AT397581B - Verfahren zur bestimmung von anti-p.falciparum- sporozoit-antikörpern im menschlichen blut - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von anti-p.falciparum- sporozoit-antikörpern im menschlichen blut Download PDF

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Description

AT 397 581 B
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue immunoenzymatische Methode zur Diagnose von Malaria im menschlichen Blut.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zum Nachweis und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern im menschlichen Blut, Serum und/oder Plasma. 5 Malaria stellt eine der schwersten parasitären Erkrankungen dar und befällt jedes Jahr Hunderte von Millionen von Menschen, vor allem in den tropischen Regionen von Asien, Afrika und Amerika, und verursacht dabei eine hohe Kindersterblichkeit.
Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus Plasmodium gehört, das auf den Menschen durch den Stich der Anophelesmücke übertragen wird. io Unter den hunderten von Species von Plasmodium, die in der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen pathogen: Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax und Plasmodium falcipa-rum.
Dieses letztere stellt insbesondere die am meisten verbreitete Species dar und verursacht die meiste Erkrankungshäufigkeit und Mortalität im Zusammenhang mit Malaria. 75 Die Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern im Blut von Individuen, die verdächtig sind, malariainfiziert zu sein, stellt einen wesentlichen klinischen Parameter für die Diagnose von Malaria dar und die Auswertung der Wirksamkeit einer Antimalaria-Vakzine. im allgemeinen wird die Diagnose von Malariainfektionen mittels der Blutprüfung unter dem Mikroskop oder durch immunologische Methoden durchgeführt, die auf Messungen der Fluoreszenz (IFA), der 20 Radioaktivität (IRMA) und der enzymatischen Aktivität (EIA) basieren.
Die mikroskopische Analyse des Blutes ist jedoch schwierig und für eine epidemiologische Untersuchung, wo hunderte oder tausende Proben geprüft werden, ungeeignet.
Ein nicht sehr geeignetes Ergebnis liefern weiterhin die immunologischen Methoden IRMA und IFA, die, abgesehen davon, daß sie lange Arbeitszeiten benötigen, durch viele Schritte, die sie erfordern, kompliziert 25 sind und durch die Verwendung von Substanzen, die instabil und für den Menschen schädlich sind.
Unter den EIA-immunoenzymatischen Methoden ist die üblicherweise verwendete der ELISA(Enzyme-Linked-lmmuno-Sorbent-Assay)-Test, der umfaßt: (a) Fixieren durch Absorption oder durch kovalente chemische Bindung eines natürlichen oder synthetischen Antigens auf einen festen Träger: 30 (b) Blockieren der restlichen Stellen auf dem Träger mit einem geeigneten Protein; (c) inkubieren des an den Träger gebundenen Antigens mit dem zu untersuchenden Serum, und (d) Aufeinanderfolgende Zugabe eines Anti-Human-Immunoglobulin-Antikörpers, gebunden an ein Detektorenzym, und eines farblosen Substrats für das Enzym, das im Falle einer positiven Reaktion des Serums ein gefärbtes Produkt ergibt. 35 Dieser Test erfordert jedoch, obzwar er es ermöglicht, einige der Nachteile der IRMA- und IFA-Methoden zu überwinden, durch Verwendung stabiler und nicht-radioaktiver Substanzen, lange Arbeitszeiten (etwa 6 Stunden) und die Verwendung von Reaktanten, wie Anti-Immunoglobulin-Antikörper-Enzym, das nur mittels komplexer und kostspieliger Methoden erhalten werden kann.
Somit existiert das Bedürfnis in der Fachwelt für eine rasche, preiswerte und empfindliche diagnosti-40 sehe Methode, die für Massenuntersuchungen in Gegenden, wo Malaria endemisch ist, oder in Gegenden, wo eine genaue Kontrolle durchgeführt werden muß, um infektiöse Herde zu lokalisieren und diesen vorzubeugen, nützlich ist.
Diesem Bedürfnis wird gemäß der vorliegenden Erfindung nach einer neuen immunoenzymatischen Methode nachgekommen, welche mit einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat arbeitet, das fähig ist, 45 mit den Antisporoit- bzw. Antisporozoitantikörpern einen stabilen Antikörper-Antigen-Enzym-Komplex zu bilden und mit den Proteinen, welche gleichfalls den Antisporozoitantikörper dieses Komplexes binden.
Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine immunoenzymatische Methode zum Nachweis und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-AntikÖrpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Abkömmlingen, die umfaßt: Inkubieren dieser Proben in Anwesenheit eines synthetischen Antigen-50 Enzym-Konjugats, das fähig ist, mit den Antisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörpersynthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden; Binden des Antisporozoit-Antikörpers dieses Komplexes mit den Proteinen, entweder adsorbiert auf oder kovalent gebunden an einen festen Träger; und schließlich Bestimmen der enzymatischen Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im positiven Falle ein gefärbtes Produkt zu ergeben vermag. 55 Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieses synthetischen Antigen-Detektorenzym-Konjugats zur Herstellung einer Ausrüstung für die Diagnose von Malaria.
Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich. 2
AT 397 581 B
Das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, das für die erfindungsgemäße Methode geeignet ist, wird durch eine Poiypeptid-Sequenz gebildet, die in der Lage ist, die Antisporozoit-Antikörper zu erkennen und zu binden, und durch ein Enzym gebildet. insbesondere ist gemäß der vorliegenden Erfindung das Sequenz-Polypeptid bzw. die Polypeptid-5 Sequenz (Asn-Ala-Asn-Pro)n,worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40, vorzugsweise von 10 bis 20, hat,und exakt das polypeptidische Segment des natürlichen Circumsporozoit-Proteins bzw. Circumsporozoi-toize-Proteins der Membran des Sporozoits von P.falciparum reproduziert.
Die Anwesenheit von nur zwei endständigen, funktionalen, chemischen Gruppen, NH2 und COOH, in diesem Polypeptid macht es besonders geeignet für die Herstellung des Konjugats gemäß der vorliegenden 10 Erfindung, da es ermöglicht, daß eine stabile, kovalente Bindung zwischen dem Polypeptid und dem Enzym gebildet wird, ohne der katalytischen Aktivität desselben Enzyms schädlich zu sein.
Dieses Polypeptid wird in reiner Form und in hoher Ausbeute nach dem Verfahren, wie es in der EP-A2-209 643 beschrieben ist, mittels Polymerisation des HCI.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP-Poypeptids in einem inerten, polaren Lösungsmittel in Anwesenheit einer tertiären organischen Base hergestefit. 15 Enzyme, die für die Herstellung des Konjugats der vorliegenden Erfindung nützlich sind, werden unter solchen ausgewählt, die auf einem chromogenen Substrat zu wirken in der Lage sind. Beispiele solcher Enzyme sind Peroxidase, α-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Vorzugsweise wird Peroxidase verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat hergestellt mittels 20 eines Verfahrens, das umfaßt: (1) Oxidieren des gereinigten Enzyms in einer 0,1 M Lösung von NaHC03, wie z.B. Natriummetaperjo- dat, bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln während etwa 2 Stunden: (2) Zugabe des Polypeptids, gelöst in NaHC03 (pH 9,2) zu dieser Lösung in einem Polypeptid/Enzym-
Molverhältnis von etwa 40/1 und Halten der entstandenen Lösung durch Stehen bei Raumtemperatur im 25 Dunkeln während etwa 16 Stunden; (3) Zugabe eines reduzierenden Mittels zu dieser Lösung, wie z.B. NaBH*, und schließlich (4) Abtrennen des Polypeptid-Enzym-Konjugats.
Insbesondere wird gemäß einer praktischen Durchführungsform der vorliegenden Erfindung ein Konjugat hergestellt, worin das Polypeptid (Asn-Ala-Asn-Pro)i7 und das Enzym Peroxidase ist. Der Konjugations-30 grad, d.h. das Moiverhältnis von Polypeptid zu Enzym in diesem Konjugat ist 0,9-0,92, nahe bei dem erwarteten Wert (1) für das reine Konjugat.
Die spezifische Aktivität der Peroxidase, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm, wie von H.Galloti (1979), J.CHn.Chem.Clin.Biochem. 17, 1-7, berichtet, ist 75% derjenigen des nichtkonjugierten Enzyms. 35 Gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung wird dieses Konjugat in einer Pufferlösung während etwa 20 bis 30 Minuten mit einer Probe von ganzem menschlichen Blut, Humanserum oder Humanplasma inkubiert.
Das Reaktionsgemisch wird dann weitere 20 bis 30 Minuten auf einem festen Träger inkubiert, auf dem das A-Protein adsorbiert und/oder kovalent gebunden ist. 40 Von diesem Protein ist bekannt, daß es leicht die menschlichen Immunoglobuline, ausgenommen IgM und IgGs, bindet und daher mit dem Antisporozoit-Antikörper, der an das Antigen-Enzym-Konjugat gebunden ist, einen stabilen Komplex bildet.
Feste Träger, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, sind Polysaccharid-Materialien, wie Cellulose und Agarose, sowie Kunststoff-Materialien. 45 Am Ende der Reaktion und nach geeigneten Waschungen wird zu den Mischungen eine Lösung gegeben, welche das chromogene, enzymatische Substrat und H2O2 enthält, und nach 2 bis 3 Minuten wird die Entwicklung von Farbe beobachtet.
In dem Fall, wo das gesamte Blut analysiert wird, wird die Ausgangsmischung vor der Zugabe zu dem A-Protein zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen. so Der Threshold-Wert, d.h, die minimale Menge an positivem Serum, welche eine Farbentwicklung, die mit dem bloßen Auge sichtbar ist, erzeugt, war 0,1 ul bzw. 0,4 ul für zwei untersuchte Seren.
Weiterhin wird keine Farbentwicklung beobachtet für die Leerprobe, welche aus einem Gemisch, das das Konjugat ohne die Probe von Blut und/oder seinen Derivaten enthält, besteht, für Serum und Plasma von gesunden Personen, für nicht-malariainfiziertes Gesamtblut, entweder haemolysiert oder nicht, und für 55 7-Globuline (Globuman-Bern).
Dies zeigt eine vollständige Abwesenheit von Überschneidungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an. 3
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Die Möglichkeit eines raschen Durchlaufs, etwa 60 Minuten, verglichen mit den 6 Stunden, die für den ELISA-Test erforderlich sind, und die Verwendung einer kleinen Anzahl von Reaktanten, d.h. nur das Antigen-Enzym und die Proteine, stellen einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
Eine beträchtlicher Vorteil dieser Methode besteht weiterhin in der Möglichkeit, die Antisporozoit-5 Antikörper im Gesamtblut bestimmen und messen zu können. Dies ist verursacht durch die hohe Stabilität des Konjugats der vorliegenden Erfindung, verglichen mit den im Blut enthaltenen Proteasen.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren absolut spezifisch, und tatsächlich bestätigten alle Proben, welche nach den IRMA-, IFA- und ELISA-Tests als positiv befunden wurden, bei der Analyse mit der erfindungsgemäßen Methode Positivität. io Infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet für eine epidemiologische Studie von Malaria und insbesondere für Massenprüfungen von Malariainfektion in Gegenden, in denen sanitäre Einheiten und Strukturen fehlen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. is Beispiel 1
Herstellung von (Asn-Ala-Asn-Pro)i 7-Peroxidase-Konjugat
Peroxidase-Enzym (Sigma) wurde gereinigt und gefriergetrocknet, bevor es mit dem Peptid konjugiert 20 wurde. 10 mg reines Enzym (E) wurde dann in 1 ml 0,1 M NaHCC>3 gelöst und 2 h mit 1 ml 16 mM NaJO* -(Natriummetaperjodat) bei Raumtemperatur (20-25°C) in Dunkeln oxidiert.
Am Ende dieses Zeitraums wurde zu· dem Reaktionsgemisch 1 ml NaHC03 (pH 9,2), enthaltend 70 mg (Asn-Ala-Asn-Pro)i7-Peptid (P) in einem Molverhältnis von Peptid/Enzym gleich 40/1, zugesetzt. 25 Die so erhaltene Mischung wurde quantitativ in das Innere einer Pasteur-Pipette überführt, die am Ende mit Glaswolle verschlossen wurde, und dazu gab man 500 mg Sephadex(R) G-25 (Pharmacia Uppsala)-Pulver. Die Pipette wurde dann weitere 16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln stehengelassen.
Zu dem Reaktionsgemisch, das aus der Pipette eluiert wurde, wurden 150 ul 0,1 mM NaOH, enthaltend 5 mg/ml NaBH«., zugesetzt und 30 min später wurden dazu 450 ul der gleichen Lösung gegeben. 30 Nach etwa 1 h wurde das Gemisch, welches das Enzym-Peptid-Konjugat (E-P) und das nichtreagierte Peptid (P) und Enzym (E) enthielt, mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, in einer Säule von Sephadex G-10, die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert). Das Gemisch wurde dann auf eine Säule (0,9 x 10 cm) von Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), äquilibriert mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, gegeben und mit 65 mM Natriumacetatpuffer, 35 pH 4,4, eluiert und auf Sephadex GlO-Säule, äquilibriert mit destilliertem Wasser, entsalzt. Das die E-P-Verbindung enthaltende Eluat und das nichtreagierte Enzym wurden gefriergetrocknet.
Das nichtreagierte Peptid wurde zuvor mit dem eingeführten Puffer eluiert und seine Unversehrtheit wurde durch IR-Spektroskopie analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten das gleiche Spektrum für das eluierte Peptid und für das als 40 Rohmaterial verwendete Peptid. So war es möglich, zu schließen, daß keine Veränderungen in dem Peptid während der Konjugationsreaktion aufgetreten waren und daß das an das Enzym gebundene Peptid folglich unbeschädigt war.
Der Grad der E-P-Konjugation, d.h. das Molverhältnis von Peptid zu Enzym in dem Konjugat, wurde bestimmt, indem die Erhöhung an Asn, Ala und Pro-Aminosäureresten in dem E-P + freies E enthaltenden 45 Gemisch im Verhältnis zu dem Ausgangsenzym E berechnet wurde.
Die Analyse der Aminosäuren wurde nach saurer Hydrolyse von E-P + E und E mit 6N HCl bei 100°C während 24 h innerhalb verschlossener Ampullen mittels eines automatischen Beckman-Aminosäureanaly-sators durchgeführt.
In Anbetracht der Tatsache, daß die Aminosäurezusammensetzung der beiden peroxidasischen Isoen-50 zyme (B und C), die in dem Ausgangs-E vorliegen, bekannt ist (L.M. Shannan et al., 1966, J.Biol.Chem. 241, 2 166), war es möglich, für ein E:P-Molverhältnis von 1, entsprechend dem reinen E-P-Konjugat, eine theoretische Erhöhung an Asp, Ala und Pro von 63% bzw. 68% bzw. 100% zu berechnen. Für die oben erwähnten Aminosäuren wurden Zunahmen von 58%, 62% und 90% gefunden, was einem E:P-Molverhältnis von 0,90-0,92 entspricht, annähernd äquivalent dem errechneten Verhältnis für das 55 reine Konjugat.
Die spezifische Restaktivität des an das Peptid gebundenen Peroxidase-Enzyms, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm mit 1,7 nM ABTS [2,2’-Azino-di-(3-ethylbenzothiazolyl-sulfonsäure)] und 0,83 mM H2O2 in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, (H.Gallati, J.CIin.Chem.Clin.Biochem. 17,1-7, 1979), war 4

Claims (12)

  1. AT 397 581 B etwa gleich 75% derjenigen des Ausgangsenzyms. Beispiel 2 5 Für diesen Test wurden 8 malariainfizierte Seren, das heparinisierte Plasma von 4 gesunden Spendern, das Serum von 3 gesunden Personen und eine Probe von malariainfiziertem Gesamtblut verwendet, indem in einem Volumenverhältnis 1:1 das malariainfizierte Serum mit dem hämolysierten und nicht-hämolysierten Gesamtblut einer gesunden Person vermischt wurde. Zu 100 ul von 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,15 M NaCI, 0,05% Tween-20 (PBS-T) und io 200 ng E-P-Konjugat, wurden zugesetzt: 1 bis 5 ul Blut oder Plasma oder Serum von gesunden Personen; oder 10 ul von PBS-T, enthaltend 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8;, 1,6; 3,2 ul Serum von malariainfizierten Personen. Die Lösungen wurden 15 bis 20 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Im Falle des Gesamtbluts wurde die Lösung zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen. 15 Anschließend wurden die Lösungen in farblose und transparente Mikropipettenspitzen aus Kunststoffmaterial gegeben, die an ihrem Ende Glaswolle und darauf ein Bett, bestehend aus einer Menge von etwa 6 ul A-Protein-Sepharose CL-4B (Pharmacia Uppsala), vorgewaschen mit PBS-T, enthielten. Die Lösungen wurden durch Schwerkraft während einer Zeit von 20 bis 30 min perkoliert, die Mikrosäulen wurden dreimal mit jeweils 200 ul PBS-T und zweimal mit jeweils 200 ul PBS (der Puffer ohne 20 Tween-20) gewaschen. Anschließend wurden zu jeder Mikrosäule 200 ul einer Substratlösung von 4-Chlor-1-naphthol (Biorad) und H2O2, hergestellt durch Vermischen zum Zeitpunkt der Verwendung von 1 Vol-Teil 4-Chlor-1-naphthol (Biorad) (3 mg/ml In kaltem Methanol) und 5 Vol-Teilen einer Lösung von 6 ul H2O2 von 30% (Vol/Vol), zugesetzt zu 10 ml PBS, gegeben. Nach 2 bis 3 min wurde die Entwicklung einer tiefblauen Farbe für die 25 positiven Proben beobachtet. Der Threshold-Wert, d.h. die minimale Menge an positivem Serum, welche eine leicht sichtbare blaue Bande bzw. Ring erzeugte, ergab 0,1 ul - 0,4 ul für zwei getestete positive Seren. Die Spezifität des Tests wurde an einem positiven, malariaverseuchten Serum (Entwicklung eines blauen Ringes mit E-P) überprüft unter Verwendung von 200 ng freiem Enzym ohne E-P jn einem Test und 30 in einem anderen Test eines großen Überschusses (3 ug) (etwa lOOfach) von freiem P in Konkurrenz mit dem vorhandenen E-P-Konjugat (200 ng). Am Ende der Reaktion wurde keine Farbentwicklung beobachtet. Keine Farbentwicklung wurde ferner in der Mikrosäule beobachtet für die Leerprobe, gebildet durch das Reaktionsgemisch mit E-P ohne Zugabe von Blut, Serum oder Plasma; für das Serum oder Plasma von gesunden Personen; für das nicht-malariainfizierte Gesamtblut; oder für menschliche 7-Globuli'ne (Globu-35 man - Bern), getestet in einer Menge, äquivalent etwa 60 ul Serum. Dies zeigte eine vollständige Abwesenheit von Störungen bzw. Überlagerungen in dem Test unter Verwendung des E-P-Konjugats an. Die Stabilität des an das Peptid gebundenen Peroxidase-Enzyms (E-P) wurde auf spektrophotometri-schem Wege bestimmt, indem in Zeiträumen von 0 bis 2 h von einer Lösung von PBS-T (100 ul), enthaltend 200 ng E-P, zu der Proben von Serum oder Plasma zugesetzt waren, Zeichnungen bzw. Skizzen 40 gemacht wurden. Nach 2 h zeigten die erhaltenen Ergebnisse eine unveränderte Peroxidase-Aktivität. Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P. falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichen Blut und/oder seinen Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß (a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen Antisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthetisches Antigen-Enzym-Kom-plex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden; 50 (b) der Antikörper dieses Komplexes mit den Proteinen, die auf einem festen Träger adsorbiert und/oder chemisch gebunden sind, gebunden wird, und schließlich (c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Antigen das sequentielle Polypeptid bzw. die Polypeptid-Sequenz (Asn-Ala-Asn-Pro)n 5 55 AT 397 581 B ist, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40 hat,und das Protein ein A-Protein ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n im Bereich von 10 bis 20 liegt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Enzymen, die eine kolorimetrische Reaktion mit einem spezifischen Substrat zu liefern vermögen.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Peroxidase und/oder alkall· io sehe Phosphatase ist.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25* C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 15 bis 20 Minuten durchgeführt wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein Polysaccharid oder Plastik- bzw. Kunststoffmaterial ist.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharid-Träger Cellulose, Agarose und dergl. sind. so
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25 * C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 20 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
  10. 10. Verfahren zur Herstellung des im Anspruch 1 verwendeten Konjugats, dadurch gekennzeichnet, daß 25 das Konjugat hergestellt wird, indem in homogener Phase in NaHC03 bei Raumtemperatur (20-25 * C) im Dunkeln das oxidierte Enzym mit einem molaren Überschuß von (Asn-Ala-Asn-Pro)n-Polypeptid, worin n die oben angegebene Bedeutung hat, umgesetzt wird.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis des Polypeptids zu 30 dem Enzym in dem Konjugat gleich oder etwa gleich 0,92 ist.
  12. 12. Diagnostische Ausrüstung für die Bestimmung bzw. den Nachweis und die Messung von Anti-P. falciparum-Sporozoit-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, definiert in Anspruch 1, und Proteine verwendet werden. 35 40 45 50 6 55
AT0338987A 1986-12-23 1987-12-22 Verfahren zur bestimmung von anti-p.falciparum- sporozoit-antikörpern im menschlichen blut AT397581B (de)

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