DE3346795A1

DE3346795A1 - Enzymimmunoassay und entsprechendes diagnostikum

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Publication number: DE3346795A1
Application number: DE19833346795
Authority: DE
Inventors: E. Prof. Dr. 3550 Marburg Geyer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1983-12-23
Publication date: 1985-07-04

Description

Enzymimmunoassay und entsprechendes Diagnostikum
Die Erfindung betrifft einen sogenannten Festphasen-Enzymimmunoassay, das ist eine Testmethode, bei der ein auf einer Festphase immobilisiertes Proteinantigen zum serologischen Nachweis von 'ntikörpern verwendet wird und bei der im positiven Falle der auf der Festphase gebildete Antigen-Antikörperkomplex mit einem Enzym markiert wird.
Die Erfindung betrifft außerdem ein entsprechendes Diagnostikum.
Es ist bekannt, daß die Antigen-Antikörper-Reaktion in zahlreichen Diagnoseverfahren zum Erkennen von Körperfunktionen oder zum Nachweis von Krankheitserregern ver wendbar ist. Dabei muß einer der beiden Reaktionspartner bekannt sein, damit der andere qualitativ oder quantitativ in einer Körperflüssigkeit bestimmt oder in Zellen und Geweben lokalisiert werden kann. Außerdem muß die hochspezifische Antigen-Antikörper-Reaktion in irgend einer Form sichtbar oder meßbar gemacht werden, um sie diagnostisch verwerten zu können. Eine der Methoden des Sichtbar- bzw. Meßbarmachens der Antigen-Antikörper-Reaktion (Ag-Ak-Reaktion) ist die Verwendung eines spezifischen Markierungsmittels für den Ag-Ak-Komplex. Im hier beschriebenen Falle wird als Markierungsmittel ein Enzym verwendet.
Es ist auch bereits bekannt, eine der beiden Komponenten der Immunreaktion oder auch deren Produkt an einem festen Träger zu fixieren. Dadurch laßt sich häufig die Nachweisempfindlichkeit erhöhen und die Handhabung erleichtern.
Als fester Träger für die adsorptive Fixierung von Proceinen wird üblicherweise Polystyrol, z.B. in Form von iMikro titerplatten oder in Form von sogenannten Tubes verwendet. Das Adsorptionsvermögen dieses Materiales ist jedoch nicht in allen Fällen zufriedenstellend. Auf der Suche nach verbesserten festen Trägern für die adsorptive Immobilisierung von Proteinen sind auch schon Versuche mit Nitrocellulose-Folie gemacht worden, vergl. Anderson et al.,Electrophoresis, 3, 135-142 (1982). Es konnte auch bereits gezeigt werden, daß die Antigen-Eigenschaften bestimmter Proteinantigene bei der adsorptiven Immobilisierung auf Nitrocellulose-Folie erhalten blieben (vgl.
Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979); und Weiss et al., Acta Tropica 39, 373-377 (1982).) Die bekannten Methoden haben jedoch den Nachteil, daß sie nur in relativ gut eingerichteten Laboratorien durchgeführt werden können, da sie zum Nachweis der Immunreaktion teure und komplizierte technische Einrichtungen, z.B. Spectrophotometer, Elektrophorese-Geräte oder radiometrische Vorrichtungen benötigen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis einer Immunreaktion zu schaffen, das einfach und schnell auch außerhalb gut eingerichteter Laboratorien durchführbar ist und trotzdem eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit besitzt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen Enzymimmunoassay der eingangs erwähnten Art gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, daß man - ein Proteinantigen auf eine Nitrocellulose- oder Polyamidfolie aufträgt, - die FoLie mit einem Mittel behandelt, das die vom Prote inant Lgen nicht besetzten Adsorpt ionss teL len der Folie absättigt, - die Folie mit Patientenserum behandelt, - die Folie mit einem Anti-Human-Iyr /Enzym-Konjugat bebehandelt, - die Folie mit einem Substrat für das im vorausgegangenen Behandlungsschritt verwendete Enzym und einem Farbstoffprecursor, der mit den Spaltprodukten des Substrats einen auf der Folie gut haftenden deutlich sichtbaren Farbstoff bildet, behandelt - und schließlich die Folie trocknet, wobei nach jedem Behandlungsschritt überschüssiges Reagens durch Waschen entfernt und zum Schluß eine visuelle Bewertung vorgenommen wird.
Zur Erfindung gehört außerdem ein Diagnostikum zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Assay, das gekennzeichnet ist durch: - mindestens eine Flächeneinheit einer Nitrocellulose-oder Polyamidfolie, die mindestens ein Proteinantigen adsorbiert enthält, - ein Anti-Human-Ig/Enzym-Konjugat, - ein Substrat für das im Konjugat enthaltene Enzym, - einen Farbstoffprecursor, der mit den Spaltprodukten des Substrats einen auf der Folie gut haftenden und deutlich sichtbaren Farbstoff bildet und - mindestens eine wäßrige Pufferlösung.
Als Nitrocellulose-Festphase kann man für die erfindungsgemäßen Zwecke Handelsprodukte verwenden, beispielsweise eine nitrierte Cellulose, die unter der Handelsbezeichnung "Pyroxylin" vertrieben wird oder das Produkt ME 25 mit einer Porengröße von 0,45 µm der Firma Schleicher & Schüll oder ein Produkt der Firma Bio-Rad Laboratories ebenfalls mit einer Porengröße von 0,45 µm. oder der Firma Millipore HATF 0,45 pin, Triton-frei. Als Polyamid-Festphase eignen sich auch Folien auf Nylon-Basis, z.B. eine Nylonmembran der Fa. Pall, die an der Oberfläche je 50 % aktive Amino- und Carboxylgruppen enthält.
Als Mittel zum Aosättigen der unbesetzten Adsorptionsstellen der Folie verwendet man vorzugsweise Rinderserum-Albunin oder Polyvinylpyrrolidon.
Anstelle des Anti-Human-IgG kann man ohne weiteres auch Anti-Human-Immunglobulin TypM oder E (tgM bzw. IgE) für das Enzym-konjugat verwenden und anstelle des Enzyms Peroxidase kann man auch alkalische Phosphatase verwenden, wobei man als Enzymsubstrat beispielsweise stark verdünntes Wasserstoffperoxid in einem Puffer und als Farbstoffprecursor ein Diaminobenzidin, z.B. 3,31-Diaminobenzidin verwendet.
Brauchbar sind auch andere Diaminobenzidine mit syr9nischer oder unsymmetrischer Anordnung der Aminogruppen.
Das Diaminobenzidin wird in der Regel gemeinsam mit dem Wasserstoffperoxid in einem Puffer von etwa pH 7,6 angewendet. Ein dazu geeigneter Puffer ist z.B. Tris/HCl-Puffer [Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid].
Die Einwirkung der verschiedenen Reagenzien erfolgt in der Regel in Anwesenheit eines Inkubationspuffers; geeignet ist z.B. ein Puffer aus 0,02 Mol/Liter Na2HP04 x 2H20tNaH2P04 x H20; 0,15 Mol/l Nach; 0,01 v (w/v) NaN3 mit einem pH-Wert von 7,2. Zum Waschen verwendet man einen Waschpuffer, der z.B. die Zusammensetzung des vorstehend erwähnten Inkubationspuffers haben kann und zusätzlich noch etwa 0,4 % (v/v) Tween 20 enthält.
Der Gesamtablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens und das Reaktionsgeschehen in den einzelnen Stufen sind schematisch in der beiliegenden Figur 1 dargestellt und dort durch entsprechende Bemerkungen erläutert. Mit Hilfe des erfindungsgemäß verwendeten Farbstoffprecursors, Diaminobenzidin, gelingt es, eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar zu machen und auf dem festen Träger zu fixieren. Bei positiver Reaktion findet nämlich auf dem Träger eine Dunkelfärbung statt. Diese Dunkelfärbung ist sehr empfindlich und trotzdem sehr stabil, so dap der auf diese Weise markierte Folien-Träger auch zu Dokumentationszwecken verwendet werden kann.
In Figur 2 sind Versuchsergebnisse zusammengestellt, die als Beispiel zeigen, daß der erfindungsgemäße Festphasen-Enzymimmunoassay mit heterologen grob- bzw. hochgereinigten Proteinantigenen der Baumwollrattenfilarie, Litomosoides carinii, zum Nachweis von IgG-Antikörpern bei Onchozerkose-Patienten sehr gut geeignet ist. Als Kontrollen wurden Seren gesunder Mitteleuropäer mitgeführt. Diese Figur zeigt, daß die benötigten Antigenmengen äuperst gering sind. In der Regel sind sie geringer als die für den konventionellen Enzymimmunoassay in Mikrotiterplatten (Polystyrol-Adsorption des Antigens) erforderlichen Mengen. Dieser Vorteil ist bei Antigenen, die hochgereinigt sind, und deren Produktion nicht bzw. nicht problemlos in hinreichenden Mengen möglich ist, von besonderer Bedeutung. Figur 2 zeigt auch, daß selbst Antigene höchsten Reinheitsgrades an der erfindungsgemäß verwendeten Nitrocellulose-Folie immobilisiert werden können, was bei herkömmlichen Polystyrol-Matrices oft ein Problem darstellt.
Die erfindungsgemäß immobilisierten Antigene sind auf ihrem Träger sehr gut haltbar. Die Ergebnisse von Lagertests, die sich über einen Zeitraum von 21 Wochen erstreckten und bei 40 und 37"C durchgeführt wurden, sind in der beiliegenden Figur 3 zusammengestellt. Aus ihr ist ersichtlich, dap die erfindungsgemäß immobilisierten Antigene mit und vor allem ohne Albumininprägnierung zur Absättigung freier Bindungsvalenzen auf der verwendeten Festphase so gut haltbar sind, dap eine kommerzielle Produktion und ein Vertrieb unter üblichen Bedingungen keine Probleme verursachen.
Der erfindungsgemäße Assay mit einer visuell auswertbaren Enzym-Substrat-Farbreaktion bei positiven Antikörpertitern macht die konventionelle photometrische Messung überflüssig und macht daher den hochsensiblen Enzymimmunoassay für medizinisch-diagnostische Zwecke zugänglich, ohne auf die konventionelle apparative Ausstattung angewiesen zu sein. Dies ist beispielsweise für die tropenmedizinisch-parasitologische Diagnostik unter Feldbedingungen wichtig, wobei die Methode auch im Sinne eines allgemeinen differential diagnostischen Screenings eingesetzt werden kann. Zum Zwecke des Screenings können auf einer erfindungsgemäßen Folie mehrere verschiedene Antigene definierter Erreger, z.B. von Viren, Bakterien, Protozoen, Helminthen, in sinnvoller Anordnung immobilisiert und dann mit Testseren behandelt werden. Zwei Beispiele für ein derartiges Screening sind in der beiliegenden Figur 4 dargestellt. Die in Figur 4 in den einzelnen Testfeldern symbolisierten verschiedenen Antigene können z.B. durch Auftüpfeln oder durch Aufkleben von mit Antigen behandelten Folienstückchen aufgebracht werden. Durch Auswahl entsprechonder Antigene kann dieses Screening regionalen epidemiologischen Gegebenheiten angepaßt werden.
Rund ausgestanzte Folien mit einem für handelsübliche Mikrotiterplatten bzw. -tubes geeigneten Durchmesser, gestatten auch die Benutzung dieser Mikrotiterplatten bzw. - tubes (kein Polystyrol!), wenn die gestanzten Folien auf diesem Boden fixiert werden.
Hinzu kommen folgende weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Assay: - Wesentlich kostengünstigere Antigen-Matrix als beim konventionellen Verfahren mit Mikrotiterplatten oder Polystyroltubes. Je nach Menge des pro Reaktionsfeld deponierten Antigens dürfte der Preis bei 1/2 bis 1/8tel des üblicherweise zugrunde zu legenden Preises liegen.
- Kostenersparnis durch geringen Konjugat-Verbrauch pro Testansatz.
- Die Durchführung des Tests (Antigenkupplung) ist nicht von spezifischen Puffersystemen abhängig.
- Die Enzym-Substrat-Farbreaktion muß nicht gestoppt werden, eine Farbstoffixierung auf der Folie ist nicht notwendig.
- Eine Aufbewahrung der Folie nach dem Test für Dokumentationszwecke ist möglich.
Das nachfolgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel Eine Nitrocellulose-Folie der Firma Schleicher & Schüll, Handelsbezeichnung ME 25, Porengröße: 0,45 pm bzw. eine Folie der Firma Bio-Rad Laboratories1 ebenfalls mit einer Porengröße von 0,45 pm wird mit einem Inkubationspuffer angefeuchtet. Man verwendet etwa 2 ml Puffer pro Quadratzentimeter Folie und als Puffer eine wäßrige Lösung folgender Zusammensetzung: 0,02 Mol/l Na2HPO4 x 2H20/NaH2P04 x H20; 0,15 Mol/l NaCl; 0,01 % (w/v) NaN3, mit einem pH-Wert von 7,2.
Uberschüssiger Puffer wird vom Filterpapier entfernt.
Man trägt eine auf an sich bekannte Weise gewonnene Antigenlösung (1,2,3..pl) auf, läßt etwa 5 Minuten lang einwirken, dabei wird das Antigenprotein adsorbiert.
Man wäscht die Folie mit dem oben bereits erwähnten Inkubationspuffer etwa 15 Minuten lang und verwendet dabei 2 auch wieder etwa 2 ml pro cm Folie.
Anschließend wird die Folie mit 1 % Polyvinylpyrrolidon (PVP)+ 0,2 Rinderserum-Albumin in dem oben erwähnten Inkubationspuffer 1 Stunde bei 37°C behandelt,um freie Bindungsstellen abzusättigen.
Danach wird überschüssiges PVP und Rinderserum-Albumin durch Waschen mit Waschpuffer entfernt, wobei der Puffer innerhalb von 15 Minuten dreimal gewechselt wird. Als Waschpuffer verwendet man einen Puffer, der oben bereits beschriebenen Zusammensetzung mit einem Zusatz von etwa 0,4 % (v/v) Tween 20. Die so vorbehandelte Folie kann entweder getrocknet und für spätere Tests aufbewahrt werden oder sie wird anschließend im Test nach folgender Methode weiterverwendet: Man trägt Patientenserum auf die Folie auf, etwa 20 p1 2 pro cm ; Serumverdünnungen mit Inkubationspuffer + 1 % Rinderserum-Albumin, Inkubation in feuchter Kammer, etwa eine Stunden bei 370 C.
Anschließend wird mit dem bereits oben erwähnten Waschpuffer gewaschen. Es soll sorgfältig übe r eine Stunde bei 3maligem Wechsel gewaschen werden.
Nun wird ein Antikörper-Enzym-Konjugat aufgetragen, z.B.
etwa 20 ul pro cm2 Folie. Geeignet ist z.B. Anti-Human-IgG (Gamma-Kette)-Peroxidase vom Kaninchen, der Firma Behring, Konjugatverdünnung 1:100 mit Inkubationspuffer + 1 % Rinderserum-Albumin), Inkubation in feuchter Kammer, etwa eine Stunde bei 37°C.
Danach wird mit dem oben bereits erwähnten Waschpuffer gewaschen, wobei innerhalb einer Stunde der Puffer 3 mal gewechselt wird.
Anschließend werden das Substrat des Enzyms und der Farbstoffprekursor, nämlich verdünnter H202 und Diaminobenzidin in einem Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6 aufgetragen, man läf3t etwa 30 Minuten im Dunkeln einwirken. Die Pufferlösung enthält etwa 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidin und 0,05 % (v/v) H202 in 50 mMol/l Tris-HCl-Puffer Das Diaminobenzidin wird zunächst mit ganz wenig Dimethylformamid angelöst und danach mit Tris-HCl-Puffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
Nach dieser Benzidinbehandlung wird mit destilliertem Wasser etwa 30 Minuten lang gewaschen und schließlich die Folie zwischen Filterpapier getrocknet und visuell bewertet. Eine Dunkelfärbung steht für eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion.
Erläuterung der Figur 4: Praktische Anwendungsbeispiele für den Nitrocellulose-Festphasen-Enzymimmunoassay.
a) Nitrocellulose-Folie (z.B. 10 cm x 10 cm) zur Serodiagnostik von 100 verschiedenen Probandenseren auf gleichzeitig 4 verschiedene Erregerarten (Screening).
Je nach Bedarf kann die gewünschte Anzahl von Reak-2 tionsfeldern (1 cm ), auf die 4 verschiedene Antigene deponiert sind, abgeschnitten und für die Untersuchung verwendet werden.
Beispiel aus dem tropenmedizinisch-parasitologischen Bereich: QPlasmodium falciparum (Halaria tropica), ç Entamoeba histolytica (Amöbenruhr), A Schistosoma mansoni (Bilharziose), Onchocerca volvulus (Onchozerkose).
b) Nitrocellulose-Folie (z.B. 10 cm x 10 cm) zur Serodiagnostik von 10 verschiedenen Probandenseren auf 1 Erreger bei einer Auswahl von 10 verschiedenen Antigenen zum Nachweis 10 verschiedener Egger. Auch in diesem Fall kann die erwünschte Anzahl von Reaktionsfeldern von der angebotenen Folie entfernt werden. Symbole: S.o., O Trypanosoma cruzi (Chagaskrankheit).
Grundsätzlich ist eine Vielzahl von Variationen der Antigendeponierung möglich, darüber hinaus die Verwendung von Antigenen zum serologischen Nachweis vira-Ler bzw. bakterieller Infektionen.
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Claims

Patentansprtiche 1. Enzymimmunoassay unter Verwendung von auf einer Festphase immobilisierten Proteinantigenen zum serologischen chwes von Antikörpern, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dap man - ein Proteinantigen auf eine Nitrocellulose- oder Polyamidfolie aufträgt, - die Folie mit einem Mittel behandelt, das die vom Proteinantigen nicht besetzten Adsorptionsstellen der Folie absättigt, - die Folie mit Patientenserum behandelt, - die Folie mit einem Anti-Human-IgG/Enzym-Konjugat behandelt, - die Folie mit einem Substrat für das im vorausgegangenen Behandlungsschritt verwendete Enzym und mit einem Farbstoffprecursor, der mit den Spaltprodukten des Substrats einen auf der Folie gut haftenden deutlich sichtbaren Farbstoff bildet, behandelt, - und schließlich die Folie trocknet, wobei nach jedem Behandlungsschritt überschüssiges Reagenz durch Waschen entfernt und zum Schluß eine visuelle Bewertung vorgenommen wird.
2. Enzymimmunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dap man als Mittel zum Absättigen der unbesetzten Adsorptionsstellen der Folie Rinderserum-Albumin oder Polyvinylpyrrolidon verwendet.
3. Enzymimmunoassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anti-Human-IgG/ Enzym-Konj ugat ein Anti-Human-IgG/Peroxidase-(oder alkalische Phosphatase-)Konjugat verwendet, als Enzymsubstrat Wasserstoffperoxid und als Farbstoffprecursor 3,31 -Diatinobenzidin verwendet
4. Enzymimmunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Waschbehandlungen Inkubations- oder Waschpuffer verwendet und am Ende mit destilliertem Wasser wäscht.
5. Diagnostikum zum serologischen Nachweis von Antikörpern, gekennzeichnet durch - mindestens eine Flächeneinheit einer Nitrocellulose-oder Polyamid-Folie, die mindestens ein Proteinantigen adsorbiert enthält, - ein Ant i-Huma iqG/Enzyrn-Konjuaat, - ein Substrat für das im Konjugat enthaltene Enzym und - einen Farbstoffprecursor, der mit den Spaltprodukten des Substrats einen auf der Folie gut haftenden und deutlich sichtbaren Farbstoff bildet und - mindestens eine wäßrige Pufferlösung.
6. Diagnostikum nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dap die das Proteinantigen enthaltende Flächeneinheit auch ein Mittel enthält, das die von Proteinantigen nicht besetzten Adsorptionsstellen absättigt.
7. Diagnostikum nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dap die Flächeneinheit als Absättigungsmittel Rinderserum-Albumin oder Polyvinylpyrrolidon enthält.
8. Diagnostikum nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß es als Anti-Human-IgG/Enzymkonjugat ein Anti-HumarrIgG /Peroxidase-(oder alkalftohe Phosphatase-ìKonjugat, sowie als Enzymsubstrat Wasserstoffperoxid und als Farbstoffprecursor 3,3' -Diamonobenzidin enthält.
9. Diagnostikum nach einem der Ansprüche 5 bis 8 zum Nachweis einer Onchozerkoseinfektion, dadurch gekennzeichnet, dap die Nitrocellulose-Flächneinheit als Proteinantigen mindestens ein Antigen der Baumwollrattenfilarie Litomosoides carinii enthält.