JPH06105255B2 - 固相ウレアーゼイムノアッセイのための基質組成物及び方法 - Google Patents
固相ウレアーゼイムノアッセイのための基質組成物及び方法Info
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Description
【０００１】（発明の背景） （発明の分野）本発明は、リガンドに関するイムノアッ
セイに関し、更に詳しくは膜イムノアッセイ及びそれに
有用な試薬に関するものである。
セイに関し、更に詳しくは膜イムノアッセイ及びそれに
有用な試薬に関するものである。
【０００２】（発明の背景）液体試料中に低濃度で存在
する、通常分析対象物と称される物質の濃度を測定する
ために、迅速かつ感受性の高いアッセイ系が開発されて
いる。抗原又はハプテンの特異抗体への結合に基づくイ
ムノアッセイは、高レベルの特異性及び感受性を与える
ので特に有用である。これらのアッセイは、標識形態の
上記試薬の一方を用い、標識試薬はトレーサーと称され
る。
する、通常分析対象物と称される物質の濃度を測定する
ために、迅速かつ感受性の高いアッセイ系が開発されて
いる。抗原又はハプテンの特異抗体への結合に基づくイ
ムノアッセイは、高レベルの特異性及び感受性を与える
ので特に有用である。これらのアッセイは、標識形態の
上記試薬の一方を用い、標識試薬はトレーサーと称され
る。
【０００３】酵素はイムノアッセイにおいてしばしば標
識として用いられている。通常の酵素イムノアッセイ
（ＥＩＡ）においては、酵素は特異結合抗原−抗体対の
一方の成分と共有結合し、得られた酵素結合体が基質と
反応して、検出及び測定される信号を生成する。信号
は、肉眼で検出されるか又は分光光度測定法によって検
出される色変化であってもよく、あるいは、ケイ光によ
って検出される生成物への基質の転化であってもよい。
識として用いられている。通常の酵素イムノアッセイ
（ＥＩＡ）においては、酵素は特異結合抗原−抗体対の
一方の成分と共有結合し、得られた酵素結合体が基質と
反応して、検出及び測定される信号を生成する。信号
は、肉眼で検出されるか又は分光光度測定法によって検
出される色変化であってもよく、あるいは、ケイ光によ
って検出される生成物への基質の転化であってもよい。
【０００４】ＥＩＡのための便宜な形態は、一方のアッ
セイ試薬を固体支持体上に固定化する固相イムノアッセ
イである。固体支持体は、ディップスティック、試験管
又はキュベットの内壁、又は微量滴定プレートの形態で
あってよい。
セイ試薬を固体支持体上に固定化する固相イムノアッセ
イである。固体支持体は、ディップスティック、試験管
又はキュベットの内壁、又は微量滴定プレートの形態で
あってよい。
【０００５】膜イムノアッセイは、しばしばフロースル
ーイムノアッセイと称される。流れが毛管作用によって
生成するフロースルーＥＩＡの例は、Bagshawの米国特
許第３，８８８，６２９号、Coleらの米国特許第４，２
４６，３３９号及びValkirsらの米国特許第４，６３
２，９０１号に記載されているアッセイである。Grayの
米国特許第４，２７７，５６０号及びMcLaurinらの米国
特許第４，８１２，２９３号は、それぞれ圧力及び減圧
を用いたフロースルーアッセイの例である。
ーイムノアッセイと称される。流れが毛管作用によって
生成するフロースルーＥＩＡの例は、Bagshawの米国特
許第３，８８８，６２９号、Coleらの米国特許第４，２
４６，３３９号及びValkirsらの米国特許第４，６３
２，９０１号に記載されているアッセイである。Grayの
米国特許第４，２７７，５６０号及びMcLaurinらの米国
特許第４，８１２，２９３号は、それぞれ圧力及び減圧
を用いたフロースルーアッセイの例である。
【０００６】膜ＥＩＡにおいては、膜を通して任意の数
の液体を流れさせて、アッセイ成分の結合、分離及び洗
浄を行うことができる。ほとんどの膜ＥＩＡ工程の最終
段階は、色原体のような発色剤(color developing reag
ent)を膜と接触させる工程である。色原体は、膜上に捕
捉されている酵素と反応して着色生成物を生成し、これ
を分析対象物の存在の証拠として検出したり、分析対象
物の濃度の証拠として測定したりすることができる。着
色生成物は、可溶性であってもよく、この場合にはこれ
は膜を通過し、濾液中において検出される。また、不溶
性であってもよく、この場合には膜上の着色スポットを
形成する。
の液体を流れさせて、アッセイ成分の結合、分離及び洗
浄を行うことができる。ほとんどの膜ＥＩＡ工程の最終
段階は、色原体のような発色剤(color developing reag
ent)を膜と接触させる工程である。色原体は、膜上に捕
捉されている酵素と反応して着色生成物を生成し、これ
を分析対象物の存在の証拠として検出したり、分析対象
物の濃度の証拠として測定したりすることができる。着
色生成物は、可溶性であってもよく、この場合にはこれ
は膜を通過し、濾液中において検出される。また、不溶
性であってもよく、この場合には膜上の着色スポットを
形成する。
【０００７】酵素ウレアーゼは、尿素を二酸化炭素及び
アンモニアに転化せしめる。これは、溶液イムノアッセ
イのための標識として開発されており、アンモニア生成
によるアッセイ媒体のｐＨの上昇が、ブロムクレゾール
パープルのような指示薬によって比色検出される(Chand
lerらのJournal of Immunological Methods, 53, 187(1
982);米国特許第４，５９０，１５７号）。
アンモニアに転化せしめる。これは、溶液イムノアッセ
イのための標識として開発されており、アンモニア生成
によるアッセイ媒体のｐＨの上昇が、ブロムクレゾール
パープルのような指示薬によって比色検出される(Chand
lerらのJournal of Immunological Methods, 53, 187(1
982);米国特許第４，５９０，１５７号）。
【０００８】Chandlerらの手順によって尿素を溶液中に
おいて比色検出するＥＩＡによると、検出される生成物
は深く着色されており、水溶性であるので、優れた視覚
読み取りが得られる。一方、水溶性であることによる迅
速な拡散は、ディップスティック又は膜のような固相上
におけるスポットとしての生成物の沈殿を阻害する。こ
れは、固相ＥＩＡ法におけるウレアーゼの有用性を著し
く制限するものである。固相上に沈殿する不溶性生成物
に転化することのできるウレアーゼ基質に対する必要性
がある。かかる基質は、免疫学的標識としてのウレアー
ゼの有用性を大きく伸ばすものである。本発明はかかる
基質を提供するものである。
おいて比色検出するＥＩＡによると、検出される生成物
は深く着色されており、水溶性であるので、優れた視覚
読み取りが得られる。一方、水溶性であることによる迅
速な拡散は、ディップスティック又は膜のような固相上
におけるスポットとしての生成物の沈殿を阻害する。こ
れは、固相ＥＩＡ法におけるウレアーゼの有用性を著し
く制限するものである。固相上に沈殿する不溶性生成物
に転化することのできるウレアーゼ基質に対する必要性
がある。かかる基質は、免疫学的標識としてのウレアー
ゼの有用性を大きく伸ばすものである。本発明はかかる
基質を提供するものである。
【０００９】（発明の概要）本発明の一つの態様はリガ
ンドの酵素イムノアッセイのための方法である。リガン
ドを含むと考えられる液体試料を、それに固定されてい
る捕捉抗リガンドを有する固体支持体と共にインキュベ
ートし、それによってリガンドを支持体に結合させる。
次に、支持体を、ウレアーゼに結合した検出抗リガンド
を含むトレーサーと、ウレアーゼが支持体に固定され始
めるように接触させることができる。次に、ウレアーゼ
に対する基質組成物を支持体に接触させる。ウレアーゼ
は組成物の第１の成分をアンモニアに転化せしめる。こ
のアンモニアは、組成物の第２の成分であるｐＨ依存還
元剤を活性化させるのに十分な程度にアッセイ媒体のｐ
Ｈを上昇させる。還元剤が活性化すると、第３の成分で
あるテトラゾリウム塩を着色された不溶性のホルマザン
に還元し、これが支持体上の検出可能なスポットとして
沈殿する。
ンドの酵素イムノアッセイのための方法である。リガン
ドを含むと考えられる液体試料を、それに固定されてい
る捕捉抗リガンドを有する固体支持体と共にインキュベ
ートし、それによってリガンドを支持体に結合させる。
次に、支持体を、ウレアーゼに結合した検出抗リガンド
を含むトレーサーと、ウレアーゼが支持体に固定され始
めるように接触させることができる。次に、ウレアーゼ
に対する基質組成物を支持体に接触させる。ウレアーゼ
は組成物の第１の成分をアンモニアに転化せしめる。こ
のアンモニアは、組成物の第２の成分であるｐＨ依存還
元剤を活性化させるのに十分な程度にアッセイ媒体のｐ
Ｈを上昇させる。還元剤が活性化すると、第３の成分で
あるテトラゾリウム塩を着色された不溶性のホルマザン
に還元し、これが支持体上の検出可能なスポットとして
沈殿する。
【００１０】好ましい支持体は、好ましくは、好適なホ
ルダー内において吸収性パッドに隣接して取り付けられ
ている多孔性膜である。パッドは毛細管作用によって液
体をして膜を通過して流れさせる。
ルダー内において吸収性パッドに隣接して取り付けられ
ている多孔性膜である。パッドは毛細管作用によって液
体をして膜を通過して流れさせる。
【００１１】アッセイのための好ましいリガンドは、抗
原、最も好ましくはウィルス抗原であり、好ましい捕捉
抗リガンドは抗体である。好ましいトレーサーは、ウレ
アーゼに結合している検出抗体と称される第２の抗体で
ある。好ましい基質組成物は、アンモニア生成化合物と
して尿素と、遊離アンモニアによってｐＨが上昇せしめ
られるとテトラゾリウム塩を還元する還元剤としてアス
コルビン酸とを含む。
原、最も好ましくはウィルス抗原であり、好ましい捕捉
抗リガンドは抗体である。好ましいトレーサーは、ウレ
アーゼに結合している検出抗体と称される第２の抗体で
ある。好ましい基質組成物は、アンモニア生成化合物と
して尿素と、遊離アンモニアによってｐＨが上昇せしめ
られるとテトラゾリウム塩を還元する還元剤としてアス
コルビン酸とを含む。
【００１２】したがって、本発明のアッセイ系は、標識
としてウレアーゼを用いたイムノアッセイにおける大き
な改良を与えるものである。第１番目に、基質組成物
が、溶液アッセイである従来のすべてのウレアーゼアッ
セイとは異なり固体支持体上に沈殿する着色された検出
可能な生成物を与える。生成した色は安定であり可逆性
がないので、色の減退又は変化を起こすことなく、酵素
反応を洗浄溶液で停止することができる。これに対し、
ブロムクレゾールパープル又はフェノールレッドのよう
なｐＨ指示薬を用いる従来技術のウレアーゼアッセイに
おいては可逆性のある色変化が与えられる。本発明は、
ウレアーゼの迅速な転化速度の有利性を与え、従来技術
の溶液アッセイにおける制限を克服し、はるかに容易で
より依存性の高い固相フォーマットによってウレアーゼ
アッセイの商業的な開発を可能にするものである。
としてウレアーゼを用いたイムノアッセイにおける大き
な改良を与えるものである。第１番目に、基質組成物
が、溶液アッセイである従来のすべてのウレアーゼアッ
セイとは異なり固体支持体上に沈殿する着色された検出
可能な生成物を与える。生成した色は安定であり可逆性
がないので、色の減退又は変化を起こすことなく、酵素
反応を洗浄溶液で停止することができる。これに対し、
ブロムクレゾールパープル又はフェノールレッドのよう
なｐＨ指示薬を用いる従来技術のウレアーゼアッセイに
おいては可逆性のある色変化が与えられる。本発明は、
ウレアーゼの迅速な転化速度の有利性を与え、従来技術
の溶液アッセイにおける制限を克服し、はるかに容易で
より依存性の高い固相フォーマットによってウレアーゼ
アッセイの商業的な開発を可能にするものである。
【００１３】（詳細な説明）本発明は多くの異なる形態
の態様によって満足されるものであるが、ここでは、本
発明の好ましい態様について詳しく説明することとす
る。この開示は本発明の原理の例示として考えられるべ
きものであり、本発明を説明されている態様に限定する
ものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲及びその
均等物によって定められる。
の態様によって満足されるものであるが、ここでは、本
発明の好ましい態様について詳しく説明することとす
る。この開示は本発明の原理の例示として考えられるべ
きものであり、本発明を説明されている態様に限定する
ものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲及びその
均等物によって定められる。
【００１４】本発明の一つの態様は、ウレアーゼによっ
て着色された不溶性生成物に転化せしめられる基質組成
物である。本発明の第２の態様は、標識としてウレアー
ゼ及び基質として上記組成物を用いたリガンドのイムノ
アッセイに関する方法である。該方法は、ウレアーゼの
有する多くの有利性を示し、同時に、従来においてこの
酵素をイムノアッセイにおいて広範に用いることを妨げ
ていた欠点を克服する。
て着色された不溶性生成物に転化せしめられる基質組成
物である。本発明の第２の態様は、標識としてウレアー
ゼ及び基質として上記組成物を用いたリガンドのイムノ
アッセイに関する方法である。該方法は、ウレアーゼの
有する多くの有利性を示し、同時に、従来においてこの
酵素をイムノアッセイにおいて広範に用いることを妨げ
ていた欠点を克服する。
【００１５】本発明のアッセイは、任意の従来の固相法
によって行うことができ、該方法においては、試料中の
リガンドの存在又は不存在は、着色生成物への、酵素に
よって触媒された基質の転化によって検出される。例え
ば、本発明のアッセイは、イムノクロマトグラフィーに
よって行うことができる。この方法においては、検出す
べきリガンドを含む液相を、毛細管作用によって、種々
のアッセイ試薬が隣接しているが別の領域に付着されて
いるガラスプレートのような固相を横切って移動させ
る。この方法の代表例は、Wengらの米国特許第４，７４
９，４６８号及びLiottaの米国特許第４，４４６，２３
２号において開示されているアッセイである。
によって行うことができ、該方法においては、試料中の
リガンドの存在又は不存在は、着色生成物への、酵素に
よって触媒された基質の転化によって検出される。例え
ば、本発明のアッセイは、イムノクロマトグラフィーに
よって行うことができる。この方法においては、検出す
べきリガンドを含む液相を、毛細管作用によって、種々
のアッセイ試薬が隣接しているが別の領域に付着されて
いるガラスプレートのような固相を横切って移動させ
る。この方法の代表例は、Wengらの米国特許第４，７４
９，４６８号及びLiottaの米国特許第４，４４６，２３
２号において開示されているアッセイである。
【００１６】他の好適なアッセイ法はディップスティッ
クを用いるものである。この方法においては、通常は捕
捉抗体を含むバインダーをその上に有するガラスプレー
トである固相を、試験液、アッセイ試薬を含む液及び洗
浄液中に交互に浸漬する。最後の浸漬において、試験液
中のリガンドの濃度に比例してディップスティック上に
捕捉される酵素によって、本発明の基質が着色生成物に
転化せしめられ、これがディップスティック上に沈殿
し、リガンドの存在の指標となる。
クを用いるものである。この方法においては、通常は捕
捉抗体を含むバインダーをその上に有するガラスプレー
トである固相を、試験液、アッセイ試薬を含む液及び洗
浄液中に交互に浸漬する。最後の浸漬において、試験液
中のリガンドの濃度に比例してディップスティック上に
捕捉される酵素によって、本発明の基質が着色生成物に
転化せしめられ、これがディップスティック上に沈殿
し、リガンドの存在の指標となる。
【００１７】上述のようなリガンドに関するイムノアッ
セイが本発明の好ましい適用であるが、該方法は、リガ
ンドが核酸プローブであってよく、トレーサーがウレア
ーゼに結合したＤＮＡ又はＲＮＡの相補ストランドであ
ってよいアッセイにおいて用いることができるというこ
とは当業者に容易に認識されよう。酵素をＤＮＡ及びＲ
ＮＡストランドに結合させるアッセイ法は当該技術にお
いて周知である。
セイが本発明の好ましい適用であるが、該方法は、リガ
ンドが核酸プローブであってよく、トレーサーがウレア
ーゼに結合したＤＮＡ又はＲＮＡの相補ストランドであ
ってよいアッセイにおいて用いることができるというこ
とは当業者に容易に認識されよう。酵素をＤＮＡ及びＲ
ＮＡストランドに結合させるアッセイ法は当該技術にお
いて周知である。
【００１８】好ましいアッセイ法は、固相が多孔性膜で
あるフロースルーアッセイである。かかる膜は、当該技
術において公知なフロースルーアッセイに適合する任意
の好適なアッセイ器具内に配置することができる。好ま
しい器具においては、アッセイ液の流れは、膜に隣接す
る吸収性材料のパッドによって起こされる毛細管作用に
よって促進され、膜及び吸収性パッドは好適なハウジン
グ内に配置される。膜フロースルーアッセイ及びそのた
めの種々の器具は開示されており、種々の器具が市販さ
れている。
あるフロースルーアッセイである。かかる膜は、当該技
術において公知なフロースルーアッセイに適合する任意
の好適なアッセイ器具内に配置することができる。好ま
しい器具においては、アッセイ液の流れは、膜に隣接す
る吸収性材料のパッドによって起こされる毛細管作用に
よって促進され、膜及び吸収性パッドは好適なハウジン
グ内に配置される。膜フロースルーアッセイ及びそのた
めの種々の器具は開示されており、種々の器具が市販さ
れている。
【００１９】多孔性膜は、アッセイの全ての他の成分又
は工程をいかなるようにも妨害しない任意の材料製のも
のであってよい。好適な膜は、例えば、ガラス繊維製、
ポリビニリデン製、ジフロライド製、ポリカーボネート
製、ニトロセルロース製及びナイロン製のものである。
かかる膜は当該技術において周知であり、多くのもの
が、Pall (East Hills, New York)、Millipore (Bedfor
d, Massachusetts)及びSchleicher and Shuell (Keene,
New Hampshire)のような製造者から市販されている。
は工程をいかなるようにも妨害しない任意の材料製のも
のであってよい。好適な膜は、例えば、ガラス繊維製、
ポリビニリデン製、ジフロライド製、ポリカーボネート
製、ニトロセルロース製及びナイロン製のものである。
かかる膜は当該技術において周知であり、多くのもの
が、Pall (East Hills, New York)、Millipore (Bedfor
d, Massachusetts)及びSchleicher and Shuell (Keene,
New Hampshire)のような製造者から市販されている。
【００２０】リガンドは任意のリガンド源からのもので
あってよく、抗原、抗体又はハプテンであってよい。例
えば、リガンドは、体液中に存在するＨＣＧ又はＦＳＨ
のような内分泌ホルモンであってよく、また、体液から
単離された後、バッファーのような異なる液体中に導入
されたものであってもよい。あるいは、リガンドは、体
液以外のリガンド源、例えばクラミジアのような微生物
の培養物又はその細胞抽出物からのものであってもよ
い。Lyme病に対する抗体のような抗体をアッセイするこ
ともでき、あるいは、リガンドは、治療薬剤又は濫用薬
剤(drug of abuse)のようなハプテンであってもよい。
あってよく、抗原、抗体又はハプテンであってよい。例
えば、リガンドは、体液中に存在するＨＣＧ又はＦＳＨ
のような内分泌ホルモンであってよく、また、体液から
単離された後、バッファーのような異なる液体中に導入
されたものであってもよい。あるいは、リガンドは、体
液以外のリガンド源、例えばクラミジアのような微生物
の培養物又はその細胞抽出物からのものであってもよ
い。Lyme病に対する抗体のような抗体をアッセイするこ
ともでき、あるいは、リガンドは、治療薬剤又は濫用薬
剤(drug of abuse)のようなハプテンであってもよい。
【００２１】好ましいリガンドは抗原であり、最も好ま
しくはアデノウィルス、パラインフルエンザ３ウィルス
及び最も好ましくは単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、
ＲＳウィルス（ＲＳＶ）及びインフルエンザＡ（Ｆｌ
ｕ．Ａ）のような体液中に存在するウィルス性抗原であ
る。以下、本発明を好ましい膜アッセイについて一般的
に説明する。
しくはアデノウィルス、パラインフルエンザ３ウィルス
及び最も好ましくは単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、
ＲＳウィルス（ＲＳＶ）及びインフルエンザＡ（Ｆｌ
ｕ．Ａ）のような体液中に存在するウィルス性抗原であ
る。以下、本発明を好ましい膜アッセイについて一般的
に説明する。
【００２２】膜は、リガンドに特異な抗リガンドで被覆
することができる。したがって、リガンドが好ましいウ
ィルス性抗原である場合には、抗リガンドは、抗原に特
異的に結合し、それによって膜上の抗原を捕捉する抗体
である。この試薬を以下捕捉抗体と称する。膜は、更
に、捕捉抗体によって占有されていない膜上の全ての結
合部位を充填する不活性タンパク質で被覆することがで
きる。本明細書においては、不活性タンパク質という用
語は、アッセイの全ての他の成分に対して免疫学的に非
反応性で、アッセイ媒体中の他のタンパク質に非特異的
に実質的に結合しないタンパク質を意味し、該不活性タ
ンパク質は、本発明のアッセイの一部でない他の物質に
対しては免疫学的に反応性であってもよいと理解され
る。好適な不活性タンパク質の限定されない代表例は、
カゼイン及びアルブミンであるが、他のものも当業者に
は明白であろう。
することができる。したがって、リガンドが好ましいウ
ィルス性抗原である場合には、抗リガンドは、抗原に特
異的に結合し、それによって膜上の抗原を捕捉する抗体
である。この試薬を以下捕捉抗体と称する。膜は、更
に、捕捉抗体によって占有されていない膜上の全ての結
合部位を充填する不活性タンパク質で被覆することがで
きる。本明細書においては、不活性タンパク質という用
語は、アッセイの全ての他の成分に対して免疫学的に非
反応性で、アッセイ媒体中の他のタンパク質に非特異的
に実質的に結合しないタンパク質を意味し、該不活性タ
ンパク質は、本発明のアッセイの一部でない他の物質に
対しては免疫学的に反応性であってもよいと理解され
る。好適な不活性タンパク質の限定されない代表例は、
カゼイン及びアルブミンであるが、他のものも当業者に
は明白であろう。
【００２３】リガンドがハプテンである場合には、好適
な抗ハプテン捕捉抗体を生成させるために、タンパク質
にハプテンを結合させることが必要である。かかる工程
はハプテンイムノアッセイの分野においては周知であ
り、本発明のこの態様に関する更なる詳細は本発明の完
全な理解のためには必要ではない。
な抗ハプテン捕捉抗体を生成させるために、タンパク質
にハプテンを結合させることが必要である。かかる工程
はハプテンイムノアッセイの分野においては周知であ
り、本発明のこの態様に関する更なる詳細は本発明の完
全な理解のためには必要ではない。
【００２４】捕捉抗体又は不活性タンパク質のいずれか
又は両方による膜の被覆は、任意の方法によって行うこ
とができるが、好ましくは、膜を抗体及び／又は不活性
タンパク質の溶液とインキュベートし、それによってタ
ンパク質を膜の表面のポリマーマトリクス中に物理的に
吸収させることによって行うことができる。被覆工程は
当該技術において完全に通常的なものである。
又は両方による膜の被覆は、任意の方法によって行うこ
とができるが、好ましくは、膜を抗体及び／又は不活性
タンパク質の溶液とインキュベートし、それによってタ
ンパク質を膜の表面のポリマーマトリクス中に物理的に
吸収させることによって行うことができる。被覆工程は
当該技術において完全に通常的なものである。
【００２５】リガンドを膜上に被覆された抗リガンドに
結合させるために、膜を、リガンドを含むと考えられる
試料と共にインキュベートすることができる。好ましく
は、試料を被覆された膜に施し、約０〜５０℃、好まし
くはほぼ雰囲気温度における約１〜１５分、好ましくは
約５分の一時的なフロースルーフォーマットにおいて膜
を通過させる。この方法によれば、試料中の抗原は、試
料中のその濃度に比例して膜上に捕捉される。更に試料
が体液である場合のように、試料が大過剰の関係のない
タンパク質を含む場合においても、ウィルス性抗原が優
先的に吸収されることが分かった。
結合させるために、膜を、リガンドを含むと考えられる
試料と共にインキュベートすることができる。好ましく
は、試料を被覆された膜に施し、約０〜５０℃、好まし
くはほぼ雰囲気温度における約１〜１５分、好ましくは
約５分の一時的なフロースルーフォーマットにおいて膜
を通過させる。この方法によれば、試料中の抗原は、試
料中のその濃度に比例して膜上に捕捉される。更に試料
が体液である場合のように、試料が大過剰の関係のない
タンパク質を含む場合においても、ウィルス性抗原が優
先的に吸収されることが分かった。
【００２６】本発明の別の態様においては、膜を不活性
タンパク質で被覆し、その表面上に抗原を直接吸収さ
せ、捕捉抗体を用いずにアッセイを行うことができる。
捕捉抗体が存在しないフロースルーイムノアッセイは、
共に審査継続中である共通の譲受人に譲渡された米国特
許出願第２７２，３８０号（１９８８年１１月１７日出
願）において開示されている。更に他の態様において
は、抗原を膜上に直接吸着させ、次に抗原を含む膜を不
活性タンパク質で処理して全ての非占有結合部位を充填
することができる。
タンパク質で被覆し、その表面上に抗原を直接吸収さ
せ、捕捉抗体を用いずにアッセイを行うことができる。
捕捉抗体が存在しないフロースルーイムノアッセイは、
共に審査継続中である共通の譲受人に譲渡された米国特
許出願第２７２，３８０号（１９８８年１１月１７日出
願）において開示されている。更に他の態様において
は、抗原を膜上に直接吸着させ、次に抗原を含む膜を不
活性タンパク質で処理して全ての非占有結合部位を充填
することができる。
【００２７】それに結合したリガンドを有する膜をトレ
ーサーの溶液で処理することができる。トレーサーは、
ウレアーゼに結合した抗リガンド（以下、検出抗リガン
ドと称する）であってよい。この場合、アッセイは通常
のサンドイッチ法又は半サンドイッチ法によって行われ
る。好ましい検出抗リガンドは、膜上に捕捉された抗原
に結合し、それによって試料中の抗原の量に正比例して
膜表面にウレアーゼを固定させる抗体である。また、ウ
レアーゼを通常の方法でビオチン、アビジン及びストレ
プトアビジンのようなバインダーと結合させて、これを
抗リガンドに結合させることもできる。
ーサーの溶液で処理することができる。トレーサーは、
ウレアーゼに結合した抗リガンド（以下、検出抗リガン
ドと称する）であってよい。この場合、アッセイは通常
のサンドイッチ法又は半サンドイッチ法によって行われ
る。好ましい検出抗リガンドは、膜上に捕捉された抗原
に結合し、それによって試料中の抗原の量に正比例して
膜表面にウレアーゼを固定させる抗体である。また、ウ
レアーゼを通常の方法でビオチン、アビジン及びストレ
プトアビジンのようなバインダーと結合させて、これを
抗リガンドに結合させることもできる。
【００２８】アッセイは、また、競合アッセイによって
行うこともできる。この場合、トレーサーは、ウレアー
ゼ又はウレアーゼとビオチン、アビジン若しくはストレ
プトアビジンとの結合体に結合したリガンドである。こ
のフォーマットにおいては、リガンドとトレーサーと
が、抗リガンド結合部位に関して競合し、ウレアーゼ
は、試料中のリガンドの量に反比例して膜表面上に固定
されるようになる。競合アッセイは、また、検出抗体、
好ましくはモノクローナル抗体を生成させるために用い
られるハプテンに結合したウレアーゼを含むトレーサー
を用いて行うこともできる。
行うこともできる。この場合、トレーサーは、ウレアー
ゼ又はウレアーゼとビオチン、アビジン若しくはストレ
プトアビジンとの結合体に結合したリガンドである。こ
のフォーマットにおいては、リガンドとトレーサーと
が、抗リガンド結合部位に関して競合し、ウレアーゼ
は、試料中のリガンドの量に反比例して膜表面上に固定
されるようになる。競合アッセイは、また、検出抗体、
好ましくはモノクローナル抗体を生成させるために用い
られるハプテンに結合したウレアーゼを含むトレーサー
を用いて行うこともできる。
【００２９】ウレアーゼのような酵素又はビオチン、ア
ビジン若しくはストレプトアビジンとの酵素結合体の抗
原又は抗体への結合は、当該技術において周知であり、
更に詳しい説明をすることなく当業者の理解の範囲内に
あると認められる。
ビジン若しくはストレプトアビジンとの酵素結合体の抗
原又は抗体への結合は、当該技術において周知であり、
更に詳しい説明をすることなく当業者の理解の範囲内に
あると認められる。
【００３０】ウレアーゼがそれに固定された膜を、本発
明の基質組成物で処理することができる。かかる組成物
は、相互作用して引き続いて着色された不溶性生成物を
与える少なくとも三つの成分を含んでいてよい。該組成
物の第１の成分は、ウレアーゼによってｐＨ上昇物質に
転化される化合物である。当該技術において公知な好適
な化合物は、尿素、例えばＮ−メチル尿素及びセミカル
バジドのような置換尿素類、及びホルムアミド及びアセ
トアミドのような単純なアミド類である。ウレアーゼに
よってこれらの化合物がアンモニアに開裂して、これが
アッセイ媒体のｐＨを上昇させる。好ましい第１の成分
は尿素である。
明の基質組成物で処理することができる。かかる組成物
は、相互作用して引き続いて着色された不溶性生成物を
与える少なくとも三つの成分を含んでいてよい。該組成
物の第１の成分は、ウレアーゼによってｐＨ上昇物質に
転化される化合物である。当該技術において公知な好適
な化合物は、尿素、例えばＮ−メチル尿素及びセミカル
バジドのような置換尿素類、及びホルムアミド及びアセ
トアミドのような単純なアミド類である。ウレアーゼに
よってこれらの化合物がアンモニアに開裂して、これが
アッセイ媒体のｐＨを上昇させる。好ましい第１の成分
は尿素である。
【００３１】基質組成物の第２の成分は、第３の成分の
ためのｐＨ依存還元剤であってよい。好適な第２の成分
は、インドキシル及び好ましくはアスコルビン酸であ
る。第２の成分は、低いｐＨにおいては第３の成分であ
るテトラゾリウム塩を還元しない。しかしながら、第１
の成分へのウレアーゼの作用によってアンモニアが生成
することによって、着色された不溶性のホルマザンへの
テトラゾリウム塩の還元を引き起こすのに十分にｐＨが
上昇せしめられる。テトラゾリウム塩のホルマザンへの
還元は当該技術において周知である。好適なテトラゾリ
ウム塩の代表例は、インドニトロテトラゾリウムバイオ
レット及びニトロブルーテトラゾリウムクロライドであ
るが、他のものも当業者に周知である。
ためのｐＨ依存還元剤であってよい。好適な第２の成分
は、インドキシル及び好ましくはアスコルビン酸であ
る。第２の成分は、低いｐＨにおいては第３の成分であ
るテトラゾリウム塩を還元しない。しかしながら、第１
の成分へのウレアーゼの作用によってアンモニアが生成
することによって、着色された不溶性のホルマザンへの
テトラゾリウム塩の還元を引き起こすのに十分にｐＨが
上昇せしめられる。テトラゾリウム塩のホルマザンへの
還元は当該技術において周知である。好適なテトラゾリ
ウム塩の代表例は、インドニトロテトラゾリウムバイオ
レット及びニトロブルーテトラゾリウムクロライドであ
るが、他のものも当業者に周知である。
【００３２】したがって、本発明の好ましいサンドイッ
チアッセイにおいては、膜上に被覆された抗リガンドに
よって試料中のリガンドが捕捉される。捕捉されたリガ
ンドはトレーサーと結合し、これによって、ウレアーゼ
が膜に固定されるようになる。膜に固定されたウレアー
ゼは基質組成物中の尿素をアンモニアに転化せしめる。
アンモニアはｐＨを、アスコルビン酸がテトラゾリウム
塩をホルマザンに還元するレベルに上昇する。したがっ
て、サンドイッチアッセイフォーマットにおいては、膜
上の色の発現は試料中のリガンドの指標である。
チアッセイにおいては、膜上に被覆された抗リガンドに
よって試料中のリガンドが捕捉される。捕捉されたリガ
ンドはトレーサーと結合し、これによって、ウレアーゼ
が膜に固定されるようになる。膜に固定されたウレアー
ゼは基質組成物中の尿素をアンモニアに転化せしめる。
アンモニアはｐＨを、アスコルビン酸がテトラゾリウム
塩をホルマザンに還元するレベルに上昇する。したがっ
て、サンドイッチアッセイフォーマットにおいては、膜
上の色の発現は試料中のリガンドの指標である。
【００３３】競合アッセイにおいては、試料中のリガン
ドは、抗リガンドとの結合に関してトレーサーと競合す
る。したがって、このアッセイ機構においては、トレー
サー及びしたがってウレアーゼは、リガンドの濃度に反
比例して膜に固定されるようになる。したがって、競合
アッセイにおいては、着色ホルマザンの非存在が試料中
のリガンドの指標である。
ドは、抗リガンドとの結合に関してトレーサーと競合す
る。したがって、このアッセイ機構においては、トレー
サー及びしたがってウレアーゼは、リガンドの濃度に反
比例して膜に固定されるようになる。したがって、競合
アッセイにおいては、着色ホルマザンの非存在が試料中
のリガンドの指標である。
【００３４】本発明方法を用いて尿素に関して試験する
ことができることは明らかである。本発明のこの態様の
ために、ウレアーゼを膜上に吸着させることができ、未
知量の尿素、アスコルビン酸塩及びテトラゾリウム塩を
含む溶液を、膜を通して通過させることができる。未知
量の尿素によってスポットが膜上に発現する。既知量の
尿素を含む標準試料と色を比較して尿素を定量すること
ができる。
ことができることは明らかである。本発明のこの態様の
ために、ウレアーゼを膜上に吸着させることができ、未
知量の尿素、アスコルビン酸塩及びテトラゾリウム塩を
含む溶液を、膜を通して通過させることができる。未知
量の尿素によってスポットが膜上に発現する。既知量の
尿素を含む標準試料と色を比較して尿素を定量すること
ができる。
【００３５】更に本発明を説明するために以下の実施例
を与えるが、これは本発明を制限するものではない。
を与えるが、これは本発明を制限するものではない。
【００３６】（実施例１）アスコルビン酸ナトリウム／
ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを用いたウレ
アーゼの検出（バイオダインＣ膜） 以下の構成で膜フィルタースタックを組み立てた。
ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを用いたウレ
アーゼの検出（バイオダインＣ膜） 以下の構成で膜フィルタースタックを組み立てた。
【００３７】（ａ）表層：３ミクロンBiodyneＣ膜(Pal
l, Glen cove, New York, #BIA0030HC5)。雰囲気温度に
おいて、０．３％カゼインを含むリン酸塩緩衝食塩水中
に３０分間浸漬することによって予めコーティングし
た。
l, Glen cove, New York, #BIA0030HC5)。雰囲気温度に
おいて、０．３％カゼインを含むリン酸塩緩衝食塩水中
に３０分間浸漬することによって予めコーティングし
た。
【００３８】（ｂ）次の層：不織レイヨンシート(Schle
icher and Schuell, Keene, New Hampshire; #5-S)。
icher and Schuell, Keene, New Hampshire; #5-S)。
【００３９】（ｃ）底層：セルローズ吸収性パッド(2)
(Filtration Sciences, Mount Holly Springs,Pennsylv
ania; #ED320-200)。
(Filtration Sciences, Mount Holly Springs,Pennsylv
ania; #ED320-200)。
【００４０】表層の上に形成される受容孔(receiving w
ell)を有するプラスチックホルダー中に膜層を入れた。
この孔中に、受容孔よりも狭い開口を有し、表膜にぴっ
たりと接して設置される流れ抑制挿入物を取り付けた。
ell)を有するプラスチックホルダー中に膜層を入れた。
この孔中に、受容孔よりも狭い開口を有し、表膜にぴっ
たりと接して設置される流れ抑制挿入物を取り付けた。
【００４１】ＴＥＯＡバッファー（１５０μｌ、０．１
Ｍトリエタノールアミン、１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
６）中のウレアーゼ／ビオチン結合体の溶液を、抑制挿
入物を通して加え、膜上に吸着されたウレアーゼ／ビオ
チンの三角パターンを生成させた。１分後、挿入物を除
去し、膜をＴＥＯＡバッファー（２００μｌ）で洗浄し
た。ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットの水溶液
（２００μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、次にウレア
ーゼ基質（２００μｌ、２５ｍＭ尿素、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）
を加えた。１０、２０及び３０分後に、停止バッファー
（４００μｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
３．０）を加え、膜の色をGretag反射光度計(マジェン
タセット)を用いて測定した。この色を、吸着されたウ
レアーゼ／ビオチン結合体に対応する三角パターンとし
て観察した。ウレアーゼを加えていない試料は、膜上に
三角パターンを示さなかった。
Ｍトリエタノールアミン、１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
６）中のウレアーゼ／ビオチン結合体の溶液を、抑制挿
入物を通して加え、膜上に吸着されたウレアーゼ／ビオ
チンの三角パターンを生成させた。１分後、挿入物を除
去し、膜をＴＥＯＡバッファー（２００μｌ）で洗浄し
た。ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットの水溶液
（２００μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、次にウレア
ーゼ基質（２００μｌ、２５ｍＭ尿素、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）
を加えた。１０、２０及び３０分後に、停止バッファー
（４００μｌ、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
３．０）を加え、膜の色をGretag反射光度計(マジェン
タセット)を用いて測定した。この色を、吸着されたウ
レアーゼ／ビオチン結合体に対応する三角パターンとし
て観察した。ウレアーゼを加えていない試料は、膜上に
三角パターンを示さなかった。
【００４２】インキュベーションの時間と、ウレアーゼ
検出の限界との間の関係が図に示される。
検出の限界との間の関係が図に示される。
【００４３】（実施例２）アスコルビン酸ナトリウム／
ニトロブルーテトラゾリウムクロライドを用いたウレア
ーゼの検出（BiodyneＣ膜） ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット水溶液をニト
ロブルーテトラゾリウムクロライド（３００μｌ、０．
１６５ｍｇ／ｍｌ、０．５％メタノール）に置き換えた
外は実施例１の手順を繰り返した。１２分後、Gretag反
射光度計（ブラックセッティング）を用いて測定した。
ウレアーゼ／ビオチンの検出限界は１０ｎｇ／試験であ
った。ウレアーゼを加えない膜は三角パターンを示さな
かった。
ニトロブルーテトラゾリウムクロライドを用いたウレア
ーゼの検出（BiodyneＣ膜） ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット水溶液をニト
ロブルーテトラゾリウムクロライド（３００μｌ、０．
１６５ｍｇ／ｍｌ、０．５％メタノール）に置き換えた
外は実施例１の手順を繰り返した。１２分後、Gretag反
射光度計（ブラックセッティング）を用いて測定した。
ウレアーゼ／ビオチンの検出限界は１０ｎｇ／試験であ
った。ウレアーゼを加えない膜は三角パターンを示さな
かった。
【００４４】（実施例３）インドキシル／ニトロブルー
テトラゾリウムクロライドを用いたウレアーゼの検出
（BiodyneＣ膜） 実施例１に記載のようにして、ウレアーゼ／ビオチン結
合体をBiodyneＣ膜上に吸着させた。挿入物を除去し、
試料をＴＥＯＡバッファー（２００μｌ）で洗浄した。
ウレアーゼ基質溶液（２５ｍＭ尿素、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭインドキシルブチレート）をウサギ肝エステ
ラーゼ（５．３μｇ／ｍｌ）で処理してインドキシルブ
チレートからインドキシルを生成させた。溶液を速やか
に混合し、器具に加えた。１２分後、停止バッファーを
加え、膜の色をGretag反射光度計（ブラックセッティン
グ）を用いて読み取った。ウレアーゼ／ビオチンの検出
限界は１０ｎｇ／試験であった。ウレアーゼ／ビオチン
結合体を膜に結合させた場合のみしか色が観察されなか
った。
テトラゾリウムクロライドを用いたウレアーゼの検出
（BiodyneＣ膜） 実施例１に記載のようにして、ウレアーゼ／ビオチン結
合体をBiodyneＣ膜上に吸着させた。挿入物を除去し、
試料をＴＥＯＡバッファー（２００μｌ）で洗浄した。
ウレアーゼ基質溶液（２５ｍＭ尿素、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭインドキシルブチレート）をウサギ肝エステ
ラーゼ（５．３μｇ／ｍｌ）で処理してインドキシルブ
チレートからインドキシルを生成させた。溶液を速やか
に混合し、器具に加えた。１２分後、停止バッファーを
加え、膜の色をGretag反射光度計（ブラックセッティン
グ）を用いて読み取った。ウレアーゼ／ビオチンの検出
限界は１０ｎｇ／試験であった。ウレアーゼ／ビオチン
結合体を膜に結合させた場合のみしか色が観察されなか
った。
【００４５】（実施例４）テトラゾリウム塩還元を用い
た尿素に関するアッセイ 実施例１に記載のようにして器具を調製した。ＴＥＯＡ
バッファー中のウレアーゼ溶液をBiodyneＣ膜上に吸着
させた。ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットの水
溶液（２００μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、器具を
通して流れさせた。未知量の尿素を含む試料を膜を通し
て通過させ、基質バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）中に既知濃度の尿素を
有する標準試料を同量の吸着ウレアーゼを有する他の膜
に施した。５分後、未知試料の色の強度を反射光度計で
測定し、標準試料中に存在する尿素の量に関連させた。
この関連付けを順に行い、上記方法によって試験された
未知試料中に存在する尿素の濃度を測定した。
た尿素に関するアッセイ 実施例１に記載のようにして器具を調製した。ＴＥＯＡ
バッファー中のウレアーゼ溶液をBiodyneＣ膜上に吸着
させた。ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットの水
溶液（２００μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を加え、器具を
通して流れさせた。未知量の尿素を含む試料を膜を通し
て通過させ、基質バッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）中に既知濃度の尿素を
有する標準試料を同量の吸着ウレアーゼを有する他の膜
に施した。５分後、未知試料の色の強度を反射光度計で
測定し、標準試料中に存在する尿素の量に関連させた。
この関連付けを順に行い、上記方法によって試験された
未知試料中に存在する尿素の濃度を測定した。
【図１】本発明方法による、インキュベーション時間の
関数としてのウレアーゼ活性の検出を示す図である。
関数としてのウレアーゼ活性の検出を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 グレン・ピー・ヴォンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27526，フクエイ−ヴァリナ，ピネイ・グ ローブ・ウィルボン・ロード 2717 (72)発明者 ジェームズ・ピー・マペス アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27612，ローリー，キングスランド・ドラ イブ 8005
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の工程：（ａ）リガンドを含むと考
えられる液体を、捕捉抗リガンドを予め被覆した多孔性
膜を通して通過させて、それによって該リガンドを該膜
上に捕捉し； （ｂ）リガンド及び検出抗リガンドの一方に結合したウ
レアーゼを含むトレーサー溶液を、該膜を通して通過さ
せて、該膜上に該ウレアーゼを含む結合フラクションを
与え； （ｃ）基質組成物の溶液を該膜を通して通過させ、該組
成物はウレアーゼによってアンモニアに転化せしめられ
る化合物、ｐＨ依存還元剤及びテトラゾリウム塩を含
み、該膜上の該ウレアーゼは該化合物をアンモニアに転
化せしめ、該アンモニアは基質溶液のｐＨを上昇させ、
それによって該還元剤を活性化させ、活性化した還元剤
は該テトラゾリウム塩をホルマザンに還元し、該ホルマ
ザンは該膜上に着色スポットとして沈殿して該液体中の
リガンドの存在を示す； 工程を含むことを特徴とする液体中のリガンドの検出方
法。 - 【請求項２】 該トレーサーが該検出抗リガンドに結合
したウレアーゼを含み、該トレーサーが該リガンドに結
合する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該化合物が、尿素、Ｎ−メチル尿素、セ
ミカルバジド、ホルムアミド及びアセトアミドからなる
群から選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 該還元剤が、インドキシル及びアスコル
ビン酸からなる群から選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 以下の工程：（ａ）リガンドを含むと考
えられる液体を固体支持体と接触させて該リガンドを該
支持体に結合させ； （ｂ）支持体に結合したリガンドを、抗リガンドに結合
したウレアーゼを含むトレーサーと接触させ、それによ
って、該抗リガンドを結合リガンドに結合させ、該ウレ
アーゼを該支持体に固定し； （ｃ）該支持体に固定されたウレアーゼを該ウレアーゼ
に対する基質組成物と接触させ、該組成物は、該ウレア
ーゼによってアンモニアに転化せしめられる化合物、テ
トラゾリウム塩及び該テトラゾリウム塩のためのｐＨ依
存還元剤を含み、これによって、該リガンドが該液体中
に存在している場合には該支持体上に着色スポットが形
成される； 工程を含むことを特徴とする液体中のリガンドの検出方
法。 - 【請求項６】 該支持体が多孔性膜である請求項５記載
の方法。 - 【請求項７】 以下の工程： （ａ）ウレアーゼを固体支持体上に吸着させ； （ｂ）該支持体を尿素を含むと考えられる溶液と接触さ
せ； （ｃ）該支持体を該ウレアーゼに対する基質組成物と接
触させ、該組成物はテトラゾリウム塩及び該テトラゾリ
ウム塩に対するｐＨ依存還元剤を含み、これによって、
尿素が該液体中に存在している場合には該支持体上に着
色スポットが形成される； 工程を含むことを特徴とする液体中の尿素の検出方法。 - 【請求項８】 標識としてウレアーゼを用いた酵素イム
ノアッセイのための基質組成物であって、該ウレアーゼ
によってアンモニアに転化せしめられる化合物、テトラ
ゾリウム塩、及び、該アンモニアの形成によって得られ
るｐＨにおいて該テトラゾリウム塩をホルマザンに還元
する還元剤を含むことを特徴とする上記基質組成物。 - 【請求項９】 リガンドに関するアッセイを行うための
材料のキットであって、 （ａ）包装物； （ｂ）多孔性膜及び該膜と接触している吸収性材料のパ
ッドを含む該包装物中のフィルタースタック； （ｃ）該リガンド又は検出抗リガンドの一方に結合して
いるウレアーゼを含むトレーサー；及び （ｄ）該ウレアーゼによってアンモニアに転化せしめら
れる化合物、テトラゾリウム塩及び該テトラゾリウム塩
に対するｐＨ依存還元剤を含む、該ウレアーゼに対する
基質組成物； を含む上記キット。 - 【請求項１０】 抗原に関するアッセイを行うための材
料のキットであって、 （ａ）包装物； （ｂ）その上に捕捉抗体を有する多孔性膜、及び、該膜
と接触している吸収性材料のパッドを含む該包装物中の
フィルタースタック； （ｃ）検出抗体に結合しているウレアーゼを含むトレー
サー；及び （ｄ）尿素、アスコルビン酸及びテトラゾリウム塩を含
む、該ウレアーゼに対する基質組成物； を含む上記キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/528,526 US5139934A (en) | 1990-05-25 | 1990-05-25 | Substrate composition and method for solid phase urease immunoassay |
| US528526 | 1990-05-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04231874A JPH04231874A (ja) | 1992-08-20 |
| JPH06105255B2 true JPH06105255B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=24106044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3096614A Expired - Lifetime JPH06105255B2 (ja) | 1990-05-25 | 1991-04-26 | 固相ウレアーゼイムノアッセイのための基質組成物及び方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5139934A (ja) |
| EP (1) | EP0458231A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06105255B2 (ja) |
| AU (1) | AU640750B2 (ja) |
| CA (1) | CA2037521A1 (ja) |
| IE (1) | IE910682A1 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5139934A (en) * | 1990-05-25 | 1992-08-18 | Becton, Dickinson And Company | Substrate composition and method for solid phase urease immunoassay |
| US5314804A (en) * | 1992-03-24 | 1994-05-24 | Serim Research Corporation | Test for Helicobacter pylori |
| AU675251B2 (en) * | 1993-01-04 | 1997-01-30 | Becton Dickinson & Company | Flow-through hybridization assay for oligonucleotide sequences |
| US5354658A (en) * | 1993-01-28 | 1994-10-11 | Dennis Wright | Non-radioactive method for detecting a labelled segment and a solution or composition therefor |
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