 그 표적 물질에 결합할 수 있는 수용체 사이에 친화성 반응을 행하기 위한 미소체적 반응 용기 내에 작은 면적의 멤브레인을 이용하는 친화성 반응의 미소체적 분석 방법으로서,
(1) 샘플의 미소체적을 채취하고, 샘플 중의 표적 물질이 멤브레인에 부착될 수 있도록 멤브레인에 적재하는 단계;
(2) 표적 물질과 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 부착시키는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하면서 미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣는 단계;
(3) 상기 멤브레인에 부착된 표적 물질이 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합하여 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 반응 용기 내의 멤브레인을 배양하는 단계; 및
(4) 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
를 포함하는 미소체적 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는, 비제한적으로, 직접 또는 샌드위치 방식 면역검정, 핵산 혼성화, 또는 다른 공지의 친화성 상호반응 분석을 포함하되 임의 형태의 친화성 상호반응에 적합하다.
바람직하게, 본 발명은 동물, 인간 및 식물로부터의 임의 형태의 체액 또는 조직을 검출하는 데 유용하다. 본 발명에 따르면, 유체 샘플에는, 비제한적으로, 인간 또는 동물의 체액 또는 식물 조직 내의 수액이 포함된다. 본 발명에서 이용하는 테스트 샘플에는, 비제한적으로, 항원, 항체, 병원균, 바이러스, 핵산 단편 및 단백질 단편이 포함된다. 바탕색(예를 들면, 식물 조직에서의 녹색 유체 또는혈액 샘플에서의 적색 유체)은 제거하는 것이 바람직하다. 탈색제로는 포백제, 알콜, 클로로포름, 아세톤, 사염화탄소 또는 이들의 혼합물과 같은 바탕색을 제거할 수 있는 임의의 물질이 포함된다.
본 발명에 따르면, 테스트 샘플의 표적 물질을 흡수하기 위해 사용되는 멤브레인은 표적 물질을 흡수할 수 있는 임의의 다공성 재료이면 된다. 그러한 재료에는, 비제한적으로, 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리 섬유, PVDF, 레이온, 여과지, 폴리비닐클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 디아조화 종이, 활성화 비즈(activated beads), 단백질 A(Staphylococcus aureus) 비즈, 폴리리진, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 유리 및 플라스틱 등이 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 니트로셀룰로오스가 사용된다. 멤브레인의 면적은 표지된 항글로불린을 분석할 경우 관찰 가능한 스폿을 형성할 수 있는 양으로 멤브레인이 샘플을 결합할 수 있는 범위에서 가능한 한 작은 것이다. 그 면적은 1㎟ 내지 200㎟, 예를 들면 100㎟인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 예를 들면 플라스틱 스트립과 같이 멤브레인을 실질적으로 지지하기 위해 고체상(solid phase)을 사용하는 것이 유리하다. 매우 다양한 재료 및 형상이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 스트립의 단부(端部)에 상기 멤브레인을 유지시키기 위해 테스트 스트립과 같은 스트립 또는 스틱의 일체부(integral part)를 사용한다. 고체상의 크기는 제한되지 않는다. 예를 들면, 폭은 10mm 미만, 바람직하게는 5mm 미만이다. 멤브레인을 지지하는 상기 스트립은 식물 조직, 인체, 또는 동물 신체의 표면을 뚫고 들어가서 테스트 샘플이 상기 멤브레인에 접촉하거나 또는 테스트 샘플의 표적 물질이 멤브레인 표면에 흡착될 수 있도록 예리하게 만들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 폭이 3mm 이하인 스트립이 사용된다. 또한 식물 조직을 뚫고 들어가도록 예리하게 만들어진 스트립의 한쪽 끝을 1매의 멤브레인이 덮는다.
본 발명의 방법에 적용되는 액체 테스트 샘플의 양은 매우 적으며, 바람직하게는 0.5㎕ 이하이다. 상기 멤브레인 상에 테스트 샘플을 적용하는 방법으로는 여러 가지가 공지되어 있고 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 멤브레인 상에 테스트 샘플을 적하하거나 점적할 수 있고, 및/또는 테스트 샘플 용액 속에서 멤브레인을 린스할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 멤브레인 상에 액체 테스트 샘플을 점적하기 위해 뾰족한 스틱 또는 바늘을 사용한다. 관찰 가능한 스폿은 그 직경이 0.2mm 내지 1.5mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5mm 미만이다.
미소체적 반응 용기는 본 발명에 따른 친화성 반응을 수행하는 데 사용된다. 용기의 체적이 멤브레인, 고체상, 또는 스트립을 반응 용액으로 충분히 린스할 수 있는 한 상기 용기의 형상에는 제한이 없다.
본 발명의 일 실시예에서, 미소체적 반응 용기는 원형 또는 반원형 개구 또는 플라스크 저면을 가지거나 상부와 하부로 분할되어 있다. 하부의 직경은 상부의 직경보다 작다.
본 발명에 따르면, 친화성 반응을 진행하는 표적 물질 및 수용체의 용액 중의 양은 상기 멤브레인을 완전히 린스하는 데에 충분한 양, 예를 들면 3-200㎕, 바람직하게는 20-50㎕인 것이 추천된다.
본 발명에 따르면, 테스트 샘플이 흡수되어 있는 멤브레인은 친화성 반응 및 표적 물질-수용체 컴플렉스 형성이 확실히 완결되도록 충분한 시간 동안 배양되어야 한다. 반응 체적이 매우 작기 때문에 고속 반응이 가능하다. 반응 시간은 수분에 불과하게 단축될 수 있으며, 이것은 종래의 방법보다 훨씬 짧은 것이다.
본 발명의 실행하기 위해서, 표적 물질과 결합할 수 있는 수용체는 시중에서 구입하거나 종래의 기법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체는 종래의 면역학적 기법을 이용하여 제조할 수 있다.
표적 물질-수용체 컴플렉스의 검출은 공지의 표준 친화성 반응 분석을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 신호를 생성할 수 있는 표지된 물질을 사용하여 검출을 수행할 수 있다. 본 발명에 따르면, 이들 표지된 물질에는, 비제한적으로,
(1) 효소, 예를 들면;
-겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase), 기질의 예로는 1,1'-트리메틸렌-비스(4-포르밀피리디늄 브로마이드)디옥심(TMB), 2,2'o-아지노비스(3-에틸벤지디아졸린-설폰산)(ABTS),o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD), DAB/코발트, 클로로나프톨, 또는 임의의 플루오로메트릭 또는 냉광 표지(cold light label);
-대두 과산화효소(soybean peroxidase), 기질은 상기 언급한 바와 같음;
-알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 기질은p-니트로페닐 포스페이트(PNPP), 니트로-블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트-p-톨루이딘염(NBT/BCIP), 패스트 레드(Fast Red) TR/AS 및 임의의 플루오로메트릭 또는 냉광 표지;
-β-갈락토시다아제, 기질은 예를 들면o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드(ONPG), 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드/5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG/X-Gal);
-글루코스 산화효소, 기질은 NBT, 페나진 메토설페이드(PMS);
(2) 바이오틴-아비딘;
(3) 착색된 라텍스 입자;
(4) 금속 콜로이드;
(5) 플루오로메트릭 물질; 또는
(6) 방사성 동위원소, 예를 들면,125I 및35S.
본 발명은 다양한 표적 물질을 검출하는 간단한 기술로서 고도로 숙련된 기술자가 아니라도 분석을 수행할 수 있는 기술을 달성한다. 이 목적은 검출 측정이 가시적 검사에 의한 것일 때 매우 중요하다. 특히, 바람직하게는 예를 들면 과산화효소, 착색된 라텍스 입자 및 금속 콜로이드와 같은 발색제를 사용하여 신호를 육안으로 관찰할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 알칼리성 인산가수분해효소가 사용된다.
표지 물질 및 수용체의 접합(conjugation)은 표지 결합 수용체(label-bound-receptor)를 표적 물질과 결합하기 전에 실행될 수 있다. 효소는 특정 항-면역글로불린에 공유결합을 이룰 수 있고, 이어서 이것은 존재 여부를 측정하고자 하는 항체에 결합된다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 표적 물질이 수용체에 결합되고 신호를 생성하도록 제2의 표지된 수용체가 첨가되는 "샌드위치 면역검정"에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 표적 물질-수용체 컴플렉스는 비특이적으로 결합된 타깃, 수용체 및/또는 표지 물질을 제거하기 위해 주의 깊게 세척해야 한다. 세척용 완충액은 물, 인산완충염(phosphate-buffered saline; PBS), 트리스-완충염(TBS), 또는 염 용액일 수 있다. 필요할 경우, Tween-20, Triton-X 100과 같은 계면활성제를 첨가할 수 있다.
본 발명에 따르면, 충분한 시간 동안 배양한 후, 신호 생성 물질이 신호를 발생한다. 결과의 잘못된 유도를 피하기 위해 반응을 정지시키기 위해 종결 용액(stopping solution)을 첨가할 수 있다. 예를 들면 효소와 물질의 상호반응이 완결된 후, 전술한 종결 용액 또는 다른 종결제를 가하여 반응을 정지시킨다.
본 발명에 따른 희석용 완충액은 소량의 단백질, 예를 들면 0.5-15%의 탈지 우유, 0.1-5% 소혈청 알부민, 계란 알부민 또는 이들의 혼합물을 함유하는 세척용 완충액일 수 있다. 필요할 경우, Tween-20, Triton-X 100 등과 같은 계면활성제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 친화성 반응의 미소체적 분석 방법은 샘플 중의 표적 물질과 그 표적 물질에 결합할 수 있는 수용체 사이에 친화성 반응을 행하기 위한 미소체적 반응 용기 내에 작은 면적의 멤브레인을 이용하며,
(1) 샘플의 미소체적을 채취하고, 샘플 중의 표적 물질이 멤브레인에 부착될 수 있도록 멤브레인에 적재하는 단계;
(2) 선택적으로, 탈색 용액 중에서 상기 멤브레인을 충분한 시간 동안 린스하는 단계;
(3) 미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣고 표적 물질과 결합할 수 있고 신호 발생 화합물로 표지된 수용체를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 부착시키는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하는 단계;
(4) 상기 멤브레인에 부착된 표적 물질이 친화성 반응을 통해 상기 수용체에 결합하여 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 반응 용기 내의 멤브레인을 배양하는 단계;
(5) 상기 단계 (4)에서 처리된 상기 멤브레인을 여러 번 세척하여 결합되지 않은 수용체 용액을 제거하는 단계; 및
(6) 신호를 관찰하여 표적 물질의 존재를 결정하는 단계
를 포함한다.
상기 검출 분석은 표지된 수용체 및 표적 물질(들)과 친화성 반응을 진행함으로써 하나 또는 여러 개의 표적 물질을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 단일 액체 테스트 샘플 중에서 하나 이상의 표적 물질의 존재를 동시에 검출하는 방법을 제공한다. 제1 수용체에 결합할 수 있는 상기 멤브레인에는 하나 또는 여러 개의 스폿이 결합되었다. 멤브레인을 블록킹하고 간섭을 회피하기 위해 희석 완충액이 첨가된다. 상기 멤브레인은 제2 수용체와 함께 배양된다. 하나 이상의 표적 물질의 존재를 검출하는 방법은:
(1) 표적 물질과 결합할 수 있는 제1 수용체의 하나 이상의 스폿을 멤브레인 상에 안정하게 결합시키는 단계;
(2) 소량의 단백질을 함유하는 용액을 첨가하여 멤브레인을 블록킹하는 단계;
(3) 샘플의 미소체적을 채취하여 상기 멤브레인의 스폿(들)에 적재하는 단계;
(4) 선택적으로, 샘플이 흡착되어 있는 멤브레인을 탈색 용액 중에서 충분히 탈색할 수 있는 시간 동안 린스하는 단계;
(5) 멤브레인을 미소체적 반응 용기 내부에 넣는 단계;
(6) 표적 물질과 결합할 수 있는 제2 수용체 용액 2-200㎕를 미소체적 반응 용기에 첨가하고, 멤브레인 스트립 상에 부착된 표적 물질이 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성하기 위해 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합될 수 있도록 하는 충분한 시간 동일 반응 용기에서 멤브레인을 배양하는 단계;
(7) 필요할 경우, 추가의 제2 수용체 용액을 제거하기 위해 상기 단계 (6)에서 처리된 멤브레인을 여러 번 세척하는 단계; 및
(8) 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 또한 샘플 중의 표적 물질과 상기 표적 물질과 결합할 수 있는 수용체 사이의 친화성 반응의 미소체적 분석 방법을 실행하는 장치로서,
(1) 표적 물질이 멤브레인 상에 흡착될 수 있도록 표면에 샘플이 적재되는 멤브레인;
(2) 표적 물질 및 수용체가 친화성 반응을 진행하여 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성하는 미소체적 반응 용기; 및
(3) 표적 물질-수용체 컴플렉스의 검출에 사용하기 위한 구성 요소
를 포함하는 미소체적 분석 장치를 제공한다.
상기 장치는 친화성 반응의 미소체적 분석을 수행하기 위해
(4) 마이크로피펫;
(5) 다른 반응물을 담는 병; 및
(6) 대조 스트립(control strip), 즉 샘플에 대한 비교로서 표적 물질의 존재를 측정하기 위해 충분한 양의 표적 물질을 흡착한 멤브레인
을 포함하는 추가 구성 요소를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 친화성 반응 분석을 수행하기 위한 장치로서,
(1) 표적 물질을 흡착할 수 있는 멤브레인을 지지하는 스트립 또는 스틱인 테스트 스트립;
(2) 미소체적 반응 용기;
(3) 표지되거나 표지된 물질에 결합될 수 있는 수용체에 결합할 수 있는 물질을 담는 병;
(4) 신호 발생제를 담는 병; 및 필요에 따라 추가로
(5) 마이크로피펫;
(6) 다른 반응물을 담는 병; 및
(7) 대조 스트립, 즉 샘플에 대한 비교로서 표적 물질의 존재를 측정하기 위해 충분한 양의 표적 물질을 흡착한 멤브레인
을 포함하는 미소체적 분석 장치를 제공한다.
하기 실시예는 예시를 목적으로 제시되는 것이며 제한를 목적으로 하는 것이 아니다.
실시예 1: 표지된 항체의 제조
정제된 호박 황색 모자이크 바이러스(1mg/mL)를 완전 또는 불완전 아쥬번트와 격렬히 혼합하여 뉴질랜드 토끼에게 주사하고 7일마다 재챌린지(rechallenge)한다. 1개월 후에 바이러스에 대한 최적 항체 반응이 얻어진다. 암모늄설페이트 침전 및 DEAE 컬럼 크로마토그래피 분리에 의해 토끼 항바이러스 IgG를 얻고 이어서 겨자무 과산화효소와 접합시킨다. 또한 1.5% 소혈청 알부민 및 0.1% Tween-20 포소(phoso)-완충 염(PBS) 용액을 반응 용액에 첨가한다.
실시예 2: 테스트 스트립의 제조
플라스틱 스트립을 3mm×75mm 크기로 절단하고, 그 플라스틱 스트립에3mm×5mm 크기의 니트로셀룰로오스를 부착한다.
실시예 3: 미소체적 반응 검출 분석
1.호박 황색 모자이크 바이러스를 6.4ng/㎕, 3.2ng/㎕, 1.6ng/㎕, 0.8ng/㎕, 0.4ng/㎕, 0.2ng/㎕ 및 0.1ng/㎕ 함유하는 표준 테스트 샘플과 건강한 호박의 조직으로부터 유체 0.2㎕를 채취한다.
2.이어서, 건강한 호박의 조직 및 표준 테스트 샘플로부터 채취한 상기 유체를 실시예 2에 의거한 테스트 스트립의 멤브레인 상에 점적한다. 스폿의 직경은 0.5mm 미만인 것이 바람직하다.
3.실시예 1에서 제조된 반응 용액 25㎕를 피펫으로 채취하여 미소체적 반응 용기에 넣는다.
4.상기 단계 2에서 제조된 호박 조직으로부터의 유체를 흡수한 스트립을 상기 용기 내에서 린스하고 40분간 배양한다.
5.스트립을 세척용 완충액으로 세척한다.
6.스트립을 발색제가 담긴 병에 넣고 7분간 배양한다.
7.스트립을 탈색 용액 중에 담그면 스트립의 녹색 바탕색을 제거할 수 있다. 스트립을 깨끗한 흡수지에 블롯팅하여 과량의 발색 용액을 제거한다.
도 1에 나타낸 결과는 건강한 호박 조직에서 채취한 유체는 변색이 없으나 호박 황색 모자이크 바이러스를 6.4ng/㎕(B), 3.2ng/㎕(C), 1.6ng/㎕(D), 0.8ng/㎕(E), 0.4ng/㎕(F), 0.2ng/㎕(G) 및 0.1ng/㎕(H) 함유하는 테스트 샘플은 선명한 발색이 있다. 상기 방법은 0.02ng까지 도달할 수 있는 높은 검출 감도를제공한다.
실시예 4: 미소체적 반응 검출 분석
1.호박 황색 모자이크 바이러스를 6.4ng/㎕, 3.2ng/㎕, 1.6ng/㎕, 0.8ng/㎕, 0.4ng/㎕, 및 0.2ng/㎕ 함유하는 표준 테스트 샘플과 건강한 호박의 조직으로부터 유체 0.5㎕를 채취한다.
2.이어서, 건강한 호박의 조직 및 표준 테스트 샘플로부터 채취한 상기 유체를 실시예 2에 의거한 테스트 스트립의 멤브레인 상에 점적한다. 스폿의 직경은 0.5mm 미만인 것이 바람직하다.
3.상기 스트립을 탈색 용액 중에 담그면 스트립의 녹색 바탕색을 제거할 수 있다. 스트립을 깨끗한 흡수지에 블롯팅하여 과량의 발색 용액을 제거한다.
4.실시예 1에서 제조된 반응 용액 25㎕를 피펫으로 채취하여 미소체적 반응 용기에 넣는다.
5.호박 조직으로부터의 유체를 흡수한 스트립을 상기 용기 내에서 린스하고 40분간 배양하여 반응을 완결시킨다.
6.스트립을 세척용 완충액으로 세척한다.
7.스트립을 발색제가 담긴 병에 넣고 5분간 배양한다.
도 2에 나타낸 결과는 건강한 호박 조직에서 채취한 유체는 변색이 없으나 호박 황색 모자이크 바이러스를 6.4ng/㎕(B), 3.2ng/㎕(C), 1.6ng/㎕(D), 0.8ng/㎕(E), 0.4ng/㎕(F), 및 0.2ng/㎕(G) 함유하는 테스트 샘플은 선명한 발색이 있다. 상기 방법은 0.1ng까지 도달할 수 있는 높은 검출 감도를 제공한다.
본 발명에 따르면 취급이 보다 편리하고 보다 빠르며 보다 민감한 미소체적 검출 방법이 제공된다.

Claims (36)

  1. 샘플 중의 표적 물질(target substance)과 상기 표적 물질에 결합할 수 있는 수용체(receptor) 사이에 친화성 반응(affinity reaction)을 행하기 위한 미소체적(microvolume) 반응 용기 내에 작은 면적의 멤브레인을 이용하는 친화성 반응의 미소체적 분석 방법으로서,
    (1) 상기 샘플의 미소체적을 채취하고, 샘플 중의 표적 물질이 상기 멤브레인에 부착될 수 있도록 상기 멤브레인에 적재(loading)하는 단계;
    (2) 상기 표적 물질과 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액을 첨가하되, 상기 용액의 체적은 상기 샘플을 부착시키는 상기 멤브레인의 전체 면적을 적시기에 충분하도록 첨가하면서 상기 미소체적 반응 용기 내부에 상기 멤브레인을 넣는 단계;
    (3) 상기 멤브레인에 부착된 상기 표적 물질이 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합하여 표적 물질-수용체 컴플렉스(complex)를 형성할 수 있도록 충분한 시간 동안 상기 반응 용기 내의 상기 멤브레인을 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
    를 포함하는 미소체적 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1') 상기 단계 (2)에 앞서, 상기 멤브레인을 탈색시키기에 충분한 시간 동안 상기 멤브레인을 탈색 용액 중에 담그는 단계; 및
    (3') 상기 단계 (4)에 앞서, 상기 멤브레인을 탈색시키기에 충분한 시간 동안 상기 멤브레인을 탈색 용액 중에 담그는 단계
    를 추가로 포함하고,
    (4') 상기 단계 (4)는 상기 표적 물질-수용체 컴플렉스에 결합한 표지가 신호를 발생하고, 상기 표적 물질의 존재를 결정하도록 상기 신호를 관찰하는
    미소체적 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    0.5㎕의 테스트 샘플을 사용하는 미소체적 분석 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    관찰 가능한 스폿을 형성하기 위해 예리한 스틱(stick) 또는 바늘을 사용하여 상기 샘플을 상기 멤브레인 상에 스폿팅하는 미소체적 분석 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 스폿의 직경이 1mm 미만인 미소체적 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 스폿의 직경이 0.5mm 미만인 미소체적 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    3-200㎕의 수용체 용액이 사용되는 미소체적 분석 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    20-50㎕의 수용체 용액이 사용되는 미소체적 분석 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인의 재료가 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리 섬유, PVDF, 레이온, 여과지, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 디아조화 종이(diazotized paper), 활성화 비즈(activated beads), 단백질 A(Staphylococcus aureus) 비즈, 폴리리진, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 유리 및 플라스틱으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미소체적 분석 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인이 니트로셀룰로오스인 미소체적 분석 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 표적 물질-수용체 컴플렉스의 검출이 상기 컴플렉스에 신호 발생 화합물로 표지(labeling)함으로써 분석되는 미소체적 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표지가 발색제(color developer)인 미소체적 분석 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 표지가 효소, 착색된 라텍스(latex) 입자, 또는 금속 콜로이드인 미소체적 분석 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 표지가 효소인 미소체적 분석 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 샘플이 액체 샘플인 미소체적 분석 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 샘플이 식물 조직 유체(plant tissue fluid)인 미소체적 분석 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 샘플이 동물 체액(동물 혈청, 완전 혈액, 플라스마, 또는 소변)인 미소체적 분석 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 샘플이 미생물 성장 배지인 미소체적 분석 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 미소체적 반응 용기가 직경이 10mm 미만인 원형, 타원형 또는 반원형 개구(opening)를 가지는 미소체적 분석 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 미소체적 반응 용기가 플라스크 저면을 가지는 미소체적 분석 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 미소체적 반응 용기가 상부 및 하부로 분할되고, 상기 하부는 상기 상부의 직경보다 작은 직경을 가지는 미소체적 분석 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 미소체적 반응 용기가 상부 및 하부로 분할되고, 상기 하부는 상기 상부의 직경보다 짧은 직경을 가지는 미소체적 분석 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 멤브레인이 고체상(solid phase)의 스틱(stick)인 미소체적 분석 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 고체상이 플라스틱 스트립인 미소체적 분석 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 표적 물질을 동시에 검출하기 위해 적용될 수 있는 미소체적 분석 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 표적 물질과 결합할 수 있는 수용체 용액을 활용할 수 있는 미소체적 분석 방법.
  27. 반응이 진행되는 미소체적 반응 용기 내에 면적이 작은 멤브레인을 이용하여 하나 이상의 표적 물질의 존재를 검출하는 방법으로서,
    (1) 상기 표적 물질과 결합할 수 있는 제1 수용체의 하나 이상의 스폿을 멤브레인 상에 안정하게 결합시키는 단계;
    (2) 멤브레인을 블록킹하는 단계;
    (3) 샘플의 미소체적을 채취하여 상기 멤브레인의 스폿(들)에 적재하는 단계;
    (4) 필요할 경우, 상기 샘플이 흡착되어 있는 상기 멤브레인을 탈색 용액 중에서 충분히 탈색할 수 있는 시간 동안 린스(rinse)하는 단계;
    (5) 상기 단계 (4)에서 처리된 상기 멤브레인을 상기 미소체적 반응 용기 내부에 넣는 단계;
    (6) 표적 물질과 결합할 수 있는 제2 수용체 용액 2-200㎕를 상기 미소체적 반응 용기에 첨가하고, 멤브레인 스트립 상에 부착된 상기 표적 물질이 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성하기 위해 친화성 반응에 의해 상기 수용체에 결합될 수 있도록 하는 충분한 시간 동안 상기 반응 용기에서 상기 멤브레인을 배양하는 단계;
    (7) 필요할 경우, 추가의 제2 수용체 용액을 제거하기 위해 상기 단계 (6)에서 처리된 상기 멤브레인을 여러 번 세척하는 단계; 및
    (8) 상기 표적 물질-수용체 컴플렉스를 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 물질 검출 방법.
  28. 제1항에 정의된 바와 같은, 샘플 중의 표적 물질과 상기 표적 물질과 결합할 수 있는 수용체 사이의 친화성 반응의 미소체적 분석 방법을 실행하기 위한 장치로서,
    (1) 상기 표적 물질이 멤브레인 상에 흡착될 수 있도록 상기 샘플이 적재되는 멤브레인;
    (2) 상기 표적 물질 및 상기 수용체가 친화성 반응을 진행하여 상기 표적 물질-수용체 컴플렉스를 형성하는 미소체적 반응 용기; 및
    (3) 상기 표적 물질-수용체 컴플렉스의 검출에 사용하기 위한 구성 요소
    를 포함하는 미소체적 분석 장치.
  29. 제28항에 있어서,
    (4) 마이크로피펫;
    (5) 다른 반응물을 담는 병; 및
    (6) 대조 스트립(control strip), 즉 샘플에 대한 비교로서 상기 표적 물질의 존재를 측정하기 위해 충분한 양의 표적 물질을 흡착한 멤브레인
    을 추가로 포함하는 미소체적 분석 장치.
  30. 제28항에 있어서,
    (7) 상기 표적 물질을 흡착할 수 있는 멤브레인을 지지하는 로드(rod) 또는 스틱인 테스트 스트립;
    (8) 미소체적 반응 용기;
    (9) 표지되거나 표지된 물질에 결합될 수 있는 상기 수용체 용액에 결합할 수 있는 반응물을 담는 병;
    (10) 신호 발생 반응물을 담는 병, 및
    필요할 경우,
    (11) 마이크로피펫;
    (12) 다른 반응물을 담는 병; 및
    (13) 대조 스트립, 즉 샘플에 대한 비교로서 상기 표적 물질의 존재를 측정하기 위해 충분한 양의 표적 물질을 흡착한 멤브레인
    을 추가로 포함하는 미소체적 분석 장치.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 스트립에 결합된 상기 멤브레인이 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리 섬유, PVDF, 레이온, 여과지, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 디아조화 종이, 활성화 비즈, 단백질 A(Staphylococcus aureus) 비즈, 폴리리진, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 유리 및 플라스틱으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미소체적 분석 장치.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 스트립에 결합된 상기 멤브레인이 니트로셀룰로오스인 미소체적 분석 장치.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 표적 물질-수용체 컴플렉스의 검출이 상기 컴플렉스에 신호 발생 화합물로 표지함으로써 분석되는 미소체적 분석 장치.
  34. 제28항에 있어서,
    상기 표지가 발색제인 미소체적 분석 장치.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 표지가 효소, 착색된 라텍스 입자, 또는 금속 콜로이드인 미소체적 분석 장치.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 표지가 효소인 미소체적 분석 장치.
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