JP2514878B2 - 固相アッセイ装置及びその使用法 - Google Patents

固相アッセイ装置及びその使用法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】本発明は一般に、分析装置及び方法に関す
る。更に詳細には、本発明は、結合アッセイの実施の際
有用な新規な材料、改良分析装置、並びにこの材料及び
装置を利用してアッセイを行なう方法に関する。本発明
の概念は、血清、血しょう、全血、尿、脊髄及び羊膜
液、粘膜液等のような生物流体及び生産物の酵素イムノ
アッセイの実施の際特に有利である。
【０００２】
【背景技術】流体その他の材料中存在することがある、
興味ある又は臨床上の意義のある物質の存在及び（又
は）濃度を決定するアッセイにおいて、種々の分析操作
及び装置が広く用いられている。このような臨床上の意
義又は興味がある物質は、普通「分析物」（ａｎａｌｙ
ｔｅ）と称され、例えば、抗体、抗原及び「リガンド」
（ｌｉｇａｎｄ）という用語で普通知られている広い範
ちゅうの物質を含むことができる。特に疾病又はその他
の人体の条件に関しては、適時の、臨床上意義のあるい
くつかの分析物の、生物液中の存在又は量の精密な決定
は、健康管理専門家が病的生理不全を処置管理し、又妊
娠のような生理条件を早期かつ精密に決定することがで
きるのに大きな影響を有する。
【０００３】人体の種々の障害又は条件の診断の際次第
に応用されている１つのアッセイ法は、結合アッセイ、
特に酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）として知られる型の
結合アッセイである。ＥＩＡ技術は、高等生物の免疫系
を利用し、系中生物に病原性又は異質である物質（即
ち、抗原）の生物中の存在に反応して抗体が生じる。１
種又はそれ以上の抗体が特定の抗原に反応して生じ、又
それと反応することができ、それによってその特定の抗
原を測定するのに、試験管内で、有利に利用することが
できる高度に特異性の反応機構がつくり出される。
【０００４】常用のＥＩＡ操作は、液体試薬を使用する
一連の湿式化学工程を含み、アッセイ中の試料生物流
体、例えば、尿、全血又は血清の試験試料中の抗原又は
抗体が検出される。１つの型のＥＩＡ操作においては、
試料中の分析物は、はじめ試料中に導入される対応する
抗原又は抗体試薬に結合するようになる。次に、他の抗
原又は抗体が導入される。しかし、この第２の抗原又は
抗体は、多くは追加の適当な色原体又は色素のような指
示試薬と反応する時又はその存在下に、発色のような検
出可能な反応を生じるか又は引きおこすことができる酵
素その他の物質で標識又はコンプレックス化されてい
る。次にこのようにして生じた検出可能な反応を、原試
料中存在する抗原又は抗体の存在又は量の指示又は尺度
として、可視的に又は機器により、読みとり解釈するこ
とができる。
【０００５】固相ＥＩＡ操作は一般に、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）その他の常用の湿式化学法のような従
来用いられている液体試薬結合アッセイ技術に比して、
安全、使用の容易さ、特異性及び感度の故に、抗体及び
抗原のアッセイに対して共に好適であると考えられる。
更に、分光光度計の使用のような、機器により発色を読
む可能性は、多くの固相ＥＩＡ技術の特徴であり、その
結果それらは広く使用されている。
【０００６】かくして、１つの型の常用の固相ＥＩＡ
「サンドイッチ」アッセイにおいては、興味のある抗体
又は抗原を含有することが疑われている試験試料は、表
面上に抗原又は抗体の固定化によるか又はそれとの化学
結合によってそれを支持体の表面に保持することができ
るタンパクまたはその他の物質で予め被覆されている固
体の、実質的に不活性なプラスチック又はガラスビー
ズ、その他の支持材料とはじめに接触させられる。第２
の抗原又は抗体〔これは、普通酵素と結合（化学的に結
合）されている〕を次に添加し、この第２の種は、支持
体上対応する抗体又は抗原に結合するようになる。１回
又はそれ以上の洗浄工程によって非結合材料を除去して
後、指示薬物質、例えば、酵素の存在下に反応性である
色原体物質を次に添加し、酵素の存在に対するその感受
性により、検出可能な色反応を生じる。発色反応、その
密度等は、試料中に存在した抗原又は抗体量を可視的に
又は機器により決定することができ、それと相関させる
ことができる。
【０００７】このようなアッセイ技術、並びにこのよう
なアッセイにおいて必要な免疫学的反応及び変化を行な
うための固相ビーズその他の支持体は周知であるが、欠
点がないわけではない。例えば、アッセイを実施し、又
用いられる液体試薬を含有する精巧な装置が必要である
結果、特に個々の試料の低容量試験のためには、実質な
労力及び装置のコストがかかることが多い。更に、この
ようなアッセイと結びつけられた常法で被覆された支持
体その他の装置を製造することはしばしば困難で、特定
のアッセイに対して、所定の感度及び特異性の要求に適
合せしめるように、その中に使用される材料すべてを特
別に設計することは難かしく、このようなアッセイの精
度及び再現性を最適のものとすることは難かしい。従っ
て、ＥＩＡ操作において有利に使用することができ、又
多くの面倒な湿式化学工程又は複雑な機器の必要なし
に、前述したような常用の方法に比して迅速、敏感かつ
高度に再現性の結果を生じることができる、比較的単純
な、使用容易かつ比較的安価な固相材料及び分析装置が
必要であるのである。
【０００８】
【発明の要約】本発明は、前述した必要性に直接向けら
れ、一面においては、試験試料中分析物の存在又は量を
決定するため結合アッセイの実施の際有用である新規な
材料、並びにこの材料を利用するアッセイを提供する。
他の一面においては、本発明は、改良固相分析装置、並
びにこの装置を使用する結合アッセイを提供し、それは
先行技術の装置及びアッセイ法よりきわめて有利であ
る。尚別の一面においては、本発明は、固相分折装置の
使用について独特の、内蔵された操作のコントロールを
提供する。尚別の一面においては、本発明は、固相分析
装置中液流を制限する障壁手段を提供する。
【０００９】本発明の新規な材料は、繊維の多孔性マト
リックス及び約０．１〜約１０ミクロン、好適には約
０．１〜５ミクロンの平均直径を有する、複数の実質的
に球形の固体粒子よりなり、粒子は、繊維上マトリック
ス内に保持固定されている。好適な１実施態様において
は、粒子は、その表面上試料中の分析物と反応すること
ができる物質を有している。更に１実施態様において
は、粒子の平均直径は、マトリックスの平均孔径より小
さい。
【００１０】つまり、本発明は、試験試料中の分析物の
存在又は量を決定するための結合アッセイにおいて有用
な材料であって、繊維の多孔性マトリックス及び０．１
〜５ミクロンの平均直径を有する実質的に球形の複数の
固体粒子よりなり、該粒子の平均直径は該マトリックス
の平均的孔の大きさよりも小さいものであり、そこでは
該粒子はその表面上に、該試料中の分析物と結合するこ
とができる物質を有し、粒子が繊維上で該マトリックス
内に保持固定されてなる材料を提供することに関するも
のである。
【００１１】さらに、また本発明は、流体試料中の分析
物の存在又は量を決定するための結合アッセイにおいて
有用な固相アッセイ装置であって、繊維の多孔性のマト
リックス及び０．１〜５ミクロンの平均直径を有する実
質的に球形の複数の固体粒子を有し、該粒子の平均直径
は該マトリックスの平均的孔の大きさよりも小さいもの
であり、そこでは該粒子はその表面上に、該試料中の分
析物と結合することができる物質を有し、粒子が繊維上
で該マトリックス内に保持固定されてなる材料の実質的
に平面の層よりなり、該実質的に平面の層は第１の試料
接触面及び該第１の面に相対している第２の面を有し、
そしてアッセイの実施に装置が使用されている時、第１
の面に接触する試料の次の工程よりなる試験試料中の分
析物の存在又は量を決定するための結合アッセイ方法で
あって：
【００１２】ａ）繊維の多孔性マトリックス及び０．１
〜５ミクロンの平均直径を有する実質的に球形の複数の
固体粒子よりなり、該粒子の平均直径は該マトリックス
の平均的孔の大きさよりも小さいものであり、そこでは
該粒子はその表面上で、該試料中の分析物と反応するこ
とができる物質を有し、粒子が繊維上該マトリックス内
に保持固定されてなる多孔性マトリックスを試料と接触
させ、それによって試料中の分析物が粒子と結合するよ
うになり、粒子上に分析物コンプレックス（複合体）を
生成する；
【００１３】ｂ）粒子上にコンプレックスを含有する材
料を、分析物と結合し得る第２の物質と接触させ、ここ
で第２の物質は分析物及び指示薬物質の存在下で検出可
能な反応を生じ得る物質で標識化されており、これによ
り標識化された物質を粒子上のコンプレックスと結合さ
せ； ｃ）該材料から非結合の標識化された物質を除去する； ｄ）該材料を指示薬物質と接触させる；そして ｅ）試料中の分析物の存在又は量の関数として得られる
反応を検出することを特徴とする方法、及び次の工程よ
りなる流体中の分析物の存在又は量を決定するのに有用
な材料の製法であって：この製法は、
【００１４】（ａ）０．１〜５ミクロンの平均直径を有
し且つその表面に流体中の分析物と特異的に結合し得る
結合性物質を固定した実質的に球形の複数の固体粒子と
温置（インキュベート）し、それにより分析物を結合性
物質と結合させて固体粒子上に分析物／結合性物質複合
体（コンプレックス）を形成し、 （ｂ）多孔性の繊維マトリックスを該温置した固体粒子
と接触させ、ここで固体粒子の平均直径は繊維マトリッ
クスの平均的孔の大きさよりも小さく、そしてそれによ
り温置した固体粒子の少なくとも一部をマトリックス内
の少なくともその繊維の一部に保持固定することからな
る。
【００１５】本発明の改良装置は、前述した材料の実質
的に平面の層よりなり、それは結合アッセイのための反
応マトリックスを形成する。実質的に平面の層は、第１
の試料接触面及び第１の面に相対している第２の面を有
する。実質的に平面の層は、装置が結合アッセイの実施
に際して使用される時、第１の面に接触する試料の少な
くとも一部が実質的に平面の層を通って第２の面に送ら
れるように装置中に配置されている。好適には、本発明
のアッセイ装置は、その外、装置が使用されている時、
試料液が第１の面に接触する前に濾過手段を通るよう
な、第１の実質的に平面の層との関係で配置されている
濾過手段よりなる。更に、本発明の装置は、吸収手段
（実質的に平面の層を通る液を吸収するため）よりなる
ことが好適である。
【００１６】本発明の概念は、試験試料中種々の分析物
の未知の存在又は濃度を決定するための結合アッセイの
実施の際のみならず、固体アッセイ装置に対して内蔵さ
れたコントロールを提供するのに有利である。下に、更
に詳述するように、本発明による好適な固相分析装置
は、アッセイ系中試験結果のあいまいでない可視の解釈
を可能にする、負の結果を示すための可視の正の対照域
のような、アッセイ対照をその中に組入れることができ
る。又、例えば、本発明の概念を利用する好適な操作コ
ントロール装置は、本発明の材料、分析中の試験試料中
分析物に検出可能な反応を生じることができる物質をそ
の多孔性の繊維のマトリックス中に有する材料よりなる
ことができる。
【００１７】本発明の障壁手段は、吸収剤手段に入る液
が反応マトリックスと再接触するのを制限するための、
固相分析装置の反応マトリックスと吸収剤手段との間に
置かれた障壁手段よりなる。
【００１８】その外、本発明によれば、本発明の材料及
び装置を利用する結合アッセイを実施する改良法が提供
される。１つのこのような好適な方法においては、分析
物、例えば、抗原又は抗体を含有する試料がこの材料か
らつくられる反応マトリックスと接触される。分析物
は、マトリックスの材料内に保持されている粒子上の試
薬と結合するようになる；次に、マトリックス中に保持
されている試薬によって結合されている分析物に結合す
ることができる第２の「標識化された」（ｌａｂｅｌｌ
ｅｄ）試薬マトリックスとが接触される。別法として、
第２の試薬は、標識化されていない抗体であることがで
き、次いで抗体に向けられる標識化された物質又は試薬
を添加する（増幅又は間接イムノアッセイ）。その後、
非結合材料は、例えば、洗浄によって除去され、装置
は、指示薬物質と接触され、これは、第２の試薬の「標
識化された物質」の存在下に、試料中の分析物の存在及
び（又は）量を示す検出可能な反応を生じる。このよう
な検出可能な反応は、可視的に又は機器により読むこと
ができ、有利には、特にアッセイから夫々正又は負の結
果のみが必要であるか又は望ましい場合には、最も望ま
しくはアッセイの結果を示すため“＋”又は“−”符号
の可視的出現の形態の、色反応であることができる。別
法として、定量的又は半定量的結果は、検出可能な反応
を可視的に又は機器により読むことによって得ることが
できる。
【００１９】図１は、本発明による分析装置の部分断面
の側面図である。図２は、図１の装置の上部平面図であ
る。図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃは、図１の装置の特に好適な
実施態様の上部平面図である。図４Ａ，４Ｂ及び４Ｃ
は、図１の装置の別の実施態様の上部平面図である。図
５は、図１の装置の透視図であり、装置の本体から取り
出されたプレーフィルターを示す。
【００２０】以下さらに詳しく本発明を説明する。本発
明の新規な材料、並びにそれから得られる装置は、多く
の型の分析に応用可能であるが、前述したような、生物
流体の呈色その他のＥＩＡを実施するための常用の固相
イムノアッセイを改良するために、イムノアッセイ中使
用される時特に有利である。本発明によって得られる装
置は、比較的使用するのが容易であり、先行技術のアッ
セイに比して、少ない操作工程及び複雑でないアッセイ
技術を要し、又未知の試料の試験のため迅速な定量的、
半定量的又は定性的結果の利点を更に提供する。この材
料及び装置は、その外、例えば、このようなアッセイの
精度及び信頼性を評価するため、対照として有利に使用
するのに適している。更に、製造にあたっては、本発明
の装置は、比較的容易につくることができる。本発明の
このような装置を利用するアッセイは、又種々の水準の
分析物に対して高度に敏感であることが見出されてい
る。前記の利点、並びに他の利点は、明細書中述べられ
る本発明の詳細な説明から明らかになる。
【００２１】本発明の概念は、種々の型の結合アッセイ
に応用可能である。抗原及び抗体分析物についてのいく
つかのこのような型のアッセイの例の模式表示を次のと
おり述べることができる。しかし、当該技術熟練者は、
抗原又は抗体以外の分析物を含む、多くの他の型のアッ
セイについて推考することができることが認められ、こ
れらに本発明の概念を応用することができる。
【００２２】１．直接アッセイ Ａ．抗原（Ａｇ）アッセイ
【化１】 Ａｂは、Ａｂ２と同一であってもなくてもよく、種々の
モノクロナール又はポリクロナール抗体であってよい。
前記の反応摸式を使用し、本発明に従って決定できる抗
原分析物の例は、限定はないが、ストレプ−Ａ（Ｓｔｒ
ｅｐ−Ａ）、ベーターｈＣＧ及び肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢ
ｓＡｇ）を含む。
【００２３】Ｂ．抗体（Ａｂ）アッセイ ｉ）
【化２】 分析物例（これには限定されない） ａ−ＨＴＬＶ−ＩＩＩ ａ−ＨＢｃ−ＩｇＭ ａ−ルベラ（Ｒｕｂｅｌｌａ） ｉｉ）
【化３】 分析物例：ａ−ＨＡＶ−ＩｇＭ
【００２４】２．間接アッセイ 抗原アッセイ
【化４】 これは、標識が分析物に向けられていないアッセイの１
群である。この実施態様においては、抗−Ａｂは、一般
に、Ａｂに向けられていてよく、或いはＡｂ中に組み入
れられている１種又はそれ以上の官能基に向けられてい
てよい。若干の場合には、次のとおり、固相上直接に分
析物を捕捉することも望ましい：
【化５】
【００２５】３．競合アッセイ 抗体アッセイ
【化６】 アッセイ模式３においては、試料及び標識は共に、固相
上抗原に向けられる。結合する標識の量は、試料中抗体
の量を反映する。
【００２６】図面の図１及び図２について、本発明の分
析装置の好適な実施態様は、一般に１０で示される。好
適な装置１０は、実質的に平面の、一般に円形の、ディ
スク形の反応マトリックス１２を含む。マトリックス１
２は、明細書中説明されるとおり、本発明の新規な材料
よりなり、分析中の試料中分析物の存在又は量を決定す
るため、装置１０がこのようなアッセイの際に使用され
る時（下に詳細説明されるとおり）、マトリックス１２
内で結合アッセイに必要な種々の化学反応及び変化がお
こるように、装置１０内に配置されている。マトリック
ス１２は、試料接触面１２ａ及びそれに対している面１
２ｂを有する：マトリックス１２の好適な組成は、下の
実施例中更に詳細に説明されている。
【００２７】好適な装置１０は、その外に、キャリヤー
１４を含み、その中にマトリックス１２が配置されてい
る。キャリヤー１４は、プラスチック、金属その他の剛
体又は半剛体物質のような任意の適当な材料からつくら
れることができる。キャリヤー１４のための材料として
特に好適なのは、“ＡＢＳ”として市場で知られ、ミズ
ーリ州セントルイス在モンサント・カンパニーから入手
し得るプラスチックである。図示される好適な実施態様
においては、キャリヤー１４は、マトリックス１２を完
全に囲み、その支持体及びホルダーとして機能する。こ
の機能を行なうために、キャリヤー１４は、マトリック
ス１２を密に支持し保持するため一般に円形のフランジ
を有する。図１及び図３ａにおいて最もよく示されると
おり、流体試料及びアッセイの実施の際使用される試薬
を受け取るためのチャンバー１７は、フランジ１６の外
側壁面１６ａによって形成される側壁及びマトリックス
１２の試料接触面１２ａによって形成される底壁によっ
て装置１０中定められている。
【００２８】好適な装置１０は更に、アッセイ装置の使
用の間液を吸収するため、図示されるとおり、キャリヤ
ー１４中配置されている吸収剤手段よりなる。装置１０
の吸収剤手段２０は、１つ又はそれ以上の材料の層より
なり、使用される時、障壁材料１８と、或いは反応マト
リックス１２と、図示されるように物理的に接触してい
る。この特に有利な特徴は、装置１０を使用するアッセ
イの実施の間、過剰の液がアッセイ操作の間に反応マト
リックス１２から送られて後、必要に応じて、過剰の液
が容易に吸収されることを可能にする。吸収剤手段２０
は、任意の水分又は流体保持性の材料、例えば、ジェー
ムス・リバーから入手でき、「１０５ポイント」又は
「５０ポイント」と称されるもの、或いは、特に好適な
ものとして、前述したものの各々の１つ又はそれ以上の
層の組合せである。
【００２９】本発明の他の一面においては、固相分析装
置中液の流れを制限するため障壁手段が提供される。こ
の面は、透過性反応面又はマトリックス、或いはフィル
ター層、並びに装置中使用される液を吸収するための吸
収剤層を有する固相分析装置中使用される時、吸収剤層
から反応マトリックスへの液の流通を防止しながら、反
応面から吸収剤手段又は層への液流を可能にするのに特
に有利である。
【００３０】図１に示されるとおり、障壁手段は、マト
リックス１２の下、かつキャリヤー１４内に拡がる障壁
材料１８の層よりなる。障壁材料１８は、マトリックス
１２の面１２ｂと接触しており、装置が使用されている
時、マトリックス１２を通って面１２ｂに送られ、そし
てそれを通って層１８中に入る液が面１２ｂと再接触す
るのを制限する機能をもつ。層１８を液制限層として利
用してマトリックス１２中「バックグラウンド」干渉を
防止するか又は排除するのを助けることが、本発明の装
置中最も好適であるが、この特徴は、マトリックス１２
の基本的機能又は概念として必須又は肝要ではなく、所
望の場合には装置から省略することができることを認め
るべきである。省略される場合にも、装置は一般に、ア
ッセイにおいて十分な性能をもつが、感度が低くなる
（検出可能な反応の低下）可能性がある。
【００３１】層１８は、制限的で、流体又は水分の実質
的に「一方向」の流れにすることができる任意の適当な
材料よりなることができる。この目的のために特に適当
な材料の例は、“Ｘ−６０５７”（１．０ミル）及び
“Ｘ−６１０８”（１．２５ミル）と称してルイジアナ
州バトン・ルージュ在エチル・ヴイスクイーン・コーポ
レーションによって製造販売されているポリエチレンウ
イーブ材料、並びに米国特許３，９２９，１３５及び
４，３４２，３１４に記載されている材料である。
【００３２】下に説明されるとおり、好適な装置１０が
試験試料中分析物を示す発色のような可視的に読むこと
ができる反応を得ることができる外に、アッセイが実施
される時、その中におこる化学的及び生物学的反応の結
果としてマトリックス１２によって得られる、例えば、
可視光線の反射率又は蛍光強度等に対応する、それから
の検出可能な反応を用いて機器測定を行なうことができ
る。従って、装置１０からの検出可能な反応は、例え
ば、常用の分光光度計によって測定することができる。
例えば、特定のアッセイの間の反応及び変化によって得
られるマトリックス１２中の検出可能な反応が、発色す
る、又増大する発色が分析を受ける試験試料中特定の分
析物の増大する水準を示すものである場合には、分光光
度計にマトリックス１２から反射される光の減少する水
準が、試料中分析物の増大する水準に対応する。このよ
うな結果の解釈は、大部分常用のエレクトロニクスを使
用して分光光度計の検出器によってつくられるアナログ
信号をディジタル情報に変換することのような、当該技
術熟練者に周知の方式で行なうことができる。このよう
なエレクトロニクスも当該技術熟練者に周知であり、試
験試料中分析物の存在及び（又は）量に対応するか又は
相関するディジタル情報からヒトが読める信号を得るこ
とができる。
【００３３】次に図面の図１，２及び図５について更に
詳細に説明すると、本発明の分析装置１０の特に好適な
実施態様は、更に反応マトリックス１２の表面１２ａ上
に配置されている濾過手段２２を含む。濾過手段２２
は、保持リング２２ａによってキャリヤー１４中にプレ
ス−フィットされており、好適にはハンドル部分２２ｃ
を有する取出し可能な部分２２ｂを有する。手段２２は
更に、例えば、プラスチック周囲部中ガラス又はセルロ
ース膜のような適当な多孔性、繊維質材料２２ｄから構
成される；特に好適なのは、単一又は組合せの、リドル
社からの「リデール商標グレード２５４」、並びにワッ
トマン社からの“ＧＦ／Ｆ”又は“ＧＦ／Ｄ”である。
装置１０がアッセイを実施するのに使用される時は、手
段２２は、種々の機能を果すことができる。行なわれる
アッセイの型及び試験試料の種類によって、手段２２
は、試料を保持するか又は反応マトリックス１２への試
料又は試薬の通過をおそくするリザーバ；アッセイ中使
用される試薬、例えば、凍結乾燥された試薬を保持する
容器；又試料中外来物を除去するか、或いは、例えば、
血しょうを通過させながら全血試料から血球を分離保持
するための「プレフィルター」のような機能を果す。そ
の外、図５に示されるように、フィルター手段２２が装
置１０から少なくとも部分的に取出し可能である（本発
明において好適であるが、必須ではない特徴）場合に
は、装置１０を使用するアッセイの実施の間、所望に応
じて、その中に保持されているかも知れない材料を取り
出すか、或いは試薬の添加のために反応マトリックス１
２を露出させるか又はそれから検出可能な反応を読むた
めに、アッセイの１工程の間、フィルター手段２２の取
外し可能な部分２２ｂを取り出すことができる。その場
合にはフィルター手段２２の膜部分は、その取外し可能
な部分の不可欠部分である。
【００３４】本発明によれば、本発明の分析装置及び方
法中有用である材料は、多孔性の繊維マトリックスより
なる。「多孔性」（ｐｏｒｏｕｓ）とは、マトリックス
が、流体が流入することができ、かつ容易に通ることが
できる材料から構成されていることを意味する。本発明
の材料においては、多孔性の性質は、ガラス、セルロー
ス、ナイロンその他の当該技術熟練者に周知の繊維質の
材料のような適当な原料を単に選択することによって達
成されることができる。例えば、使用するのに特に好適
な材料は、「ワットマンＧＦ／Ｄ」ガラス繊維濾紙であ
り、これは、０．０３２インチの公称厚さを有する。こ
のような材料の厚さは重大ではなく、流動性及び分析物
の十分な結合を可能にするだけの時間、材料内に試料を
保持する必要性のような、アッセイされる試料（及び分
析物）の性質に大きく基ずいて決められ、日常操作者の
選択の問題である。
【００３５】その外、本発明によれば、繊維質材料は好
適には、約０．１〜約１０ミクロン又はそれ以上、最も
好適には約０．１〜約５ミクロンの平均直径を有し、材
料の繊維上保持固定されている、複数の実質的に球形の
固体粒子を有する。「保持固定」（ｒｅｔａｉｎｅｄ
ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）とは、粒子が材料の
繊維上にあるかぎり、材料内の別の位置（即ち、他の繊
維）に実質的に動くことができないか、或いはその破壊
なしに材料から完全には取り出すことができないことを
意味する。粒子がこのように保持固定される機構は知ら
れていないが、繊維及び粒子の間、並びに（或いは）粒
子自体の間の物理的表面吸引によるものであろう。粒子
は、任意の適当な型の、一般に「ミクロ粒子」（ｍｉｃ
ｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）として知られる特定の材料か
ら当該技術熟練者によって選ばれることができる；この
ような粒子は典型的には、例えば、ポリスチレン、ポリ
アクリル酸メチル、ポリプロピレン、ラテックス、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ
カーボネート又は同様の材料から構成される。本発明に
おいて使用するためにどの型のミクロ粒子が選択されよ
うとも、粒子が構成される物質は、粒子の表面上試験試
料、例えば抗体又は抗原と反応することができる物質、
或いはその組合せを保持することができるか、又はそれ
自体粒子の表面上分析物を保つことができることが重要
である。更に、粒子の大きさは重大ではなく、粒子の平
均直径が実質的に前記の範囲内であるかぎり（粒子の平
均直径は、繊維質マトリックスの平均孔径より小さいこ
とが好適であるが）、前述した性質を有する任意の型の
粒子は、使用するのに適当である。
【００３６】本発明によって提供される材料及び分析装
置は、多種多様の、それ以外は周知のアッセイ技術及び
操作において有利に用いられることができ、明細書中詳
細説明された特定のイムノアッセイ技術に応用が限定さ
れないことが認められるべきである。それらは、かくし
ていわゆる「競合結合」（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｂｉ
ｎｄｉｎｇ）アッセイ又は類似の結合アッセイ操作にお
いて使用されることができ、その外、グルコース、尿酸
等のような分析物のための典型的な酵素アッセイのよう
な他のアッセイにおいて用いられることができ、それら
はイムノアッセイではないが、本発明の装置の材料又は
反応マトリックス内の粒子上に、このようなアッセイに
おいて使用される少なくとも１種の試薬をはじめに保持
させることによって有利に実施することができる。本発
明は、種々の型のアッセイ操作において多種多様の用途
に有利に応用することができ、かくして明細書中説明さ
れたアッセイ及び操作の特定の細部に決して限定されな
いことが、分析技術熟練者に容易に明らかである。
【００３７】しかし、本発明の原理によって得られる新
規な材料、並びに分析装置は、酵素イムノアッセイ、特
にいわゆる「サンドイッチ」及び間接酵素イムノアッセ
イにおいて特に有利に用いることができる。このような
アッセイは、比較的精巧な、時間がかかりかつコストが
かかる装置及び材料を必要とするところの先行技術の典
型的な「ビーズ」（ｂｅａｄ）その他のアッセイより
も、実質的に簡単である方式で、本発明の材料及び装置
を使用して行なうことができる。このようなアッセイは
又、驚くべき感度をもつことができることが見出されて
いる。
【００３８】本発明の材料を利用する１つの現在好適な
「サンドイッチ」イムノアッセイ操作の一般化した例
は、次のとおりである： 工程ａ）前述したとおり、材料中粒子上に抗体又は抗原
を保持して、反応マトリックスを形成させる； 工程ｂ）決定されるべき抗原又は抗体を含有する試験試
料をマトリックスに適用する； 工程ｃ）酵素複合型抗体又は抗原を工程ｂ）の抗原又は
抗体に適用する； 工程ｄ）洗浄して非結合材料を除去する；そして 工程ｅ）工程ｃ）の複合物の酵素部分の存在下に、反応
マトリックス中検出可能な色その他の反応を生じる指示
薬物質を適用する。 本発明の装置を使用してこのような「サンドイッチ」ア
ッセイをいかに有利に実施することができるかの更に詳
細な論述は、下の実施例中述べられる。
【００３９】本発明によれば、分析装置の材料又は反応
マトリックス中検出可能な反応が得られる；この反応
は、分析中の試料中分析物の存在及び（又は）量を示す
ものである。本発明の好適な実施態様においては、この
ような検出可能な反応は、前述したもののような、一連
のアッセイ工程に続く発色であることができ、或いは分
析技術において周知であり、又同様な目的に対して使用
される任意の数の反応であることができる。例えば、得
られる反応は、当該技術熟練者に周知であるように、適
当な試薬がアッセイにおいて用いられるならば、蛍光の
反応であることができる。この反応は又、化学発光、或
いは可視的にか、種々の既知の装置によって機器で検出
可能な種々の放射活性エネルギー反応のいずれか（例え
ば、放射活性放出）であることができる。かくして、本
発明の材料及び装置を使用する際、多くの異なった型の
検出可能な反応が可能でありかつ望ましく、本発明の概
念はそれによって限定されないことが特に認められるべ
きである。
【００４０】本発明の概念の他の一面においては、「内
蔵された」（ｏｎ−ｂｏａｒｄ）対照域が固相分析装置
に備えられており、単一の分析装置反応面において正の
対照（これは試験試料中興味のある分析物の存在又は不
存在に関係なく、有効なアッセイ結果を示す検出可能な
反応を示す）、負の対照（これは、アッセイ結果が有効
でない場合にのみ検出可能な反応の変化を示す）及び試
料分析物に対応する検出可能な反応を同時に示す。本発
明のこの面においては、同じ容量の試験試料及びアッセ
イ試薬が、操作対照及び試験域に同時に接触させられ、
それによって、当該技術において一般に実施されている
ような別の対照試験の必要が避けられる。本発明のこの
面は、今まで説明したような現在特に好適な反応マトリ
ックス及び分析装置について、後で詳述されるが、本発
明のこの面は、複数又は多種の反応結果を同時に示すこ
とができる反応面を有する任意の分析装置の場合同様に
用いることができることが当該技術熟練者に明らかであ
る。このような他の型の反応面は、例えば、被覆型又は
非被覆型繊維マトリックス、フィルター又は膜、比較的
平面の固体面等を含む。
【００４１】次に図３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，４Ａ，４Ｂ及び
４Ｃについて、内蔵された負及び正の対照域３０及び３
２は、夫々分析装置１０の反応面又はマトリックス１２
上に備えられるのが好適である。負及び正の対照域は、
定量的に機能し、それによって負及び正のアッセイレフ
ァレンス対照として機能することができ、或いは定性的
に機能し、それによってアッセイの実施の際使用される
操作及び試薬の有効性を示す操作対照として機能するこ
とができる。明細書中使用される場合、用語「対照」
（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、定量的及び定性的実施態様を共
に包含する。負の対照域３０は、明細書中説明されたよ
うに、結合アッセイの実施の際、装置１０の正常な使用
の間、酵素標識その他の信号反応材料を保持する物質を
含まない、マトリックス１２の対照域３０を保持するこ
とによって形成される。正の対照域３２は、試験試料中
興味がある分析物の存在又は不存在に関係なく、マトリ
ックスの対照域３２内に酵素標識その他の信号反応材料
と結合することができる物質を備えることによって形成
される。前述したような特に好適な反応マトリックスに
関連して使用される場合、正の対照域３２は、対照域３
２内のミクロ粒子を、結合アッセイの実施の間区域３２
内で酵素標識を結合又は保持させることができる分析物
その他の物質で被覆することによって形成されてよい。
その外、結合アッセイの実施の間区域３４上、試験試料
からの興味がある分析物を結合又は保持させるため、１
つ又はそれ以上の分析物結合域３４がマトリックス１２
上に備えられる。分析物結合域３４は、分析物を結合す
ることができる、抗原又は抗体のような物質で、マトリ
ックス１２の区域３４内のミクロ粒子を被覆することに
よって、本明細書中説明された特に好適な反応マトリッ
クス材料中に形成されてよい。
【００４２】正の対照域３２及び分析物結合域３４は、
結合アッセイの実施の際装置１０の使用を容易にするい
ずれの形状で備えられてもよい。しかし、正の対照域及
び分析物結合域を、正の試験結果がおこると正の対照域
が分析物結合域と相互作用して、使用者に既知の意味を
有する第１の表示シンボルを形成し、そして負の試験結
果がおこると正の対照域のみが第１の表示シンボルと異
なった、使用者に既知の意味を有する第２の表示シンボ
ルを形成する相互作用する形状で備えることが本発明で
は好適である。相互作用する正の対照及び分析物結合域
は、図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃの特に好適な実施態様中最も
よく示され、ここでは、正の対照域３２は、長方形の棒
又は“−”符号の形で形成され、一方分析物結合域は、
正の対照域の反対側、かつそれについて垂直に配向され
た長方形の棒の形で形成される。従って、図３Ａ，３Ｂ
及び３Ｃの装置の使用の際、装置１０の正しい使用から
得られる正の試験結果は、図３Ｃに示されるように、正
の対照域３２及び分析物結合域３４共に“＋”符号の形
で、検出可能な反応を生じ、使用者に“＋”又は正の試
験結果を示す。装置１０の正しい使用から得られる負の
試験結果は、図３Ｂに示されるように、正の対照域３２
においてのみ“−”符号の形で、検出可能な反応を生
じ、使用者に“−”又は負の試験結果を示す。結合アッ
セイが正しく実施されない場合には、或いはアッセイに
おいて使用される試薬が正しく機能しない場合には、図
３Ａに示されるように、正の対照域３２か又は分析物結
合域３４において検出可能な反応が得られず、有効でな
い試験結果を示す。その外、非特異的結合又はアッセイ
の実施の際洗浄工程を正しく行なわなかったことのよう
な、負の対照域における検出可能な反応はいずれも、有
効でない試験結果を示すことができる。図３Ａ，３Ｂ及
び３Ｃの形状は、試験結果の正（＋）又は負（−）の本
性について、並びにアッセイの有効性について、あいま
いでないシンボルの形態の使用者に対する即刻の情報で
あることが照明されているので、本発明において特に好
適である。
【００４３】別法として、操作対照域及び分析物結合域
は、所望に応じて、他の形状で備えられてよい。図４
Ａ，４Ｂ及び４Ｃの別の実施態様においては、正の対照
域３２及び分析物結合域３４は、図示されるとおり、点
の形で形成されている。かくして、正の試験結果は、図
４Ｃに示されるように、２つの点の形の存在によって示
され、負の試験結果は、図４Ｂに示されるように、正の
対照域３２においてのみ検出可能な反応の存在によって
示され、そして有効でない試験結果は、図４Ａに示され
るように、検出可能な反応に欠けることによって示され
る。他のシンボル、数等のような、負の対照域３０、正
の対照域３２及び分析物結合域３４の他の均等な形状
は、当該技術熟練者に容易に明らかである。
【００４４】
【実施例】次の実施例は、本発明の新規な材料を製造使
用する好適な方式、及びこの材料を使用する分析装置、
並びにそれらを利用するアッセイ操作を例示する。つく
られた分析装置は、図１及び図２について明細書中示さ
れ説明されている装置の、実質的に全形態及び外観を有
しており、次の操作を使用して本発明によるアッセイに
おいて製造し利用された。しかし、実施例は、例示のみ
であり、決して本発明の範囲に限定を置くと解されるべ
きでなく、この範囲は、特許請求の範囲によってのみ定
められる。別示されないかぎり、ここで表わされる百分
率は重量による。
【００４５】例１：抗体被覆型ミクロ粒子の製造 スルホン酸メチルエチル（ＭＥＳ）緩衝液（５ミリモル
（ｍＭ）、ｐＨ４．７５）１．０ミリリットル（ｍｌ）
及び抗体溶液（ベータ−ｈＣＧ）（ミリリットルあたり
２ミリグラム（ｍｇ／ｍｌ））７５ミクロリットルにカ
ルボキシレート変質型ミクロ粒子（２．５％の固形分；
０．４５ミクロンの平均直径；ポリサイエンス・アンド
・シーラジェンから市販）１００マイクロリットルを添
加した。この溶液を攪拌し、１−エチル−３（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＡ
Ｃ）（１０ｍｌのＨ２Ｏあたり２ｍｇ）１００ｍｌを次
に添加した。この溶液を１夜２〜８℃において攪拌し、
その後ミクロ粒子を遠心分離によって単離し、０．１％
「ツイーン−２０」溶液で２回洗浄し、“ＰＢＳ”リン
酸緩衝食塩水（０．０１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４；０．１５Ｍ
ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に再懸濁して０．１２５％の
溶液を得た。ＰＢＳ中再懸濁の後、粒子を、次の操作に
おいて後で使用するために貯蔵した。
【００４６】例２：固相反応マトリックスの製造 ワットマンＧＦ／Ｄガラスフィルターの中心に、例１か
らの抗体被覆型ミクロ粒子５０マイクロリットルを滴加
した；次にブタ血清を添加し、湿潤チャンバー−中室温
においてフィルター及びミクロ粒子を３０分間温置し
た。この後、今ミクロ粒子を含有しているフィルターを
ＰＢＳ緩衝液３００マイクロリットル中３回洗浄した。
次にフィルターを、次のイムノアッセイ例中使用される
まで湿潤チャンバー中貯蔵した。走査電子顕微鏡によ
り、ミクロ粒子を観察してフィルター材料のガラス繊維
上不可逆的に捕捉又は集塊になっていることが見出され
た。
【００４７】前述した例中記載された技術の外、種々の
方法；例えば、吸着又は種々の化学活性化剤の使用によ
って抗体（又は抗原）を連結することができることを注
記すべきである。又、粒子は、例えば、動物の血清が添
加されて後、繊維質マトリックスに添加することができ
ること、又このような血清の使用は、決定的に重要なも
のでないことが認められるべきである。従って、マトリ
ックスへの粒子の添加の順序及びマトリックス中に組み
入れて後又はその前のその処理は、本発明に対して決定
的ではない。更に、ポリスチレン被覆型ガラスのような
被覆型繊維質材料は、ここで特定して説明されたガラス
フィルターマトリックス材料の代りに使用することがで
き、それによっても本発明の利点を実現することができ
ることが認められる。
【００４８】例３：イムノアッセイのプロトコール（ベ
ータ−ｈＣＧの決定） 前述したように抗体被覆型ミクロ粒子を含有するガラス
繊維材料を切断して実質的に円形の「ディスク」（ｄｉ
ｓｋｓ）を得、反応マトリックスを形成するディスク
を、アッセイ中使用される溶液から過剰の液を吸収する
ためブロッター材料と接触状態にした。その後、ゼロ、
並びに５０及び１００ｍＩＵ／ｍｌの水準のベータ−ｈ
ＣＧを含有するヒト尿（約２８０マイクロリットル）
（下、表１）の試験試料５滴を各マトリックスの上に位
置しているプレフィルターに試料の滴を通して後各マト
リックスに添加した。次に抗体−酵素複合体（下、表
１）３滴を、プレフィルターを通して各マトリックスに
添加し、各マトリックスを室温において約２分間温置し
た。次にプレフィルターを除き、各マトリックスに洗剤
洗浄溶液１．０ｍｌを添加して過剰の抗体−酵素複合体
を除去した。次に、色原体指示薬（下、表１）１滴を各
マトリックスに添加し、２分後各マトリックスを発色に
ついて眼でチェックした。ベータ−ｈＣＧを含有する試
料試料の場合発色が観察され、常用の分光光度計を使用
して機器により発色に相関する光の吸光度を決定した。
結果を次の表に述べる。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】前述した抗体−酵素複合体は、一般に次の
参考文献に従って製造された：ＨＲＰＯ：ナカネ、Ｐ．
Ｋ．及びカワオイ、Ａ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２（１２）１０８４〜１０９２
（１９７４）；アルカリ性ホスファターゼ：ベーリンガ
ー・マンハイムＧｍｂＨから入手されるグルタールジア
ルデヒド操作に僅かに修正によって製造。
【００５２】１２人の非妊娠及び６人の確実妊娠婦人か
らの尿試料を、上に説明されたＨＲＰＯ−抗体酵素複合
体、並びに実質的に例３に記載操作を使用して試験し
た。非妊娠者からの１２の試料は、反応マトリックス中
見える色を生じなかった；即ち、吸光度はすべて０．０
５０より小さく、この閾値より下では色は容易には見え
ることができない。６人の妊娠者のすべてからの試料
は、試験すると見える色を生じた。
【００５３】例４：ベータ−ｈＣＧ操作対照の製造 表面にベータ−ｈＣＧに対する抗体が連結されているミ
クロ粒子（前述したとおり、０．１２５％の固形分）
１．０ｍｌをベータ−ｈＣＧ溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）
１４．０マイクロリットルと反応させた。この溶液を３
時間室温において攪拌し、次に必要になるまで２〜８℃
において貯蔵した。粒子を更に洗浄する必要はなかっ
た。
【００５４】表面にベータ−ｈＧＣが結合されている前
述した操作対照ミクロ粒子を種々の濃度に希釈し、抗体
被覆型ミクロ粒子が適用された（上述）のと同じ方式
で、前述したガラス繊維フィルター材料に適用した。次
に各希釈の活性を、ＨＲＰＯ−抗体酵素複合体２滴（約
１００マイクロリットル）を添加し、５分間温置し、洗
剤洗浄液１．０ｍｌで洗浄し、次にＴＭＢ溶液１滴（約
５０マイクロリットル）の添加によって発色させること
によりチェックした。次に、次の表に述べるとおり、常
用の分光光度計を使用して各対照の吸光度を測定した。
【００５５】
【表３】 １：３２希釈における操作対照の吸光度は、１００ｍＩ
Ｕ／ｍｌのベータ−ｈＣＧ標準のものにほぼ等しいこと
が見出された。
【００５６】例５：細菌試験−非対応細菌 ストレプＡ抗原に対するアッセイ、並びに次の表にリス
トされた種々の生物についての抗原に対するアッセイ
を、前述した本発明の装置を使用して実施した。アッセ
イのプロトコールは次のとおり要約することができる： １．予め調製された細菌綿棒試料（周知の技術によって
調製）を溶液中に入れ、装置の反応マトリックスのフィ
ルター組立物上にピペットでおいた。試料をフィルター
を通した。 ２．抗体−酵素複合体２滴（約１００マイクロリット
ル）を添加し、フィルターを通した。
【００５７】３．次にフィルターを除き、マトリックス
をＰＢＳ緩衝液１０〜１２滴（約５００マイクロリット
ル）で洗浄した。 ４．ＴＭＢ１滴（約５０マイクロリットル）を添加し、
室温において２分の温置の後マトリックス中の発色を読
んだ。 次に、次の表にリストされている微生物抗原を含有する
試料について、前述したように実施されたアッセイの結
果として、常用の反射率装置を使用して、マトリックス
から反射される６５０ノナメートルの光の吸光度を決定
した。
【００５８】
【表４】
【表５】
【００５９】例６：固相評価：本発明による種々の反応
マトリックス材料の使用 ゼロ濃度及び２５０ｍＩＵ／ｍｌの濃度のベータ−ｈＣ
Ｇ含有尿試料を、本発明に従って、種々の繊維質マトリ
ックス材料に組み入れられている微生物を使用して前述
した（例３）ようにアッセイした。次の表中リストされ
ている材料は、異なった孔径及び流速のものであった。
ワットマンＧＦ／Ｄ材料も、粒子の添加の前に前処理さ
れた。ＨＲＰＯ複合体が使用された各アッセイにおい
て、アッセイの成功を示す発色が眼で観察され、６５０
ノナメートルにおいて吸光度の読みを取った。結果は次
の表にまとめられる。
【００６０】
【表６】
【００６１】前述したデータは、本発明の装置の新規な
材料及び反応マトリックス中種々の原料繊維質材料を使
用することができることを示す。所望に応じて（例え
ば、流速）、材料の特性をいくらか変えるためにタンパ
ク血清又はポリスチレン（親水性又は疎水性）を用いて
前処理して後このような別の原料を使用することができ
る。
【００６２】例７：粒子径の効果 マトリックス材料（ワットマンＧＦ／Ｄ）の試料に０．
１９〜約３．０ミクロンの径（平均直径）の範囲の粒子
を添加した。試料あたり抗体の量は、約３０マイクログ
ラムに保ち、ゼロ及び１００ｍＩＵ／ｍｌのベータ−ｈ
ＣＧ含有尿試料を、アルカリ性ホスファターゼ複合体を
使用して前述したとおりアッセイした。６５０ノナメー
トルにおいて吸光度の読みを取った。結果を表６に述べ
る。
【００６３】
【表７】
【００６４】上の結果は、直径が０．１９〜約３．０ミ
クロンの径範囲の粒子が特に有効であり、かくして好適
であることを証明する。しかし、約０．１〜約５ミクロ
ンの範囲内の粒子は、本発明において使用するのに適当
である。又、ＧＦ／Ｄフィルター材料の孔径は約２．７
ミクロンであるので、データは、この繊維質マトリック
ス材料の平均孔径よりはるかに小さいか、或いは大きい
粒子を使用することができることを示す。
【００６５】例８：ベータ−ｈＣＧに対する迅速アッセイ ベータ−ｈＣＧに対する有利に迅速、かつ操作が簡易で
あるアッセイを、図１及び図２について前に示し説明さ
れたように、本発明に従って得られた分析装置を使用し
て実施した。アッセイのプロトコールは次のとおりであ
った。患者の尿試料５滴を、移動ピペットを使用し、装
置の反応マトリックス上のフィルターの中央に医学用滴
下器から適用した。試料をマトリックスを通して浸漬さ
せた（約１０秒）。次に抗体−酵素複合体（アルカリ性
ホスファターゼ）３滴を添加し、反応マトリックスを６
０秒間室温において温置した。次にフィルターを除き、
棄却し、ツイーン及びトライトン緩衝液と組み合わせた
クェン酸／ＮａＣｌ洗浄液１ｍｌを添加し、マトリック
スを通した。
【００６６】次に色原体酵素基質（ブロモ−クロロイン
ドールホスフェートニトロ−ブルーテトラゾリウム）を
添加し、２分間マトリックス中発色させた。可視検出可
能な正の符号（＋）の出現は、試料が上昇した（約５０
ｍＩＵ／ｍｌより大きい）水準のベータ−ｈＣＧを含有
することを示した。前述した操作を使用して実施された
が、このような上昇した水準のベータ−ｈＣＧを含有し
ない試料は、マトリックス中負の符号（−）を生じた。
例８と実質的に同様のプロトコールを用いて実施された
が、正（＋）又は負（−）の符号の出現を生じなかった
試験は、試薬の正しくない添加か、或いは試薬の劣化を
示した。
【００６７】以下は、本発明による分析装置の製造の一
般例であり、それは固相の場合の試料の非特異的反応性
（干渉）を決定するため、更に操作対照域を組み入れて
いる。本発明の材料を用いる反応マトリックスは、実質
的に前述したとおり製造することができ、粒子は、実質
的に「十字」（ｃｒｏｓｓ）の全体の形を有するパター
ンで材料に組み入れられる。「十字」の縦軸は、表面に
分析物結合性の物質を有する粒子から形成されることが
できるが、「十字」の横軸は、酵素標識を結合すること
ができる物質（即ち、標識と「複合」（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅｄ）又はそれに連結することができる抗体）から形
成されることができる。従って、これらの反応マトリッ
クスが、例えば、ベータ−ｈＣＧのアッセイ（前述した
ような）において使用される時、試料中検出可能な水準
の分析物が存在しない場合には、マトリックスの「操作
対照域」（ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａ
ｒｅａ）のみが検出可能な反応を生じる、即ち、「十
字」の縦軸（「マイナス」符号）のみが発色その他の反
応を生じ、負の結果を示す。しかし、検出可能な水準の
分析物が存在する場合には、分析物は、標識と共に、横
及び縦軸において共に粒子に結合し、両軸中検出可能な
反応（「プラス」符号）を生じる。
【００６８】さらに本発明に従った表示シンボルを形成
せしめるところの固相アッセイ装置の原理を一つの例を
あげて具体的に説明する。例えば、ツーステップサンド
イッチ法を用いた酵素免疫分析を用いた尿中のベータ−
ｈＣＧ検出キットについて説明すると、この検出キット
の反応表面を形成するマトリックス上には、抗ベータ−
ｈＣＧ抗体を固相化された粒子が、反応表面の“＋”形
状のうちの縦軸に保持されるようにしてある（図６Ａ参
照）。一方、検出キットの反応表面を形成するマトリッ
クス上には、ベータ−ｈＣＧが保持固相化された粒子
が、反応表面の“＋”形状のうちの横軸に保持されるよ
うにしてある（図６Ｂ参照）。こうして、結果として
は、本発明に従った検出キットの反応表面上には、抗ベ
ータ−ｈＣＧ抗体とベータ−ｈＣＧとが“＋”形状を形
成するように配置されることになる（図６Ｃ参照）。そ
してその他の領域はコントロール域を形成することにな
る。
【００６９】試験にあたり、この検出キットに被検試
料、例えば尿を滴下すると、以下のような反応が生起す
るものとすることができる。なお、尿は１度の滴下でそ
の円内の各領域すべてと接触することになる。これは以
下の操作において各試薬についてもおこる。 （１）被検試料中にベータ−ｈＣＧが存在するならば、
縦方向に固相化された抗ベータ−ｈＣＧ抗体にｈＣＧが
結合する（図６Ｄ参照）。次に、アルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗ｈＣＧ抗体を加えると、その酵素標識抗体
は、ベータ−ｈＣＧと結合する（図６Ｅ参照）。次にこ
うして得られたマトリックスは、任意に洗浄処理を施こ
された後、酵素と反応して発色する試薬例えば、ブロモ
−クロロインドールホスフエートニトロ−ブルーテトラ
ゾリウムを加えると、酵素標識された抗体と抗原とがコ
ンプレックスを形成している部分が発色する。つまり
“＋”形状に発色する。
【００７０】（２）被検試料中にｈＣＧが存在しない場
合は、縦方向のｈＣＧの結合は起こらず、次に添加する
酵素標識抗体は横方向のｈＣＧ抗原とのみ反応する（図
６Ｆ参照）。こうして、“−”形状に発色した表示シン
ボルを得る。 （３）もしここで、被検試料を添加した後に、劣化して
試薬として使用するに適さない試薬例えば、変性酵素標
識抗体を用いたとすると、この試薬は、抗原抗体コンプ
レックスを形成せずに、したがって何らの表示、例えば
“＋”の表示も“−”の表示もでないこととなる。つま
り、反応マトリックス上での“−”という形の発色は、
被検試料中にベータ−ｈＣＧが存在していないことを示
すのみならず、反応面上において抗原抗体反応と酵素反
応が正しく行なわれたことをも表示しているのである。
【００７１】別法として、反応が生じるマトリックスの
区域は、「点」（ｄｏｔｓ）、円、数などの形をとるこ
とができる。かくして、ミクロ粒子は、マトリックスの
材料中に噴霧その他施用して、所望に応じて種々のパタ
ーンで、前述したようにして組み入れることができる。
前述した対照は、本発明の好適なマトリックス材料と組
み合わせて使用されるようにこの例において説明された
が、内蔵された対照を、前述したように、他の固相分析
装置と組み合わせて同様に用いてよい。前述した材料及
び装置中、並びに他の型のマトリックス材料を使用する
固相アッセイ装置中へこのような操作対照を組み入れる
ことの利点は、ａ）対照が格アッセイ実施について材料
の有効性の尺度を与える；ｂ）各アッセイ実施の場合の
対照が、特に「プラス」（＋）及び「マイナス」（−）
符号のような特定のパターンが使用される時、結果の比
較解釈を可能にする；又ｃ）各アッセイ装置中への対照
の組み入れがアッセイの適切な効力確認を与え、使用者
をアッセイの結果に更に信用をもたせることを含む。
【００７２】特許請求の範囲に述べられるような、本発
明の精神及び範囲から離れることなしに、明細書中詳述
された本発明の特定の好適な実施態様において種々の修
飾及び改変を行うことができることが認められるべきで
ある。本発明のうちからは、次の実施態様をあげること
ができる。 １．試験試料中の分析物の存在又は量を決定するための
結合アッセイにおいて有用な材料であって、繊維の多孔
性マトリックス及び０．１〜５ミクロンの平均直径を有
する実質的に球形の固体粒子よりなり、粒子が繊維上の
該マトリックス内に保持固定されてなる材料。 ２．該粒子がその表面に試料中の分析物と結合すること
ができる物質を有することよりなる前項第１項記載の材
料。
【００７３】３．粒子の平均直径がマトリックスの平均
的孔の直径より小さいことよりなる前項第１項記載の材
料。 ４．流体試料中分析物の存在又は量を決定するための結
合アッセイにおいて有用な固相アッセイ装置であって、
繊維の多孔性のマトリックス及び０．１〜５ミクロンの
平均直径を有する実質的に球形の固体粒子を有する材料
の実質的に平面の層よりなり、粒子が繊維上該マトリッ
クス内に保持固定され、実質的に平面の層が第１の試料
接触面及び第１の面に相対している第２の面を有し、そ
してアッセイの実施に装置が使用されている時、第１の
面に接触する試料の少なくとも一部分が実質的に平面の
層を通して第２の面に送られるように装置中の配置され
ている固相アッセイ装置。
【００７４】５．装置が更に、試料液が第１の面に接触
する前に濾過手段を通るような、実質的に平面の層の第
１の面との関係で配置されている濾過手段よりなる前項
第４項記載のアッセイ装置。 ６．装置が更に、実質的に平面の層を通る液の少なくと
も一部分が吸収剤手段によって吸収されるような、実質
的に平面の層の低い方の面との関係で配置されている吸
収剤手段よりなる前項第４項記載のアッセイ装置。 ７．装置が更に、実質的に平面の層と吸収剤手段との間
に置かれた障壁手段よりなり、障壁手段が、吸収剤手段
によって保持されている液が実質的に平面の層に戻るの
を制限するように適応されている前項第６項記載のアッ
セイ装置。 ８．障壁層がポリエチレンウイーブ材料より構成される
前項第７項記載のアッセイ装置。
【００７５】９．次の工程より試験試料中分析物の存在
又は量を決定するための結合アッセイ法であって、 ａ）繊維のマトリックス及び０．１〜５ミクロンの平均
直径を有する複数の実質的に球形の固体粒子（粒子は、
繊維上該マトリックス内に保持固定されている）を試料
と接触させ、それによって試料中の分析物が粒子と結合
するようになり、粒子上分析物コンプレックスを生成す
る； ｂ）粒子上コンプレックスを含有する材料を分析物と結
合することができる第２の物質（これは、分析物及び指
示薬の存在下に検出し得る反応を生じることができる物
質で標識化されている）と接触させる； ｃ）材料から非結合標識物質を除去する； ｄ）材料を指示薬物質と接触させる；そして ｅ）試料中分析物の存在又は量の関数として得られる反
応を検出することを特徴とする方法。
【００７６】１０．検出し得る反応が、試料中に検出し
得る量の分析物が存在する時には可視検出可能な“＋”
符号であり、試料中に検出し得る量の分析物が存在しな
い時には可視検出可能な“−”符号である前項第９項記
載のアッセイ方法。 １１．分析物がベーターｈＣＧ、ストレプ−Ａ抗原、或
いはＨＢｓＡｇである前項第９項記載のアッセイ方法。 １２．粒子がその表面上試料中の分析物と結合すること
ができる物質を有する前項第９項記載のアッセイ方法。
【００７７】１３．次の工程よりなる流体中分析物の存
在又は量を決定するのに有用な材料の製法であって、 ａ）約０．１〜約５ミクロンの平均直径を有する、複数
の実質的に球形の固体粒子（粒子は、その表面上に固定
されて、分析物と結合することができる結合性物質を有
している）を流体の試料と共に温置し、それによって分
析物はこの物質に結合されるようになって粒子上に分析
物／結合性物質コンプレックスを生成する；そして ｂ）多孔性繊維質マトリックスを温置された種子と接触
させ、それによって粒子の少なくとも一部分は、繊維の
少なくとも一部分上でマトリックス内に保持固定される
ようにすることを特徴とする製法。
【００７８】１４．流体試料中分析物の存在又は量を決
定するための結合アッセイにおいて使用するための固相
アッセイ装置であって、正の対照域が分析物結合域と相
互作用して、装置の使用の際正の試験結果がおこると第
１の意味を有する第１の表示シンボルを生成し、そして
装置の使用の際負の試験結果がおこると第１の表示シン
ボルと異なる第２の表示シンボルを生成するような構造
になっている、負の対照域、正の対照域及び分析物結合
域を有する反応面よりなる装置。 １５．正の対照域が長方形の棒の形で反応面上形成され
ている前項第１４項記載の固相アッセイ装置。
【００７９】１６．分析物結合域が反応面上、正の対照
域の反対側の、かつそれに垂直に配向された２つの長方
形の棒の形で形成されており、それによって分析物結合
域が、正の対照域と共に“＋”符号の形を形成し、正の
対照域が負の試験結果がおこると単独で作用して“−”
の符号を形成する前項第１５項記載の固相アッセイ装
置。 １７．正の対照域及び分析物結合域が点の形で形成され
る前項第１４項記載の固相アッセイ装置。
【００８０】１８．負の対照域が正の対照域及び分析物
結合域を囲んでいる前項第１４項記載の固相アッセイ装
置。 １９．流体試料及びアッセイを実施する際使用される試
薬を受け取るための流体チャンバーを有し、流体チャン
バーが少なくとも１側壁及び１底壁によって定められ、
底壁が反応面よりなるので、単一容量の流体試料及びア
ッセイ中使用される試薬によって同時に接触される前項
第１４項記載の固相アッセイ装置。
【００８１】本発明に従えば、次なる装置も提供され
る。 （１）液体試料中分析物の存在又はその量を決定するた
めの特異的結合アッセイに使用する固相アッセイ装置に
おいて、それは反応表面域からなり、その反応表面域は
負の対照域と正の対照域とを有しており且つその両対照
域は、表示シグナルを生成する標識の存在下に試験結果
の有効性を示すための手段を有し；さらにその反応表面
域は分析物結合域を有しており、その分析物結合域は該
分析物を特異的に結合せしめる手段を有し：
【００８２】該装置において上記三つの領域は （ａ）各域が試料及び／又は試薬の一度の適用によりす
べてが接触せしめられ； （ｂ）表示シグナルを生成する標識の供与及び該試料中
検知しうる分析物の存在下に、第一の表示シンボルが形
成せしめられて、有効で正の試験結果を示し、該第一の
表示シンボルはその分析物結合域中の標識の存在により
その部分が形成せしめられるものであり；且つ （ｃ）表示シグナルを生成する標識の供与及び該試料中
検知しうる分析物の非存在下に、第二の表示シンボルが
形成せしめられて、有効で負の試験結果を示し、該第二
の表示シンボルはその分析物結合域によりなされてそれ
に寄与せしめられるところのものを除いた該第一の表示
シンボルにより形成せしめられるものであることを特徴
とする固相アッセイ装置。
【００８３】（２）該正の対照域が、長方形の棒の形で
反応表面域上形成せしめられるものである前項第１項記
載の固相アッセイ装置。 （３）該分析物結合域が該正の対照域の反対側では二つ
の長方形の棒の形でそして該正の対照域に対して垂直に
配向された形でその反応表面域上に形成せしめられるも
のであり、それにより該分析物結合域は該正の対照域と
一緒になり、“＋”符号の形を形成せしめ且つ該正の対
照域は単独で負の試験結果の生起の場合“−”符号の形
を形成せしめるものである前項第２項記載の固相アッセ
イ装置。
【００８４】（４）該正の対照域及び該分析物結合域の
少なくとも１つが、該正の対照域及び該分析物結合域の
その他に実質的に隣接した点の形で形成せしめられるも
のである前項第１項記載の固相アッセイ装置。 （５）該負の対照域が正の対照域及び分析物結合域を囲
んでいるものである前項第１項記載の固相アッセイ装
置。 （６）液体試料及びアッセイを実施する際使用される試
薬を受け入れるための流体チャンバーを有し、該流体チ
ャンバーが少なくとも１つの側壁及び１つの底壁によっ
て定められ、該底壁は反応表面域からなり、単位容量の
その液体試料及びアッセイで使用される試薬によって同
時に接触せしめられるものである前項第１項記載の固相
アッセイ装置。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による分析装置の部分断面の側面図であ
る。
【図２】図１の装置の上部平面図である。
【図３】図１の装置の特に好適な実施態様の上部平面図
である。
【図４】図１の装置の別の実施態様の上部平面図であ
る。
【図５】図１の装置の透視図であり、装置の本体から取
り出されたプレフィルターを示す。
【図６】固相アッセイ装置の表示原理を説明するための
模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャロン エム デベロークス アメリカ合衆国イリノイ州 60031 ガ ーネ ビーチウッド アベニュー 5180 (72)発明者 ジョン ジー ホフラー アメリカ合衆国イリノイ州 60041 イ ングルサイド ファーフィールド ロー ド 36433 (72)発明者 ケビン エム ナイジ アメリカ合衆国イリノイ州 60090 ヒ ーリングノースバリー レーン 1166 (72)発明者 サラ イー サフォード アメリカ合衆国イリノイ州 60048 リ バティビルチムバー レーン 15585 (56)参考文献 特開 昭59−102388（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−37191（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−292059（ＪＰ，Ａ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 流体中の分析物の存在および量を決定す
    る方法であり、 （ａ）流体の試料を、０．１〜５ミクロンの平均直径を
    有し且つその表面に流体中の分析物と特異的に結合し得
    る結合性物質を固定した実質的に球形の複数の固体粒子
    と温置（インキュベート）し、それにより分析物を結合
    性物質と結合させて固体粒子上に分析物／結合性物質複
    合体（コンプレックス）を形成し、 （ｂ）多孔性の繊維マトリックスを該温置した固体粒子
    と接触させ、ここで固体粒子の平均直径は繊維マトリッ
    クスの平均的孔の大きさよりも小さく、そしてそれによ
    り温置した固体粒子の少なくとも一部をマトリックス内
    の少なくともその繊維の一部に保持固定し、 （ｃ）該固体粒子の複合体を含有する繊維マトリックス
    を、分析物と特異的に結合し得るそして分析物および指
    示薬物質の存在下で検出可能な反応を生じ得る標識化さ
    れた物質と接触させ、これにより標識化された物質を固
    体粒子上の複合体と結合させ、 （ｄ）未結合の標識化された物質を繊維マトリックスか
    ら洗い落とし、 （ｅ）該繊維マトリックスを指示薬物質と接触させ、そ
    して （ｆ）試料中の分析物の存在または量の関数として生じ
    た反応を検出する、ことからなる流体中の分析物の存在
    および量を決定する方法。
  2. 【請求項２】 標識化された物質が酵素を含み、指示薬
    物質が色原体（クロモゲン）を含み、そして生ずる反応
    を検出する方法が繊維マトリックス中の色原体の存在ま
    たは量を検出することからなる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 分析物がベータｈＣＧである請求項１記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 分析物がストレプＡ抗原である請求項１
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 分析物がＨＢｓＡｇである請求項１記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 試験試料中の分析物の存在または量を検
    出する方法であり； （ａ）繊維の多孔性マトリックスを試験試料と接触さ
    せ、ここで多孔性マトリックスには実質的に球形の固体
    粒子が保持固定され、固体粒子はそれらの表面に吸着ま
    たは結合した、分析物と特異的に結合し得る物質を持
    ち、該被覆された固体粒子は０．１〜５ミクロンの平均
    直径を有し、該固体粒子の平均直径は多孔性マトリック
    スの平均的孔の大きさよりも小さく、 （ｂ）工程ａ）の多孔性の繊維マトリックスを、分析物
    と特異的に結合し得るそして指示薬物質の存在下で検出
    可能な反応を生じ得る物質で標識化された第２の物質と
    接触させ、それにより第２の物質を、多孔性マトリック
    スに保持固定された固体粒子に結合した分析物と結合さ
    せ、 （ｃ）該保持固定された固体粒子に結合した分析物に結
    合していない第２の物質を除去し、 （ｄ）工程ｃ）の工程の多孔性マトリックスを指示薬物
    質と接触させ、そして （ｅ）生じた検出可能な反応を試料中の分析物の存在ま
    たは量に相関させることからなる試験試料中の分析物の
    存在または量を決定する方法。
  7. 【請求項７】 分析物がベータｈＣＧである請求項６記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 分析物がストレプＡ抗原である請求項６
    記載の方法。
  9. 【請求項９】 分析物がＨＢｓＡｇである請求項６記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 第２の物質と指示薬物質との相互作用
    で生ずる検出可能な反応が視覚的に検出可能な反応であ
    り、そして工程ａ）の前に、実質的に球形の固体粒子の
    第２のセットをマトリックス内に保持固定し、ここで固
    体粒子の第２のセットはそれらの表面に吸着または結合
    され、第２の物質と特異的に結合し得る物質を持ち、且
    つ０．１〜５ミクロンの平均直径を持ち、そしてその固
    体粒子の平均直径はマトリックスの平均的孔の大きさよ
    りも小さいものであり、そして分析物結合性物質をそれ
    らの表面に吸着または結合した固体粒子と、固体粒子の
    第２のセットとをある模様に配列し、該マトリックスを
    試料と接触させた後に、第２の物質および指示薬物質
    が、 ｉ）もし検出可能な分析物が試料中に存在するならば、
    第２のセットの固体粒子に付着した第２物質と、分析物
    結合性粒子に付着した分析物に付着した第２物質との両
    者とに作用する指示薬物質の結果として視覚的に検出可
    能なプラス記号を表示し、そして ｉｉ）もし検出可能な分析物が試料中に存在しなけれ
    ば、第２のセットの固体粒子に付着した第２物質と作用
    する指示薬物質の結果として視覚的に検出可能なマイナ
    ス記号を表示する、 ことからなる請求項６記載の方法。
  11. 【請求項１１】 流体試料中の分析物の存在または量を
    決定するための結合アッセイに有効な固相アッセイ装置
    であり、 ａ）繊維の多孔性マトリックスを保持する硬いキャリヤ
    ー手段、 ｂ）繊維の多孔性マトリックスを第１の試料含有表面と
    該第１の表面と表裏の関係にある第２の表面とを持つ実
    質的に平面な層に配列し、該多孔性マトリックスを、該
    装置がアッセイの実施に用いられる時、第１の表面に接
    する試料の少なくとも一部分が実質的に平面な層を通っ
    て第２の表面に達するように、キャリヤー手段を配置
    し、 ｃ）実質的に球形の固体粒子を多孔性マトリックスの繊
    維上に保持固定し、該固体粒子はそれらの表面に吸着ま
    たは結合し、分析物に特異的に結合し得る物質を持ち、
    該被覆された固体粒子は０．１〜５ミクロンの平均直径
    を持ち、そして固体粒子の平均直径が多孔性マトリック
    スの平均的孔の大きさよりも小さいこと、からなる固相
    アッセイ装置。
  12. 【請求項１２】 装置が実質的に平面の層の第１の表面
    と接触して配置されるロ過手段を付加的に含み、それに
    よりアッセイ装置が使用される時、試料流体が第１の表
    面に接触する前にロ過手段を通過する請求項１１記載の
    固相アッセイ装置。
  13. 【請求項１３】 装置が実質的に平面の層の第２の表面
    と接触して配置される吸収手段を付加的に含み、それに
    より実質的に平面の相を通過する試料の少なくとも一部
    分が吸収手段により吸収される請求項１１記載の固相ア
    ッセイ装置。
  14. 【請求項１４】 装置が実質的に平面の層と吸収手段と
    の間に挟まれる障壁層を付加的に含み、障壁は一方向の
    み透過性であり、これによりアッセイ装置が使用され且
    つ流体が実質的に平面の層を通過する時、装置が吸収手
    段によって保持される流体を実質的に平面の層に逆戻り
    することを制限する請求項１３記載の固相アッセイ装
    置。
  15. 【請求項１５】 障壁層がポリエチレン編み合せ（ウイ
    ーブ）物質からなる請求項１４記載の固相アッセイ装
    置。
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