DE60130919T2

DE60130919T2 - Durchflussvorrichtung, diese enthaltender diagnostischer kit und verwendung zum nachweis von analyten in einer probe

Info

Publication number: DE60130919T2
Application number: DE60130919T
Authority: DE
Inventors: France Fannes
Original assignee: BIO A R T SA; Bio Art SA
Current assignee: BIO A R T SA; Bio Art SA
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: CA2431097A1; EP1344059A1; DE60130919D1; WO2002052263A1; EP1344059B1; EP1845375A2; DK1344059T3; ATE375509T1; ES2295227T3; EP1845375A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines in einer Probe vorhandenen Analyten und ein Verfahren zum Beschichten eines unlöslichen porösen Materials mit einer/einem analytbindenden Verbindung oder Komplex.
Hintergrund der Erfindung
Die Anzahl der Schnellimmunochromatographie-Vorrichtungen auf Membranbasis auf dem Markt wächst weiter in einem sehr schnellen Tempo. Hauptfaktoren, die zu diesem Wachstum beitragen, schließen Verbesserungen der Konjugattechnologie und ein zunehmendes Verständnis der damit verbundenen allgemeinen Entwicklungsprinzipien unter den Produktentwicklern ein. Obwohl heutige Immunochromatographie-Vorrichtungen in vielen verschiedenen Ausführungen mit einer vielfältigen Auswahl an Gehäusen herauskommen, basieren die am häufigsten erhältlichen Tests auf einer von zwei einfachen Ausführungen.
Die gebräuchlichste Ausführung ist die Lateralströmungs- oder Messstabausführung, welche durch ihre Verwendung sowohl bei Tests in Arztpraxen als auch bei freiverkäuflichen Tests bekannt geworden ist. Eine weniger verbreitete Ausführung ist die Durchfluss- oder Querströmungsausführung. Ungeachtet der verwendeten Ausführung erfordert das Erreichen eines empfindlichen und reproduzierbaren Tests, dass der Hersteller ein wirksames Verfahren zur Anwendung einer analytbindenden Verbindung hat. Diese analytbindende Verbindung kann den zu analysierenden Analyten spezifisch binden. Ein Schnelltest ist ein kostengünstiger, verfügbarer Assay auf Membranbasis, der den visuellen Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe liefert.
Definitionsgemäß liefern Schnelltests in einer kurzen Zeit, vorzugsweise Minuten, Ergebnisse. Es ist ein Ziel, dass diese Tests einfach, genau, zuverlässig, kostengünstig, verfügbar und absolut sicher sind. Sie sind vorzugsweise außerdem leicht und eindeutig zu interpretieren, selbst durch Anwender ohne viel Erfahrung. Üblicherweise wird eine flüssige Probe von nur 200 μl benötigt, um den Test durchzuführen, welcher gewöhnlich innerhalb von 2–5 min beendet ist. Es wird keine Geräteausstattung benötigt, um diese Tests durchzuführen, welche in Kliniken, Labors, bei Außeneinsätzen und zu Hause – oft von unerfahrenem Personal – verwendet werden können. Das Grundsubstrat eines bekannten Schnelltests ist typischerweise ein Nitrocellulosestreifen, auf dem eine analytbindende Verbindung immobilisiert ist, gewöhnlich ein Antikörper oder ein Antigen. Eine Schicht (Kissen) mit dem getrockneten Konjugat wird auf den Membranstreifen aufgebracht. Bei der Mehrheit der gegenwärtig verfügbaren Tests enthält diese Konjugatschicht Goldpartikel, absorbiert mit Antikörpern oder Antigenen, die für den nachzuweisenden Analyten spezifisch sind. Wenn die Probe auf die Vorrichtung aufgebracht wird, wandert die flüssige Probe durch Kapillardiffusion durch die Konjugatschicht, wodurch das Goldkonjugat rehydratisiert und die Wechselwirkung der Probe mit dem Konjugat ermöglicht wird.
Goldmarkierungen wurden bei den Schnelltests auf Membranbasis in den späten 1980ern eingeführt. Seine ausgezeichnete Stabilität, Empfindlichkeit und Genauigkeit machen Gold für die Verwendung im Schnelltest geeignet. Trotzdem erfordert Goldkonjugat von hoher Qualität die größte Sorgfalt und Vorsicht, um ein stabiles und empfindliches Endprodukt zu erhalten. Tatsächlich führen viele minderwertige, schlecht charakterisierte Produkte zu nicht reproduzierbaren, unzuverlässigen Ergebnissen. Um das zu verhindern, müssen Goldkolloide unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) ultrastrukturell beurteilt werden. Solch eine Beurteilung sollte den Hersteller befähigen, den Durchmesser der Kolloide mit dem von geeichten Standards zu vergleichen und Informationen über die Kugelgestalt der Partikel und die Gesamtstreuung des Partikeldurchmessers zu erhalten. Gleichmäßig geformte mit einer optimalen Partikelgröße von 40 nm bis 20 nm ermöglichen es, zuverlässige Assays zu schaffen. Nur 5% anders geformte Partikel können ein Testergebnis beeinflussen, es komplett nicht reproduzierbar machen. Aus diesem Grunde ist die Herstellung derartiger Goldpartikel von hoher Qualität teuer. Das steht im Gegensatz zu der vorstehend angegebenen Definition, dass ein Schnelltest ein kostengünstiger Assay sein sollte.
EP 0 207 152 und US-Patent Nr. 5.958.790 offenbaren ein Verfahren zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Untersuchungsprobe, basierend auf dem Durchflussprinzip, umfassend eine zweite analytbindende Verbindung, welche nach Kontakt mit dem Reaktionsbereich immobilisiert wird, wobei eine kolloidale Goldmarkierung an die zweite analytbindende Verbindung gebunden wird. Ein durch das immobilisierte kolloidale Gold erzeugtes Farbsignal bildet das optische Signal. Außerdem definiert US-Patent Nr. 5.616.467 die optimale Größe der Partikel mit 20 nm, um Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests zu erhöhen.
Jedoch sind, wie vorstehend erörtert, die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit derartiger Tests auf Goldbasis ziemlich gering. Eine weitere Optimierung wird benötigt, um Durchsatz, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen und die Kosten dieser in-vitro-Assays zu senken.
Enzymimmunoassay-Vorrichtungen, wobei ein Sandwich-Komplex gebildet wird, sind aus EP 0 458 231 bekannt. Eine Durchflussvorrichtung wird offenbart, worauf ein Sandwich-Komplex unter Verwendung von Urease als Markierung erzeugt wird. Eine Kaskade von Reaktionen wird zur Bildung eines farbigen Niederschlags offenbart. Ein Hauptproblem ist, dass diese bekannten Enzymimmunoassays mehrere Verfahrensschritte, wie eine Kaskade von Reaktionen, zur Erzeugung eines farbigen Niederschlags erfordern. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diesen mehrstufigen Reaktionsmechanismus zu verringern.
EP 0 125 118 offenbart einen Immunoassay, wobei enzymgebundene Sandwiches auf einer Messstaboberfläche gebildet werden und wobei ein unlöslicher Niederschlag gebildet wird. Mehrere Waschschritte werden zum Erhalten dieses farbigen Niederschlags benötigt.
US-Patent Nr. 5.958.790 offenbart ein Verfahren zur qualitativen oder halbqualitativen Bestimmung eines Analyten in einer Untersuchungsprobe, basierend auf dem Durchflussprinzip, wobei durch die immobilisierten kolloidalen Goldpartikel ein optisches Signal erzeugt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist folglich, einen kostengünstigen, einfachen, schnellen, reproduzierbaren, empfindlichen Test, welcher für den Nachweis von Analyten in einer Probe zuverlässig ist, zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung verwendet Konjugate oder analytbindende Verbindungen, markiert mit Enzymen, die unlösliche Präzipitate bilden können, wenn (ein) Analyt(en) in einer Testlösung in einer Durchflussanordnung vorhanden ist/sind. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auf eine weitere Optimierung des Schnelltestkonzeptes durch eine ausgewogene Berücksichtigung jedes Parameters, der zu einem reproduzierbaren und empfindlichen Test führt, ausgerichtet.
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein zuverlässiges Einschrittverfahren zum Erhalten eines farbigen Niederschlags, eingebunden in die Durchflussassayvorrichtung, zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung eines derartigen Einschrittverfahrens ermöglicht die Entwicklung eines schnelleren, einfacheren, kostengünstigeren Testsystems, aber auch die Verbesserung der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des entsprechenden Tests. Tatsächlich können durch Weglassen von Verfahrensschritten Fehler, wie Pipettierungs- oder Bedienungsfehler, eingeschränkt oder sogar vernachlässigbar werden. Die Verwendung eines Einschrittnachweisverfahrens, wie in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, im Gegensatz zur Verwendung eines mehrstufigen Nachweisreaktionsmechanismus wie in EP 0 458 231 beschrieben, hat diese Wirkung zur Folge. Außerdem werden in der/dem Vorrichtung/Verfahren/Kit der vorliegenden Erfindung Waschschritte weggelassen. Derartige Waschschritte sind für die Empfindlichkeit/Reproduzierbarkeit bei den meisten Tests nach dem Stand der Technik, z. B. EP 0 458 231 und EP 0 125 118 , unbedingt notwendig. Neben der Verbesserung der vorstehend erwähnten Merkmale ermöglicht die/das Vorrichtung/Verfahren/Kit der vorliegenden Erfindung auch eine dauerhafte Aufzeichnung der Ergebnisse, was bei der Verwendung von Goldpartikeln nicht der Fall ist. Eine dauerhafte Aufzeichnung ermöglicht dem Fachmann, erhaltene Ergebnisse mit aus früheren/späteren Versuchen erhaltenen Ergebnissen zu verwenden. Das macht den Vergleich von Inter-Assay-Ergebnissen leichter und zuverlässiger. Außerdem erfordert die Herstellung eines Kits gemäß US-Patent Nr. 5.958.790 mehr Arbeit und ist teurer und entsprechende Testergebnisse sind weniger zuverlässig.
Als allgemeine Schlussfolgerung beschreibt die vorliegende Erfindung ein schnelleres, einfacheres, kostengünstigeres Verfahren, welches vergleichbarer, zuverlässiger und reproduzierbarer als bereits bekannte Testverfahren ist.
Diese Ziele, einzeln, teilweise kombiniert oder alle zusammen, wurden durch die vorliegende Erfindung erreicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Assayvorrichtung zum Prüfen des Vorhandenseins eines Analyten in einer bestimmten Probe zur Verfügung gestellt, umfassend: einen mehrlagigen Träger, worauf eine erste analytbindende Verbindung oder ein erster analytbindender Komplex, die/der den in der Probe vorhandenen Analyten binden kann, immobilisiert ist, wobei der Analyt eine zweite enzymmarkierte analytbindende Verbindung oder einen zweiten enzymmarkierten analytbindenden Komplex unter Bildung eines Sandwich-Komplexes binden kann, wobei der Sandwich-Komplex nach Kontakt mit einem geeigneten präzipitierenden Substrat für die Enzymmarkierung einen farbigen Niederschlag in einem Einschrittverfahren erzeugen kann.
In der vorliegenden Erfindung ist ein „Komplex" so zu verstehen, dass die analytbindende Verbindung zu einem Molekülagglomerat gehören kann, wobei ein oder mehrere in diesem Agglomerat vorhandene Verbindungen den Analyten einzeln oder zusammenwirkend binden können. In einer anderen Ausführungsform kann der Analyt auch zu einem Komplex gehören, umfassend ein oder mehrere, welche gleiche oder verschiedene Analyte sein können. Die anderen Teile in diesem Agglomerat oder Komplex können Peptide, Proteine, Lipide, Nucleinsäuren oder organische Moleküle sein.
Durch Verknüpfung des Durchflusssystems mit der Verwendung eines spezifischen präzipitierenden Substrats stellten die Erfinder erstaunlicherweise fest, dass hochzuverlässige, schnelle, empfindliche Testbedingungen und Testbedingungen mit hohem Durchsatz für den Nachweis von Analyten in einer Untersuchungsprobe geschaffen werden konnten, aufgrund der Tatsache, dass ein Farbniederschlag in nur einem Schritt direkt erhalten wird. Außerdem ist die Herstellung dieser Assayvorrichtungen einfach und kostengünstig und erfordert keine besonders hohe Qualität der Produkte.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auf eine weitere Optimierung des Schnelltestkonzeptes durch eine ausgewogene Berücksichtigung jedes Parameters, der zu einem reproduzierbaren und empfindlichen Test führt, wie Zusammensetzung der Membran, Porengröße der Membran, Optimierung des markierten Reagenziensystems zum Nachweis des Analyten, Zusammensetzung des Beschichtungspuffers, Wahl der analytbindenden Verbindung, Applikationsverfahren, neues Blockierungsverfahren (Nachbeschichtung durch Eintauchen über einige Stunden wurde bisher nicht beschrieben), Lagerung und Beständigkeit der Membran, Stabilität des Messwertes, Kosten, ausgerichtet. Durch dieses Optimierungsverfahren können alle Waschschritte, welche vorher zum Klären der Hintergrundsignale benötigt wurden, weggelassen werden, was ergibt, dass der Test nicht nur kostengünstiger, sondern auch einfacher und schneller als die bisher beschriebenen Testsysteme ist.
Die vorliegende Durchflussanordnung ermöglicht ein Verfahren mit „hohem Durchsatz", welches erforderlich sein kann, wenn eine große Probenanzahl analysiert werden muss. Die beschriebene Erfindung ermöglicht auch das reproduzierbare Prüfen von Testproben, was bei Verwendung für die klinische Diagnose notwendig sein kann. Die Erfinder stellten fest, dass die Empfindlichkeit des Assays unter Verwendung der durch die Erfindung beschriebenen Vorrichtung vergleichbar ist mit dem am stärksten optimierten Zustand, wie für Tests auf Goldbasis beschrieben. Diese Vorrichtungen können für einen breiten Anwendungsbereich verwendet werden, nicht nur für klinische Anwendungen, sondern auch für Agrar-, Umwelt- und Veterinäranwendungen. Derartige Tests können außerhalb des Labors ohne Laborausrüstung durch Ärzte, Laboranten oder weniger ausgebildetes Personal durchgeführt werden.
Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung eine Assayvorrichtung, die den Anforderungen entspricht, welche für die Akzeptanz derartiger Tests entscheidend sind: Benutzerfreundlichkeit, kleine Probenvolumina, Geschwindigkeit, d. h. innerhalb von 3–5 min, Zuverlässigkeit und geringer Verkaufspreis. Außerdem zeichnen sich diese Tests auch durch die gleichen technischen Leistungen, d. h. Empfindlichkeit und Spezifität, Langzeitbeständigkeit, wie jene beim Testen mit Messgerät im Labor gebotenen, aus.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der mehrlagige Träger der erfindungsgemäßen Assayvorrichtung, wie vorstehend beschrieben:

a) eine obere Deckschicht aus einem wasserundurchlässigen Material mit mindestens einem Loch, wobei dieses Loch zumindest teilweise einen Testbereich freilegt,
b) eine poröse Zwischenschicht, umfassend mindestens ein unlösliches poröses Material, worauf die erste analytbindende Verbindung in dem Testbereich binden kann, und
c) eine untere absorbierende Schicht, umfassend mindestens eine Schicht aus einem hydrophilen Material.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das wasserundurchlässige Material der oberen Deckschicht, wie vorstehend definiert, ausgewählt aus Kunststoff, der an die zu testende Probe angepasst ist, umfassend Polypropylen, Polyvinylchlorid oder Styrol-Ethylen/Butylen-Styrol (SEBS) (Rubin (1990), Schouten und van der Vegt (1987)). Das verhindert unerwünschte Hintergrundsignale, verursacht durch hydrophobe oder hydrophile Wechselwirkung von einigen der in einer Probe vorhandenen Komponenten mit dem Kunststoff.
Die erfindungsgemäße Assayvorrichtung umfasst mindestens ein Loch in dem wasserundurchlässigen Material mit einem Durchmesser von mindestens 1 mm, das einen Testbereich einblendet. Das Loch begrenzt die Oberfläche der porösen Membran, auf welcher die Probe ausgesetzt wird, und, bei Auftüpfeln großer Volumina auf diese mehrlagige Vorrichtung, hilft das Loch auch, dass die Flüssigkeit durch die durch das Loch begrenzte Fläche absorbiert wird. Das Loch ist nicht durch die Größe des Testbereichs begrenzt. Sowohl Loch als auch Testbereich können jede Form besitzen, wie Kreis, Quadrat, Dreieck, Kreuz oder jede regelmäßige oder unregelmäßige Fläche.
Der Testbereich gehört zu der porösen Schicht, wo die erste analytbindende Verbindung oder das Fängermolekül aufgetüpfelt wurden. Der Testbereich kann zwischen 1 und 10 mm breit sein. Ein Testbereich mit einer Größe kleiner als 1 mm ist möglich, aber in solch einem Fall kann die Auswertung, d. h. das Ablesen der Ergebnisse, schwierig sein. Ein Testbereich mit einer Größe größer als 10 mm ist möglich, aber in solch einem Fall wird mehr Reagenzienvolumen benötigt. Dennoch ist in einigen Fällen die Verwendung eines großen Testbereichs wichtig, z. B. bei der Analyse von Lebensmittelproben. Das Eindringen eines größeren Probenvolumens, z. B. von 0,1 ml bis 2 ml, kann die Konzentration des nachzuweisenden Analyten auf der Membran ermöglichen. Dieser Testbereich kann einen Durchmesser von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 mm aufweisen. Bevorzugt weist der Testbereich einen Durchmesser von 3 bis 4 mm auf. Für solch einen Bereich werden vorzugsweise Probenvolumina zwischen 5 und 500 μl verwendet. Das Volumen der zugesetzten Probe ist bevorzugt gleich oder kleiner als das Volumen der Reagenslösung. Beispielsweise, wenn eine Probe von 15 μl aufgebracht wird, werden 25 μl der Reagenslösung verwendet; wenn 25–30 μl der Probe verwendet werden, werden 50 μl der Reagenslösung aufgebracht. Wenn der Testbereich größer als 4 mm ist oder wenn die Probenvolumina größer als 100 μl sind, kann die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers durch den Zusatz von Saccharose, der von 1% bis zu 40% reicht, verändert werden. Mögliche Konzentrationen sind 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und 40%. Saccharose kann in den Verdünnungspuffer gegeben werden, um das Durchflussgeschwindigkeitsphänomen abzuschwächen, um eine niedrigere Nachweisgrenze zu erzielen und das Auftreten eines heterogenen farbigen Flecks zu verhindern.
Die erfindungsgemäße Assayvorrichtung umfasst vorzugsweise eine unlösliche poröse Zwischenschicht, an welche eine analytbindende Verbindung oder an welche ein Fängermolekül gebunden ist. Diese Schicht kann komplexe Suspensionen filtern, z. B. Zellmaterial aus einer zu untersuchenden Probe, wenn der Analyt mit dem Zellmaterial assoziiert ist. Im letzten Fall wird die Membran oder der Filter mit einer Porengröße, welche diese Abtrennung zulässt, ausgewählt. Jedes aus einer Vielzahl von Filterteilen kann verwendet werden, einschließlich Glasfaserfiltern und Filtern aus unterschiedlichen synthetischen oder natürlichen Materialien. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das unlösliche poröse Zwischenmaterial ausgewählt aus Nylon, Nitrocellulose, Cellulose, Glasfaser, Polysulfon, Polyvinylidendifluorid, Polyester oder jedem anderen polymeren Material, woran biologische Substanzen binden können. Vorzugsweise ist das unlösliche poröse Zwischenmaterial Nitrocellulose (Advanced Microdevices (Pvt.) Ltd., 21, Industrial Area, Ambala Cantt – 133 001, India). Außerdem legt die vorliegende Erfindung nahe, dass das unlösliche poröse Zwischenmaterial Poren mit einem Durchmesser zwischen 0,1 und 12 μm aufweist und eine Dicke bis zu 2500 μm besitzt. Membranen mit Porengrößen von 0,1; 0,2; 0,45; 0,8; 1,2; 3,0; 5,0; 8,0 und 12 μm können verwendet werden. Membranen mit Porengrößen von 0,45; 0,8; 1,2 μm sind die passendsten; Membranen mit Poren von 0,45 um und einer Dicke von 500 μm werden vorzugsweise verwendet. Die Membrandicke scheint sich auf die Durchflussgeschwindigkeit und die Qualität der Ergebnisse auszuwirken.
Alle diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung basieren auf experimentellem Nachweis, wie im Beispielteil beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung ist die unlösliche poröse Zwischenmembran eine Schicht, wie Membran oder Filter, woran ein Maximum einer ersten analytbindenden Verbindung oder eines Fängermoleküls gebunden werden kann. In einigen Fallen kann es erforderlich sein, kein Maximum dieser ersten analytbindenden Verbindung oder dieses Fängermoleküls auf die Oberfläche aufzugeben. Der Begriff „gebunden" in der vorliegenden Erfindung soll alle Mittel zum Binden der ersten analytbindenden Verbindung oder des Fängermoleküls an den porösen Teil umfassen. Außerdem schließt dieser Begriff alle Mittel ein, die zur Herstellung kovalenter oder nichtkovalenter Bindung verwendet werden können. Das Material des porösen Teils ist ausgewählt aus einem Material, woran die analytbindende Verbindung oder, wenn verwendet, das Fängermolekül gebunden werden kann. Die Erfindung schließt die Möglichkeit, den Analyten direkt an diese poröse Oberfläche zu binden, nicht aus.
Für den Fall, dass kovalente Bindung ausgewählt wird und die zu bindenden Moleküle proteinartig sind, z. B. Antikörper oder Antigene, hat die poröse Membran Aminogruppenreste oder in diese wurden derartige Gruppen auf chemischem Wege eingeführt. Aminogruppen erlauben, dass mit dem gut bekannten Glutaraldehyd-Verfahren ein Protein daran gekoppelt wird. In einer anderen Ausführungsform können Antikörper über Aminosilane an Glasfasern gekoppelt werden. Andere natürliche oder synthetische Materialien, welche direkt oder über Zwischenprodukte an eine analytbindende Verbindung gekoppelt werden können, können ebenfalls verwendet werden.
Obwohl kovalente Bindung der ersten analytbindenden Verbindung oder des Fängermoleküls einen stabileren Zustand des Assays gewährleisten kann, wird durch die vorliegende Erfindung bewiesen, dass die Verwendung nichtkovalenter Bindungen in einer Durchflussanordnung auch zu zuverlässigen Assaybedingungen führt. Da nichtkovalente Bindungen auf Ladung oder hydrophober Wechselwirkung beruhen, ist es einfacher und weniger aufwendig, derartige Bindungen aufzubauen. Deshalb ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die erste analytbindende Verbindung oder das Fängermolekül nichtkovalent auf den unlöslichen porösen Zwischenteil der Assayvorrichtung aufzubringen.
Das Beschichten der porösen Schicht mit der Fängerverbindung oder der ersten analytbindenden Verbindung wird bevorzugt durch Eintauchen der Schicht in Beschichtungs- und Nachbeschichtungslösung, gefolgt von einem Trocknungsverfahren, durchgeführt. Jedoch in einer anderen Ausführungsform kann ein Spritz- oder Tüpfelungsverfahren zur Bindung der Moleküle mit hoher Affinität verwendet werden.
Vorzugsweise umfasst die Antikörperherstellung einen monoclonalen Antikörper, wenn auch polyclonale Antikörper aus Antiseren verwendet werden können. In dieser Hinsicht können auch Rohantikörperherstellungen für diesen Zweck verwendet werden. Verfahren zur Herstellung und/oder Reinigung polyclonaler und monoclonaler Antikörper sind jetzt gut bekannt und erfordern hier keine Anführung.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann der poröse Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung daran gebundene Fängermoleküle besitzen. Wie hierin verwendet, soll sich der Begriff „ Fängermolekül" auf Mittel, welche selektiv an die erste analytbindende Verbindung binden, beziehen. Die Verwendung einer Fängermoleküls gebunden an dem porösen Teil ermöglicht es, die Entwicklung und Herstellung des porösen Teils, der in Ligand-Rezeptor-Assays verwendbar ist, zu vereinfachen. Hier ist „Ligand" als der Analyt definiert, „Rezeptor" kann als die analytbindende Verbindung definiert werden. Beispielsweise kann es, wenn eine analytbindende Verbindung an den porösen Teil gebunden wird, notwendig sein, das Bindungsverfahren zu verändern, um die Bindung jeder analytbindenden Verbindung, die für eine Assayplatte benötigt wird, zu optimieren. Jedoch kann ein einzelnes Fängermolekül oder ein Gemisch aus mehreren Fängermolekülen oder ein Gemisch aus mehreren analytbindenden Verbindungen, wie Antigenen oder Antikörpern, gebunden an den porösen Teil, in einer Vielzahl von Assays verwendet werden. Demzufolge können der Entwicklungsaufwand und die Herstellungsverfahren stark vereinfacht werden, wenn solch ein „universeller" poröser Teil möglich ist. Folglich kann, in Abhängigkeit von der verwendeten Strategie, das Aufbringen der ersten analytbindenden Verbindung vor oder nach dem Aufbau der Assayvorrichtung eingeordnet werden und kann durch den Hersteller oder durch die Person, die den Assay durchführt, vorgenommen werden. Außerdem kann auch der Aufbau der Vorrichtung an sich durch die Person, die den Assay durchführt, vollzogen werden.
Die untere Schicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein absorbierender Teil oder eine absorbierende Schicht mit Kapillardurchgangswegen, im Allgemeinen quer zu der oberen und unteren Oberfläche. Die untere absorbierende Schicht wird mit der porösen Zwischenschicht auf eine Weise, welche die direkte Verbindung zwischen den Poren oder Zwischenräumen der porösen Schicht und den Kapillaren der absorbierenden Schicht ermöglicht, zusammengefügt. So wird eine Flüssigkeit auf die poröse Zwischenschicht aufgebracht und wird anschließend durch die untere absorbierende Schicht absorbiert und sättigt sie, die Flüssigkeit wird durch die Kapillarkraft in den absorbierenden Teil gezogen. Als Ergebnis kann eine Strömung durch die untere absorbierende Schicht hervorgerufen werden, wenn eine flüssige Probe auf die Oberfläche der porösen Zwischenschicht aufgebracht wird, selbst wenn der hydrostatische Druck der Flüssigkeit so gering ist, dass sie ohne Unterstützung, ohne die Anwendung von Druck, um sie hindurchzudrücken, oder Vakuum, um sie hindurchzusaugen, nicht durch die Zwischenschicht strömen könnte. Die absorbierende Schicht umfasst mindestens eine Schicht aus hydrophilem Material in Kontakt mit und angeordnet auf der Seite der unlöslichen porösen Schicht gegenüber der Seite der Deckschicht.
Die Auswahl des Materials für die absorbierende Schicht ist nicht entscheidend und eine Vielzahl von Fasermaterialien kann verwendet werden. Ein verwendbares Material sind Celluloseacetatfasern, ausgerichtet wie in einem Zigarettenfilter. Die Fachleute werden verstehen, dass andere absorbierende Teile, hergestellt aus Polyester, Polyolefin oder anderen Materialien, anstelle von Celluloseacetat verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung legt nahe, dass das hydrophile Material der Vorrichtung die Verbindung zwischen dem porösen Material und der absorbierenden Schicht ermöglicht und ist vorzugsweise AP120, geliefert von der Firma mdi (Advanced Microdevices (Pvt.) Ltd., 21, Industrial Area, Ambala Cantt – 133 001, India). In einer anderen Ausführungsform können entsprechende Filterschichten verwendet werden. Diese absorbierenden Schichten oder Filterschichten können von mehreren Firmen, die sich mit Membrantechnologie befassen, geliefert werden, z. B. Schleicher & Schuell, Sartorius und Millipore.
Wie bereits vorstehend erwähnt, sind gemäß der vorliegenden Erfindung die erste und die zweite analytbindende Verbindung Stoffe, welche den Analyten spezifisch binden und aus Peptiden, Proteinen, Lipiden, Nucleinsäuren und organischen Molekülen ausgewählt sind. Wenn der poröse Teil eine an ihn gebundene erste analytbindende Verbindung hat, ist die analytbindende Verbindung nach ihrem Vermögen, sich selektiv mit dem Analyten zu verbinden, ausgewählt. Beispielsweise kann, wenn der Analyt ein Antigen ist, die analytbindende Verbindung ein Antikörper sein, monoclonal oder polyclonal, welcher den Analyten spezifisch bindet, vorzugsweise ein monoclonaler Antikörper. Wenn der Analyt ein Antikörper ist, kann die analytbindende Verbindung ein Antigen oder ein Anti-Antikörper sein. Wenn der Analyt ein Enzym ist, kann die analytbindende Verbindung ein Rezeptor oder ein Substrat für das Enzym sein. Wenn der Analyt eine Nucleinsäure ist, z. B. RNA oder DNA, kann der Rezeptor ein komplementäres DNA oder RNA-Oligomer der oder ein nucleinsäurebindendes Protein sein.
Vorzugsweise sind die erste analytbindende Verbindung und/oder die zweite analytbindende Verbindung ein Antikörper, welcher den Analyten spezifisch bindet. In dieser Hinsicht definiert die vorliegende Erfindung auch, dass der Antikörper bevorzugt ein monoclonaler oder polyclonaler oder ein Antikörperpräparat davon ist. Der Begriff „spezifische Bindung" bedeutet, dass es im Wesentlichen keine Kreuzreaktion des Antikörpers mit anderen Proteinen gibt. Der Begriff „Antikörperpräparat" umfasst jede Lösung mit Antikörpern, wie Serum, oder Lösungen mit einem Antikörperderivat. Die Antikörper gemäß der Erfindung können nach Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Monoclonale Antikörper können mittels herkömmlicher Hybridomtechnik hergestellt werden, wie beschrieben von Köhler und Milstein (F. Köhler und C. Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 1995, 256: 495–497). Polyclonale Antikörper können auch mittels herkömmlicher Technik, die den Fachleuten gut bekannt ist, hergestellt werden welche Impfung eines Wirtstieres, wie einer Maus, mit einem Protein oder Epitop gemäß der Erfindung und Gewinnung des Immunserums umfasst. Die vorliegende Erfindung schließt auch Fragmente von vollständigen Antikörpern, welche ihre Bindungswirkung behalten, wie z. B. Fv-, F(ab')- und F(ab')2-Fragment, sowie Einzelkettenantikörper ein.
Die vorliegende Erfindung erörtert weiterhin, dass die erste analytbindende Verbindung direkt oder indirekt an die poröse Schicht der Vorrichtung gekoppelt werden kann. Bei indirekter Kopplung wird die Vorrichtung zuerst mit einem Fängermolekül, wie vorstehend beschrieben, welches die erste analytbindende Verbindung spezifisch bindet, beschichtet, gefolgt von dem Aufbringen der ersten analytbindenden Verbindung. Beispielsweise kann, wenn der Analyt ein Antigen ist und die erste analytbindende Verbindung ein Antikörper ist, z. B. ein Maus-IgG-Antikörper, vorzugsweise ein monoclonaler Antikörper, das Fängermolekül ein Antikörper, bevorzugt ein monoclonaler Antikörper, gegen murines IgG sein. In anderen Fällen kann die erste analytbindende Verbindung mit einer Einheit, welche selektiv an das Fängermolekül bindet, konjugiert sein. Beispielsweise kann die Einheit ein Hapten sein und das Fängermolekül ein Antikörper gegen dieses Hapten sein. Ein mögliches Hapten ist Fluorescein. In anderen Fällen kann das Fängermolekül Avidin oder Streptavidin sein. In solch einem Fall wird die erste analytbindende Verbindung ein daran gebundenes Biotin haben. In anderen Fällen kann die erste analytbindende Verbindung ein Nucleinsäure-Oligomer sein oder solch ein an ihr gebundenes Oligomer haben und das Fängermolekül kann ein zu einem Teil des ersten analytbindenden Oligomers komplementärer Nucleinsäureabschnitt sein, welcher die Bindung mit dem Analyten nicht stört. Die Fachleute werden aus dem Vorangehenden verstehen, dass eine Vielzahl von Kombinationen Fängermolekül/erste analytbindende Verbindung verwendet werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die zweite analytbindende Verbindung mit einem Enzym markiert, welches nach Wechselwirkung mit einem präzipitierenden Substrat in einem Schritt einen farbigen Niederschlag ergibt. Es ist die Verwendung solch eines präzipitierenden Substrats in solch einer definierten Assayvorrichtung, wie durch die Erfindung beschrieben, die die Analyse des Analyten in einer Testprobe kostengünstig, einfach, stabil und zuverlässig macht. Diese zweite analytbindende Verbindung kann auch als „Konjugat" bezeichnet werden.
In Analogie zur Verwendung eines Fängermoleküls, wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung außerdem eine diagnostische Assayvorrichtung, wobei der Analyt durch ein Nachweismolekül indirekt nachgewiesen wird. Tatsächlich ist es möglich, dass die zweite analytbindende Verbindung außerdem mit einem Nachweismolekül, markiert mit einem anderen Enzym (E2) als dem an der zweiten analytbindenden Verbindung vorhandenen Enzym (E1), wobei dieses Enzym E2 nach Wechselwirkung mit einem präzipitierenden Substrat unter Verwendung eines Einschrittverfahrens einen farbigen Niederschlag ergibt, verbunden ist. Auf diese Weise kann eine Verstärkung des Signals erzielt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist die zweite analytbindende Verbindung nicht enzymmarkiert und ist außerdem mit einem Nachweismolekül, markiert mit einem Enzym, welches nach Wechselwirkung mit einem präzipitierenden Substrat unter Verwendung eines Einschrittverfahrens einen farbigen Niederschlag ergibt, verbunden.
Die indirekte Kopplung der ersten analytbindenden Verbindung oder der indirekte Nachweis der zweiten analytbindenden Verbindung kann über eine Wechselwirkung von Avidin/Biotin, Streptavidin/Biotin, Antikörper/Antigen, Antikörper/Hapten, Rezeptor/Ligand, Zucker/Lektin, komplementärer Nucleinsäure, d. h. RNA oder DNA, oder einer Kombination davon, Enzym/Substrat, Enzym/Cofaktor, Enzym/Inhibitor oder Immunglobulin/Staphylokokken-Protein-A durchgeführt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Testprobe ausgewählt sein aus Zellfraktionen, Serum, Vollblut, Urin, Plasma, d. h. zur diagnostischen Untersuchung von Mensch und Tier; Boden, Lehm, Mineralien, Wasser, Luft, d. h. zur Umweltuntersuchung; allen Lebensmitteln, d. h. zur Lebensmitteluntersuchung; oder jedem/jeder anderen Medium/Suspension/Feststoff, welche(r) für einen dieser Zwecke verwendet werden kann. Das analysierte Medium kann sowohl von fester als auch flüssiger Beschaffenheit sein. Es ist klar, wenn feste Materialien verwendet werden, dass sie zuerst in einer geeigneten Lösung gelöst werden. Gemäß der Erfindung ist diese Lösung nicht immer ein realer „Puffer" mit mindestens 2 gut ausgeglichenen Komponenten. Sie kann eine stark hypotone Lösung, wie NaCl allein, oder eine Extraktionslösung, wie mit Alkohol, sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Testprobe unverdünnt oder in verdünnter Form, unter Verwendung eines Verdünnungspuffers und wobei der Verdünnungsfaktor an den nachzuweisenden Analyten angepasst wird, aufgebracht werden (Anspruch 23). Die Verdünnung kann von 1:2 bis 1:100.000 variieren. Verdünnungen von 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000, 1:1250, 1:1500, 1:1750, 1:2000, 1:2250, 1:2500, 1:2750, 1:3000, 1:3250, 1:3500, 1:3750, 1:4000, 1:4250, 1:4500, 1:4750, 1:5000, 1:5250, 1:5500, 1:5750, 1:6000, 1:6250, 1:6500, 1:6750, 1:7000, 1:7250, 1:7500, 1:7750, 1:8000, 1:8250, 1:8500, 1:8750, 1:9000, 1:9250, 1:9500, 1:9750, 1:10000, 1:11250, 1:11500, 1:11750, 1:12000, 1:12250, 1:12500, 1:12750, 1:13000, 1:13250, 1:13500, 1:13750, 1:14000, 1:14250, 1:14500, 1:14750, 1:15000, 1:15250, 1:15500, 1:15750, 1:16000, 1:16250, 1:16500, 1:16750, 1:17000, 1:17250, 1:17500, 1:17750, 1:18000, 1:18250, 1:18500, 1:18750, 1:19000, 1:19250, 1:19500, 1:19750, 1:20.000, 1:30.000, 1:40.000, 1:50.000, 1:60.000, 1:70.000, 1:80.000, 1:90.000 und 1:100.000 sind möglich. Die verwendete Verdünnung hängt davon ab, welche Probe verwendet wird. Beispielsweise kann für serologische Anwendungen, d. h. die Proben stammen von Urin, Serum, Plasma oder Zellfraktionen, der Verdünnungsbereich von unverdünnt bis 1:200 reichen; kann für mikrobiologische Anwendungen, z. B. Nachweis von mikrobiologischer Verunreinigung in Nahrung und Wasser, der Verdünnungsbereich bis zu 1:10.000 erweitert werden. Es ist klar, dass bei Proben mit großen Mengen des Analyten oder bei Verwendung einer analytbindenden Verbindung, welche eine hohe Affinität für den Analyten aufweist, Verdünnungen bis zu 100.000 vorgenommen werden können.
Der Verdünnungspuffer hat die Aufgabe, die Probe zu verdünnen, aber in bestimmten Fällen auch die Auswirkung auf die verbesserte Darstellung des Analyten, der von der analytbindenden Verbindung erkannt werden soll. Deshalb kann ein Lösungsvermittler, wie EDTA oder SDS, enthalten sein.
Außerdem muss, gemäß dem/den nachzuweisenden Analyten, die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers der Probe(n) an den Nachweis des Analyten angepasst werden. Beispielsweise kann, wenn die zu untersuchende Probe aus einem Lebensmittel isoliert wird, ein Ultraschallbehandlungsverfahren zum Lösen von Aggregaten erforderlich sein; kann, wenn die die zu untersuchende Probe aus Urin isoliert wird, die Einstellung des pH-Wertes erforderlich sein; kann, wenn die Probe Lipide enthält, d. h. eine „Fettprobe", Delipidierung erforderlich sein. Eine hämolytische Lösung kann zur Hämolyse der roten Blutkörperchen erforderlich sein. In einigen Fällen muss der Salzgehalt angepasst werden. Alle aufgeführten Maßnahmen können notwendig sein, um eine Blockierung des Systems zu verhindern oder den Zustand, in dem der Analyt die analytbindenden Verbindungen binden muss, zu optimieren.
Andere Beispiele derartiger Anpassungen sind für die Anwendung beim Menschen: eine Probe von Synovialflüssigkeit zum Nachweis von Rheumafaktoren muss mit Hyaluronidase behandelt werden. Für die mikrobiologische Anwendung: eine Probe von einem Lebensmittel zum Nachweis von Verunreinigungen muss manchmal durch den Zusatz von einigen Nährstoffen angereichert werden oder durch den Zusatz von lytischen Mitteln zu dem Verdünnungspuffer lysiert werden. Der Verdünnungspuffer kann auch einen Konservierungsstoff, wie Thimerosal oder Natriumazid, enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Analyt eine Verbindung, die anormal oder normal in der Probe vorhanden ist oder in dieser fehlt. So können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen zum Nachweis des Fehlens oder Vorhandenseins eines Analyten in einer Probe verwendet werden; gleichwohl können sie zur Auswertung der Menge eines bestimmten Analyten in einem Medium eingesetzt werden, wobei eine Abnahme oder eine Zunahme der Analytkonzentration untersucht werden kann. Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Diagnose einer Erkrankung verwendet wird, dann ist der Analyt eine Zellverbindung mit Ursprung entweder innerhalb der Zelle, in der Membran oder außerhalb der Zelle. In diesem Fall bedeutet der Begriff „anormal", dass das Vorhandensein an sich, eine Zunahme oder eine Abnahme des vorliegenden Wertes oder das Fehlen des Analyten für eine Erkrankung kennzeichnend ist. Beispiele von Analyten, welche „normal vorhanden" sind, sind LH und TSH; diese sind normal vorhanden und können bei bestimmten Erkrankungen anormal zunehmen oder abnehmen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung ausgewählt aus Antigenen und Antikörpern; wobei das Antigen ausgewählt sein kann aus jedem biologischen Agens, wie Bakterien, Viren, Schimmelpilzen, Mykobakterien, Parasiten, pathogenen Mikroorganismen; oder Molekülen, wie Peptiden, Proteinen, Lipiden, organischen Molekülen, Nucleinsäure-Oligomeren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Antigen ausgewählt sein aus Proteinen, bei welchen der Wert bei bestimmten Krankheitszuständen abnormal ansteigt oder in Lebensmitteln abnormal ansteigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Antigen ein Bakterium oder ein Toxin, produziert durch ein Bakterium in Lebensmitteln oder in biologischen Flüssigkeiten, sein. Beispiele sind: Salmonella sp., E. coli sp., Listeria sp., Clostridium sp., Staphylococcus sp., Campylobacter sp., Mycobacterium, Streptococcus ...; d. h. Urin, Blut, Serum, Stuhl, Gehirnflüssigkeit. Derartige Bakterien fehlen normalerweise in sicheren Lebensmitteln oder bei gesunden Menschen.
Ganz speziell definiert die vorliegende Erfindung, dass das Antigen ausgewählt sein kann aus C-reaktivem Protein (CRP), Troponin, Myoglobin, HCG (humanem Choriongonadotropin), LH (luteinisierendem Hormon), Rheumafaktoren, Cardiolipin, Centromer (Kinetochorproteinen) Histonen, Jo-1 (namengebend bezeichnet, das Gleiche wie Histidyl-tRNA-Synthetase), Lupuskoagulans, Myeloperoxidase, Nukleolusautoantigenen, u. a. PM-Scl = Polymyositis-Sklerodermie, RNP (Ribonucleoproteinen) (z. B. U1RNP), Scl 70 (dasselbe wie Topoisomerase 1), Sm (namengebend als Smith-Antigen bezeichnet, das Gleiche wie nukleäres Antigen), SSA/Ro (Sjögren-Syndrom-Antigen), SSB/La (Sjögren-Syndrom-Antigen), Thyreoglobulin, Zelloberflächenlipoproteinen, Schilddrüsenautoantigenen, Kollagen, ANCA (antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern) (Anspruch 29). CRP ist bei Infektionen erhöht, Myoglobin bei traumatischen Zuständen, Troponin bei Herzinfarkt, Rheumafaktoren bei entzündlichen Zuständen und HCG bei Schwangerschaft. Außerdem kann das Protein aus β-Adrenorezeptor, TSH-Rezeptor, Insulinrezeptor, Acetylcholinrezeptor, Gastrinrezeptor, Pyruvat-Dehydrogenase ausgewählt sein. Dessen ungeachtet kann diese Assayvorrichtung zum Nachweis vieler anderer Stoffe verwendet werden und ist nicht auf die aufgeführten Beispiele beschränkt.
Die erfindungsgemäße Assayvorrichtung kann auch verwendet werden, um ein Enzym durch Bindung einer Verbindung mit einer hohen Affinität für dieses Enzym an den porösen Teil als Assayrezeptor nachzuweisen. Diese Verbindung kann das Substrat des Enzyms oder eines anderen Proteins oder eines Moleküls, das dieses Enzym spezifisch bindet, sein. Ein markierter Antikörper gegen das Enzym kann verwendet werden, um die Bildung eines Rezeptor-Enzym-Komplexes an dem porösen Teil nachzuweisen. Wie dem Fachmann bekannt, können auch andere Verbindungen, welche eine spezifische Bindungskapazität für dieses Enzym aufweisen, verwendet werden.
Diese Proteine sind durch analytbindende Verbindungen, wie Antikörper, erkennbar. Positive Kontrollen enthalten vorzugsweise gereinigte natürliche Proteine; trotzdem können rekombinante Proteine mit einer ähnlichen Faltung, wie in natürlichem Protein vorgefunden, verwendet werden. Folglich muss die analytbindende Verbindung vorrangig einen Analyten mit einer Konformation, wie in natürlichem Protein vorgefunden, erkennen; dennoch können auch analytbindende Verbindungen, die sowohl korrekt gefaltetes Protein als auch denaturiertes Protein erkennen, verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Analyt einen Antikörper, der zu einer beliebigen Klasse von Immunglobulinen gehört, wie IgE, IgG, IgM, IgA, IgD, umfassen. Das Vorhandensein eines spezifischen Antikörpers in einer Probe kann Hinweise auf Stadium, Ort und Art einer Erkrankung liefern. Ein Anstieg von IgE ist ein Maß für allergische Reaktionen und das Vorhandensein von Wurmparasiten; der Anstieg von IgG bestätigt das Vorliegen von Infektionen, welche sich bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befinden; IgM weist darauf hin, dass Infektionen in einem frühen Stadium vorliegen. IgA kann insbesondere in Sekreten nachgewiesen werden und IgD ist auf Membranen von B-Zellen vorhanden. Die vorliegende Erfindung erläutert den Nachweis von antimitochondrialem Antikörper M2 und Rheumafaktor-Antikörpern mit dem erfindungsgemäßen FT-Verfahren. Das erfindungsgemäße FT-Verfahren kann jedoch verwendet werden, um andere Antikörper nachzuweisen, selbst Antikörper aus einer anderen Ig-Klasse oder Antikörper, welche auf Zelloberflächen vorhanden sind, nachzuweisen. Die Beispiele und Figurlegenden dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind in keiner Weise als Beschränkung der vorliegenden Erfindung aufzufassen.
Die erfindungsgemäße Assayvorrichtung kann auch in Untersuchungen auf einen Antikörper verwendet werden, welche ein Antigen als erste analytbindende Verbindung auf der festen Phase verwenden und welche markiertes Antigen oder markierten Anti-Antikörper als zweite analytbindende Verbindung verwenden. Die Letztere ist besonders geeignet für allergiespezifische Assays, wo die erste analytbindende Verbindung ein an den porösen Teil gebundenes Allergen ist und die zweite analytbindende Verbindung ein Antikörper, bevorzugt ein monoclonaler Antikörper gegen IgE, ist. In anderen Fällen kann die IgG-Reaktion gegen Allergene ähnlich gemessen werden, d. h. durch Verwendung eines Antikörpers, wie eines monoclonalen Antikörpers gegen IgG, als zweite analytbindende Verbindung. Andere Antikörpertests, welche auf diese Weise durchgeführt werden können, schließen Tests zum Nachweis von Virusinfektionen, z. B. Herpes, Röteln, Hepatitis, Cytomegalievirus, Rotavirus, RSV, HTLV-III, HIV, oder bakteriellen Infektionen, z. B. Streptococcus A und Streptococcus B, Chlamydia, M. tuberculosis, M. pneumoniae, H. pylori, Clostridium, E. coli, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, ein.
Außerdem definiert die vorliegende Erfindung, dass das Nucleinsäure-Oligomer ausgewählt sein kann aus DNA, RNA, DNA/RNA-Hybrid oder chemischen Analoga davon, gentechnisch verändert oder nicht. Mit DNA- oder RNA-Molekülen ist komplementäre DNA (cDNA), genomische DNA (gDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA), einsträngige DNA (ssDNA), Kern-RNA (nRNA), Transfer-RNA (tRNA), Boten-RNA (mRNA) und ribosomale RNA (rRNA) gemeint. RNA-Moleküle können auch dsRNA einschließen. Wenn Nucleinsäure-Oligomere, welche nicht aus lebenden Organismen isoliert sind, verwendet werden, können auch RNA/DNA-Hybridmolekülle oder -Oligomere, die aus synthetischen Nucleotiden, wie Inosinen, zusammengesetzt sind, verwendet werden. In diesen Fällen kann der poröse Teil mit einem Nucleinsäure-Oligomer als erster analytbindender Verbindung zum Nachweis von Nucleinsäurematerial in einer Probe beschichtet werden. Die erste analytbindende Verbindung kann ein Oligomer der DNA, z. B. komplementär zu einer Sequenz in der Nucleinsäure von Interesse, sein und kann zum Binden von entweder RNA oder DNA verwendet werden. Danach kann der Nachweis des gebildeten Komplexes unter Verwendung eines zweiten Nucleinsäure-Oligomers, das komplementär zu einem nicht eingreifenden Bereich des Nucleinsäureliganden von Interesse ist, vorgenommen werden, wobei das zweite Oligomer markiert ist, um den Nachweis zu ermöglichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung reagiert die Enzymmarkierung, welche an die zweite analytbindende Verbindung oder das Nachweismolekül gekoppelt ist, in einem Schritt mit einem präzipitierenden Substrat und kann aus Meerrettichperoxidase (HRP), alkalischer Phosphatase (AP) und Dehydrogenase ausgewählt sein. Dehydrogenase kann beispielsweise als Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase oder Malat-Dehydrogenase festgelegt sein. Für die Enzyme Glucose-Oxidase, Cholesterin-Oxidase, Uresse, β-Galactosidase und Lysozym wurden bisher keine präzipitierenden Substrate erläutert. Dessen ungeachtet ist das Prinzip bei der Verwendung dieser im gleichen Zusammenhang ebenso, wie für die vorstehenden Substrate beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung ist die Enzymmarkierung kovalent oder nichtkovalent an die zweite analytbindende Verbindung gebunden. Für die Bindung sollte die zweite analytbindende Verbindung eine reaktive Gruppe, die komplementär zu einer reaktiven Gruppe in der Enzymmarkierung ist, aufweisen. Beispielsweise ergänzt eine freie Carboxylgruppe des zweiten analytbindenden Proteins den Aminoterminus der Enzymmarkierung so, dass eine Amidbindung gebildet werden kann. In einer anderen Ausführungsform sollte die analytbindende Verbindung modifizierbar sein, um eine reaktive Gruppe aufzuweisen, die eine reaktive Gruppe der Enzymmarkierung ergänzt. Die zweite analytbindende Verbindung kann direkt oder über eine Abstandseinheit an die Bindungseinheit gebunden sein. Die Fachleute werden erkennen, dass, obwohl in den meisten Fällen die analytbindende Verbindung und die Enzymmarkierung direkt verbunden sein werden, es in einigen Fällen erwünscht sein kann, die Bindungseinheit mit einer Abstandseinheit von einem oder beiden Teilen abzutrennen. Es ist selbstverständlich, dass fast jede Bindung, die gegen die Einsatzbedingungen stabil ist und die ohne Denaturierung oder anderen Abbau der analytbindenden Verbindung und/oder Enzymmarkierung leicht gebildet werden kann, verwendet werden kann. Daher können die analytbindende Verbindung und die Enzymmarkierung nahezu jede reaktive Gruppe enthalten, die komplementär ist zu, d. h. kovalent reagieren kann mit, dem entsprechenden Terminus der Bindungseinheit, an welche sie gebunden wird, wenn verwendet. Geeignete Gruppen, die zu dem Aminoterminus der Bindungseinheit komplementär sind, schließen beispielsweise Carboxygruppen, Ester, einschließlich aktivierten Estern, wie NHS-Estern, Acylazide, Acylhalogenide, Acylnitrile, Aldehyde, Alkylsulfonylhalogenide, Halogentriazine, Imidoester, Isocyanate, Isothiocyanate, Sulfonatester usw. ein. Geeignete reaktive Gruppen, die zu dem Carboxyterminus der Bindungseinheit komplementär sind, schließen beispielsweise Amine, Alkohole, Alkylhalogenide, Thiole, Hydrazine, Diazoalkane, Sulfonatester usw. ein. Die Bedingungen zur Bildung kovalenter Bindungen unter einer Fülle von Paaren komplementärer reaktiver Gruppen sind gut bekannt. Bevorzugt ist jede Bindung zwischen der Bindungseinheit und dem biologischen Wirkstoff und der Maskierungseinheit ein Amid. Die Bedingungen zum Miteinanderverbinden von Molekülen mit komplementären Amino- und Carboxygruppen unter Bildung von Amidbindungen sind gut bekannt (siehe z. B. B. Merrifield, Concept and early development of solid-phase peptide synthesis. Methods Enzymol. 1997, 289: 3–13). Beispiele von nichtkovalenten Bindungen wurden vorstehend bereits erläutert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Substrat von HRP aus TMB (Tetramethylbenzidin) und AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol) ausgewählt sein. Bei Verwendung der Meerrettichperoxidase besteht die enzymatische Reaktion aus der Umsetzung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin mit dem Enzym und Hydrogenperoxidase unter Bildung eines unlöslichen, blauen Oxidationsproduktes mit einem Radikalkation mit einem Elektron.
Die angeführten Substrate sind im Handel erhältlich. Dennoch veranschaulichen die Erfinder in der vorliegenden Erfindung, dass die Herkunft der TMB-Lösung einen Einfluss auf die Qualität der erhaltenen Ergebnisse ausüben kann. Alle anderen Reagenzien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können geeignete Substrate bilden. AEC bringt ein rotes Endprodukt hervor, das in Alkohol löslich ist. Dieses präzipitierbare Substrat wird vorwiegend bei Immunoblotting-Verfahren und Verfahren der immunhistochemischen Färbung, verwendet, vgl. Histologie.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann für alkalische Phosphatase das Substrat aus BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) und BCIP-NBT (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Nitroblautetrazolium) ausgewählt sein. Die angeführten Substrate sind im Handel erhältlich. Andere Reagenzien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind ebenfalls geeignet. Wenn BCIP mit alkalischer Phosphatase reagiert, dimerisiert das freie halogenierte Indoxylderivat unter Bildung eines unlöslichen Indigofarbstoffs. Dieses Produkt wird allgemein bei Immunoblotting-Verfahren und Verfahren der immunhistochemischen Färbung, verwendet, vgl. Histologie. Das BCIP-NBT-System basiert auf der Hydrolyse von BCIP und der Reduktion von NBT unter Bildung eines dunkelvioletten Reaktionsproduktes. Dieses Reagens kann bei Immunoblotting-Verfahren, Verfahren der immunhistochemischen Färbung und Verfahren der In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
Für eine Dehydrogenase kann das gemäß der Erfindung verwendete Substrat NBT (Nitroblautetrazolium) sein. Nitroblautetrazolium wird auch in Analytnachweissystemen verwendet, die die Dehydrogenaseaktivität anwenden. Das erwähnte Substrat ist im Handel erhältlich. Andere präzipitierbare Substrate, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können ebenso verwendet werden.
Anschließend an die Bildung des Präzipitats kann das TMB-Präzipitat unter Verwendung eines Reagens, umfassend Polyvinylalkohol, ergänzt mit Dioctylsulfosuccinat und Dimethylformamid, fixiert werden. Eine derartige Lösung stoppt die enzymatische Reaktion und ermöglicht die dauerhafte Aufzeichnung des Ergebnisses.
Die erfindungsgemäße Assayvorrichtung kann zur qualitativen (Ja/Nein-Antwort), halbquantitativen (–/+/++/+++/++++) oder quantitativen Antwort verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Assayvorrichtung mindestens einen Testbereich, welcher für Standard(s) und/oder positive und/oder negative Abgrenzungskontrolle(n) verwendet werden kann. Mit Standard ist ein Kalibrator gemeint. Als Kalibratoren kann eine Reihe von mindestens einer Analytlösung mit bekannter Konzentration verwendet werden. Das hilft, die Analytkonzentration in einer Probe quantitativ und halbquantitativ zu bestimmen. Die Verwendung einer positiven Aufbaukontrolle zeigt, ob der Test funktioniert. Die Verwendung einer Aufbauabgrenzungskontrolle kann zur qualitativen Auswertung von Ergebnissen (Ja/Nein-Antwort) verwendet werden, es können jedoch keine quantitativen Angaben daraus erhalten werden. Für spezifische Tests kann es zweckmäßig sein, dass mehr als ein Testbereich in der erfindungsgemäßen Assayvorrichtung vorhanden ist. Beispielsweise bei deren Verwendung zum Testen auf Allergie kann eine Karte mit 6 Löchern für jedes Feld von Allergenen entwickelt werden. In einer anderen Ausführungsform, zum Testen der Herzmarker, z. B. Troponin, Myoglobin, wäre eine Karte, worauf die verschiedenen Herzmarker gleichzeitig getestet werden, optimal. Diese(r) Testbereich(e) können/kann sich in demselben Loch der oberen Deckschicht oder in getrennten Löchern befinden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Auswertung des beobachteten Signals mittels eines Kartensystems oder unter Verwendung eines Lesegerätes. Ein „Kartensystem" kann als Halter, wo farbige Flecke mit unterschiedlichen Farbintensitäten abgebildet sind, definiert werden. Wenn der Test reproduzierbar ist, kann die sichtbar gemachte Farbe mit einer Konzentration des Analyten in der untersuchten Probe in Verbindung gebracht werden. Dieser Halter kann Löcher innerhalb dieser Farbflecke umfassen. Auf diese Weise kann die Farbe des Halters durch Überlappen beider Vorrichtungen leicht mit der in der Assayvorrichtung gebildeten Farbe verglichen werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Lesegerät, das die Reflexion misst, zur Überwachung der Farbflecke verwendet werden. Jedes dem Fachmann bekannte Lesegerät, das die Reflexion misst, kann verwendet werden. In den Beispielen wird das VISI-CHROMA^TM VC-100 von Biophotonics S. A. (Lessines, Belgien) verwendet; dessen ungeachtet können andere Systeme, wie Reflexionlesegeräte, verwendet werden, z. B. Nycomed-Lesegeräte.
Das Lesegerät VISI-CHROMA, welches von den Erfindern zur Auswertung der Ergebnisse verwendet wird, verwendet eine CCD-Farbkamera (ladungsgekoppeltes Bauelement), die eine genaue Messung in einem Dreibereichsverfahren (3 Filter) auf einer ausgewählten Fläche der Membran ermöglicht. Ein derartiges Verfahren erlaubt eine sehr genaue Messung des farbigen Niederschlags (Flecks).
Die vorliegende Assayvorrichtung kann zur Kontrolle/Testung/Bestimmung von Lebensmittelproben verwendet werden. Das Vorhandensein von Bakterien, Viren, Mykotoxinen, Toxinen, Rückständen von Pestiziden, Rückständen von Antibiotika, Rückständen von chemischen Stoffen kann festgestellt werden. Beispiele von Bakterien sind Salmonella sp., E. coli sp., Staphylococcus sp., Clostridium sp., Campylobacter sp., Listeria sp., Streptococcus sp.
Die vorliegende Erfindung erläutert den Nachweis von Salmonella mit dem erfindungsgemäßen FT-Verfahren. Das erfindungsgemäße FT-Verfahren kann jedoch zum Nachweis anderer biologischer Agenzien, die DNA/RNA enthalten, wie Viren, Mykobakterien, aller Typen von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, angewendet werden. Die Beispiele und Figurlegenden dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind in keiner Weise als Beschränkung der vorliegenden Erfindung aufzufassen.
Beispiele von Toxinen sind Endo- oder Exotoxine, thermostabile oder thermolabile. Beispiele von Mykotoxinen sind Aflatoxine vom Typ A und B, Oxchratoxin. Beispiele von Rückständen von Pestiziden sind PCB, Dithiocarbamate, Propamocarb, Benzimidazole, Organocholide. Beispiele von Rückständen von Antibiotika sind Rückstände von β-Lactamen, Tetracyclinen, Makroliden, Chinolonen, Sulfonamiden, Aminoglycosiden, aber auch von Antibiotika, die als Tierwachstumsförderer verwendet werden, wie Bacitracin, Tylosin, Spiramycin, Virginiamycin und Avoparcin. Für Umweltschutzzwecke können ähnliche Antigene kontrolliert/getestet/bestimmt werden.
Das vorliegende Verfahren kann zur Diagnose und/oder Überwachung der Behandlung von Krankheiten angewendet werden. Beispiele sind der Nachweis von Virusinfektionen (Virusfamilie: Adenoviridae, Coronaviridae, Papovaviridae, Retroviridae usw.), bakteriellen Infektionen (Yersinia, Aeromonas, Pasteurella, Vibrio, Helicobacter-Spezies (H. pylori) usw.) und die Diagnose von Akute-Phase-Proteinen (Rheumafaktoren, CRP, Serumamyloid A usw.). Wesentliche Beispiele von Virusinfektionen sind Infektionen mit HIV (humanem Immundefizienz-Virus), die AIDS auslösen, und Infektionen mit HCV (Hepatitis-C-Virus), die zu Zirrhose und Leberinsuffizienz führen.
Beispielsweise kann gemäß der vorliegenden Erfindung, das Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, ausgelöst durch organspezifische oder nicht organspezifische Autoantigene, angewandt werden. Tabelle 1 fasst die wichtigsten organspezifischen und nicht organspezifischen Antikörper zusammen. Die Tabellen 2 und 3 führen organspezifische oder nicht organspezifische Autoantigene auf. Nicht organspezifische Autoantigene lösen im Allgemeinen eine Autoimmunreaktion aus, wobei verschiedene Organe beteiligt sind.
Die nicht organspezifische (multisystemische) Autoimmunerkrankung kann ausgewählt sein aus Erkrankungen, umfassend systemischen Lupus erythematodes (SLE) und andere rheumatische Erkrankungen, Sklerodermie mit oder ohne Crest-Syndrom, arzneistoffinduzierten Lupus erythematodes (LE), Polymyositis mit oder ohne Sklerodermie, primäres Sjögren-Syndrom, rheumatoide Arthritis und andere Bindegewebserkrankungen (siehe Tabelle 2).
Organspezifische Antigene lösen hauptsächlich organspezifische Autoimmunerkrankungen aus. In solch einem Fall schädigen die klinischen Manifestationen ursprünglich nur ein Organ, z. B. Leber bei primär biliärer Zirrhose, aber der Ausbruch der Erkrankung kann auch andere Organe angreifen.
Die organspezifische Autoimmunerkrankung kann ausgewählt sein aus Erkrankungen, umfassend Addison-Krankheit, hämolytische Autoimmunanämie, chronisch aktive Hepatitis, Zöliakie, Goodpasture-Syndrom, Gravesche Thyreotoxikose, Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Werlhof, Diabetes Typ I, Diabetes Typ II, linseninduzierte Uveitis, manche männliche Unfruchtbarkeit, multiple Sklerose, Myastenia gravis, Pemphigoid, primär biliäre Zirrhose, perniziöse Anämie, primäres Myxödem, sympathische Ophthalmie, Colitis ulcerosa, Vaskulitis und Wegener-Granulomatose (siehe Tabelle 3) (Lemoine 1992; Humbel; Abuaf et al.).
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung der Behandlung von Infektionserkrankungen, eingeschlossen durch Viren, Bakterien, Schimmelpilze, Mykobakterien oder Parasiten, angewendet werden. Beispiele von Antigenen, welche bei Infektionserkrankungen nachgewiesen werden können, sind HIV, HbsAg, HbsAb, HbeAg, HbeAb, Hbc-IgM, Malaria, Chlamydia, StrepA, H. pylori, Lyme, Salmonella, E. coli, Syphilis, TB, Dengue-Fieber und Chagas.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung der Behandlung von allergischen Erkrankungen oder Unverträglichkeitsmanifestationen, ausgelöst durch zahlreiche Allergene aus Gräsern, Unkraut, Schimmelpilzen, Lebensmitteln, Baumen, Epidermis und Staub, angewandt werden. Mehr als 2000 potentielle Allergene sind identifiziert worden. Beispiele der vorstehend erwähnten Allergene sind: Ruchgras, Wiesenlieschgras, Kulturhaferpollen; Gemeine Beifuß-Ambrosie, Westliche Beifuß-Ambrosie, Löwenzahn, Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Candida albicans, Hühnereiweiß, Kuhmilch, Krabbe, Eigelb; Ahorn, Erle, Birke, Haselnuss, Eiche; Katzen- und Hundeepithel, Pferde- und Rinderschuppen; Staub.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Verwendung bei der Testung von Herzmarkern angewendet werden. Die Herzmarker können aus Myoglobin, Kreatinkinase und Troponin ausgewählt sein. Die Entzündungsmarker können aus C-reaktivem Protein und Interleukinen ausgewählt sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Verwendung bei der Testung von Bakterien und/oder Toxinen angewendet werden. Mit „Testung" ist die Feststellung des Vorhandenseins/Fehlens, der Zunahme oder Abnahme bestimmter Antigene gemeint. Toxine können Mykotoxine einschließen. Beispiele von nachzuweisenden Bakterien sind Salmonella sp., E. coli sp., Listeria sp., Clostridium sp., Staphylococcus sp., Campylobacter sp., Mycobacterium, Streptococcus, Shigella sp., Bacillus sp.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Verwendung bei der Testung von Tumorantigenen. Beispiele von Antigenen, welche bei Tumoren nachgewiesen werden können, sind AFP, PSA, CEA, CA 15-3 und Ferritin.
Beispiele von Antigenen, welche unter Verwendung des Verfahrens bei Arzneistoffmissbrauch nachgewiesen werden können, sind Methamphetamin, Barbiturate, Benzodiazepin, Amphetamin, Morphin, THC, Kokain und Profil.
Ganz allgemein beinhaltet die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zum Nachweis eines in einer Testprobe vorhandenen Analyten.
Das Verfahren kann Schritte umfassen, wobei das Zugeben der ersten analytbindenden Verbindung, der Probe, der zweiten analytbindenden Verbindung, der Substratlösung und der Fixierungslösung anschließend, nacheinander, vorgenommen wird. Interessanterweise wird nach dem Zusatz des Substrates kein Waschschritt benötigt. Der Wegfall des Waschschrittes ist auf das Verfahren der spezifischen Blockierung der Membran nach dem Aufbringen des Bindungsproteins auf die Membran, welches jede frei gebliebene Stelle blockiert, zurückzuführen.
In einer anderen Ausführungsform kann das Verfahren Schritte umfassen, wobei das Zugeben der ersten analytbindenden Verbindung, der Probe, der zweiten analytbindenden Verbindung, der Substratlösung und der Fixierungslösung nicht alles anschließend vorgenommen wird, einige von diesen können vorab vor ihrem Aufbringen auf die Vorrichtung vorgemischt werden. Das Vorangehende hat die Anwendung der Erfindung auf sequenzielle immunometrische Assays mit monoclonalen Antikörpern, d. h. einen Immunoassay unter Verwendung eines ersten Rezeptors für monoclonale Antikörper auf dem porösen Teil und eines zweiten Rezeptors für monoclonale Antikörper, welcher markiert ist, hervorgehoben. Die Probe wird dem porösen Teil zugegeben, gefolgt von dem markierten Antikörper. Andere Assayvarianten sind möglich. Beispielsweise können, bei einem immunometrischen Assay, der markierte Antikörper und die Probe vor dem Zusatz zu dem porösen Teil vermischt werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Assayvorrichtung zur Durchführung von kompetitiven Assays, d. h. Assays, wobei die erste analytbindende Verbindung an den porösen Teil gebunden ist und wobei der Analyt in der Probe mit einer feststehenden Menge des markierten Analyten, zugesetzt der Probelösung oder zugegeben nach Probenzusatz, konkurriert, verwendet werden. Kompetitive Immunoassays werden auf diese Weise unter Verwendung eines Antikörpers, z. B. einer Herstellung monoclonaler oder polyclonaler Antikörper, als erster analytbindender Verbindung, gebunden an die feste Phase, günstig durchgeführt. Markiertes Antigen kann der Probe zugesetzt werden, bevor die Probe der porösen Schicht zugegeben wird. In einer anderen Ausführungsform kann es nach dem Zusatz der Probe oder gleichzeitig damit zugegeben werden. Wenn ein Fängermolekül verwendet wird, kann die Probe auf verschiedenen Wegen untersucht werden. Beispielsweise können, in einem „Sandwich-Assay", eine erste analytbindende Verbindung und eine markierte zweite analytbindende Verbindung mit der Probe vereinigt werden, um den Analyten vor dem Zusatz zu dem porösen Teil zu binden. In einer anderen Ausführungsform können eine erste analytbindende Verbindung und eine Probe vor dem Zusatz zu dem porösen Teil vereinigt werden oder in der Reihenfolge von zuerst einer analytbindenden Verbindung und dann der Probe zugegeben werden, gefolgt vom Zusatz einer markierten zweiten analytbindenden Verbindung. In derartigen Sandwich-Assays kann das Fängermolekül ausgewählt sein, um die erste analytbindende Verbindung zu binden und die markierte zweite analytbindende Verbindung nicht zu binden. Im Format eines kompetitiven Assays ist die Intensität der Färbung des Niederschlags der Konzentration des nachzuweisenden Markers umgekehrt proportional.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Beschichtung der porösen Zwischenschicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung, umfassend die folgenden Schritte:

– Schneiden von Membranen in Streifen,
– Eintauchen der Streifen in einen Applikationspuffer und das Fängermittel oder die erste analytbindende Verbindung,
– Inkubieren der Membran,
– Eintauchen der Membran in ein Blockierungsmittel mit 0,2 bis 10% Blockierungsmittel, wobei das Blockierungsmittel BSA oder ein anderes Mittel, von dem bekannt ist, dass es freie Stellen auf Membranen blockiert, sein kann,
– Inkubieren der Membranen,
– Trocknen der Streifen und
– Abpacken der Streifen zum Schutz der Membranen vor Feuchtigkeit, wenn Lagerung erforderlich ist, das wird vorzugsweise unter Anwendung von Vakuum durchgeführt, nachfolgende Lagerung wird vorgenommen,

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die poröse Zwischenschicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschichtet, umfassend die folgenden Schritte:

– Schneiden von Membranen in Streifen von vorzugsweise 0,8 cm Breite,
– Eintauchen der Streifen in ein auf RT gebrachtes Bad mit dem Applikationspuffer und dem Fängermolekül oder der ersten analytbindenden Verbindung,
– Inkubieren der Membran über 3 h bei RT unter leichtem Schütteln,
– Eintauchen der Membran in ein Blockierungsmittel mit 1% BSA,
– Inkubieren über 3 h bei RT unter leichtem Schütteln,
– Trocknen der Streifen bei 37°C in einem Inkubator für 1 h bis über Nacht und
– Abpacken der Streifen zum Schutz der Membranen vor Feuchtigkeit, wenn Lagerung erforderlich ist, und Lagerung bei RT,

Vorzugsweise wird das Durchflussverfahren unter Verwendung einer Vorrichtung, wie durch die Erfindung beschrieben, mit den folgenden Schritten durchgeführt:

– Verdünnen der Probe 1:2 bis 1:100.000 in dem Verdünnungspuffer, wobei der Verdünnungspuffer ein Tris-Puffer mit geringem Salzgehalt und mit 1 bis 5% BSA ist, die Zusammensetzung des Verdünnungsmittels kann an den nachzuweisenden Analyten angepasst werden, in einer anderen Ausführungsform kann eine unverdünnte Probe verwendet werden,
– Aufbringen von 15 μl oder einem Tropfen der verdünnten Probe auf die Membran,
– Eindringenlassen der Probe für mindestens 1 min, d. h. Bereich von 30 s bis zu 1,5 min, bevorzugt 45 s, die erste Eindringzeit hängt von der zu testenden Probe ab, z. B. kann eine Probe mit einem hohen Gehalt an Leukozyten oder Fibrin langsamer eindringen,
– Aufbringen von 25 μl oder einem Tropfen Konjugat, d. h. Anti-CRP gekoppelt an HRP, und Eindringenlassen,
– Aufbringen von 25 μl oder einem Tropfen präzipitierendem TMB und Eindringenlassen,
– Aufbringen von 25 μl oder einem Tropfen Fixierungslösung und Eindringenlassen,
– Warten für 2 min bis zum Ablesen des Ergebnisses und Ablesen innerhalb von 30 min und
– Abdecken des farbigen Flecks mit Scotchband, d. h. Typ 3M, wenn eine langfristige Aufbewahrung des Ergebnisses erforderlich ist.

Wie im Beispielteil dargestellt, beschreibt die vorliegende Erfindung (Beispiel 1) auch ein optimiertes Verfahren zum Nachweis von Analyten mittels Dot-Blot, basierend auf einem Enzymassay, wie vorher für das Durchflusskonzept beschrieben. In diesem Verfahren umfasst das Beschichten eines Streifens mit poröser Schicht mit einer ersten analytbindenden Verbindung oder mit einem Fängermolekül die folgenden Schritte:

– Spülen der Membranstreifen in Alkohol über 1 bis 60 s,
– Inkubieren der Membranen in einem kalten Salzpuffer zwischen 1 und 60 min,
– Zusetzen von 0,1 bis 10 μl Beschichtungslösungen,
– Inkubieren der Streifen für 1 h bis über Nacht zwischen 4 und 25°C unter Schütteln,
– Trocknen der Membranen für 1 h bis über Nacht bei Raumtemperatur,
– Sättigen der Membranen mit einem Blockierungsprotein für 15 min bis über Nacht bei RT bzw. 4°C, unter Schütteln, und
– Trocknen der Membranen bei 37°C über Nacht oder über das Wochenende.

Diese Streifen können anschließend in einem Dot-Blot oder in einem äquivalenten Assayverfahren verwendet werden.
Das Punktverfahren kann durchgeführt werden, umfassend folgende Schritte:

1. Verdünnen der analythaltigen Proben 1:2 oder 1:10.000 in dem Tris-Verdünnungspuffer,
2. Inkubieren von 1 bis 2 ml dieser verdünnten Probe über 5 min bis 45 min (Zeit X) bei Raumtemperatur (RT) unter Schütteln,
3. Waschen der Membranen mindestens dreimal mit 1 bis 3 ml Lösung von Tris (0,01 M) und Tween 20 (0,5% bis 1%) jeweils mindestens 3 min unter Schütteln,
4. Zusetzen von 1 ml bis 2 ml enzymmarkiertem Konjugat, wobei der Verdünnungsfaktor gemäß dem Verfahren angepasst wird,
5. Inkubieren der Membran für mindestens 5 bis 30 min bei RT (Zeit Y) unter Schütteln,
6. Waschen der Membranen dreimal für mindestens 3 min jeweils unter Schütteln,
7. Zugeben von 1 bis 2 ml Chromogenlösung (membranpräzipitierendes Substrat),
8. Inkubieren der Membran für 1 min bis 15 min (Zeit Z) bei RT unter Schütteln,
9. Stoppen der Reaktion durch Zusetzen von 1 ml Stopplösung,
10. Analysieren des Auftretens eines blauen Flecks mit unterschiedlicher Intensität.

Alle hier beschriebenen Parameter können unter Verwendung von Bedingungen, wie für die vorstehend entwickelte Durchflussassayvorrichtung beschrieben, variiert werden.
Die folgenden Beispiele und Figurlegenden dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung und sind in keiner Weise als Beschränkung der vorliegenden Erfindung aufzufassen.
Kurzbeschreibung der Figuren

Tabelle 1: Wichtigste organspezifische und nicht organspezifische Antikörper, die bei Autoimmunerkrankungen vorhanden sind.
Tabelle 2: Nicht organspezifische Antigene.
Tabelle 3: Organspezifische Antigene.
Tabelle 4 (4a–4c): Bewertung des Durchflussverfahrens, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, und anderer vorhandener Verfahren der Immunturbidimetrie und des Durchflussverfahrens von Nycomed.
Tabelle 5: Bewertung verschiedener Membranchargen.
Tabelle 6: Prüfung verschiedener Membranchargen.
Tabelle 7 (7a–7h): Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit.
Tabelle 8 (8a–8f): Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit.
Tabelle 9 (9a–9c): Bewertung unterschiedlicher TMB-Mittel.
Tabelle 10 (10a–10c): Auswertung des niedrigsten Nachweises, welcher erfasst werden kann.
Tabelle 11 (11a–11b): Nachweis von antimitochondrialen Antikörpern des Typs M2.
Tabelle 12: Nachweis von Salmonella typhimurium.
Tabelle 13: Einfluss der Zusammensetzung des Verdünnungspuffers.
Tabelle 14 (14a–14e): Korrelation mit einem anderen Schnellverfahren zum Nachweis von CRP mit Immunturbidimetrie.

Ausführungsformen der Erfindung
Die Erfinder entwickelten einen Schnelltest auf Membranbasis zum Nachweis von Analyt(en). Der beschriebene Test wurde zuerst für den Nachweis des C-reaktiven Proteins (CRP), welches ein Akute-Phase-Protein ist, entwickelt und optimiert (Beispiele 1–4, 8, 9, 16). Wie die Erfinder in der vorliegenden Erfindung bewiesen, kann dieser Test zum Nachweis jedes anderen Analyten in allen anderen Medien verwendet werden.
Andere Assays wurden außerdem zum Nachweis von Rheumafaktoren (Beispiel 6), Antikörpern M2 (Beispiel 5) oder Salmonella typhimurium (Beispiel 7) durchgeführt.
In Versuch 1 wurde das Vorhandensein des Analyten CRP unter Verwendung eines polyclonalen Antiserums gegen CRP (vom Kaninchen stammend) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml als Fängerantikörper während des Beschichtungsverfahrens untersucht.
In Beispiel 5 wurde das Vorhandensein von Anti-M2-Antikörpern untersucht; ein gereinigtes organspezifisches Autoantigen, Pyruvat-Dehydrogenase (Antigen PDH = Antigen M2), mit einer Enzymaktivität von 0,0634 Einheiten/ml wurde aufgebracht.
In Beispiel 6 wurde das Vorhandensein von Rheumafaktoren unter Verwendung gereinigter humaner Immunglobuline als Fängerantikörper während des Beschichtungsverfahrens untersucht; eine Lösung von gereinigten humanen Immunglobulinen mit einer Beschichtungskonzentration von 48 μg/ml wurde aufgebracht.
In Beispiel 7 wurde das Vorhandensein von Salmonella typhimurium unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers als Fängerprotein während des Beschichtungsverfahrens in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml untersucht.
Die Serum- oder Plasmaspiegel von CRP steigen als Reaktion auf infektiöse und nichtinfektiöse entzündliche Prozesse. Die Spiegel können von ±5 mg/l bis 500 mg/l steigen. Messungen der CRP-Spiegel sind bei der Unterscheidung von Virusinfektionen, d. h. leichter Anstieg bis zu 50 mg/l, von schweren bakteriellen Infektionen, d. h. bis zu 500 mg/l, und bei der Prüfung der Wirksamkeit einer Behandlung verwendbar. Die Feststellung niedriger Spiegel von CRP, die von 1 mg/l bis 5 mg/l reichen, kann prädiktiv für Atherosklerose sein.
Verschiedene Verfahren können zum Nachweis von CRP verwendet werden, wie Radioimmunoassay (RIA), Radiale Immunodiffusion, Latexagglutination, Turbidimetrie, Nephelometrie, Enzymimmunoassay, u. a. Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Fluoreszenzpolarimetrie und Immunoassays auf Membranbasis. Verfahren der Radialen Immunodiffusion oder Latexagglutination ermöglichen nur eine Ja/Nein-Bewertung oder eine halbquantitative Auswertung. Diese Verfahren leiden allgemein unter fehlender Empfindlichkeit oder fehlender Genauigkeit. Andere vorstehend erwähnte Verfahren sind auf Messgeräten basierende Tests, die eine quantitative Auswertung der Ergebnisse ermöglichen. Bei derartigen Verfahren ist jedoch die zur Erhaltung der Ergebnisse benötigte Zeit zu lang und häufig erfordern die Verfahren mehrere Waschschritte.
Deshalb werden neue zuverlässige Schnelltestsysteme zur Diagnose von besonders entzündlichen Erkrankungen benötigt.
Beispiel 1: Optimierung eines Punktverfahrens als Schnelltest
Das Ziel dieser Durchführbarkeitsuntersuchung war die Entwicklung eines Schnellverfahrens, das die Auswertung der Ergebnisse innerhalb weniger Minuten ohne komplizierte Laborausstattung ermöglicht.
1.1 Herstellung von Punktstreifen
Polyvinylidenfluorid-Membranen von Millipore (Kat. 00010 IPVH) mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm wurden verwendet und in Streifen von 3 mm Breite geschnitten. Die Streifen wurden mit absolutem Ethanol (Merck 1.00.983) 15 s gespült und 10 min in kalter TBS (Tris-gepufferte Salzlösung, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 9,0 ± 0,1) vor dem Beginnen des Beschichtungsverfahrens (Applikationsverfahrens) inkubiert. Die Beschichtungsvolumina sind klein, d. h. 1 bis 5 μl, und erfordern eine genaue Pipette oder eine genaue Tüpfelvorrichtung, z. B. ein BIO-Punktsystem. In diesem Versuch wurde dazu eine genaue Pipette verwendet. Nach dem Beschichten unter Verwendung eines „Tüpfelverfahrens" wurden die Membranen bei 37 °C getrocknet, gefolgt von einem Sättigungsschritt unter Verwendung eines Blockierungsproteins, in der Konzentration von 1% bis 5% reichend. In diesem Versuch wurde BSA verwendet. Dieser Blockierungsschritt wurde 1 h bei RT unter Schütteln durchgeführt. Die Membranen wurden danach über Nacht bei 37°C getrocknet.
Drei Versuche wurden unter Verwendung dieser beschichteten Streifen durchgeführt, wobei bei jedem Versuch nach einem anderen Analyten gesucht wurde und/oder ein anderer Antikörper verwendet wurde.
1.2. Punktverfahren
Gemäß dem nachzuweisenden Analyten wurden die Punktverfahren wie folgt durchgeführt:

1. Die Proben mit CRP-Protein – Versuch 1 – oder Rheumafaktoren des Typs IgM – Versuch 2 – in Anti-M2-Antikörpern – Versuch 3 – wurden 1:50 oder 1:100 in Tris-Verdünnungspuffer verdünnt.
2. 1 bis 2 ml dieser verdünnten Probe wurden 5 min bis 45 min (Zeit X) bei Raumtemperatur (RT) unter Schütteln inkubiert.
3. Die Membranen wurden dreimal mit 1 bis 3 ml Lösung von Tris (0,01 M) und Tween 20 (0,5% bis 1%) jeweils 3 min, unter Schütteln, gewaschen.
4. 1 ml bis 2 ml Konjugat wurden für die weitere Inkubation verwendet.
5. Die Inkubation wurde 5 bis 30 min bei RT (Zeit Y) unter Schütteln durchgeführt.
6. Die Membranen wurden ein zweites Mal dreimal jeweils 3 min jeweils unter Schütteln gewaschen (siehe Schritt 3).
7. 1 bis 2 ml Chromogenlösung, d. h. membranpräzipitierendes TMB, wurden zugeben.
8. Die Inkubation wurde 1 min bis 15 min (Zeit Z) bei RT unter Schütteln durchgeführt.
9. Die Reaktion wurde durch das Zusetzen von 1 ml Stopp- oder Fixierungslösung 10 gestoppt. Das Auftreten eines blauen Flecks mit unterschiedlicher Intensität wurde visuell analysiert.

Die Konjugatspezifität wurde gemäß dem nachzuweisenden Analyten ausgewählt. In Versuch 1 wurde der HRP-markierte Anti-CRP in einer Konzentration von 0,65 g/l verwendet; in Versuch 2 wurde der humane Anti-μ-IgM (P0322 von Dako, Fab'2) in einer Konzentration von 1 g/l verwendet; in Versuch 3 wurde ein Gemisch aus humanem Anti-γ-IgG (P406 von Dako, Fab'2) und humanem Anti-μ-IgM (P 322 von Dako, Fab'2) in einer Endkonzentration von 1 g/l verwendet.
Bei allen drei Versuchen war die Zusammensetzung der Fixierungslösung folgendermaßen (für 100 ml):

0,1 g Dioctylsulfosuccinat SIGMA D 0887

0,5 ml Dimethylformamid SIGMA D 8654

1,9 ml Polyvinylalkohol 5% SIGMA P8136

76 ml H₂O (filtriert)
1.3 Auswertung der Ergebnisse
Die Farbentwicklung wurde qualitativ beurteilt. Wenn eine Farbe gebildet wurde, wurde ausgewertet, dass die Probe positiv ist, was bedeutet, dass die Testprobe den Analyten enthält.
1.4. Endergebnis
Präzipitierendes TMB ermöglichte die Ausbildung einer blauen Färbung, die der Konzentration von CRP proportional ist. Das Vorhandensein von Lösungsvermittlern in dem Verdünnungspuffer schien die Beeinflussung durch ein anderes Blutprotein, wie humanes Albumin und humane Immunglobuline, zu verhindern. Das Beschichtungsverfahren und das Blockierungsverfahren wurden unter Verminderung des Hintergrunds optimiert. Die Verwendung von neuen Punktstreifen ermöglichte gute Ergebnisse bei Inkubationszeiten von 5 min, 5 min, 1 min unter Verwendung des HRP-TMB-Enzymnachweissystems. Trotzdem waren die Waschschritte immer noch mühselig und einfaches Eintauchen, welches die Anwendung aller Waschschritte ausschließt, und verringerte Inkubationszeiten von 2 min, 2 min, 1 min erzeugten einen zu hohen Hintergrund.
Außerdem wird, bei einem derartigen Verfahren, leichtes Schütteln benötigt, um die immunologische Wechselwirkung (Ag-Ab) zu optimieren. Auch Waschschritte sind zum Abtrennen der freien Fraktion von der gebundenen Fraktion zwingend erforderlich. Darüber hinaus kann das Waschverfahren unter Schütteln durchgeführt werden, um einen Hintergrund, wie eine blaue Hintergrundfärbung der Streifen zu vermeiden.
Schließlich erfordert dieses Verfahren eine gewisse Laborausrüstung, z. B. Schüttelmischer, und einige Verfahrensschritte, z. B. das Waschverfahren, sind mühselig. Außerdem können große Volumina an Reagenzien verwendet werden, d. h. 1 ml oder mehr, was den Volumenanforderungen für Schnelltests nicht entspricht (siehe Einleitung).
Wegen der vorstehend erwähnten Argumente erfüllten die mit dem Punktverfahren verbundenen Anforderungen nicht die Vorgaben von Schnelltests.
Technische Parameter, die verbessert werden sollten:

1. Inkubationszeiten
– die Zielzeit ist 5 min insgesamt, z. B. 2 min/2 min/1 min
– eine Titration des Konjugats kann durchgeführt werden, um falsche positive oder falsche negative Ergebnisse zu vermeiden
– die derzeitige Empfindlichkeit (5 min/5 min/1 min) beträgt ±10 mg/l, sollte aber verbessert werden
– die blaue Färbung ermöglicht eine gute visuelle Unterscheidung, eine halbquantitative Bestimmung ist möglich
2. Waschschritte: zu mühselig
3. Testaufbau, um Laborausrüstung zu vermeiden

Beispiel 2: Optimierung des Durchflusskonzeptes
Bei der Entwicklung eines Schnelltests zum Nachweis von CRP konzentrierten sich die Erfinder auf die Optimierung der technischen Parameter: Zusammensetzung, Qualität und Porengröße der Membran (siehe 2.1), Optimierung des enzymmarkierten Reagenziensystems zum Nachweis des Analyten (hier CRP) (siehe 2.2), Zusammensetzung des Beschichtungspuffers (Applikationspuffers) (siehe 2.3), Zusammensetzung und Titration des Agens der analytbindenden Verbindung, hier HRP-markierter Anti-CRP-Antikörper, Anwendung des Bindungsverfahrens (Beschichtungsverfahrens), Blockierungsverfahren (Nachbeschichtungsverfahren) (siehe 2.4), Lagerung/Beständigkeit der Membran, Stabilität des Messwertes unter Beibehaltung der Färbung und der Kosten.
2.1 Auswahl der Membran (Zusammensetzung – Porengröße)
Qualität und Zusammensetzung der Membran üben Einfluss auf die Bindung des Fängermittels oder der ersten analytbindenden Verbindung (Anti-CRP-Antikörper) und die Durchflussgeschwindigkeit (Probe, Konjugat und präzipitierendes Substrat) aus. Es ist daher wichtig, eine hochbeständige Bindung des Proteins zu erreichen, um eine sehr gute Empfindlichkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Reproduzierbarkeit zu erzielen. Auch der Porendurchmesser der Membran ist von großer Wichtigkeit.
Die Erfinder stellten fest, dass Membranen mit Porendurchmessern von 1,2 μm und 0,8 μm eine zu schnelle Durchflussgeschwindigkeit (innerhalb einiger Sekunden) herbeiführen, was einen unscharfen farbigen Fleck, der schwer auszuwerten ist, ergibt.
Kurzbeschreibung der Versuche
Membranen von S&S mit einem Porendurchmesser von 1,2 μm und eine Membran von mdi mit einem Porendurchmesser von 0,8 μm wurden mittels eines Tüpfelverfahrens unter Verwendung von 3 oder 5 μl eines Anti-CRP-Antikörpers beschichtet. Eine Probe, positiv bei CRP (Konzentration 40 mg/l), wurde 1:25 in einem Tris-Verdünnungspuffer (10 mM) mit 1% Saccharose verdünnt. Die Erfinder stellten eine zu schnelle Durchflussgeschwindigkeit, d. h. von weniger als 10 s, und einen erheblichen Diffusionsprozess fest. Außerdem war, nach Zusatz des Konjugats, d. h. HRP-markierten Anti-CRP-Antikörpers, der Hintergrund, d. h. die blaue Hintergrundfärbung, zu intensiv, um eine gute visuelle Ablesung zu ermöglichen. Die Hintergrundfärbung wurde durch die Verwendung des Verdünnungspuffers allein getestet. Dagegen zeigte eine Membran von mdi mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm annehmbare Hintergrundsignale und wurde anschließend ausgewählt. Hier war die Durchflussgeschwindigkeit langsamer, d. h. ±30 s.
Darüber hinaus bedingt eine geringere Porengröße, d. h. 0,45 gegenüber 0,8 und 1,8 μm, einen größeren Oberflächenbereich, somit eine höhere Bindungskapazität. Außerdem ermöglicht eine kleine Porengröße die Vermeidung der radialen Diffusion der Reagenzien während des Durchflusses, was zur Bildung eines gut geformten farbigen Fleckes führt.
Die endgültige Auswahl wurde zwischen Typ CN und Typ CLN, geliefert von der Firma mdi (Advanced Microdevices (Pvt.) Ltd., 21, Industrial Area, Ambala Cantt – 133 001, India), beides Cellulosenitratmembranen, vorgenommen.
Der Membrantyp CN ist eine einfache Membran, die nicht gestützt ist und relativ brüchig ist. Die Erfinder beobachteten heterogene Färbungen vermutlich wegen Lufteinschlüssen, die sich zwischen den absorbierenden Lagen und der Membran ausbildeten. Außerdem war die Durchflussgeschwindigkeit bei der Probe „zu langsam", mehr als 3 min.
Die Membrantypen CLN sind gestützt, papierkaschiert, d. h. „gestützt" durch Papier, leicht zu handhaben und bewirken das Auftreten einer homogenen Färbung. Aufgrund der Art des Trägermaterials besteht immer ein guter Kontakt zwischen dem Absorbens und der Membran, d. h. kein Lufteinschluss. Weiterhin unterstützt die Struktur die Einstellung der Durchflussgeschwindigkeit der Membran auf einen niedrigen Wert, was eine erhöhte Empfindlichkeit zur Folge hat. CLN-040-SL53 weist eine Porengröße von 45 μm, eine Dicke von ca. 480 μm und eine Proteinbindungskapazität von 103 μg/cm² auf.
Die in der absorbierenden Schicht verwendete absorbierende Lage (AP 120) hat eine besondere Beschaffenheit und quillt teilweise bei Benetzung zur Gewährleistung eines guten Kontaktes mit der Membran. Diese Lage wurde von derselben Firma mdi bezogen und besitzt eine Dicke von ca. 1550 μm.
2.2 Auswahl des markierten Systems
Das Verfahren wurde so optimiert, dass eine einfache visuelle Auswertung der Ergebnisse, d. h. ein eindeutig gefärbtes Signal bei den positiven Proben, aber auch ein sehr niedriges Signal bei den negativen Proben, d. h. geringer Hintergrund. Auch die visuelle Unterscheidung zwischen schwach positiven Ergebnissen, festgestellt bei Virusinfektionen und leichten bakteriellen Infektionen, d. h. CRP-Konzentration bis zu 50 mg/l, und stark positiven Ergebnissen, festgestellt bei schweren bakteriellen Infektionen, d. h. von ± 60 bis zu 200 mg/l, musste geklärt werden. Ein reproduzierbares Testsystem, d. h. übereinstimmende Ergebnisse in unterschiedlichen Membranchargen, wurde erhalten. Tatsächlich ist die Bestimmung der CRP-Konzentration zur Beurteilung der Nachfolge der Behandlung, d. h. Antibiotika, verwendbar. Eine Assayvorrichtung ist kostengünstig.
Das gebildete optische Endsignal bei Tests auf Membranbasis kann durch farbige Latexpartikel, Goldpartikel, Farbstoffe oder Enzyme gebildet werden. Die Verwendung von Latexpartikeln kann zu Auswertungsproblemen führen und lässt kein dauerhaftes Ergebnis zu. Selbstagglutination kann auch auftreten, was die Spezifität des Verfahrens beeinträchtigt. Goldpartikel von guter Qualität sind relativ teuer. Man kann außerdem auf einige Probleme der Reproduzierbarkeit der Herstellung im Hinblick auf Kugelform, Größe stoßen. Die Literatur zeigte, dass die Größe der Goldpartikel ein entscheidender Faktor war.
Die Erfinder entschlossen sich, ein Konjugat, d. h. gereinigte Anti-Human-CRP-Antikörper, vom Kaninchen stammend, gekoppelt an Meerrettichperoxidase – HRP –, und ein präzipitierendes TMB-System zu verwenden. Im Gegensatz zu der Verwendung von Goldpartikeln wird so das Vorhandensein von CRP mit einer enzymatischen Einschrittreaktion, welche durch die Verwendung eines Fixierungsmittels, d. h. einer Stopplösung, gestoppt wird, aufgedeckt.
Die Verwendung einer Fixierungslösung ermöglicht eine dauerhafte Aufzeichnung des Ergebnisses. Das ist nicht der Fall mit Goldpartikeln, wobei das Ablesen innerhalb von 5 min durchgeführt werden kann und wobei das Ergebnis nicht fixiert werden kann. Die enzymatische Reaktion besteht aus der Umsetzung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin mit Meerrettichperoxidase und Wasserstoffperoxid unter Bildung eines blauen Oxidationsproduktes mit einem Radikalkation mit einem Elektron.
Vorteile einer derartigen Kombination schließen kommerzielle gebrauchsfertige TMB-Herstellungen von hochbeständiger Qualität und mit einer langen Haltbarkeitsdauer ein, die auf dem Markt erhältlich sind. Die Herstellung solch eines Reagens ist einfach und reproduzierbar. Die Verwendung eines derartigen präzipitierenden Systems ermöglicht die Ausbildung einer blauen, d. h. aquamarinen, Färbung, die leicht abzulesen ist. Das in diesem Versuchsaufbau verwendete Konjugat kann titriert werden, so dass die beste Verdünnung dieser Verbindung ausgewählt werden kann, was ein korrektes, reproduzierbares und genaues Ablesen ermöglicht. In Kombination mit einem Reflexionslesegerät erlaubt diese Assayvorrichtung eine genaue Einstellung jeder Membrancharge, was eine gute Reproduzierbarkeit garantiert.
2.3 Optimierung der Komponenten
Membran
Die Membran ist der entscheidendste Faktor, um ein gutes Testergebnis zu erhalten. Auch wenn genaue Bindungsmechanismen noch unbekannt sind, z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindung, elektrostatische Wechselwirkungen, wird ein hoher Bindungsgrad durch ein optimiertes Applikationsverfahren und einen optimierten Applikationspuffer (Beschichtungspuffer) erzielt. Nitrocellulose wird aufgrund seiner neutralen Ladung bevorzugt ausgewählt.
Bei dem Beschichtungsverfahren wurden die Membranen in Streifen von 0,8 cm Breite, angepasst an die Durchflussvorrichtung, geschnitten und langsam in ein Bad, gebracht auf RT und den Applikationspuffer und die analytbindende Verbindung enthaltend, eingetaucht. Es kann angemerkt werden, dass, wenn die Streifen in einen kalten Applikationspuffer, z. B. 4°C, eingetaucht werden, die Streifen zum „Zurückziehen" neigen und die Bindungswirksamkeit herabgesetzt wird.
Der Beschichtungspuffer (Applikationspuffer) hat einen sehr geringen Salzgehalt und eine Beschaffenheit mit basischem pH-Wert (9,1 ± 0,1). Die erste analytbindende Verbindung wurde im Überschuss unter Verwendung eines polyclonalen Antiserums gegen CRP mit hoher Affinität aufgebracht. Eine Antikörper-Stammlösung mit einer Titerkonzentration von 10,0 mg/ml ± 1,0 wurde 1:50 in der Applikationslösung verdünnt, was zu einer Bindungskonzentration von 0,2 mg/ml führte. Zusammensetzung des Applikationspuffers für 1 l:

1,2 g Tris ICN 103133

8,8 g NaCl Merck Eurolab (ME) 1723
Verschiedene Versuche zeigten, dass der reaktive Bereich (Cellulosenitrat) in direktem Kontakt mit der Applikationslösung sein kann. Eintauchen lieferte die besten Ergebnisse. Ein Tüpfelbeschichtungsverfahren führte zu weniger guten Ergebnissen wegen der Bildung von inhomogenen und unscharfen Flecken.
Verschiedene Inkubationszeiten, d. h. Eintauchzeiten, wurden von 1 h bis 5 h getestet. Eine Inkubation von 3 h bei RT (18–22°C) unter leichtem Schütteln (Schüttelmischer) lieferte die besten Ergebnisse. Nach der Aufbringung werden die Membranen nicht abgewaschen, um die „Desorption" der analytbindenden Verbindung aufgrund des Vorhandenseins von grenzflächenaktiven Mitteln im Waschpuffer zu vermeiden. Tatsächlich kann das Vorhandensein eines Detergens wie Tween 20, welches gewöhnlich im Waschpuffer vorhanden ist, diese Wirkung hervorrufen.
2.4 Nachbeschichtungs-, Blockierungsverfahren
Ein derartiges Verfahren wurde in die Erfindung einbezogen und optimiert, um einen geringen Hintergrund zu erreichen, aber auch um einen Waschschritt, der während des FT-Verfahrens (Durchflussverfahrens) gewöhnlich erforderlich ist, zu vermeiden. Das Ziel war die Blockierung aller frei gebliebenen Stellen auf der Membran. Das Nachbeschichtungs- oder Blockierungsverfahren wird bei den ELISA-Verfahren viel verwendet, d. h. Verwendung löslicher Substrate zum Blockieren der verbliebenen freien Stellen nach dem Beschichtungsverfahren.
Die beim Punktverfahren verwendeten Streifen werden im Allgemeinen, aber nicht immer, blockiert, um einen zu hohen Hintergrund, hervorgerufen durch die unspezifische Adsorption des Konjugats auf dem Streifen, zu verhindern. Bei FT-Verfahren sind Waschungen zwingend erforderlich, um das Konjugat mit ungebundenen Goldpartikeln, d. h. das Gold-Antikörper-Konjugat, welches auf den Membranen adsorbiert werden kann, zu entfernen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die verbliebenen freien Stellen nach dem Beschichtungsverfahren unter Verwendung von gereinigtem BSA (Rinderserumalbumin) in einer Konzentration von 1% zur Verhinderung jeglicher unspezifischer Adsorption des Konjugats während des Durchflusses blockiert. Dennoch können andere Proteine oder Polymerkomponenten, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, für denselben Zweck verwendet werden.
Nach dem Beschichtungsverfahren werden die Streifen deshalb sofort in ein zweites Bad mit dem Blockierungsmittel eingetaucht. Die Streifen werden unter leichtem Schütteln (Schüttelmischer) 3 h bei RT (18–24°C) eingebracht. Zusammensetzung des Blockierungspuffers (für 1 l):

8,5 g NaCl MERCK EUROLAB 1723

1,25 g Na₂HPO₄ MERCK EUROLAB 1770

0,160 g NaH₂PO₄·2H₂O MERCK EUROLAB 1769

1 g Thimerosal MERCK EUROLAB 818957

10 g BSA ICN 105133
Wegen der starken Bindung der analytbindenden Verbindung an die Membran wurde diese Verbindung durch das BSA, welches die verbliebenen freien Stellen blockiert, nicht „verdrängt". Die Streifen wurden in die Blockierungslösung 3 h unter leichtem Schütteln eingetaucht. Thimerosal wurde als Konservierungsstoff zugesetzt.
Auch nach dem Blockierungsverfahren wurden die Membranen nicht abgewaschen, um die „Desorption" der analytbindenden Verbindung und der Blockierungsmittel aufgrund des Vorhandenseins von grenzflächenaktiven Mitteln zu vermeiden. Tatsächlich kann das Vorhandensein eines Detergens wie Tween 20, welches gewöhnlich im Waschpuffer vorhanden ist, diese Wirkung hervorrufen.
Die Streifen wurden bei 37°C für 1 h getrocknet und anschließend über Nacht in einen Inkubator bei 18–22°C zur Vermeidung von Staub gebracht. Der Trocknungsschritt kann auch über Nacht bei 37°C durchgeführt werden, ohne Auswirkung auf das Endergebnis. Die Streifen wurden dann zum Schutz gegen Feuchtigkeit unter Vakuum abgepackt und bei RT aufbewahrt.
Das vorstehend beschriebene Behandlungsverfahren lieferte die besten Ergebnisse mit dem nachstehend beschriebenen Durchflussverfahren (siehe Abschnitt 2.5).
Die analytbindende Verbindung wird im Überschuss verwendet; der mit der analytbindenden Verbindung ergänzte Applikationspuffer kann bei Einfrieren bei –20°C zwischen zwei Behandlungsschritten 2-mal wiederverwendet werden.
Ebenso kann auch die Blockierungslösung, bei Aufbewahrung bei 4°C zwischen 2 Behandlungsschritten, ohne Beeinträchtigung der Wirksamkeit des Blockierungsverfahrens 2-mal wiederverwendet werden.
2.5 FT-Verfahren
Die Probe, d. h. Serum oder Vollblut, wurde 1:50 in dem Verdünnungspuffer verdünnt. Der verwendete Verdünnungspuffer war ein Tris-Puffer mit niedrigem Salzgehalt und mit BSA, d. h. 3 oder 5%. Herstellung von 1 l Verdünnungspuffer:

1,2 g Tris ICN 103133

8,8 g NaCl ME 1723

50 g BSA Ref. ICN 105033

1 g Thimerosal ME 818957
15 μl oder ein Tropfen der verdünnten Probe wurde auf die Membran aufgebracht und die Probe wurde mindestens 1 min die Membran durchtränken gelassen. Gewöhnlich beträgt die Absorptionszeit ca. 45 s, d. h. Bereich 30 s bis zu 1,5 min. Solch eine Zeit ist langsamer als jene mit einem anderem FT-Verfahren festgestellte. Es ist bekannt, dass sich die Empfindlichkeit des Tests mit abnehmender Durchflussgeschwindigkeit erhöht. Tatsächlich beeinträchtigen zu hohe Durchflussgeschwindigkeiten, d. h. wenige Sekunden, die Empfindlichkeit des Verfahrens.
Das wurde gefolgt durch den Zusatz von 25 μl oder einem Tropfen Konjugat, d. h. Anti-CRP, gekoppelt an HRP, 25 μl oder einem Tropfen präzipitierendem TMB, 25 μl oder einem Tropfen Fixierungslösung. Nach jedem Zusatz wurde die Lösung die Membran durchtränken gelassen. Das Ergebnis wurde nach minimal 2 min abgelesen. Allerdings kann es erforderlich sein, mindestens 2 min zu warten, bevor die enzymatische Reaktion gestoppt wird. Für eine langfristige Aufbewahrung des Ergebnisses wird empfohlen, den farbigen Fleck mit Scotchband, d. h. Typ 3M, abzudecken.
Das Verfahren mit den angeführten Volumina 15, 25, 25, 25 μl erzeugt einen homogenen farbigen Fleck von 3–4 mm Durchmesser. Wenn ein größerer Durchmesser > 4 mm erzielt werden muss oder wenn die Volumina größer sind, z. B. Tropfendispenser von 50 μl, muss die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers durch die Zugabe von Saccharose, d. h. 10% bis zu 40%, verändert werden, was die Durchflussgeschwindigkeit verlangsamt und womit sich eine heterogene Färbung vermeiden lässt. Zusammensetzung der Fixierungslösung (für 100 ml):

1 g Dioctylsulfosuccinat SIGMA D 0887

5 ml Dimethylformamid SIGMA D 8654

19 ml Polyvinylalkohol 5% SIGMA P8136

76 ml H₂O (filtriert)
2.6 Auswertung des Ergebnisses
2.6.1 Visuelle Ablesung = halbquantitative Ablesung
Die CRP-Konzentration wurde durch Vergleichen der Testreaktion mit einer Standardkurve, hergestellt mit hochgereinigtem CRP, bestimmt. Die sechs Bereiche der Skala entsprechen den folgenden Konzentrationen: 11 mg/l; 27,5 mg/l; 69 mg/l; 91 mg/l; 137 mg/l und 275 mg/l. In einer anderen Ausführungsform können andere Konzentrationen, die den Bereich von 1 mg/l bis 500 mg/l umfassen, verwendet werden.

Die Proben wurden folgendermaßen ausgewertet:

Farbe der Testreaktion	CRP-Konzentration
– heller als der Bereich von 11 mg/l	< 11 mg/l
– identisch mit einem Bereich	übereinstimmend mit dem Bereich
– zwischen 2 Bereichen	Schätzung eines Wertes zwischen den Bereichen
– dunkler als der Bereich von 275 mg/l	> 275 mg/l

In dem Kit wird eine Farbskala enthalten sein, die den Vergleich der Färbung der Probe mit der Färbung der bekannten Konzentrationen von CRP ermöglicht. In einer anderen Ausführungsform können die farbigen Flecke unter Verwendung eines Reflexionslesegerätes gescannt, wie nachstehend erörtert.
2.6.2 Auswertung unter Verwendung eines Lesegerätes
Unter Verwendung eines Reflexionslesegerätes ist die Messung der Intensität der Färbung genauer und ermöglicht die Bestimmung der Konzentration an CRP. Die Konzentration einer unbekannten Probe kann durch Interpolation auf einer Standardkurve, erhalten mit verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem CRP, berechnet werden.
Beispiel 3: Vergleich mit einem anderen vorhandenen Verfahren
3.1 Ziel der Untersuchung
Das optimierte FT-Verfahren wurde mit 2 im Handel erhältlichen Verfahren verglichen.
Versuchsbedingungen
Die Erfinder analysierten 50 von sehr niedriger bis sehr hoher Konzentration an CRP reichende Serumproben, die mit dem Nephelometrieverfahren (quantitatives Verfahren) mittels des Durchflussverfahrens von Bio ART, d. h. eines halbquantitativen Verfahrens unter Verwendung von präzipitierendem TMB, und mittels des Verfahrens von Nycomed, d. h. eines halbquantitativen FT-Verfahrens unter Verwendung von Goldpartikeln, getestet wurden.
3.2 Verfahren
Die Proben wurden gemäß dem folgenden Verfahren getestet:
a) FT BIO-ART (gemäß der vorliegenden Erfindung):

1. Unter Verwendung einer Pipette wurden 15 μl der verdünnten Probe (1:50) auf die beschichtete Membran aufgebracht und mindestens 45 s eindringen gelassen.
2. Unter Verwendung einer Pipette (siehe Tabelle 4a) oder eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4b) wurden 25 μl Konjugat, d. h. Anti-Human-CRP, vom Kaninchen stammend, HRP-markiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), mit einer Konzentration von 0,9 mg/l auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
3. Unter Verwendung einer Pipette (siehe Tabelle 4a) oder eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4b) wurden 25 μl Chromogen (präzipitierendes TMB) auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
4. Unter Verwendung einer Pipette (siehe Tabelle 4a) oder eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4b) wurden 25 μl Fixierungslösung auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
5. Die visuelle Ablesung und/oder Messung der Reflexion wurden nach 2 min Stabilisierung durchgeführt.

b) FT Nycomed:
Das Kit von Nycomed wurde gemäß dem in der Packungsbeilage beschriebenen Verfahren verwendet. Das Kit mit Chargen-Nr. 10092464 wurde verwendet.

1. Unter Verwendung einer Pipette wurden 25 μl der verdünnten Probe (1:40) oder einer positiven Kontrolle auf die beschichtete Membran aufgebracht. Die Probe wurde mindestens 45 s eindringen gelassen.
2. Ein Tropfen Konjugat wurde auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
3. Ein Tropfen Waschlösung wurde auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
4. Die Ablesung, d. h. visuell oder durch das Reflexionslesegerät, wurde nach 30 s Stabilisierung durchgeführt.

Zur Validierung des Reflexionslesegerätes wurden sowohl die Ergebnisse mit BIO ART als auch mit Nycomed mit dem Reflexionslesegerät abgelesen. Unter Verwendung einer Standardkurve wurde die Konzentration der Probe berechnet, um die Durchführbarkeit eines tatsächlich quantitativen Verfahrens abzusehen.
3.3 Reagenzien

Membrancharge Nr.: 0064 (Tabelle 4a) und 00115 (Tabelle 4b)
Präzipitierendes TMB Chargen-Nr.: 5 DT 0629, Verfallsdatum: 06/01
Fixierungslösung Chargen-Nr.: 0051, Verfallsdatum: 05/01
Konjugat: HRP-markierter Anti-CRP, verdünnt 1:700 (0,9 mg/l)

3.4 Auswertung der Ergebnisse
3.4.1 Nycomed: visuelle Ablesung = halbquantitative Ablesung
Die CRP-Konzentration wurde durch Vergleichen der Testreaktion mit der mit dem Kit gelieferten Referenzfarbskala geschätzt. Die fünf Bereiche der Skala entsprachen den folgenden Konzentrationen: 10 mg/l, 25 mg/l, 50 mg/l, 100 mg/l und 200 mg/l.

Die Signale wurden folgendermaßen ausgewertet:

Farbe der Testreaktion	CRP-Konzentration
– heller als der Bereich von 10 mg/l	< 10 mg/l
– identisch mit einem Bereich	übereinstimmend mit dem Bereich
– zwischen 2 Bereichen	Schätzung eines Wertes zwischen den Bereichen
– dunkler als der Bereich von 200 mg/l	> 200 mg/l

3.4.2 BIO ART: visuelle Ablesung = halbquantitative Ablesung
Die in den Proben vorhandene CRP-Konzentration wurde durch Vergleichen der Testreaktion mit einer Standardkurve, erstellt mit hochgereinigtem CRP, geschätzt. Die sechs Bereiche der Skala entsprechen den folgenden Konzentrationen: 11 mg/l; 27,5 mg/l; 69 mg/l; 91 mg/l; 137 mg/l, 275 mg/l. Andere Konzentrationen, die den Bereich von 10 mg/l bis 250 mg/l umfassen, können verwendet werden.

Die Auswertung wurde mittels folgender Kriterien durchgeführt:

3.4.3 Berechnung der Ergebnisse mit dem Reflexionslesegerät
Die Endfärbung wurde durch Verwendung des Reflexionslesegerätes abgelesen, wie nachstehend beschrieben. Die CRP-Konzentration wurde aus der Standardkurve berechnet. Die Ergebnisse sind in mg/l wiedergegeben, wie in den Tabellen 4a und 4b aufgeführt.
3.5 Ergebnisse
Siehe Tabellen 4a und 4b.
3.6 Schlussfolgerungen
Aus Tabelle 4a kann gefolgert werden, dass es keine Unstimmigkeit im Hinblick auf negatives Ergebnis im Vergleich zu positivem Ergebnis gibt, 3 Proben * (30, 34, 43) werden in andere Kategorien eingestuft und gemäß der Membrancharge werden 5 Proben ** (25, 26, 30, 35, 37) anders eingestuft. Um stets das gleiche Signal für den gleichen Konzentrationswert zu erhalten, kann das Konjugat titriert werden, z. B. ermöglicht diese Titration die Ermittlung der besten Endverdünnung, die in dem jeweiligen Versuch verwendet werden kann.
In Tabelle 4b zeigen die ersten Ergebnisse, dass die Quantifizierung möglich ist. Da die Konzentration durch Interpolation der Standardkurve berechnet wird, kann keine genaue Konzentration bei Werten kleiner als 10 mg/l ermittelt werden. Zusätzliche Standards, d. h. mit Werten von 2 und 5 mg/l, werden zur Ermittlung der Konzentration mit Genauigkeit benötigt. Für zwischen 10 und 50 mg/l variierende Proben ist die Korrelation zwischen beiden Verfahren gut. Probe Nr. 31 muss nochmals getestet werden. Für zwischen 51 und 150 mg/l variierende Proben ist die Korrelation ebenfalls gut, außer dass Probe 39 noch einmal getestet werden muss. Bei der visuellen Ablesung (siehe Tabelle 1a) stellten die Erfinder fest, dass sowohl das Verfahren von Nycomed als auch das erfindungsgemäße Verfahren eine Unterscheidung bei Proben mit einer Analytkonzentration höher als 150 mg/l benötigt. Durch Anpassung der Konjugatverdünnung kann ein derartiges Problem überwunden werden. Durch Anpassung der TMB-Konzentration kann ein derartiges Problem überwunden werden.
Weiter zu dieser vorausgehenden Untersuchung wurden die Reagenzien optimiert und eine zweite Serie von Proben mit zwischen 0,4 mg/l und 200 mg/l reichenden Konzentrationen wurde gemäß dem FT-Verfahren von BIO ART getestet. Die Ergebnisse wurden mit dem Verfahren von Nycomed und mit Nephelometrie verglichen. Eine mit gereinigtem CRP hergestellte Standardkurve wurde zur Auswertung der Ergebnisse erstellt. Die sechs Konzentrationen der Standardkurve mit Bio ART waren 0 mg/l, 1 mg/l, 10 mg/l, 25 mg/l, 75 mg/l, 200 mg/l.
a) FT BIO-ART (gemäß der vorliegenden Erfindung):

1. Unter Verwendung einer Pipette wurden 20 μl der verdünnten Probe (1:50) auf die beschichtete Membran aufgebracht und mindestens 45 s eindringen gelassen.
2. Unter Verwendung eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4c) wurden 25 μl Konjugat, d. h. Anti-Human-CRP, vom Kaninchen stammend, HRP-markiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), mit einer Konzentration von 0,9 mg/l auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
3. Unter Verwendung eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4c) wurden 25 μl Chromogen (präzipitierendes TMB) auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
4. Unter Verwendung eines Tropfendispensers (siehe Tabelle 4c) wurden 25 μl Fixierungslösung auf die beschichtete Membran aufgebracht und eindringen gelassen.
5. Die Messung der Reflexion wurde nach 2 min Stabilisierung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4c dargestellt.
Der Zusatz eines Standards von 1 mg/l ermöglicht eine bessere Unterscheidung bei niedrigen Werten, d. h. < 10 mg/l. Für zwischen 10 und 75 mg/l variierende Proben ist die Korrelation zwischen beiden Verfahren gut. Probe Nr. 31 wurde nochmals getestet und zeigte eine Konzentration von 43,8 mg/l, was mehr im Einklang mit dem Ergebnis von der Nephelometrie ist. Für zwischen 75 und 150 mg/l variierende Proben ist die Korrelation ebenfalls gut, bis auf Probe 39, welche immer noch ein Ergebnis niedriger als die Nephelometrie zeigte (67 mg/l). Wie beim Verfahren von Nycomed kann ein Wert höher als 200 mg/l nicht sicher abgegrenzt werden.
Beispiel 4: Bewertung der Reproduzierbarkeit von Ergebnissen unter Verwendung eines Reflexionslesegerätes
4.1 Einführung
Das Lesegerät ist ein Bildverarbeitungslesegerät, das die Quantifizierung des Farbsignals durch Reflexion ermöglicht. Das Lesegerät wird an die Verwendung zum Lesen der durch das CRP-Durchflussverfahren erhaltenen Signale, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, angepasst. Dieses Lesegerät erlaubt die Messung eines bestimmten Bereichs. Dieser Bereich ist nicht auf eine spezielle Form, wie einen Kreis, beschränkt.
Die Vorteile einer derartigen Quantifizierung sind Bewertung der Inter-Chargen-Reproduzierbarkeit, Titration des Konjugats, um das gleiche Signal für die gleiche Konzentration zu erhalten, Beurteilung der Empfindlichkeit, Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit und Standardisierung des Qualitätskontrollverfahrens (quantitative Vorgaben „Akzeptierung/Aussonderung").
4.2 Versuchsbedingungen
Das FT-Verfahren wurde gemäß dem in Beispiel 3 und 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Für jeden Versuch werden die verwendete Membran und Probe angegeben. Die beim Konjugat vorgenommene Verdünnung wird zusätzlich angeführt.
a) Membrancharge Nr. 0064 Probe 48 Konjugat 1:700
Die vierte im Juni hergestellte Membrancharge (Charge 0064) wurde unter Verwendung eines Konjugats mit einer Konzentration von 0,9 mg/l getestet. Eine Serumprobe Nr. 48 mit einer Konzentration von 258 mg/l CRP wurde 1:50 in dem Tris-Verdünnungspuffer, der 5% BSA enthielt, verdünnt und 5-mal auf 5 getrennten Teilen der Membran getestet (Wiederholung 1 (R1) bis Wiederholung 5 (R5)). Das vorstehend beschriebene Verfahren (Versuch 3 und 4) wurde verwendet und das Ablesen wurde 2 min nach Fixierung durchgeführt. Die Reflexion wurde unter Verwendung eines Rotfilters (R), eines Grünfilters (G) und eines Blaufilters (B) gemessen. Die Ergebnisse wurden nach der Messung mit dem Rotfilter ausgewertet, weil der Unterschied in den Intensitäten zwischen den verschiedenen Flecken zwischen 0 und höheren Werten unter Verwendung dieses Filters stärker ausgeprägt ist. Die 5 Wiederholungen lieferten die folgenden Ergebnisse: R1: 60,65 Reflexionseinheiten (RU); R2 59,47 RU; R3 61,30 RU; R4 59,68 RU und R5 63,24 RU. Der Mittelwert der Signale war 60,8 RU mit einer Standardabweichung von 1,5 RU. Der Variationskoeffizient (CV) betrug 2,5%.
b) Membrancharge 0063
Die dritte im Juni hergestellte Charge (0063) wurde unter Bedingungen, wie vorstehend für Charge Nr. 0064 beschrieben, getestet. Die Ergebnisse für die 5 Wiederholungen unter Verwendung des Rotfilters waren: R1 66,72 RU; R2 70,05 RU; R3 68,10 RU; R4 68,54 RU und R5 68,02 RU. Der Mittelwert der Signale war 68,2 RU mit einer Standardabweichung von 1,2 RU. Der Variationskoeffizient betrug 1,8%.
c) Membrancharge 0094 Probe 48 Konjugat 1:700
Die vierte im September hergestellte Charge (0094) wurde unter den für Charge Nr. 0064 beschriebenen Bedingungen getestet. Die Ergebnisse für die 5 Wiederholungen unter Verwendung des Rotfilters waren: R1 73,67 RU; R2 71,14 RU; R3 73,74 RU; R4 78,42 RU und R5 74,35 RU. Der Mittelwert der Signale war 74,3 RU mit einer Standardabweichung von 2,6 RU. Der Variationskoeffizient betrug 3,5%.
d) Membran 0064 Probe 30 Konjugat 1:700
Die vierte im Juni hergestellte Charge (0064) wurde unter den für Charge Nr. 0064 beschriebenen Bedingungen, jedoch mit einer hämolysierten Probe (Nr. 30) mit einer Konzentration von 52,7 mg/l getestet. Eine hämolysierte Probe enthält Reste von Blutzellen, welche die Ablesung der erhaltenen Signale beeinflussen können. Auf diese Weise wurde überprüft, ob verunreinigende Verbindungen die Ablesung dieses Assays beeinflussen. Die Ergebnisse für die 3 Wiederholungen unter Verwendung des Rotfilters waren: R1 76,38 RU; R2 67,60 RU und R3 78,56 RU. Der Mittelwert der Signale war 74,2 RU mit einer Standardabweichung von 5,9 RU. Der Variationskoeffizient (CV) betrug 7,8%. Die Erfinder schlussfolgerten, dass ein höherer CV mit der hämolysierten Probe unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten wurde.
e) Membran 0093 Probe Nr. 30 (hämolysiert) Konjugat 1:700
Die dritte im September hergestellte Charge (0093) wurde unter den für Charge Nr. 0064 beschriebenen Bedingungen, jedoch mit einer hämolysierten Probe (Nr. 30) mit einer Konzentration von 52,7 mg/l getestet. Die Ergebnisse für die 3 Wiederholungen unter Verwendung des Rotfilters waren: R1 83,30 RU; R2 82,34 RU und R3 81,73 RU. Der Mittelwert der Signale war 82,4 RU mit einer Standardabweichung von 0,8 RU. Der Variationskoeffizient betrug 0,9%. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgerten die Erfinder, dass nicht das Verfahren „als solches", sondern die bei diesem Verfahren verwendete Membran die Streuung beeinflusste.
f) Membran 0064 Probe 6 Konjugat 1:700
Die vierte im Juni hergestellte Charge (0064) wurde unter den für Charge Nr. 0064 beschriebenen Bedingungen, aber unter Verwendung einer Probe (Nr. 6) mit einer CRP-Konzentration von 2,0 mg/l getestet. Die Ergebnisse für die 4 Wiederholungen unter Verwendung des Rotfilters waren: R1 129,6 RU; R2 126,6 RU; R3 131,8 RU und R4 126,6 RU. Der Mittelwert der Signale war 128,7 RU mit einer Standardabweichung von 2,5 RU. Der Variationskoeffizient bei diesem Versuch betrug 1,96%.
g) Membran 0081 Probe 6 Konjugat 1:700
Die erste im August hergestellte Charge (0081) wurde unter den für Charge Nr. 0064 beschriebenen Bedingungen mit einer Probe (Nr. 6) mit einer CRP-Konzentration von 2,0 mg/l getestet. In diesem Versuch wurden verschiedene Reagenzienvolumina getestet und ihr Einfluss auf die festgestellten Signale untersucht.
g.1 Verwendete Reagenzienvolumina: 15 μl, 25 μl, 25 μl, 25 μl
Die Signale, die erhalten wurden, waren: R1 122,7 RU und R2 137,1 RU.
g.2 Verwendete Reagenzienvolumina: 15 μl, 15 μl, 15 μl, 15 μl
Die Signale, die erhalten wurden, waren: R3 141,5 RU und R4 150,6 RU.
Die Erfinder stellten einen geringen Unterschied in der Intensität der Färbung, bestätigt durch die Messung der Reflexion, fest.
h) Testen der Standardkurve bei verschiedenen Membranchargen Versuchsbedingungen
Eine Standardkurve mit hoch gereinigtem CRP wurde in dem Tris-Verdünnungspuffer mit 3% BSA hergestellt. Das Durchflussverfahren wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) durchgeführt und die Messung der Reflexion mit dem Rotfilter wurde bei verschiedenen Membranchargen vorgenommen.
Ziel des Versuches:
Die Erfinder stellten eine schlechte visuelle Unterscheidung bei den Membranchargen 00102 und 00107 und eine gute Unterscheidung bei Charge 00103 und 00106 fest. Die Beschichtungstechnik war nach Chargennummer und Herstellung unterschiedlich (Beschichtungsverfahren). Die Chargen 00103 und 00106 wurden auf 0,8 cm breiten Streifen hergestellt; die Chargen 00102 und 00107 wurden auf größeren, 8,5 cm breiten Streifen hergestellt. Gemäß dem Qualitätskontrollverfahren ermöglicht die genaue Messung der Reflexion die Akzeptierung oder Aussonderung der Membranen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Die verwendeten Größen der Membranstreifen sind angegeben. Die Reflexionseinheiten sind für die jeweils verwendete Standardkonzentration dargestellt.
Wegen der mangelnden Unterscheidung in der Farbintensität wurden die Membranchargen Nr. 00102 und 00107 ausgesondert. Die Membranen 001030 und 00106 boten eine gute visuelle Unterscheidung, bestätigt durch die Messung der Reflexion, und durchliefen das Qualitätskontrollverfahren.
i) Testen von Proben bei verschiedenen Membranchargen
Versuchsbedingungen
Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an CRP wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen FT-Verfahren (Versuch 3 und 4) getestet, um zu bestätigen, welche Größe von Membranstreifen zur Erzielung der besten Farbunterscheidung optimal zu verwenden ist.
Folgende Proben wurden verwendet und 1:50 in Tris-Verdünnungspuffer mit 3% BSA verdünnt: Probe Nr. 45 (208 mg/l); Probe Nr. 41 (157 mg/l); Probe Nr. 37 (94 mg/l); Probe Nr. 29 (48 mg/l); Probe Nr. 21 (20 mg/l) und Probe Nr. 9 (15 mg/l).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Die verwendeten Größen der Membranstreifen sind angegeben; die Reflexionseinheiten für die jeweils getestete Konzentration sind für jede getestete Membran aufgeführt.
Die Erfinder schlussfolgerten, dass keine Beziehung zwischen der Größe der Streifen während des Beschichtungsverfahrens und der Qualität der Ergebnisse besteht.
j) Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit zusätzlicher Daten
Vorläufige Versuchsbedingungen
Das FT wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) durchgeführt. 3 Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen an CRP wurden in 4 Wiederholungen getestet. Die Reflexion wurde gemessen und der Variationskoeffizient berechnet.
Folgende Proben wurden verwendet und 1:50 in Tris-Verdünnungspuffer, ergänzt mit 3% BSA, verdünnt: Probe Nr. 41 (157 mg/l); Probe Nr. 29 (47,8 mg/l) und Probe Nr. 15 (9 mg/l).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7a aufgeführt. Die Reflexionseinheiten für die jeweils verwendete Probe sind angegeben. Der Mittelwert der bestimmten Signale, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient für jede Gruppe von Messungen sind dargestellt.
Versuchsbedingungen zusätzlicher Daten
Weiter dazu wurden umfangreiche Tests durchgeführt, um die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit zu untersuchen. Das FT wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) bei unterschiedlichen Chargennummern von Membranen durchgeführt. Verschiedene Proben mit von 1 bis 368 mg/l reichenden Konzentrationen und die Standardkurve (erstellt mit hochgereinigtem BSA) mit einem Standard von 1 bis 200 mg/l wurden in Tris-Puffer, ergänzt mit 3% BSA, verdünnt und in verschiedenen Wiederholungen auf unterschiedlichen Membranen getestet. Die Reflexion wurde gemessen und der Mittelwert, die Standardabweichung und die CV's wurden berechnet. Für jeden Versuch sind die Chargennummern der Reagenzien angegeben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 7b bis 7g dargestellt.
Die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit ist geringer als 5% und kann bis zu 1% betragen.
k) Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit
Vorläufige Versuchsbedingungen
Das FT-Verfahren wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) durchgeführt. Die Standardkurve wurde auf verschiedenen Membranchargen, d. h. Streifen mit unterschiedlichen Daten, getestet, um die Reproduzierbarkeit des Verfahrens (genaue Ergebnisse) unabhängig von den Testbedingungen, wie Umgebungstemperatur, zu prüfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8a dargestellt.
Versuchsbedingungen zusätzlicher Daten
Weiter dazu wurden umfangreiche Tests durchgeführt, um die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit zu untersuchen. Das FT wurde von verschiedenen Anwendern gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) bei unterschiedlichen Chargennummern von Membranen an unterschiedlichen Tagen durchgeführt. Verschiedene Proben mit von 1 bis 368 mg/l reichenden Konzentrationen und die Standardkurve (erstellt mit hochgereinigtem BSA) mit einem Standard von 1 bis 200 mg/l wurden in Tris-Puffer, ergänzt mit 3% BSA, verdünnt und in verschiedenen Wiederholungen auf unterschiedlichen Membranen getestet. Die Reflexion wurde gemessen und der Mittelwert, die Standardabweichung und die CV's wurden berechnet. Für jeden Versuch sind die Chargennummern der Reagenzien angegeben. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8b bis 8f dargestellt. Die Cv's sind geringer als 10% und können bis zu 1% betragen.
l) Bewertung zusätzlicher Daten mit einem anderen präzipitierendem TMB
Ziel 1: Eine andere Bezugsquelle von präzipitierendem TMB (geliefert durch eine andere Firma) wurde getestet, um die mangelnde Unterscheidung bei hohen Werten von CRP, wie in Tabelle 4b dargestellt, zu überwinden.
Zwei verschiedene Lösungen wurden verglichen. Eine Lösung von TMB „A" wurde von Seramun (15754 Dolgenbrodt, Deutschland) bezogen und mit einer Lösung von TMB „B", erhalten von D-TEK (7000 Mons, Belgien), verglichen.
Versuchsbedingungen
Eine Standardkurve wurde in Tris-Verdünnungspuffer hergestellt und das FT-Verfahren unter Verwendung eines Tropfendispensers durchgeführt, wie vorstehend beschrieben (Versuch 3 und 4).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9a dargestellt. Die Reflexionseinheiten sind für die jeweils verwendete Konzentration unter Verwendung der unterschiedlichen TMB-Mittel (TMB „A" und „B") angegeben.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse zeigten, dass TMB „B" eine bessere Unterscheidung im Vergleich zu TMB „A" hervorruft. Eine derartige Erkenntnis bestätigte die Qualitätsschwankung entsprechend der Bezugsquelle.
Ziel 2: Zur Gewährleistung einer guten Reproduzierbarkeit wurde eine neue Charge von TMB mit der vorhergehenden Charge unter der gleichen Versuchsbedingung auf einer Standardkurve verglichen.
Versuchsbedingungen
2 Chargen von TMB wurden bei einer gereinigten Standardkurve, von 5 bis 100 mg/l reichend, getestet und 2 Proben bei Membrancharge 1051.
Die Streuung zwischen 2 Chargen wurde berechnet mit dem Verhältnis:
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9b dargestellt.
Schlussfolgerung
Die neue Charge ergibt mit der vorhergehenden vergleichbare Ergebnisse (1% Streuung zwischen beiden Chargen).
Ziel 3: Zur Gewährleistung einer guten Reproduzierbarkeit wurde eine neue Charge von TMB mit der vorhergehenden Charge unter der gleichen Versuchsbedingung an Proben verglichen.
Das FT wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) bei Membrancharge 1065 (hergestellt im Juni 2001) durchgeführt. 2 Chargen TMB wurden an 2 Proben und dem Verdünnungspuffer allein (Blindwert) in dreifacher Ausführung mit einer anderen Dispensiervorrichtung für jede der Wiederholungen getestet. Die Reflexion wurde gemessen und der Mittelwert, die Standardabweichung und die CV's wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9c dargestellt.
Schlussfolgerung
Die neue Charge ergibt mit der vorhergehenden vergleichbare Ergebnisse innerhalb der Inter-Assay-Variation.
m1) Vorläufige Bestimmung der niedrigsten Konzentration, welche nachgewiesen werden kann.
Eine von 2,5 mg/l bis 360 mg/l reichende Standardkurve wurde in einem Tris-Verdünnungspuffer mit 3% BSA hergestellt. Das FT-Verfahren wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung (Versuch 3 und 4) durchgeführt.
Versuchsbedingung:
Membran 0064, Konjugat Anti-CRP, HRP-markiert mit einer Verdünnung von 1:700, wurde verwendet, was eine Endkonzentration von 0,9 mg/l ergab. 2 kommerzielle TMB wurden verglichen: TMB-A von D-TEK (Belgien) und TMB-B von Seramun (Deutschland). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10a dargestellt. Die für den jeweiligen Standardwert (mg/l) gemessenen Reflexionseinheiten sind angegeben.
Schlussfolgerung:
Bei dieser Charge ist der niedrigste Wert, d. h. verschieden von 0, welcher nachgewiesen werden konnte, 2,5 mg/l. Werte zwischen 180 und 360 mg/l können unterschieden werden.
m2) Zusätzliche Daten in Bezug auf die niedrigste Konzentration, welche nachgewiesen werden kann.
Versuchsbedingungen
Eine von 0 mg/l (Blindwert) bis 10 mg/l reichende Standardkurve wurde in einem Verdünnungspuffer mit 3% BSA hergestellt. Jede Konzentration wurde in 4 Wiederholungen auf einer anderen Membrancharge getestet. Das FT-Verfahren wurde gemäß der vorstehenden Beschreibung durchgeführt. Mittelwert, Standardabweichung und CV wurden berechnet. Eine statistische Analyse (Mittelwert ±1,5 Standardabweichung (SD)) ermittelte den niedrigsten von 0 verschiedenen Wert, welcher nachgewiesen werden kann. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10b und 10c dargestellt.
Schlussfolgerungen
Der niedrigste Wert, welcher mit einem Reflexionslesegerät nachgewiesen werden kann, ist 1 mg/l.
4.3 Allgemeine Schlussfolgerungen
Durch eine genaue Messung des farbigen Flecks ermöglicht das Reflexionslesegerät die Einführung eines Qualitätskontrollverfahrens und geforderter Spezifikationen. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient kann von 1% bis zu 7% betragen, was völlig passabel für einen Schnelltest ist. Unter Verwendung derselben Endverdünnung des Konjugats ist der Intra-Assay-Variationskoeffizient kleiner als 10% für die andere Membrancharge. Durch Titration des Konjugats kann der kleinere Variationskoeffizient erhalten werden. Eine schlechte visuelle Unterscheidung wird immer durch die mit dem Lesegerät erhaltenen Reflexionswerte bestätigt.
Beispiel 5. Nachweis von antimitochondrialen Antikörpern (Typ M2) mit dem FT-Verfahren
5.1 Einführung
M2-Antigen, d. h. Pyruvat-Dehydrogenase, ist ein spezifischer Marker für die Diagnose von primär biliärer Zirrhose (PBC). Der Nachweis von Anti-M2-Antikörpern ist ein spezifisches Hilfsmittel zur Diagnose von PBC aus anderen Lebererkrankungen.
5.2 Versuch A
Membranen des Typs CLN von mdi (Advanced Microdevices) mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm wurden mit hochgereinigtem Dehydrogenase-Komplex (Sigma Ref. P5194) beschichtet und gemäß den unter den Überschriften 2.3 und 2.4 beschriebenen Verfahren blockiert. Menschliche Anti-M2-Antikörper (IgG/IgM) werden durch die Verwendung von Anti-Human-IgG Fab'2, HRP-markiert, (Dako Ref. P406) und Anti-Human-IgM Fab'2, HRP-markiert, (Dako Ref. P322) mit von 0,2 bis 0,3 mg/l reichenden Konzentrationen, gefolgt vom Zusatz von präzipitierendem TMB, deutlich gemacht. Die Proben wurden 1:100 in einem Tris-Verdünnungspuffer mit 5% BSA verdünnt und das FT wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben (Versuch 3 und 4).
Ergebnisse
Eine Beschichtungskonzentration von 0,115 mg/ml, entsprechend einer Enzymaktivität von 0,54 Einheiten/ml, ermöglichte eine gute visuelle Unterscheidung zwischen einem negativen, schwach positiven (+) und positiven Ergebnis (++). Der Hintergrund (nur Verdünnungspuffer) war akzeptabel.
5.2 Versuch B
Membranen des Typs CLN von mdi (Advanced Microdevices) mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm wurden mit hochgereinigtem Dehydrogenase-Komplex in einer Konzentration von 0,24 mg/ml (Sigma Ref. P5194) beschichtet und gemäß dem unter den Überschriften 2.3 und 2.4 beschriebenen Verfahren blockiert.
Menschliche Anti-M2-Antikörper (IgG/IgM) werden durch die Verwendung von Anti-Human-IgG-Fab'2, HRP-markiert, (Dako Ref. P406) und Anti-Human-IgM-Fab'2, HRP-markiert, (Dako Ref. P322) mit einer von 0,2 bis 1,0 mg/l reichenden Konzentration, gefolgt vom Zusatz von präzipitierendem TMB, deutlich gemacht. Die Proben wurden 1:50 (da diese Verdünnung die beste Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen ermöglichte) in einem Tris-Verdünnungspuffer mit 3% BSA verdünnt und das FT wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben (Versuch 3 und 4). Die Ergebnisse wurden durch Vergleich der Intensität der Färbung mit der Intensität der Abgrenzung (Grenze des positiven Bereichs) ausgewertet. Die Reflexion wurde gemessen. Da keine Korrelation zwischen der Schwere der Erkrankung und der Menge von Anti-M2-Antikörpern besteht, ist ein „Ja/Nein", d. h. Vorhandensein oder Fehlen von Anti-M2-Antikörpern, ausreichend und es wird keine quantitative Bestimmung benötigt.
Die untersuchten Proben wiesen ein positives, typisches Cytoplasmaprofil mit dem Immunfluoreszenzverfahren auf. Ein derartiges Immunfluoreszenzverfahren erlaubt jedoch keine Unterscheidung von Anti-M2 von anderen Typen antimitochondrialer Antikörper (Anti-M4, Anti-M5, Anti-M9).
Ziel der Untersuchung

a) Die Ergebnisse des FT wurden mit dem ELISA-Verfahren zum Nachweis von Anti-M2-Antikörpern verglichen. Das ELISA-M2-Verfahren ist ein automatisiertes Verfahren, wobei das Ergebnis innerhalb von 2 h erhalten wird. Die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit wurde ebenfalls untersucht.
b) Die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit (Inter- und Intra-Assay) wurde untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 11a und 11b dargestellt.
Auswertung der Ergebnisse:

ELISA:

positives Ergebnis, wenn die optische Dichte größer als die OD für die Abgrenzungskontrolle ist.

FT:

positives Ergebnis, wenn der RU-Wert höher als der RU-Wert für die Abgrenzungskontrolle ist.

Es besteht eine gute Korrelation (100%) mit dem ELISA-Verfahren. Es wird keine Unstimmigkeit im Hinblick auf positive Ergebnisse im Vergleich zu negativen Ergebnissen festgestellt. Die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit ist geringer als 10%.
Beispiel 6. Nachweis von Rheumafaktoren mit dem FT-Verfahren
6.1 Einführung
Rheumafaktoren sind menschliche Immunglobuline, d. h. vorwiegend zum IgM-Isotyp gehörend, der gegen menschliche oder tierische Immunglobuline gerichtet ist. Der Nachweis von Rheumafaktoren ist sehr nützlich bei der Diagnose von rheumatoider Arthritis.
6.2 Versuch
Membranen des Typs CLN von mdi (Advanced Microdevices) mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm wurden gemäß den unter den Überschriften 2.3 und 2.4 beschriebenen Verfahren mit gereinigten menschlichen Immunglobulinen (Sigma Ref. 068H4858) beschichtet und blockiert. Rheumafaktoren des Typs M wurden durch die Verwendung von Anti-Human-IgM-Fab'2, HRP-markiert, (Dako Ref. P322), mit einer Konzentration von ±1,5 mg/l, gefolgt vom Zusatz von präzipitierendem TMB, deutlich gemacht. Die Proben wurden 1:100 in einem Tris-Verdünnungspuffer mit 5% BSA verdünnt und das FT wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
6.3 Ergebnisse
Bei einer Beschichtungskonzentration von 0,53 mg/ml ist die visuelle Unterscheidung zwischen negativen Proben (< 25 IU/ml) und positivem Ergebnis (± 200 IU/ml) akzeptabel.
Beispiel 7: Nachweis von Salmonella
7.1 Einführung
Der Nachweis einer möglichen bakteriellen Lebensmittelverunreinigung ist das Ziel der Empfehlungen des Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP). Salmonella ist eine der wichtigsten Bakterien, die für Massenlebensmittelvergiftung verantwortlich sind. Klassische Verfahren, wie Kultur, Selektion durch Wachstum auf spezifischem Medium und biochemische Identifizierung, sind arbeits- und zeitaufwendig. Außerdem können verschiedene Bakterien die gleichen biochemischen Eigenschaften teilen, was einen falschen Nachweis bewirken kann. Spezifische Antikörper, die gegen Bakterienantigene gerichtet sind, haben jetzt die Entwicklung von Verfahren zum schnellen Nachweis von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern ermöglicht. Die Verwendung eines derartigen Schnellnachweisverfahrens könnte eine schnellere Identifizierung und einen schnelleren Nachweis ermöglichen. Das Ziel war die Entwicklung eines FT für den Nachweis von Salmonella sp.
7.2. Versuchsbedingungen
Membranen des Typs CLN von mdi (Advanced Microdevices) mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm wurden mit einem durch A-Chromatographie gereinigten monoclonalen Fängerantikörper, spezifisch für Salmonella typhimurium (Biodesign Ref. C65636M) mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml beschichtet. Das Beschichtungs- und Nachbeschichtungsverfahren sind jene in den Abschnitten 2.3 und 2.4 beschriebenen, außer dass die Inkubationszeit bei dem Beschichtungsverfahren 5 h unter leichtem Schütteln bei RT (18–24°C) und 1 oder 2 h bei dem Nachbeschichtungsverfahren betrug.
In der Zwischenzeit wurde eine Referenz von Salmonella typhimurium sp. (American Type Culture Collection, Ref. ATCC 14028, geliefert vom Laboratorium für Mikrobiologie der Universität Gent) auf spezifisches Medium (Nähragar) plattiert und unter aeroben Bedingungen über 24 h bei 37°C inkubiert.
a) Testverfahren zum Nachweis
Bei einem derartigen Verfahren wurde eine größere Testvorrichtung (Testbereich von 1 cm) mit einer größeren Anzahl von Filtern – 8 – (Adsorptionslagen) verwendet. Eine Reinkultur von Salmonella typhimurium wurde in physiologischem Wasser verdünnt. 200 μl einer derartigen Suspension wurden auf die Membran gebracht und eindringen gelassen. Das Vorhandensein von Salmonella wurde mit 200 μl eines zweiten HRP-markierten Antikörpers (Kaninchen-Anti-Salmonella, mit Peroxidase konjugiert, polyvalent für „O"- und „H"-Antigene von Salmonella (Konzentration 4 μg/ml, Biodesign Ref. B65704R), gefolgt vom Zusatz von 200 μl präzipitierendem TMB, aufgedeckt. Die Färbung wurde mit 200 μl Fixierungslösung gestoppt. Es gab einen klaren blauen Fleck, der das Vorhandensein von Salmonella typhimurium anzeigte.
b) Mögliche quantitative Bestimmung
Um eine mögliche quantitative Bestimmung zu prüfen, wurde eine von 5,3 × 10⁷ bis 7,0 × 10¹ reichende Standardkurve von Salmonella typhimurium in hypotoner Lösung hergestellt und mit dem FT getestet. Die unterschiedlichen Verdünnungen wurden zur quantitativen Bestimmung berechnet. Für die Durchführung des FT-Verfahrens wurde eine größere Testvorrichtung verwendet, d. h. Testbereich von 1 cm mit einer größeren Anzahl von Filtern – 8 – (Adsorptionslagen). 500 μl der jeweiligen Verdünnungen wurden auf die Membran gebracht und eindringen gelassen. 2 Arbeitsweisen zur Probenverteilung wurden verwendet, 2 × 250 μl Probe, d. h. ein erstes Eindringen von 250 μl, gefolgt von einer zweiten Schicht von 250 μl Probe, und eine Spülung von 500 μl Probe auf einmal.
Das Vorhandensein von Salmonella wurde mit 500 μl eines zweiten HRP-markierten Antikörpers (Kaninchen-Anti-Salmonella, mit Peroxidase konjugiert, polyvalent für „O"- und „H"-Antigene von Salmonella (Konzentration 4 μg/ml, Biodesign Ref. B65704R), gefolgt vom Zusatz von 200 μl präzipitierendem TMB, aufgedeckt. Die Färbung wurde mit 500 μl Fixierungslösung gestoppt. Die Reflexion wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt.
Es gibt eine Abnahme der Intensität der blauen Färbung, gemessen durch Reflexionseinheiten gemäß der Bakterienkonzentration, was bedeutet, dass die quantitative Bestimmung möglich ist. Eine Spülung von 500 μl Probe auf einmal führte zu einem stärker gefärbten Fleck.
Beispiel 8: Verwendung einer Nylonmembran zum Nachweis von CRP-Protein
Nylon ist ein lineares synthetisches Polyamid, das am Ende entweder primäre Aminendgruppen (positiv geladen) oder Carboxylatendgruppen (negativ geladen) aufweist. Da die Nylonmembranen eine andere Oberflächenchemie als Nitrocellulose (welches neutral ist) aufweisen, sind die Bindungseigenschaften anders.
Versuchsbedingungen
Zur Untersuchung der Bindungskapazitäten von Nylon wurden Membranen von der Firma CUNO gemäß dem in Abschnitt 2.3 beschriebenen Verfahren, mit 10 mmol oder 25 mmol Tris-Puffer beschichtet. Unterschiedliche Blockierungsverfahren wurden getestet, entweder mit BSA (Bedingung A) oder mit Polymerlösungen, wie Polyvinylalkohol (max. 0,1%) oder Polyvinylpyrrolidon (max. 1%), kombiniert mit Magermilchpulverproteinen, (Bedingung B). Nylon des Typs C der Firma Cuno mit 0,45 μm Durchmesser mit dem niedrigsten Verhältnis von Amin- zu Carboxylatendgruppen, was eine schwach positive Ladung ergibt, wurde verwendet. Proben wurden gemäß dem in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Verfahren getestet.
Ergebnisse
Durch die Verwendung von BSA als Blockierungsmittel (Bedingung) wurde ein farbiger Fleck bei den positiven Proben festgestellt, es wurde jedoch ein erheblicher Hintergrund bei der negativen Probe beobachtet. Die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen war schlecht. Mit Polymerlösungen und mit Magermilchpulverprotein blockierte Membranen lieferten schlechte Ergebnisse (gesprenkelter Fleck). Die erste Eindringzeit war zu schnell und ein Diffusionphänomen wurde beobachtet.
Da verschiedene Bindungsvorgänge bei der Bindung auf der Nylonmembran einbezogen sind, kann eine neue Optimierung der Reagenzien vorgenommen werden, wenn derartige Membranen verwendet werden. Dennoch gilt das generelle Konzept, wie in der vorliegenden Erfindung dargestellt.
Beispiel 9: Einfluss der Molarität in Tris und des pH-Wertes
Der Einfluss der Zusammensetzung (Molarität) und des pH-Wertes des verwendeten Verdünnungspuffers wurden untersucht.
Die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers variierte gemäß den Bedingungen A, B und C (siehe unten).
Versuchsbedingungen und Verfahren
Die Proben wurden 1:50 in dem Verdünnungsmittel A, B und C verdünnt und gemäß Beispiel 3 und 4 weiter getestet.
Zusammensetzung des Verdünnungsmittels (für 1 l):
Bedingung A

Charge 1111 A und 1112: 0,12 g Tris

0,88 g NaCl ⇒ pH 7,36

30 g BSA
Dieser Puffer ist an eine „Vollblutprobe" angepasst und ermöglicht eine vollständige Hämolyse der roten Blutkörperchen aufgrund der geringen Konzentration von NaCl, was hypotone Bedingungen, die zu Hämolyse führen, erzeugt. Der pH-Wert ist neutral. Bedingung B

Charge 1051: 1,2 g Tris

8,8 g NaCl ⇒ pH 9,6

30 g BSA
Dieser Puffer ist für Serumproben angepasst, ermöglicht aber keine vollständige Hämolyse der roten Blutkörperchen, wenn Vollblut getestet wird. Der pH-Wert ist basisch. Bedingung C

Charge 1113: 1,2 g Tris

0,88 g NaCl ⇒ pH 10,5

30 g BSA
Dieser Puffer bewirkt Hämolyse der roten Blutkörperchen, aber mit einem basischen pH-Wert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt.

Es gibt keinen statistischen Unterschied in den Ergebnissen gemäß Pufferzusammensetzung. Jedoch erhöht ein basischer pH-Wert die Durchflussgeschwindigkeit durch die Membran. Zusammensetzung C wurde ausgewählt. Reagenzien

A	Membran: 1062	B	Membran: 1062
	Konjugat: 1083		Konjugat: 1051
	Verdünnungsmittel: 1111 und 1112		Verdünnungsmittel: 1051
	TMB: 1021		TMB: 1021
	Fixierungsmittel: 1081		Fixierungsmittel: 1081

C	Membran:
	Konjugat: 1083
	Verdünnungsmittel: 1113
	TMB: 1021
	Fixierungsmittel: 1081

Beispiel 10: Vergleich mit einem anderen Schnellverfahren zum Nachweis von CRP
Einführung
Das CRP-FT-Kit von wurde gegen das Schnellverfahren zum Nachweis von CRP durch Immunturbidimetrie von der Firma ORION bewertet. Der Endanwender war der Notdienst eines Krankenhauses. Die Proben stammten von Patienten, die Anzeichen von Virusinfektionen oder bakteriellen Infektionen zeigten. Bei einer erheblichen Konzentration an CRP (> 50 mg/l) wurde der Patient mit Antibiotika behandelt. Das Verfahren von ORION ist ein schnelles quantitatives Verfahren auf Basis der Immunturbidimetrie, welches aber ein Lesegerät zur Auswertung der Ergebnisse erfordert. Ein derartiges Verfahren erlaubt nicht die visuelle Auswertung eines Ergebnisses.
Ziel der Untersuchung
47 Proben, die von negativ in der CRP-Konzentration bis stark positiv reichten, wurden gemäß Anleitung des Kits von Orion getestet.
Anzahl der getesteten positiven Proben: 17 (36% der Gesamtzahl der Proben)
Anzahl der getesteten negativen Proben: 30 (64% der Gesamtzahl der Proben)
Das FT-Verfahren von BIO ART wurde gemäß dem in Abschnitt 3 beschriebenen Versuch durchgeführt.
Auswertung der Ergebnisse
Die Ergebnisse wurden quantitativ mit Orion (Messung der Konzentration) und halbquantitativ mit BIO ART (Vergleich der blauen Färbung mit einer Referenzfarbskala mit den folgenden Konzentrationen: 10, 25, 75 und 200 mg/l) ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14a–14e dargestellt. Es besteht eine gute Korrelation bei den negativen Proben (Tabelle 14a). Die Übereinstimmung beträgt 90% (27 von 30 Proben korrelieren gut). 3 Proben (12, 15, 3) werden als schwach positiv mit BIO ART und negativ mit Orion bewertet. Da für diese 3 Proben keine klinischen Daten verfügbar waren, konnte keine endgültige Schlussfolgerung hinsichtlich der Möglichkeit von entweder falschen positiven Ergebnissen bei BIO ART oder falschen negativen Ergebnissen bei Orion gezogen werden. Bei den schwach positiven Proben (Tabelle 14b) besteht eine Korrelation von 92% zwischen beiden Verfahren (11 von 12 Proben). Eine Probe (31) weist eine Konzentration von 25–50 mg/l mit dem Verfahren von BIO ART und 25 mg/l mit Orion auf. Solch ein Unterschied führt jedoch nicht zu einer falschen Klassifizierung oder Fehldiagnose. Die vier positiven Proben (Tabelle 14c) werden ebenso entweder mit BIO ART oder mit Orion eingestuft. Nur eine stark positive Probe (Nr. 37, siehe Tabelle 14d) wurde getestet und hat eine Konzentration von 200 mg/l mit BIO ART und 112 mg/l mit Orion. Der Abgrenzungswert betrug 8 mg/l bei Orion und 10 mg/l bei BIO ART, was bedeutet, dass Proben mit einer Konzentration geringer als 8 oder 10 mg/l normale Spiegel von CRP aufweisen.
Schlussfolgerung
1. Korrelation bei den positiven Proben
Es gibt kein falsches negatives Ergebnis mit dem Verfahren von BIO ART (alle Proben, welche mit Orion positiv sind, wurden mit dem Verfahren von BIO ART als positiv festgestellt). Die Korrelation bei positiven Proben ist somit 100%. Außerdem werden 16 Proben bei 17 (außer Nr. 31) in denselben Konzentrationsbereich eingestuft.
2. Korrelation bei negativen Proben (siehe Tabelle 4a)
3 Proben (Nr. 12, 15, 3) sind schwach positiv mit BIO ART und negativ mit Orion. Bei Fehlen von klinischen Daten oder einem zusätzlichen dritten Verfahren kann keine Schlussfolgerung hinsichtlich der Möglichkeit von entweder falschen positiven Ergebnissen (Verfahren von BIO ART) oder einem falschen negativen Ergebnis (Orion) gezogen werden. Außerdem führen diese 3 schwach positiven Ergebnisse von BIO ART nicht zu einer Fehldiagnose.
3. Allgemeine Schlussfolgerung
Eine derartige Untersuchung zeigte, dass die visuelle Auswertung der Ergebnisse mit dem FT-Verfahren von BIO ART für die Auswertung stichhaltig ist. Das FT von BIO ART besitzt die gleichen technischen Leistungen wie das andere Schnellverfahren. Es wurde jedoch, weiter zu dieser Untersuchung, entschieden, einen zusätzlichen Standard von 1 mg/l aufzunehmen, um die visuelle Unterscheidung zwischen 0 und 10 mg/l zu verbessern.
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Tabellen

Tabelle 1: Wichtigste organspezifische und nicht organspezifische Antikörper, die bei Autoimmunerkrankungen vorhanden sind

Allgemeine Klassifizierung
Organspezifische Antikörper	Nicht organspezifische Antikörper
gegen Parietalzellen (z. B. perniziöse Anämie)	gegen glatte Muskulatur (z. B. chronisch aktive Hepatitis CAH Typ 1)
gegen Schilddrüsen-Mikrosomen (z. B. Hashimoto-Thyreoiditis, Gravesche Thyreotoxikose)	gegen Leber-Nieren-Mikrosomen (z. B. chronisch aktive Hepatitis CAH Typ 2)
gegen Thyreoglobuline (z. B. Hashimoto-Thyreoiditis, Gravesche Thyreotoxikose)	gegen Mitochondrien (z. B. primär biliäre Zirrhose)
gegen die Langerhans-Inseln (z. B. Diabetes)	gegen Retikulin (z. B. Zöliakie)
gegen die Haut (z. B. Pemphigoid)	gegen Endomysium (z. B. Zöliakie)
gegen quergestreifte Muskulatur (z. B. Myastenia gravis)	gegen Zellkern (z. B. systemische Autoimmunerkrankungen: SLA, Sjögren-Syndrom, Sklerodermie, Dermatomyositis, Polymyositis ...)

Tabelle 2: Autoimmunerkrankungen, ausgelöst durch nicht organspezifische Autoantigene

Erkrankungen	Autoantigen
systemischer Lupus erythematodes	dsDNA, ssDNA, RNP, Sm, Cardiolipin, (SSA) (SSB)
arzneimittelinduzierter Lupus erythematodes	Histone
Sklerodermie	Nukleolus, Scl 70
Crest-Syndrom	Zentromer
andere rheumatische Erkrankungen	ssDNA und/oder dsDNA
Polymyositis	Jo-1
Polymyositis + Sklerodermie	Pm-Scl
rheumatoide Arthritis	Immunglobuline (IgG)
gemischte Bindegewebserkrankungen	RNP
Sjögren-Syndrom	SSA/SSB

Tabelle 3: Autoimmunerkrankungen, ausgelöst durch organspezifische Autoantigene

Erkrankung	nicht organspezifische Autoantigene
Addison-Krankheit	Nebennierencellcytoplasma
hämolytische Autoimmunanämie	Erythrocyten
chronisch aktive Hepatitis	Zelloberflächenlipoproteine, glatte Muskulatur, nukleäre Laminine
Zöliakie	Endomysium
Goodpasture-Syndrom	Basalmembran (Glomerulus und Lunge)
Gravesche Thyreotoxikose	TSH-Rezeptor
Hashimoto-Thyreoiditis	Thyreoglobulin
Morbus Werlhof	Thrombozyten
Diabetes Typ I	Inselzellcytoplasma und -oberfläche
Diabetes Typ II	Insulinrezeptor
linseninduzierte Uveitis	Linse
männliche Unfruchtbarkeit (manche)	Spermien
multiple Sklerose	Gehirn
Myastenia gravis	Skelett- und Herzmuskulatur
Pemphigoid	Basalmembran (Haut)
perniziöse Anämie	Parietalzelle, Gastrinrezeptor, Intrinsic-Faktor
primär biliäre Zirrhose	Mitochondrien, Pyruvat-Dehydrogenase
primäres Myxödem	Schilddrüse
sympathische Ophthalmie	Uvea
Colitis ulcerosa	Kolonlipopolysaccharid
Vaskulitiden	pANCA
Wegener-Granulomatose	cANCA

Tabelle 4: Bewertung des Durchflussverfahrens, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, und anderer vorhandener Verfahren der Nephelometrie und von Nycomed Tabelle 4a: Halbquantitatives Verfahren

Rangfolge	Bezeichnung	Nephelometrie	BIO ART FT	NYCOMED	Int.
		[mg/l]	[mg/l]	[mg/l]
1	114467	0.4	< 11 < 11*	< 10	Neg.
2	114083	0.6	< 11 < 11*	< 10	Neg.
3	114196	1.2	< 11 < 11*	< 10	Neg.
4	114187	1.7	< 11 < 11*	< 10	Neg.
5	114169	1.9	< 11 < 11*	< 10	Neg.
6	114058	2.0	< 11 < 11*	< 10	Neg.
7	114188	2.1	< 11 < 11*	< 10	Neg.
8	114035	2.5	< 11 < 11*	< 10	Neg.
9	114125	2.5	< 11 < 11*	< 10	Neg.
10	114086	3.2	< 11 < 11*	< 10	Neg.
11	114206	4.8	< 11 < 11*	= 10	Neg/D.
12	114201	5.3	< 11 < 11*	< 10	Neg.
13	114181	6.2	< 11 < 11*	= 10	Neg/D.
14	114197	8.9	< 11 < 11*	leicht > 10	Neg/D.
15	114057	9.3	+/–20 +/–15*	leicht > 10	D./D.
16	114011	10.7	leicht > 11 = 11*	dunkler > 10 +/– 20	D./Pos.
17	114085	11.9	leicht > 11 < 11*	dunkler > 10 +/– 20	D./Pos.
18	114118	13.0	= 11 = 11*	25	Pos. +
19	114192	14.2	> 11 aber < 27.5 > 11 aber < 27.5*	25	Pos. +
20	114190	17.8	> 11 aber < 27.5 > 11 aber < 27.5*	25	Pos. +
21	114084	20.2	+/–20 [11–27.5]*	leicht > 25 +/– 30	Pos. +
22	114065	24.7	27.5 [11–27.6]*	25–50	Pos. +
23	114015	28.2	27.5 27.5*	25–50	Pos. ++
24	114061	31.7	27.5/ 27.5*	50	Pos. ++
25	115066	34.9	+/–69 [50–100] [27.5–69]*	50	Pos. ++
26	115165	38.5	+/–69 [50–100] +/–40*	50	Pos. ++
27	114066	43.0	+/–69 [50–100] +/–50	dunkler > 50 aber < 100	Pos. ++
28	115168	45.4	+/–69 [50–100] +/–50	dunkler > 50 aber < 100	Pos. ++
29	114081	47.7	+/–50 +/–50	+/–80	Pos. ++
30	115019	52.7	[27.5–69] +/–50	leicht 100 +/– 90	Pos. ++(+)
31	144039	54.7	< 69 [50–100] < 69*	+/–90	Pos. ++(+)
32	114177	60.5	< 69 [50–100] +/–69*	+/–100	Pos. ++(+)
33	115083	61.9	< 69 [50–100] < 69*	100	Pos. ++(+)
34*	114016	67.6	+/–27.5/ +/–27.5*	100	Pos. ++(+)
35**	115026	75.1	leicht > 91 [100–150] leicht < 69*	leicht > 100	Pos. ++(+)
36	114068	84.0	leicht > 91 [100–150] = 91*	100	Pos. ++(+)
37**	114179	94.0	= 69 = 91*	leicht > 100	Pos. +++
38	115079	109.0	= 91 = 91*	> 100	Pos. +++
39	115022	122.0	= 91 = 91*	> 100	Pos. +++
40	114073	133.0	[91–137] = 137*	dunkler > 100 +/–160	Pos. +++
41	114076	157.0	[91–137] = 137*	200	Pos. ++++
42	115034	166.0	+/–137 +/–137*	200	Pos. ++++
43*	114185	181.0	[91–137] [91–137]*	200	Pos. ++++
44**	115042	203.0	= 91 (heterog. Fleck) = 137*	200	Pos. ++++
45	114181	208.0	> 137.5 > 137.5*	200	Pos. ++++
46	114019	218.0	leicht < 275 [138–275]	> 200 ges.	Pos. ++++
47	115016	231.0	+/–150 +/–150*	> 200 ges.	Pos. ++++
48	114087	258.0	+/–150 +/–150*	> 200 ges.	Pos. ++++
49	115064	312.0	+/–275 +/–275*	> 200 ges.	Pos. ++++
50	115084	368.0	+/–275 +/–275*	> 200 ges.	Pos. ++++

Tabelle 4b: Durchführbarkeitsuntersuchung eines quantitativen Verfahrens 4.b.1. Standardkurve

Standards mg/l	Reflexion Rotfilter BIO ART	Reflexion Rotfilter Nycomed
275	77.2	69.9
120	84.3	92.3
60	95.4	112.5
40	101.2	131.4
20	137.0	152.1
10	153.6	161.5

4.b.2. Proben

Probe	Nephelometrie mg/l angezeigte Konz.	Reflexion Rotfilter BIO ART	Konz. mg/l	Reflexion Rotfilter Nycomed	Konz. mg/l
1	0.4	168.4	< 10	190.4	< 10
2	0.6	169.1	< 10	192.4	< 10
3	1.2	161.3	< 10	np
4	1.7	171.9	< 10	190.5	< 10
5	1.9	171.3	< 10	np
6	2.0	175.4	< 10	189.1	< 10
7	2.1	158.3	< 10	np
8	2.5	164.2	< 10	190.2	< 10
9	2.5	150.1	< 5	np
10	3.2	157.4	< 10	190.5	< 10
11	4.8	184.8	< 10	np
12	5.3	162.0	< 10	188.7	< 10
13	6.2	173.8	< 10	np
14	8.9	155.9	< 5	174.0	< 10
15	9.3	153.8	9	np
16	10.7	155.2	< 5	170.1	10
17	11.9	151.2	11	np
18	13.0	148.0	12	164.7	11
19	14.2	130.2	20	np
20	17.8	140.7	15	154.3	16
21	20.2	132.9	19	np
22	24.7	127.6	23	146.2	24
23	28.2	109.6	32	np
24	31.7	123.6	24	140.5	28
25	34.9	110.6	33	np
26	38.5	114.9	30	131.4	36
27	43.0	106.8	38	np
28	45.4	99.7	40	121.9	52
29	47.7	94.7	50	np
30	52.7	104.1	37	117.1	56
31	54.7	142.6	15?	119.9	50
32	60.5	98.2	60	114.1	64
33	61.9	101.4	52	111.2	70
34	67.6	100.8	56	113.1	68
35	75.1	98.9	60	110.2	72
36	84.0	102.3	52	103.0	92
37	94.0	94.9	78	100.4	100
36	109.0	94.6	78	87.4	160
39	122.0	97.6	64?	88.5	150
40	133.0	83.9	140	81.8	190
41	157.0	84.9	135	80.9	200
42	166.0	85.5	120	83.8	175
43	181.0	84.4	136	75.0	240
44	203.0	101.9	52?	74.0	260
45	208.0	83.1	150?	72.6	250
46	218.0	101.6	52?	68.8	300
47	231.0	99.1	54?	68.9	300
48	258.0	106.4	58?	71.6	280
49	312.0	91.3	91?	70.9	280
50	368.0	88.6	100?	60.5	400

Tabelle 4c: Durchführbarkeit eines quantitativen Verfahrens Standardkurve mit BIO ART:

Standard	RU
mg/l
0	189
1	183
10	151
25	132
75	108
200	74

Kurve:

y = –0,8465x + 3,0706
R² = 0,991

Standardkurve mit Nycomed:

Standard RU

mg/l

0 170

10 162

40 131

60 113

120 92

275 70
Kurve:

y = –1,2818x + 5,4987
R² = 0,995

Probe	Nephelometrie Angezeigte Konz. mg/l	BIO ART RU	BIO ART Konz. mg/l	NYCOMED RU	NYCOMED Konz. mg/l
0–5 mg/l
1	0,4	176	2,6	190	< 10
2	0,6	176	2,6	192	< 10
3	1,2	178	2,1	np
4	1,7	169	4,6	190	< 10
5	1,9	164	6,3*	np
6	2,0	173	3,2	189	< 10
7	2,1	176	2,6	np
8	2,5	180	1,6	190	< 10
9	2,5	168	5,6*	np
10	3,2	170	4,3	191	< 10
11	4,8	156	9,5*	np
5,1–10 mg/l
12	5,3	152	11,4	187	< 10
13	6,2	147	14,0	np
14	8,9	155	9,5	174	< 10
15	9,3	156	8,6	np
0,1–25 mg/l
16	10,7	148	13,4	170	10
17	11,9	141	17,7	np
18	13,0	141	17,7	165	6,3
19	14,2	151	11,9	np
20	17,8	133	23,6	154	17
21	20,2	133	23,6	np
22	24,7	148	13,4	146	24,8
25,1–75 mg/l
23	28,2	132	24,5	np
24	31,7	127	29,1	140	31,0
25	34,9	127	29,1	np
26	38,5	112	48,6	131	41,3

27	43,0	131	25,3	np
28	45,4	123	33,4	122	53,3
29	47,7	124	32,3	np
30	52,7	112	48,6	117	60,9
31	54,7	115	43,8	np
32	60,5	117	40,9	120	58,2
33	61,9	112	48,6	np
34	67,6	106	59,9	113	67,6
75,1–200 mg/l
35	75,1	111	50,3	110	73,1
36	84	104	64,3	103	87,8
37	94	107	57,8	100	95,1
38	109	98	80,1	87	137,3
39**	122	103	66,6	89	129,3
40	133	112	48,6	82	161,0
41	157	85	136,2	81	166,5
42	166	81	164,3	84	150,8
43	181	77	201,9	75	207,2

Assayprotokoll

Assayprotokoll

Assayprotokoll

Tabelle 5: Bewertung verschiedener Membranchargen

Standard Konzentration mg/l	Membrancharge 00102	Membrancharge 00103	Membrancharge 00106	Membrancharge 00107
Abmessungen	8.5 cm × 17 cm	0.8 cm × 17 cm	0.8 cm × 17.5 cm	8.5 cm × 17 cm
275	65.2	67.5	62.9	88.6
137.5	65.4	75.8	76.3	76.6
91	83.7	78.7	88.1	90.9
69	88.6	84.8	90.6	86.9
27.5	122.4	113.5	116.5	120.7
11	119.9	136.7	144.0	113.6

Tabelle 6: Prüfung verschiedener Membranchargen

Konzentration mg/l	Membrancharge 0092	Membrancharge 0093	Membrancharge 0094	Membrancharge 00102	Membrancharge 00104
Streifen	8.5 cm × 17.5 cm	8.5 cm × 17.5 cm	8.5 cm × 17.5 cm	8.5 cm × 17.5 cm	8.5 cm × 17.5 cm
208	78.7	80.7	81.0	78.1	73.1
157	77.8	93.7	80.0	83.6	82.7
94	79.5	100.3	98.8	98.9	87.1
48	108.1	107.7	107.8	93.5	109.1
20	126.8	131.5	138.2	104.4/121.7	132.6
15	np	146.7	147.6	117.7	137.3
QC	QC abgelehnt	QC bestanden	QC bestanden	QC abgelehnt	QC bestanden

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7a

CRP-Konzentration mg/l	Reflexion Charge 00106	Reflexion Charge 0064	Reflexion Charge 00111	Reflexion Charge 00112
157	86.9	80.7	92.2	72.6
	93.9	82.8	79.2	91.2
	100.9	81.5	81.7	84.1
	109.4	80.4	89.4	84.6
Mittelwert	100.3	81.3	85.6	83.1
Standardabweichung	6.7	1.2	6.15	7.7
Variationskoeffizient	6.6%	1.5%	7.2%	9.3%

47.8	108.5	103.6	93.3	101.5
	122.2	104.3	101.4	98.8
	131.4	101.1	106.8	100.6
	120.9	101.0	109.4	97.1
Mittelwert	120.8	102.2	102.7	99.5
Standardabweichung	9.4	2.0	7.1	2.0
Variationskoeffizient	7.7%	1.9%	6.9%	2.0%

9	168.2	153.2	133.6	144.9
	156.5	154.4	139.4	152.3
	171.0	155.1	139.1	140.8
	168.5	154.5	136.4	145.7
Mittelwert	166.0	154.3	137.1	144.7
Standardabweichung	6.5	0.8	2.7	5.4
Variationskoeffizient	3.9%	0.5%	2.0%	3.7%

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7b

Reagenzien (Chargen-Nr.)
Membran	1062
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1111 A
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
03 (1 mg/l)	175	10 (3 mg/l)	158
	166		163
	167		167
	175		162
Mittelwert	170	Mittelwert	162
SD	4,9	SD	4
%CV	2,8	%CV	2,5
15 (9 mg/l)	152	21 (20 mg/l)	142
	155		128
	158		134
	165		137
Mittelwert	157	Mittelwert	134
SD	5,2	SD	5,5
%CV	3,3	%CV	4,1
29 (48 mg/l)	123	36 (84 mg/l)	101
	111		103
	128		102
	115		101
Mittelwert	118	Mittelwert	101
SD	6,7	SD	0,9
%CV	5,7	%CV	1,0
38 (109 mg/l)	100	59 (368 mg/l)	80
	95		79
	90		81
	96		77
Mittelwert	94	Mittelwert	79
SD	3,7	SD	2,1
%CV	3,9	%CV	2,7

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7c

Reagenzien (Chargen-Nr.)
Membran	1063
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
02 (0.6 mg/l)	178	17 (12 mg/l)	134
	180		147
	169		146
	168		144
	170		152
	176		146
Mittelwert	174		145
SD	5,2		5,9
%CV	2,9		4,1
22 (24,7 mg/l)	118	35 (75 mg/l)	103
	122		99
	120		105
	113		103
	125		100
	126		98
	121	Mittelwert	102
	4,6	SD	2,7
	3,8	%CV	2,6
44 (203 mg/l)	77
	81
	73
	72
	75
	70
Mittelwert	75
SD	3,9
%CV	5,3

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7d

Reagenzien
Membran	1062
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
02 (0,6 mg/l)	178	17 (12 mg/l)	134
	180		147
	169		148
	168		144
	170		152
	176		148
Mittelwert	174	Mittelwert	145
SD	5,2	SD	5,9
%CV	2,9	%CV	4,1
22 (24,7 mg/l)	118	35 (75 mg/l)	103
	122		99
	120		105
	113		103
	125		100
	126		98
Mittelwert	121	Mittelwert	102
SD	4,6	SD	2,7
%CV	3,8	%CV	2,6
44 (203 mg/l)	77
	81
	73
	72
	75
	70
Mittelwert	75
SD	3,9
%CV	5,3

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7e

Reagenzien
Membran	1061 b
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
02 (0,6 mg/l)	169	17 (12 mg/l)	127
	167		132
	168		140
	165		139
	169		127
	170		140
Mittelwert	168		134
SD	2,1		6,8
%CV	1,2		4,7
22 (32 mg/l)	111	35 (75 mg/l)	99
	110		95
	112		98
	113		100
	112		98
	111		100
Mittelwert	111	Mittelwert	98
SD	0,8	SD	1,9
%CV	0,7	%CV	1,9
44 (203 mg/l)	84
	80
	80
	85
	88
	81
Mittelwert	83
SD	3,2
%CV	3,9

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7f

Reagenzien
Membran	1066
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
02 (0,6 mg/l)	176	17 (12 mg/l)	139
	166		132
	164		138
	163		130
Mittelwert	167	Mittelwert	135
SD	6,0	SD	4,4
%CV	3,6	%CV	3,3
21 (20 mg/l)	119	36 (84 mg/l)	93
	119		101
	114		96
	114		96
Mittelwert	118	Mittelwert	96
SD	2,9	SD	3,3
%CV	2,5	%CV	3,4
50 (388 mg/l)	75
	77
	83
	86
Mittelwert	80
SD	5,1
%CV	6,3

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7g

Reagenzien
Membran	1071
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
02 (0,6 mg/l)	171	17 (12 mg/l)	125
	174		139
	178		132
	167		132
Mittelwert	172	Mittelwert	132
SD	4,7	SD	5,7
%CV	2,7	%CV	4,3
21 (20 mg/l)	111	36 (84 mg/l)	85
	117		100
	106		79
	107		69
Mittelwert	110	Mittelwert	88
SD	5,0	SD	8,8
%CV	4,5	%CV	10,0
50 (368 mg/l)	67
	73
	63
	67
Mittelwert	68
SD	4,1
%CV	6,1

Tabelle 7: Bewertung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 7h

Reagenzien
Membran	1062
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1113
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Probe	RU
03 (1,2 m/l)	182	10 (3,2 mg/l)	165
	182		164
	177		172
	178		165
Mittelwert	180		167
SD	2,6		3,7
%CV	1,5		2,2
21 (20 mg/l)	123	29 (48 mg/l)	110
	136		103
	143		108
	130		97
Mittelwert	132	Mittelwert	104,5
SD	9,7	SD	5,8
%CV	7,4	%CV	5,5
36 (84 mg/l)	89	38 (109 mg/l)	89
	95		93
	94		81
	101		82
Mittelwert	95	Mittelwert	86
SD	4,9	SD	5,7
%CV	5,2	%CV	6,7

Tabelle 8: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit Tabelle 8a:

Standard Konz. mg/l							Mittelwert	SD	CV%
Charge	00106	00106	00111	00112	00114	00111
275	62.9	58.4	68.7	68.2	76.4	70.1	67.3	5.9	8.7
137.5	76.3	75.7	73.0	78.2	82.6	77.8	77.3	3.2	4.1
91	88.1	78.8	85.8	89.2	84.8	80.0	84.4	4.2	5.0
69	90.6	89.6	99.5	95.1	93.6	86.6	92.5	4.6	4.9
27.5	116.5	102.4	115.3	108.6	112.9	102.4	109.7	6.2	5.7
11	114.1	123.2	137.1	130.9	134.9	122.9	127.2	8.7	6.8

Tabelle 8b: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien
Membran	1062
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081 u. 1111A
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Standard	RU
02 (0,6 mg/l)	174	1 mg/l	173
	178		172
	174		172
	176		182
Mittelwert	176	Mittelwert	175
SD	2	SD	4,9
%CV	1,1	%CV	2,8

17 (12 mg/l)	137	10 mg/l	147
	150		154
	147		141
	141		150
Mittelwert	144	Mittelwert	148
SD	5,8	SD	5,5
%CV	4,1	%CV	3,7

22 (24,7 mg/l)	118	25 mg/l	125
	113		135
	120		121
			131
Mittelwert	117	Mittelwert	128
SD	3,6	SD	6,2
%CV	3,1	%CV	4,9

35 (75 mg/l)	106	75 mg/l	104
	104		103
	101		97
	111		108
Mittelwert	106	Mittelwert	103
SD	4,2	SD	4,5
%CV	4,0	%CV	4,4

44 (203 mg/l)	76	200 mg/l	89
	78		90
	74		74
	85		73
Mittelwert	78	Mittelwert	82
SD	4,8	SD	9,2
%CV	6,2	%CV	11,3
		Blindwert	180
			181
			181
			181
		Mittelwert	181
		SD	0,5
		%CV	0,3

Assayprotokoll

Tabelle 8c: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien
Membran	1063
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081 u. 1111A
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Standard	RU
02 (0,6 mg/l)	169	1 mg/l	176
	170		170
	173		169
	173		174
Mittelwert	171	Mittelwert	173
SD	2,1	SD	3,3
%CV	1,2	%CV	1,9

17 (12 mg/l)	132	10 mg/l	141
	143		135
	141		153
	Np		141
Mittelwert	139	Mittelwert	143
SD	5,9	SD	7,5
%CV	4,2	%CV	5,3

22 (24,7 mg/l)	113	25 mg/l	137
	122		121
	122		115
	118		124
Mittelwert	119	Mittelwert	124
SD	4,3	SD	9,3
%CV	3,6	%CV	7,5

35 (75 mg/l)	94	75 mg/l	110
	111		100
	101		98
	91		104
Mittelwert	99	Mittelwert	103
SD	8,9	SD	6,3
%CV	8,9	%CV	5,1

44 (203 mg/l)	75	200 mg/l	91
	96		87
	83		80
	82		79
Mittelwert	84	Mittelwert	84
SD	8,8	SD	5,7
%CV	10,4	%CV	6,8

		Blindwert	183
			179

Assayprotokoll

Tabelle 8d: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien
Membran	1066
Konjugat	1083 u. 1081
Verdünnungspuffer	1081 u. 1111A
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Standard	RU
200 mg/l	83
	76
	81
	95
	78
	74
	67
Mittelwert	79
SD	8,1
%CV	10,2
75 mg/l	104
	93
	92
	104
	95
	92
	87
Mittelwert	95
SD	6,4
%CV	6,4
25 mg/l	126
	119
	109
	126
	110
	110
	108
Mittelwert	115
SD	7,9
%CV	6,8
10 mg/L	130
	130
	127
	131
	135
	132
	148
Mittelwert	133
SD	6,9
%CV	5,2
1 mg/L	159
	160
	162
	168
	161
	167
	163
Mean	163
SD	3,4
%CV	2,1

Assayprotokoll

Tabelle 8e: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien
Membran	1066
Konjugat	1083 u. 1081
Verdünnungspuffer	1081 u. 11114
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU
44 (203 mg/l)	76
	70
	72
	80
	78
Mittelwert	75
SD	4,1
%CV	5,5
35 (75 mg/l)	102
	90
	91
	101
	104
Mittelwert	98
SD	6,6
%CV	6,7
22 (24,7 mg/l)	118
	115
	120
	129
	132
Mittelwert	123
SD	7,3
%CV	6,0
17 (12 mg/l)	133
	129
	133
	154
	157
Mittelwert	141
SD	13,1
%CV	9,3
2 (0,6 mg/l)	162
	162
	169
	171
	166
Mittelwert	166
SD	4,0
%CV	2,4

Tabelle 8f: Bewertung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien
Membran	1065
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081 u. 1111A
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Probe	RU	Standard	RU
02 (0,6 mg/l)	173	1 mg/l	164
	172		164
	175		171
	175		177
Mittelwert	174	Mittelwert	169
SD	1,5	SD	6,3
%CV	0,9	%CV	3,7

17 (12 mg/l)	155	10 mg/l	147
	145		148
	149		140
	136		143
Mittelwert	146	Mittelwert	145
SD	8,0	SD	3,7
%CV	5,5	%CV	2,6

22 (24,7 mg/l)	115	25 mg/l	110
	119		136
	121		119
	124		119
Mittelwert	120	Mittelwert	121
SD	3,8	SD	10,8
%CV	3,2	%CV	8,9

35 (75 mg/l)	92	75 mg/l	98
	84		98
	97		92
	88		106
Mittelwert	90	Mittelwert	99
SD	5,6	SD	5,7
%CV	6,2	%CV	5,8

44 (203 mg/l)	87	200 mg/l	84
	75		84
	80		83
	81		87
Mittelwert	81	Mittelwert	85
SD	4,9	SD	1,7
%CV	6,1	%CV	2,0

Assayprotokoll

Tabelle 9: Bewertung unterschiedlicher TMB-Mittel Tabelle 9a: Bewertung unterschiedlicher TMB-Mittel (Ziel 1)

CRP-Konzentration mg/l	Reflexion mit TMB "A"	Reflexion mit TMB "B"
275	77.2	59.0
137.5	84.3	67.5
91	95.4	73.9
69	101.2	89.0
27.5	136.9	105.2
11	153.6	123.8

Tabelle 9b: Bewertung von 2 unterschiedlichen Chargen von TMB (Ziel 2)

Reagenzien
Membran	1051
Konjugat	1051
Verdünnungspuffer	1051
Fixierungsmittel	1021

Standard	TMB Charge 207 (Ref.)	TMB Charge 629	% Ref.
mg/l	RU	RU	Verhältnis 207/629
100	91	87	95,6
50	103	118	114,5
10	144	141	97,9
5	148	149	100,6
+ ctrl Nycomed	137	121	88,3
+ Probe Verdünnung 1:200	114	127	111,4
			Mittelwert: 101,4 + 1,04%

Tabelle 9c: Bewertung von 2 unterschiedlichen Chargen von TMB an Proben

Reagenzien
Membran	1065
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	111A
Fixierungsmittel	1081

Proben	TMB Charge 629 (Ref.)	TMB Charge 917	% Diff.
	RU	RU
29 (48 mg/l)	113	125
	127	117
	113	132
Mittelwert	118	125	5,4%
Standardabweichg.	8,0	7,5
CV%	6,9	6,0

59 (368 mg/l)	58	58
	76	62
	70	70
Mittelwert	69	63	9,5%
Standardabweichg.	10	6,1
CV%	14,6	9,6

Blindwert (0 mg/l)	185	176
	178	175
	179	175
Mittelwert	181	175	3,4%
Standardabweichg.	3,8	0,6
CV%	2,1	0,3
		Mittelwert	6,1%

Tabelle 10: Bestimmung der niedrigsten Nachweisgrenze Tabelle 10a:

Reagenzien (Chargen-Nr.)
Membran	1061b
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1111
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Standardkonzentration	RU
0 mg/l	184
	191
	181
	189
Mittelwert	188,25
Standardabweichg. (SD)	4,57
CV%	2,45
1,5 SD	6,85
Mittelwert +/–1,5 SD	179,4–193,1
2 SD	9,4
Mittelwert +/–2 SD	176,9–195,7

1 mg/l	160
	162
	172
	159
Mittelwert	163,25
Standardabweichg. (SD)	5,97
CV%	3,65
1,5 SD	8,94
Mittelwert +/–1,5 SD	154,3–172,2
2 SD	11,9
Mittelwert +/–2 SD	151,4–175,5
10 mg/l	143
	138
	133
	144
Mittelwert	139,5
Standardabweichg. (SD)	5,1
CV%	3,6
1,5 SD	7,6
Mittelwert +/–1,5 SD	131,9–147,1
2 SD	10,1
Mittelwert +/–2 SD	129,4–149,6

Tabelle 10b: Bestimmung der niedrigsten Nachweisgrenze

Reagenzien (Chargen-Nr.)
Membran	1106
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Standardkonzentration	RU
0 mg/l	178
	183
Mittelwert	180,5
Standardabweichg. (SD)	3,53
CV%	1,95
1,5 SD	5,3
Mittelwert +/–1,5 SD	175,2–185,8
2 SD	7,1
Mittelwert +/–2 SD	173,4–187,6

1 mg/l	169
	173
Mittelwert	171,0
Standardabweichg. (SD)	2,82
CV%	1,6
1,5 SD	4,2
Mittelwert +/–1,5 SD	166,8–175,2
2 SD	5,6
Mittelwert +/–2 SD	165,4–176,6

10 mg/l	145
	136
Mittelwert	140,05
Standardabweichg. (SD)	6,4
CV%	4,5
1,5 SD	9,5
Mittelwert +/–1.5 SD	131,0–150,0
2 SD	12,7
Mittelwert +/–2 SD	127,8–153,2

Tabelle 10c: Bestimmung der niedrigsten Nachweisgrenze

Reagenzien (Chargen-Nr.)
Membran	1071
Konjugat	1083
Verdünnungspuffer	1081
TMB	1021
Fixierungsmittel	1081

Standardkonzentration	RU
0 mg/l	171
	177
Mittelwert	174
Standardabweichg. (SD)	4,2
CV%	2,4
1,5 SD	6,4
Mittelwert +/–1,5 SD	167,8–180,4
2 SD	8,4
Mittelwert +/–2 SD	165,6–182,4

1 mg/l	169
	171
Mittelwert	170
Standardabweichg. (SD)	1,4
CV%	0,8
1,6 SD	2,1
Mittelwert +/–1,5 SD	167,9–172,1
2 SD	2,8
Mittelwert +/–2 SD	167,2–172,8

10 mg/l	143
	142
Mittelwert	142,5
Standardabweichg. (SD)	0,7
CV%	0,5
1.5 SD	1,1
Mittelwert +/–1,5 SD	141,4–143,6
2 SD	1,4
Mittelwert +/–2 SD	141,1–143,9

Tabelle 11: Nachweis von antimitochondrialen Antikörpern des Typs M2 Tabelle 11a: 1. Vergleich mit dem ELISA-Verfahren

Reagenzien

Membran: 1082

Konjugat: 1051

Verdünnungspuffer: 1081

Fixierungsmittel: 1021

Probe Nr.	FT (RU)	Int.	ELISA (OD 450 nm)	Int.
positiv
34590	135	+	1,836	+
4820	128	+	1,905	+
26416	90	+	1,587	+
18133	119	+	1,481	+
8413	121	+	1,800	+
5276	90	+	1,510	+

negativ
49319	161	–	0,206	–
49556	154	–	0,178	–
3494	158	–	0,064	–
2364	149	–	0,049	–
49435	164	–	0,036	–
40855	147	–	0,075	–
3494	181	–	0,049	–
2384	154	–	0,064	–
46235	156	–	0,040	–
Abgrenzung	143	–	< 0,300
Blindwert	164

Tabelle 11b: Nachweis von antimitochondrialen Antikörpern des Typs M2 Untersuchung der Inter-Assay-Reproduzierbarkeit

Reagenzien

Membran: 1081/1082/1083/1085

Konjugat: 1051 Verdünnungspuffer: 1081 Fixierungsmittel: 1021

Positive Probe	RU	RU	RU	RU
Membrancharge	1081	1082	1083	1085

5276	90	80	np	80
		89
		90
Mittelwert	88
Standardabweichg.	5,3
CV%	6,2

26416	89	106	95	82
	90
Mittelwert	92
Standardabweichg.	8,9
CV%	9,6

18133	119	104	109	98
Mittelwert	107
Standardabweichg.	7,7
CV%	7,2

Negative Proben	RU	RU	RU
Membrancharge	1081	1082	1083

3494	161	152	167

Mittelwert	160
Standardabweichg.	7,5
CV%	4,7

2364	153	159	148
Mittelwert	153
Standardabweichg.	5,5
CV%	3,6

49435	153	140	153
Mittelwert	149
Standardabweichg.	7,5
CV%	5,0

Tabelle 12: Nachweis von Salmonella Durchführbarkeit einer quantitativen Bestimmung

Verdünnungsfaktor	Zählung der Bakterien/ml	Reflexionseinheiten	Reflexionseinheiten
		a) Volumina 2 × 250 μl	b) Volumen 1 × 500 μl
10-1	5,30 × 10⁷	92	25
10-2	5,0 × 10⁶	67
10-3	5,80 × 10⁵	np
10-4	6,3 × 10⁴	106	50
10-5	5,6 × 10³	107
10-6	5,9 × 10²	np
10-7	6,5 × 10¹	np
10-8	7,0	np	96
Blindwert		170	170

Tabelle 13: Einfluss der Zusammensetzung des Verdünnungspuffers

Probe	Puffer 1111 (A)	Puffer 1112 (A)	Puffer 1051 (B)	Puffer 1113 (C)
	RU	RU	RU	Ru's
3 (1,2 mg/l)	175	171	172	182
	166	175	177	182
	167	165	174	177
	74	169	170	178
Mittelwert	170	170	176	180
Standardabweichg.	4,9	4,2	3,0	2,6
CV's%	2,8	2,4	1,7	1,5

15 (9,3 mg/l)	152	151	157	157
	155	162	157	161
	159	153	152	160
	165	154	160	150
Mittelwert	158	155	157	157
Standardabweichg.	5,6	4.8	3,3	5,0
CV's%	3,6	3,1	2,1	3,2

21 (20 mg/l)	142	137	119	123
	128	142	137	136
	133	141	141	143
	137	136	122	130
Mittelwert	135	139	130	132
Standardabweichg.	5,9	2,9	10,8	9,7
CV's%	4,4	2,1	8,4	7,4

36 (84 mg/l)	101	103	102	89
	103	115	108	95
	102	117	99	94
	101	112	112	101
Mittelwert	102	112	105	95
Standardabweichg.	0,9	6,2	5,9	4,9
CV's%	0,9	5,5	5,6	5,2

50 (268 mg/l)	80	68	71	74
	79	70	91	69
	81	74	85	71
	77	71	80	65
Mittelwert	79	71	82	70
Standardabweichg.	1,7	2,5	8,5	3,8
CV's%	2,2	3,5	10,3	5,4

Tabelle 14: Korrelation mit einem anderen Schnellverfahren zum Nachweis von CRP mit Immunturbidimetrie Tabelle 14a: Korrelation bei negativen Proben

Nummer der Probe	BIO ART Konz. mg/l	ORION Konz. mg/l
12	0–9	< 8
15	10	< 8
3	10–25	< 8

Tabelle 14b: Korrelation bei schwach positiven Proben (Konzentration von 9 bis 26 mg/l)

1. Probe Nr.	2. BIO ART Konz. mg/l	3. ORION Konz. mg/l	4. Korrelation
5. 5	6. 25	7. 19	8. Ok
9. 7	10. 10	11. 9	12. Ok
13. 10	14. 25	15. 16	16. Ok
17. 11	18. 25	19. 19	20. Ok
21. 13	22. 10	23. 12	24. Ok
25. 21	28. 10–25	27. 11	28. Ok
29. 22	30. 10–25	31. 26	32. Ok
33. 26	34. 25	35. 15	36. Ok
37. 30	38. 10–25	39. 13	40. Ok
41. 31	42. 25–25	43. 25	44. Ok
45. 33	46. 25	47. 10	48. Ok
49. 42	50. 10	51. 18	52. Ok

Tabelle 14c: Korrelation bei positiven Proben zwischen 27 und 100 mg/l

Probe Nr.	BIO ART Konz. mg/l	ORION Konz. mg/l	Korrelation
14	75–100	77	ok
15	25–50	27	ok
18	25–50	50	ok
40	50	44	ok

Tabelle 14d

Probe Nr.	BIO ART Konz. mg/l	ORION Konz. mg/l
37	200	112

Tabelle 14e: Allgemeine Schlussfolgerung

			ORION⁺
			+Ergebnisse		–Ergebnisse
BIO ART	+Ergebnisse	17	3
	–Ergebnisse	0	27
Gesamt		17	30
Empfindlichkeit:		17/17 100%	Spezifität:	27/30 90%

Claims

Verfahren zum Beschichten eines unlöslichen porösen Materials mit einer/einem Analyt-bindenden Verbindung oder Komplex, umfassend die Schritte: a) Eintauchen des Materials in eine Lösung, die die/den Analyt-bindende(n) Verbindung oder Komplex umfasst, b) Eintauchen des Materials in eine blockierende Lösung, c) Trocknen des porösen Materials, wobei die Schritte in Abwesenheit jeglicher zwischenzeitlicher Waschungen durchgeführt werden.
Verfahren zum Prüfen des Vorhandenseins von oder zum Quantifizieren eines Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte: a) Beschichten eines unlöslichen porösen Materials gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, b) Herstellen einer mehrlagigen Vorrichtung, die das poröse Material aus Schritt a) umfasst, c) Aufbringen der Probe auf die Vorrichtung aus Schritt b), wobei die (erste) Analyt-bindende Verbindung oder der (erste) Analyt-bindende Komplex den in der Probe vorhandenen Analyt bindet, d) Bilden eines Sandwiches, wobei der Analyt eine zweite enzymmarkierte Analyt-bindende Verbindung oder einen zweiten enzymmarkierten Analyt-bindenden Komplex bindet, e) Erzeugen eines farbigen Niederschlags nach Kontakt mit einem geeigneten präzipitierenden Substrat für die Enzymmarkierung in einem Einschritt-Verfahren, und, f) Zufügen einer fixierenden Lösung, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und die dauerhafte Erhaltung der resultierenden Farbe zu erlauben.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe in Schritt c) auf den Testbereich aufgetragen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Schritte c) bis f) in Abwesenheit von zwischenzeitlichen Waschschritten durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Enzymmarkierung HRP ist und das präzipitierende Substrat ausgewählt ist aus TMB (Tetramethylbenzidin) oder AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Enzymmarkierung alkalische Phosphatase ist und das Substrat ausgewählt ist aus BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) oder BCIP-NBT (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Nitroblautetrazolium).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Enzymmarkierung Dehydrogenase ist und das Substrat NBT (Nitroblautetrazolium) ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das erzeugte TMB-Präzipitat fixiert werden kann unter Verwendung eines Reagens ausgewählt aus Polyvinylalkohol, ergänzt mit Dioctylsulfosuccinat oder Dimethylformamid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei Volumina von 5 bis 500 Mikrolitern angewendet werden, um einen homogenen farbigen Fleck zu erzeugen, wenn in der Deckschicht der Vorrichtung ein Loch von 3 bis 4 mm Durchmesser vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei 1% bis 40% Saccharose der Probe zugeführt wird, wenn der Testbereich größer als 4 mm ist oder wenn das Probenvolumen größer als 100 Mikroliter ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 9 oder 10, wobei ein Bereich, begrenzt durch das Loch, einen Durchmesser von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 mm aufweist und wobei das Probenvolumen 5 bis 2000 Mikroliter beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Wasser oder Nahrungsproben kontrolliert, getestet und/oder bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei durch Nahrung übertragene Krankheitserreger entdeckt und/oder identifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 2, verwendet um einen Autoimmunerkrankungsmarker, Infektionserkrankungsmarker, ein Allergen, einen Herzerkrankungsmarker, Entzündungsmarker oder bakteriellen Infektionsmarker zu ermitteln.
Verfahren nach Anspruch 2, angewendet zur Diagnose und/oder Überwachung einer Behandlung von Krankheiten.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Krankheiten Autoimmunerkrankungen, Infektionserkrankungen, Allergene, Herzerkrankungen, Entzündung und bakterielle Infektionen einschließen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die blockierende Lösung 0,2–10% Blockierungsmittel enthält.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Blockierungsmittel BSA ist.