DE2851150A1

DE2851150A1 - Verfahren zum testen auf das vorhandensein eines analyten

Info

Publication number: DE2851150A1
Application number: DE19782851150
Authority: DE
Inventors: Michael W Burgett; Richard A Harte
Original assignee: International Diagnostic Technologies Inc
Current assignee: Whittaker Corp
Priority date: 1977-11-25
Filing date: 1978-11-25
Publication date: 1979-06-07
Also published as: JPS5486611A; FR2410278B1; US4294817A; DE2851150C2; GB2008747A; JPH0220944B2; FR2410278A1; CA1111346A; GB2008747B

Description

J. RICHTER F. WERDERMANN

DlFU-INS. DJFL.-ING.

HAMBURG

PATE NTANWÄLTE (ß

■ t-

2OOO HAMBURG 36

NEUER WALL 1O TEL. CO4O) 34OO45 34 OO 56 TELEGRAMME: INVENTIUS HAMBURG

2 h W_c /J

IHR ZEICHEN:

χ 73 532 DH

PATENTANMELDUNG

2. 18. September I978

(entspricht US-Anm. Serial No. 9^3

PRIORITÄT: 1. 25. November 1977

(entspricht US-Anm. Serial No 854- 613)

BEZEICHNUNG:

AIiMELDER;

ERFINDER;

Verfahren zum Testen auf das Vorhandensein eines Analyten.

International Diagnostic Technology, Inc.

2551 Walsh Avenue

Santa Clara, Kalif.,V.St.A₈

Michael W. Burgett 21 Sea Crest Court El Granada, Kalif.,V.St.A.

Richard A. Harte

693 Upland Road

Redwood City, Kalif.,V.St.A.

909823/0661

Konten: Deutsche Ban!: AQ Kamburg (BLZ 20070000) Konto-Nr. 8/10055 · Postscheckamt Hamburg (BLZ 20010020) Konto-Nr. 282080-201

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen auf das Vorhandensein eines Analyten, wobei die Testprobe eine unbekannte Menge eines störenden Stoffes enthalten kann.

Rubella oder Röteln sind eine harmlose Kinderkrankheit von kurzer Dauer. Sie wäre von geringer Bedeutung, gäbe es nicht' die schweren Schäden bei Neugeborenen, die aus einer Rötelinfektion im Mutterleib im ersten.Vierteljahr der Schwangerschaft resultieren. Somit ist die Bestimmung des Immunitätszustandes bei einzelnen Personen als Mittel zur Verhütung dieser Geburtsschäden wichtig. Serologische Bestimmungen von Röteln werden zur Feststellung des Immunitätszustandes bei einzelnen Personen in einer vorgegebenen Population (insbesondere Frauen im gebärfähigen Alter) eingesetzt, so daß diejenigen geimpft werden können, die ohne Schutz sind. Die Bestimmungen werden zur Einschätzung des Immunitätszustandes bei Schwangeren herangezogen, um ihnen bei der Möglichkeit von Infektionen im Mutterleib helfen zu können. Schließlich dient die serologische Rubella-Bestimmung als diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Krankheiten mit Exanthemen oder Ausschlagbildung.

Gegenwärtig steht eine Anzahl von Verfahren der Erkennung von Antikörpern des Rubellavirus zur Verfügung. Das gebräuchlichste ist die Probe auf eine Haemaglutinations-Inhibition (HAI), die Serum-lTeutralisationsprobe, die

909823/0661

Complement-Fixierungsprobe (CP) und. die indirekte Immunofloureazenzprobe (IS¹).

Bestimmte Viren, die Rubella, einschließen, besitzen die Fähigkeit, sich mit roten Blutkörperchen zu verbinden und diese zum Verkleben zu bringen (Haemaglutination). Wenn sich nun Rubella-Antikörper mit dem Virus verbinden, so verhindern sie die Verklebung roter Blutkörperchen. Stewart u.a. (Stewart, G.L.; Parkman, P.D.; Kopps, H.E.; Dougalfi, R.D.; Hamilton, J.P.; und Meyer, H.M. in New Eng. J. Med. 276 : 554 (1967) ) verwendeten diese Eigenschaft des Rubellavirus zur Entwicklung der Probe auf Haemaglutinations-Inhibition (HAI oder HI). Da die HI-Probe als erste beschrieben worden war, sind viele Abwandlungen dieses Verfahrens hervorgebracht worden. Dies hat die Zentralstelle für Krankheitsüberwachung des US-Gesundheitsministeriums (CDC - Center for Disease Control) veranlaßt, ein standardisiertes Verfahren anzubieten, nämlich den standardisierten Haemaglutinations-Inhibitionstest (Bezeichnung: "Immunology Series Ho. 3 U.S.D. H.E.W.', C»D.C., Atlanta, Georgia, V_oSt.A., Oktober 1970).

Die S'erum-Neutralisationsprobe auf Rubella, die zuerst von Parkman u.a_o (Parkman, P.D.; Buescher, E.L.; Artenstein, M.S. in Proc. So. Exp. Biol. Med. j} : 225 (1962)) beschrieben worden ist, beruht auf der Tatsache, daß mit Antikörpern kombinierte Viren nicht mehr infektionserzeugend sind.

909823/0681

Für Rubeile ist ebenfalls eine Complement-Fixierungsprobe von Linette, E.H., in "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Diseases", 3. Auflage, New Kork 1964, American Public Health Association, Seite 1 bis 66, beschrieben worden. Diese beruht auf der Fähigkeit des AntikÖrper/Rubellavirus-Komplexes, ein Komplement zu binden oder zu fixieren.

Brown u.a. (Brown, G.G.; Massab, H.F.; Veronelli, J.A.; und Francis, T., Jr. ) haben nach Science 145 : 94-3 (1964) und Schaeffer u.a. (Schaeffer, M.; Orsi, E.V.; und V/idelock D.j ) nach Bact. Rev. 28 : 402 (1964) eine indirekte Immunofluoreszenzprobe auf Rubella entwickelt. Bei dieser Probe wurden mit Rubella infizierte Zellen auf Hikroskopschiebern fixiert. Die fixierten Zellen wurden einer Inkubation mit aufgelösten Serumproben unterzogen. Rubella-Antikörper in der Serumprobe verbinden sich dabei mit Rubella-Antigenen in den fixierten Zellen« Die Rubella-Antikörper auf den Zellenwurden dabei mit einem mit fluoreszierendem Anhängerstoff markierten Antihuman-Immunoglobulin-Antikörper festgestellt.

Wenn auch diese Rubella-Tests bekannt sind, so leiden sie wegen ihrer klinischen Komplexität an einer Anzahl von Wachteilen, auch wegen des Kostenaufwandes, des Zeitbedarfs und wegen ihrer quantitativen Zuverlässigkeit, und aus diesem Grund ist es wünschenswert, einen neuen Rubella-Test zu entwickeln, bei dem Rubella durch eine immunolo-

909 8 2 3/0661

gische Probe auf Fluoreszenz rasch und kostengünstig, mit verläßlichen quantitativen Ergebnissen festgestellt werden kann_o

Eine Anzahl von Entwicklungen sind im Bereich der Fluoreszenz-Iraraunitätsproben ausgeführt worden, wobei Patienten auf einen bestimmten Bestandteil in einem Körpermedium oder einer Körperflüssigkeit dadurch getestet werden können, daß man:

(a) ein bekanntes Auster oder eine Probe des -Bestandteils an einen Träger bindet,

(b) die Trägeroberfläche mit einer Probe der Körperflüssigkeit oder des Körpermediums in Berührung bringt, derart, daß die darin befindlichen Antikörper von dem Bestandteil auf der Trägeroberfläche angezogen werden können,

(c) die Oberfläche mit einem fluoreszierend markierten zweiten Antikörper zum ersten Antikörper in Berührung gebracht wird, und die Fluoreszenz der resultierenden Oberfläche gemessen wird.

Wie beispielsweise in den nachfolgenden Patentschriften angegeben, sind eine Anzahl von Techniken und Vorrichtungen entwickelt worden, durch welche die fluoreszente immunologische Probe einen neuen Stand der quantitativen Verläßlichkeit und der bequemen Durchführbarkeit erreicht hat: US-PS 3 992 631 - Erfinder: Richard A. Harte US-PS 3 999 948 - Erfinder: Fred H. Deindoefer u.a.

909823/0661

US-PS 4 020 151 - Erfinder: Gunner Bolz u.a. US-PS 4 025 310 - Erfinder: Gunner Bolz u.a. US-PS 4 056 724 - Erfinder: Richard A₀ Harte.

Eine Anpassung dieser neuen Techniken der fluoreszenten immunologischen Proben auf einen Rubella-Test ist ein sehr wünschenswertes Endergebnis, ruft jedoch wesentliche Schwierigkeiten bei der Bestrebung hervor, zuverlässige quantitativen Ergebnisse zu erhalten. Augenscheinlich wirken viele gleichzeitig wirksame Substanzen'störend auf das eigentliche Verfahren zur Probe auf Immunität ein, wenn solche Testverfahren auf Rubella angesetzt werden.

Daher ist es Aufgabe der Erfindung, ein neuartiges Testverfahren der eingangs definierten Art zu schaffen, bei dem der Einfluß störender Stoffe weitgehend ausgeschaltet ist, und das quantitativ verläßliche Ergebnisse liefert und dabei rasch und einfach, ohne hohen Kostenaufwand auszuführen ist»

Das zur Lösung der gestellten Aufgabe vorgeschlagene, erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß es die Präparierung einer ersten Oberfläche umfaßt, an die ein Antigen als Analyt gebunden wird, auf den der störende Stoff einwirken kann, daß eine zweite Oberfläche . präpariert wird, die dafür ausgelegt ist, ein breites Spektrum von Proteinsubstanzen einschließlich des genannten störenden Stoffes zu binden, doch die keine wesentliche

909823/0661

Wenge des genannten Analyten bindet, daß mit der genannten ersten und zweiten Oberfläche eine immunologische Probe an einer unbekannten Serumprobe in ein- und derselben Menge an Probenserum ausgeführt wird, daß daran anschließend gleichzeitig die beiden Oberflächen in eine Menge einer mit einem Anhängerstoff versehenen Substanz eingetaucht wird, und daß schließlich die Differenz zwischen den Beträgen an mit Anhängerstoff versehener Substanz auf der ersten und der zweiten Oberfläche gemessen wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine fluorimetrische immunologische Probe für Anti-Rubella-Antikörper entwickelt worden, die einige der oben erwähnten neuen Techniken und Vorrichtungen für fluorimetrische immunologische Proben an Oberflächen in Einsatz bringt. Der neue Test besteht aus einer Anzahl miteinander in Verbindung gebrachter Merkmale und zusätzlich ein Zwei-Oberflächen-Testverfahren, das in seiner Ganzheit neu in diesem Bereich ist.

So ist nach der Erfindung ein Zwei-Oberflächen-Testverfahren entwickelt worden für immunologische Proben an Oberflächen, wobei das Virus-Antigen direkt an die Testoberfläche gebunden ist.

In gleicher Weise ist herausgefunden worden, daß eine immunologische Oberflächenprobe mit Antigen-Auszügen von Bakterien oder Protozoen ausgeführt werden kann, die an die

909823/0661

Testoberfläche gebunden sind, während immunologische Proben dieser Art bisher nur mit vollständigen Organismen ausgeführt worden sind.

Der neue Zwei-Oberflächen-Test ermöglicht immunologische Proben, die bisher nicht möglich gewesen sind, wegen der einander aufhebenden, gleichzeitig ablaufenden Reaktionen. Wenn auch der Mechanismus, mit dem die Reaktionen bei der Probe ablaufen, nicht vollständig erkannt ist, so wird angenommen, daß die fluorimetrische immunologische Probe auf Anti-Rubella-Antikörper gleichzeitig, gewissermaßen im "Wettstreit" miteinander ablaufende Reaktionen mit Immunoglobulinen oder anderen Serumbestandteilen kompliziert wird. Diese miteinander auftretenden Reaktionen werden vom eigentlichen Endergebnis der Probe durch ein neues Verfahren isoliert, in welchem zwei Testoberflächen anstelle einer einzigen zusammen jedes Stadium der Probe durchlaufen, wobei die erste Oberfläche den Gegenstand der Probe bindet, nämlich Anti-Rubelle-Antikörper, während die zweite Oberfläche die gleichzeitig in Reaktion tretenden Proteine bindet, die ansonsten störend auf die Zuverlässigkeit der Probe eingewirkt hätten. Gemäß dem neuen Verfahren wurden die beiden Testoberflächen, die zusammen die Probe durchliefen, abschließend quantitativ auf einen markierenden Anhängerstoff untersucht, der vorzugsweise fluoreszierend ist, und das Ergebnis der Probe wird als Meßwertdifferenz zwischen den Fluoreszenzmessungen auf den beiden Oberflächen genommen.

909823/0681

Die beiden Testoberflächen können in einer Vielfalt von Weisen präpariert werden, aber vorzugsweise und aus herstellungstechnischen Gpünden v/erden die beiden Testoberflächen aus gleichem Material hergestellt, wobei die Testoberflächen von einem Probenträger getragen werden, mit die Oberflächen im Verlauf der Probe transferiert werden können. Vorzugsweise werden die Testoberflächen nach dem Verfahren gemäß der Patentanmeldung P (entsprechend der US-Anmeldung Serial No. 845 669, eingereicht am 26.10.1977, Erfinder Naomi Kameda) derselben Anmelderin präpariert. Vorzugsweise wird die Testoberfläche aus einem porösen Copolymer hergestellt, an das sich die '^estsubstanz (das Antigen des Rubellavirus) anch der Trocknung bindete Sine geeignete Copolymer-Oberflache ist ein unter der US-Handelsbezeichnung "Millipore" auf dem Markt verfügbares Material, das ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat ist. Unter bestimmten Bedingungen können die folgenden Stoffe auch als Trägermaterialien verwendet werden:

Polymere Kohlenwasserstoffe, wie Polystyrol, Polyaethylen, Polypropylen, Polybutylen, Butylkautschuk, und andere synthetische Kautschukarten, silastischer Kautschuk, Polyester, Polyamide, Zellulose und Zellulosederivate, Acrylate, Methacrylate, und polymere Vinylverbindungen, wie Vinylchlorid und Polyvinylfluorid. Copolymere wie aufgesetzte Copolymere mit Polystyrol sind ebenfalls geeignet. Zusätzlich zu den vorgenannten Materialien

909823/0681

kann die feste Trägeroberflache Kieselerdegel, Siliziumplättchen, Glas, unlösliches Biweiß und metallische Oberflächen, wie beispielsweise mit Tantal beschichtetes Glas, umfassen.

Die zweite Oberfläche kann an einen anderen immunologisch aktiven Analyten (ein Antigen zur Kontrolle, beispielsweise aus nicht infizierten Zellen) gebunden sein, der die gleichzeitig reagierenden Proteine des Blutserums, wie !lipoproteine und Immunoglobuline bindet, aber es ist festgestellt worden, daß die zweite Testoberfläche aus demselben Material, wie beispielsweise "Millipore" wie bei der Test-Oberfläche für den Rubellavirustest bestehen kann, ohne daß irgendeine Proteinsubstanz anfangs an sie gebunden wird.

Wie oben angedeutet, sind die beiden Testoberflächen vorzugsweise auf Probenträgern angebracht, die den Transport der Testoberflächen während der ganzen Probe erleichtern. Vorzugsweise sind beide Testoberflächen auf einem einzigen Probenträger angebracht, für eine zusätzliche Vereinfachung beim Transport der Testoberflächen während der ganzen Probe, und dies ist besonders vorteilhaft beim vorliegenden Anti-Rubella-Test, wo eine unbeschichtete Oberfläche als zweite Oberfläche eingesetzt wird, weil die Verfahrensschritte zur Bindung eines Rubellavirus an die erste Oberfläche nicht die Präparierung der zweiten Testoberfläche erschweren. Die Anti-Rubella-Testoberfläche nach der Erfindung wird nach den Merkmalen der intensiven Trocknung

909823/0661

und Vorwäsche der oben erwähnten Patentanmeldung (Erfinder Naomi Kameda) präpariert, und bei der vorliegenden Erfindung werden zusätzliche Vorteile dadurch erhalten, daß der Schritt der intensiven Trocknung bei starker Abkühlung, d.h. bei Temperaturen im Bereich von etwa O bis 10 ⁰G und vorzugsweise 2 bis 6 ⁰G ausgeführt wird.

Der erfindungsgemäfle Probenträger, bei dem ein Virus-Antigen an einen polymeren Träger gebunden ist, kann auch vorteilhaft in immunologischen Proben eingesetzt werden, die anders als die ^roben in den folgenden speziellen Ausführungsbeispielen sind. Dies gilt beispielsweise dort, wo der Probenträger mit dem Virus-Antigen, das an ihn gebunden ist, Proben durch radio-immunologische oder mit Enzym-Markierung arbeitende Verfahren anstelle der fluorimetrischen immunologischen Probe unterzogen wird. Außerdem können die erfindungsgemäßen Probenträger mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Virus-Antigen, mit Antigenen von anderen Viren als dem Rubella-Virus, beispielsweise von dem Virus "Herpes Simplex I" und dem Cytomegalovirus (dem Erreger der Zytomegalie) ausgeführt werden. Das Material kann auch mit Antigenen von Protozoen-Parasiten, wie Toxoplasma gondii, und Bakterien vom Stamm "Treponema pallidum" ausgeführt werden. Schließlich wird ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem zwei Oberflächen derselben Behandlung einschließlich Inkubation mit einer unbekannten Serumprobe und anschließender Messung der Differenz an

909823/0661

an zur Markierung dienenden Anhängerstoffen auf beiden Oberflächen allgemein in einer weiten Vielzahl von immunologischen Proben eingesetzt werden kann, um zusammenhängende, verläßliche Ergebnisse trotz der Anwesenheit störender Stoffe bei dem Probenträger mit dem unbekannten Serum zu erhalten, die normalerweise die Ergebnisse der Probe mehrdeutig machen würden. So kann beispielsweise eine immunologische Probe auf die quantitative Feststellung von Antikörpern gegen den Syphilliserreger Treponema pallidum in Seren ausgeführt werden, wie es in einem der nachfolgenden Ausführungsbeispiele angedeutet wird.

Sind einmal die Oberflächen für den Test vorbereitet worden, so wird die Probe durch aufeinanderfolgendes Bewegen beider Testoberflächen durch die folgenden Medien ausgeführt:

(a) eine verdünnte auf Anti-Rubella-Antikörper zu testende Serumprobe,

(b) eine Waschlösung, hergestellt aus einer gepufferten Salzlösung,

(c) eine gepufferte Salzlösung, die fluoreszierend markierte Antihüman-Immunoglobuline enthält, und schließlich

(d) eine abschließend eingesetzte Waschlösung.

Dann wurden die beiden Oberflächen auf das quantitative Vorhandensein von floreszierendem Anhängerstoff ausgemessen, dabei wird vorzugsweise ein Fluareszenzmeßgerät der Anmelderin vom Typ FIAX 100 verwendet. Die Fluores-

909823/0661

zenzmeßwerte der beiden Oberflächen werden voneinander subtrahiert, um eine Meßwertdifferenz zu ergeben. Schließlich wird die Meßwertdifferenz mit einer Kennlinie aus den aus ■Kontroll-Serumlösungen mit vorbekannten Mengen erkannter Anti-HubelIa-Antikörper verglichen und, sofern in geeigneter Weise programmiert, können diese -Berechnungen mit dem FIAX 100-Fluoreszenzmeßgerät mit einem Mikroprozessor-Zusatz durchgeführt werden. Wie dem Fachmann der Immunologie-Probentechnik bekannt, kann das Verfahren in einer Anzahl von Arten abgewandelt werden, doch ist festgestellt worden, daß das speziell zur Veranschaulichung dienende, nachfolgende Ausführungsbeispiel reprodu: zierbare und für den kommerziellen Gebrauch befriedigende Ergebnisse hervorgebracht hat.

Ausführungsbeispiel 1 - Die Vorbereitung der Probenträger

Für das im folgenden beschriebene Ausführungsbeispiel wurden Probenträger präpariert, die eine kreisrunde Scheibe mit einem Durchmesser von 6,6 mm aus dem Material mit der US-Handelsbezeichnung "Millipore" Typ "HAMK" enthielten. Dieses Material ist ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, das als Sperrfiltermaterial zur Ausfilterung von Teilchen einer Größe von über 0,45 /um ausgelegt ist. Eine große Anzahl von Probenträgern wurde in der folgenden Weise präpariert:

Eine im Handel verfügbare Rubella-Antigenlösung wurde zum präparieren der Probenträger verwendet. Eine annehmbare Substanz muß einen Haemaglutinationstiter bei Verwendung

909823/0661

von Erythrozyten einen einen Tag alten Kükens als Indikatorzellen von mehr als 1:128 und eine Proteinkonzentration von weniger als 11 Milligramm/Milliliter aufweisen. Das Diagnose-Antigen für die Haemaglutinatlons-Inhibitionsprobe (HI) aus der Charge Nr. C96 1296 wurde von den Flow-Laboratorien Rockville, Maryland, V.St.A., erworben, erfüllte diese Anforderungen und wurde im weiteren verwendet.

Eine Menge von 25 /ul der Antigenlösung wurde auf jeden der Probenträger aufgebracht. Die feuchten Probenträger wurden in eine Trocknungskammer bei O bis 1O⁰G eingelegt. Andere Experimente zeigen an, daß Temperaturen von 0 bis 25°C annehmbare Ergebnisse lieferten. Durch eine Menge von Calciumchlorid mit der US-Handelsbezeichnung "Drierite" wurde die Trocknungskammer trockengehalten, dieses Calciumchlorid wurde alle 2A- Stunden ersetzt.

Die Probenträger wurden in der Trocknungskammer 48 Stunden gehalten, nach dieser Zeit waren die Probenträger mit der Trocknungsluft bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von weniger als etwa 10$ im Gleichgewichtszustand. Dann wurden die Probenträger aus der Trocknungskammer entnommen.

Dann wurde eine Waschlösung bereitet, die 0,05 mol "Tris" (Hydroxymethyl)-Aminomethan-Pufferlösung mit einem p_H-Wert von 8,6 mit 0,1.5 mol Natriumchlorid (Kochsalz), 0,1$ NaN, und 0,35$ "Tween 20" oder Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat enthielt. Die getrockneten Probenträger wurden zehn Minuten

909823/0661

lang in der Waschlösung getränkt, und dann wurde die Waschlosung von den Probenträgern abgeschüttelt, die Probenträger in die Trocknungskammer zurückgebracht und dort 18 Stunden lang getrocknet, nach dieser Zeit erschienen sie bei der Sichtprüfung trocken.

Ausführungsbeispiel 2 - ffluorimetrische immunologische Probe

Eine Wasch-Pufferlösung wurde mit 0,35$ "Tween 20" oder PoIyoxyaethylensorbitan-Monolaurat, das einer mit "Tris" oder Hydroxymethylaminomethan gepufferten Salzlösung beigefügt worden war, gelagert und abgekühlt. Es wurde eine Pufferlösung zur Verdünnung bereitet, die 0,35/0 "Tween 20" oder Polyoxyaethylensorbitan-Monolaurat und 2,5% Albumin aus Rinderserum in mit "Tris" oder Hydroxymethylaminomethan gepufferter Salzlösung enthielt. Vier Lösungen, I bis IV, wurden zur Eichung aus rekalzlfiziertem und entfettetem Humanplasma mit aus der Probe auf Rubella durch Haemaglutinations-Inhibition bekannten Titern zubereitet. Der angenäherte Rubella-Titer jeder Eichungslösung wird in der nachfolgenden Tabelle I gegeben:

Tabelle I

Eichungslösung Angenäherter Rubella-Titer (Kehrwert

der stärksten Verdünnung, die noch eine Haemaglutinations-Inhibition ergibt)

I 512

II 64-

III 10

IV 5

Ein Reagensröhrengestell wurde mit 12x75 Reagensröhren mit Kulturen vorgesehen. Ein Milliliter der Verdünnungs-Puffer-

909823/0661

lösung wurde den Reagensröhren in der ersten Reihe zugesetzt, und ein Milliliter der Wasch-Pufferlösung in der zweiten und vierten Reihe. In die Röhren der dritten Reihe wurde ein Milliliter eines fluoreszierenden Reagens eingebracht, das aus Antikörpern der Ziege auf Human-Immunoglobulin bestand, wobei diese Antikörper mit Fluoreszin-Isothiozyanat als Anhängerstoff versahen und in einer mit "Tris" gepufferten Salzlösung, mit einem pjj-Wert von 8*4, mit 2,5?° Albumin aus Rinderserum und 035$ "Tween 20" verdünnt worden war. Bei der ersten Reihe von Reagensröhren wurde eine Menge von 25 Millilitern einer unbekannten Probe oder eine -^ichlösung jeder Röhre zugesetzt. Eine Reagensröhre wurde für jede der Eichlösungen und eine Röhre für jede der Serumproben verwendet.

Das Reagensröhrengestell wurde auf eine Horizontal-Schüttelvorrichtung bei Raumtemperatur gestellt, dabei waren die Reagensröhren unter einem Winkel von 45 ° aufgestellt, so daß diese während der gesamten Probendurchführung bewegt werden konnten„

Die wie oben erläutert präparierten Probenträger wurden in die erste Reihe.von Reagensröhren eingebracht, wobei jede Röhre eine Oberfläche mit dem gebundenen Rubella-Antigen und eine Oberfläche zur Kontrolle enthielt, und man ließ die Probenträger dreißig Minuten lang der Bewegung ausgestzt. Dann wurden die Probenträger zu den Reagensröhren in der zweiten Reihe verlegt, und es und es wurde ein Schüttelvor-

909823/0661

gang von fünfminütiger Dauer ermöglicht, um von den Testoberflächen jegliche überschüssigen Serumbestandteile abzuwaschen, die nicht an die Testoberflächen gebunden waren. Dann wurden die Probenträger in die dritte Reihe der Reagensröhren gebracht, und ein Schüttelvorgang von JQ Minuten
Dauer ermöglicht, während irgendwelche auf den Probenträgern vorhandenen Antikörper zu Rubellaviren und jegliche gleichzeitig mit diesen in Reaktionen tretenden Serumproteine mit den fluoreszierend markierten Antihuman-Immunoglobulinen reagieren konnten. Schließlich wurden die Probenträger in die vierte Reagensröhrenreihe gebracht, und es wurde zur
abschließenden Waschung ein zehnminütiger SchuttelVorgang ermöglicht. Bei jeder Verlegung der Probenträger wurde sowohl jeweils die an den Anti-Rubella-AntikÖrper gebundene Oberfläche, als auch die zugehörige Oberfläche zur Kontrolle transferiert, derart, daß jeweils ein Testoberflächenpaar jedes Reagensglas durchlief.

Die wie oben beschrieben behandelten Testoberflächen wurden auf fluoreszierende Substanz in einem Fluoreszenzmeßgerät vom Typ FIAX 100 der Anmelderin gemessen, und die dabei
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II niedergelegt, wobei die Abkürzung "FSS" die Fluoreszenz-Signaleinheiten des Fluoreszenzmessers angibt.

909823/0661

28511

Tabelle II

Ein typisches Experiment: die	100	Anmerkungen:	in	Probe	wurde	ausgeführi	FIAX- Titer (Zwei- ob er f. (A)	FIAX- Titer (Nur ) Rub.- Oberf.- Prob en- träger) (B)	Haemaglu- tinations- Inhibitions- Titer (HAI) (σ)
	69	Kontroll- Ob erfl. - Proben träger FSE	:, wie	—	—	1024
	56	25	den Anmerkungen angegeben.	—	—	320
Proben- Rubeila- Kennzahl Oberfl.- Proben träger FSE	32	26	Meß- wert- diff. AFSE	—	—	64
Eichl. I	25	-23	75	—	—	16
Eichl.II	29	24	43	<5	6,5	<8
Eichl.III	22	35	32	<5	9,5+	<8
Eichl.IV	30	31	8	<5	5,0	< 8
1(R 140)	33	26	-10	<5	10,0+	<8
2(R 142)	25	33	- 2	<5	14,0+	< 8
3(R 143)	38	40	- 4	<5	6,5	<8
4(R 144)	39	33	_ ^	20	20,0	16
5(R 14-5)	53	23	- 7	17	22,0	16
6(R 146)	39	26	- 8	34	60,0+	32
7(R 161)	52	32	15	24	22,0	32
8(R 162)	46	22	13	60	68,0	64
9(R 165)	64	24	21	47	40,0	64
10(R 167)	49	21	17	145	190,0	128
11(R 178)	26	28	42	54,0	128
12(R 179)	25	25
13(R 195)		38
14(R 196)	24

(A) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen . des HAI-Titers über der Meßwertdifferenz AI¹SE = FSE für Rubella-StiQ"-Probenträger abzüglich FSE für Kontroll-StiQ"-Probenträger erzeugt worden war.

(B) Werte bestimmt aus einer Eichkurve, die durch Auftragen des HAI-Titers über den FSE-Werten für Rubella-StiQ"-Probenträger erzeugt worden war,

(C) HAI-Titer: bestimmt durch die Haemaglutinations-Inhibition (siehe standardisierter HAI-Eest auf Rubella, Immunol.

909823/0681

Reihe Nr. 2, US-Gesundheitsministerium, Zentralstelle für Krankheitsüberwachung, Atlanta, Gergia, Oktober 1970)· Die Titerwerte sind die Kehrwerte der stärksten Verdünnung der Serumprobe, die noch die Haemaglutination zu verhindern vermag. Dieser Test wird als Referenzverfahren für Rubel1abestimmungen angesehen.

Hinweis: Die Proben mit den Kennzahlen 2, 4, 5 haben falsche positive Titer (*· 8) beim Binzel-StiQ^H-Verfahren, jedoch negative Titer (<" 8) beim Doppel-StiQ"-Verfahren. Es liegt auch eine allgemein bessere Übereinstimmung zwischen dem FIAX-Titer und dem HAI-Titer bei dem Doppel-StiQ^H-Verfahren als bei dem Einzel-StiQ"-Verfahren vor.

Ausführungsbeispiel 5 - Zweioberflächen-Verfahren mit Anti-Treponema-Antikörpern

In einer der oben beschriebenen Vorgehensweise ähnlichen Verfahrensweise wurden Probenträger präpariert, mit aus "Millipore" Typ ¹¹HAMK" hergestellten aktiven Oberflächen. Eine Gruppe von Probenträgern wurde mit einer Menge von 10 /ul an speziell gereinigten FTA-ABS-Antigenen (Beckman, Katalog-Nr. 251041 - Charge Nr. E6 OO135) betupft und bei 0 bis 8° zwanzig Stunden lang bei einer relativen Feuchtigkeit von weniger als 10$ getrocknet.

Es wurde eine Gruppe von Proben vorbereitet, durch Verdünnung reaktionsfähiger "Treponema pallidum"-Seren (d.h. Seren, die Antikörper zu Treponema pallidum. enthielten) und nicht mit Treponema pallidum reaktionsfähiger Seren (d.h. Seren, die keine Antikörper zu Treponema pallidum enthielten). Diese verdünnten Proben wurden mit normalem Kaninchenserum

909823/0661

hergestellt. Weitere Verdünnungen der reaktionsfähigen und nicht reaktionsfähigen Seren wurden mit einer Pufferlösung bereitet, die 0,05 mol "Tris" HCl, pg-Wert 8,2, 0,15-mol- SaOl, 0,005 mol EDTA, Q,1# "Tween 20" und 2^ Albumin aus Rinderserum enthielt.

Diese Verdünnunegn wurden hergestellt, um die unten angegebenen endgültigen Probenlösungen zu schaffen. Ein Paar aus je einem behandelten und einem unbehandelten Probenträger wurde in jede der Serumproben eingebracht und 30 Minuten geschüttelt. Dann wurden die Probenträger zehn Minuten lang in einer Pufferlösung gewaschen und dann 30 Minuten in einer Verdünnung im Verhältnis 1:50 von mit Pluoreszin-Isothiozyanat als Anhängerstoff markiertem Antihuman-Immunoglobulin geschüttelt und schließlich zehn Minuten lang gewaschen. Die beiden Probenträger wurden dann in einem Pluoreszenzmeßgerät, Typ PIAX 100, der Anmelderin auf fluoreszierenden Stoff mit den folgenden Ergebnissen (in Tabelle III) gemessen:

Tabelle III

Probe Endgültige	Antigen	Kontrolle	Meßwertdifferenz
(Serum) Lösung (Verd)	PSE	PSS	APSE
reaktionsfähig 1:10	56	30	26
reaktionsfähig 1:20	46	28	18
reaktionsfähig 1:40	37	28	9
nicht reaktfg. 1:1O	89	120	-31
nicht reaktfg. 1:20	52	61	- 9
nicht reaktfg. 1s40	34	41	_ η

Dadurch,, daß gerade die Antigen-Probenträger Verwendung fanden,

909823/0 661

zeigen die nicht reaktionsfähigen Seren eine höhere Fluoreszenz als die Antigen-Probenträger mit reaktionsfähigen Seren. Die Meßwertdifferenz ^FSE (die Fluoreszenz-Signal einh exten des Antigen—Probenträgers abzüglich der Fluoreszenz-Signaleinheiten des leeren Probenträgers zur Kontrolle) war bei reaktionsfähigen Seren viel höher als bei nicht reaktionsfähigen Seren.

Ausführungsbeispiel 4- - Zweiseitiger oder Zweioberflächen-Probenträger

In derselben Weise wie oben beschrieben, wurde eine Testreihe durchgeführt, dabei wurde für jede unbekannte Substanz der Test einmal mit zwei Probenträgern und ein zweites Mal mit einem einzigen Probenträger mit zwei Testoberflächen auf seinen einander gegenüberliegenden ^eiten mit den nachfolgend in Tabelle IV aufgestellten Ergebnissen durchgeführt, die anzeigen, daß annehmbare Ergebnisse mit den beiden Testoberflächen auf einem einzigen Probenträger erhalten werden.

Die Testverfahren stimmten überein bis auf den Unterschied, daß bei jedem Test mit zwei Probenträgern die verwendete Serumprobe 15 /ul Serum in 600 /Ul einer Pufferlösung darstellte, während bei den Tests mit den doppelseitigen Probenträgern die verwendeten Serumproben 25 /ul Serum in 1000/ul Pufferlösung umfaßten. Ss kann also bei dem doppelseitigen Probenträger weniger üösiing

909823/0661

verwendet werden, um die aktiven Oberflächen mit der

Lösung bedeckt zu halten.

Tabelle IV

Probe Erwarteter Titer mit doppelsei- Titer mit zwei Nr. Tjter tigern Probenträger Probenträgern

18 5 5

2.8 5 5

3 8 6 6

4-8 7 7

5 ■ 8 - 5 5

6 8 10 13

7 8 9 "8

8 8 6 8

9 8 8 10 -tO 8 19 18

11 8 19 21

12 8 11 14

13 . ' 8 " 12 1? 1A- 8 12 12

15 8 14 12

16 8 8 8

17 16 20 29

18 16 34- 36

19 16 22 31

20 32 52 56

21 32 52 94

22 64 476

23 64 52 44

24 128 106

25 128 73 81

26 256 249

27 512 202

909823/0661

28511

Ausführungsbeispiel <p - Zweioberflächen-Probe auf den Virustyp "Herpes Simplex I" (HSV-1) und den Cytomegalovirus (CMV)

Bs wurde eine Testreihe durchgeführt, um zu demonstrieren, daß das Verfahren nach der Erfindung für Proben auf HSV-1 und CMV geeignet ist. Diese Tests wurden, wie oben beschrieben, unter Einsatz von zwei Probenträgern und in Pufferlösung im Verhältnis 40:1 aufgelösten Serumproben ausgeführt. Für die Probe auf HSV-1 wurden die Probenträger wie folgt präpariert:

Eine kreisförmige Scheibe mit einem Durehmesser von 6,6 mm, aus "Millipore", Typ "HAMK", ein Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, wurde durch einen doppelseitig klebenden Streifen an einem Probenträger befestigt, und dann wurden 25 /ul eines im Handel verfügbaren HV-CF-Antigens (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 40-607-44, Charge Nr. V9480J6) auf die Scheibe getupft. Zur Kontrolle wurde eine andere Menge von 25 /ul HV-CF-Gewebekontroll-Antigen (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-607-44, Charge Nr. V948O55 C) auf eine andere Oberfläche desselben Typs getupft. Sowohl der Probenträger mit dem Antigen, als auch der Probenträger zur Kontrolle wurden bei 10$ relativer Feuchtigkeit bei 0 bis 8 ⁰C 24 Stunden lang getrocknet.

Für die Probe auf Cytomegaloviren (CMV - Erreger der Zytomegalie) wurden die Probenträger mit den gleichen Scheiben

90 9823/0661

präpariert, die in ähnlicher Weise an einem Probenträger befestigt waren. Auf eine Oberfläche wurde eine Menge von 25 /ul eines im Handel verfügbaren CMV-CF-Antigens (Flow Laboraties, Katalog-Nr« 40-613-44, Charge Nr₀ W946O78) auf die Oberfläche getupft, und zur Kontrolle wurde eine gleiche Oberfläche mit 23 /ul eines CMV-CF-Gewebekontroll-Antigens (Flow Laboratories, Katalog-Nr. 41-613-44, Charge Nr. W946078 C) betupft. Wieder wurden beide Probenträger bei 10$ relativer Feuchtigkeit bei 0 bis 8 ⁰C 24 Stunden lang getrocknet. Die Proben wurden ausgeführt, wie beim Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben. Die Ergebnisse wurden mit Proben verglichen, die nach dem Haemagglutinations-Inhibitionsverfahren ausgeführt worden waren (siehe Tabelle V).

TabelleV

Probe	HSV-1	<8	Doppel-Pr0ben	CMV	Doppel-Proben
Nr.	(HAI)	2048	träger (HSV-1)	(HAI)	träger (CMV)
	8;		9	128; 256	140
2	1024;	32	500	64; 64	500+
3	256	64	280	128; 128	140
4	32;	<8	31	16; 16	17
5	32;	8	198	32; 64
6	*8;	256	6	<8; <8	6
7	8;		11	<8; <8	13
8	128;	128	5OO	<<8;	8,5
9	4C8		8	1024	500+
10	256;	256	210	64; 128	500+
11	128		90	16; 32	48
12	128;		210	16; 32	16
13	32		29O	128	310
14	<C8		6,5	<8	7
15	8		7	8	7
16	*8		26	256	5OO
17	* 8		7,6	<8	7
18	<8		6	* 8	50
19	128		145	8; 16	8,5
20	256		5OO	128	500
21	16		11	256; 512	500
22	16	12	NSR	8,5
23	< 8	15	32	170

909823/0661

	rf	HSV-1 HSV-1	30	CMV	CMV	10	2851Ί50
	128j 256 310	<8	7
Nr.	16; 32 10	32
24-	<8 <5	*8
25	Ausführungsbeispiel 6 -
GO 27
	Zweioberflächenverfahren für IgM, Ig

Eg wurde eine Testreihe durchgeführt, um die Konzentration von Anti-Rubella-Antikörpern des Typs IgM im Serum von Patienten in dem Verlauf der Zeit abzuschätzen. Diese Proben wurden durchgeführt, wie beim Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben. Bei den Tests mit IgG war die Lösung in dem dritten Reagensglas mit Fluoreszin-Isothiozyanat (FITC) als Anhängerstoff markiertes Antihuman-IgG (aus der Ziege), für die Tests mit IgM enthielt das dritte Reagensglas monospezifisches, mit FITC als Anhängerstoff versehenes Antihuman-IgM (aus der Ziege). Zusätzlich wurden die Proben im Reagensglas 1 im Verhältnis 1:10 für die IgM-Tests verdünnt.

Die IgM-Standardisierung wurde erhalten durch Verwendung von Serum aus einer kürzlich aufgetretenen Rubella-Infektion als Eichwert für den oberen oder hohen Wert. Die Gegenwart von IgM-Antikörpern wurde nach dem sognenannten ELISA-Verfahren nachgeprüft (Voller, A. und Bidwell, D.E. in Brit. J. Exptl Fathol. £Z:24-3 (1976)). Vergleichende Tests wurden an einer Anzahl von Serumproben von verschiedenen Patienten vollzogen, wobei auf das Vorhandensein von IgG wie nach den Ausführungsbeispielen 1 und 2 und das Vorhandensein von IgM in derselben Weise wie nach dem Ausführungsbeispiel 1 getestet wurde, jedoch mit dem IgM-Ant!körper

909823/0661

wie oben beschrieben, und zwar durch das standardisierte Haemagglutinations-Inhibitionsverfahren. Diese Proben wurden auch nach einem für IgG spezifischen ELISA-Verfahren und nach einem für IgM spezifischen ELISA-Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind im folgenden (Tabelle VI) tabelliert.

T a b e 1 1 e VI

Patienten-Probe HAI IgG IgG IgM IgM und Zeit (Titer) (Titer) ELISA ELISA (Titer)

Cug/ml) (log.

Absorb)

P, 8 Tge nach Immuni si erung	<1O	4,2	22,4 447	2 2	,4 ,5	3,0
P,11 Tge nach Immunisierung	<Ί0	4,7	8,9 141,2	1 0	,543 ,865	5,0
P,27 Tge nach Immuni si erung	20	6,8	8,9 89,0	2 1	,144 ,202	16,0
P,34 Tge nach Immuni si erung	20	7,9				34,0
M, vor Immuni sierung	<1O	4,2			3,2.
M,27 Tge nach Immunisierung	80	64,0			78,0
R 3/4 H 3/23	8 (<4) 512	3,8 190,0			4 2 2,0
W 3/4 W 3/23	16 128	9,5 40,0			160 60
Gh 3/4 16/8 Gh 3/22 64	52 128	13,33 11,16			12
Ga 11/4 8 durch CF GA 11/14	32/64 32/64	27 22			12 10

Das oben beschriebene Oberflächentestverfahren ist auch bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf den Epstein-Barr-Virus und auf Toxoplasma angewendet worden»

Ausführungsbeispiel 7 - Toxoplasma

Es wurde eine Testreihe ausgeführt, um die Einsatzmöglich-

909 823/0661

keit des erfindungsgemäßen Zweioberflächen-Verfahrens bei fluorimetrischen immunologischen Proben auf Toxoplasma zu demonstrieren. Im wesentlichen wurde dieser Test ausgeführt, wie nach Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, bis auf die Ausnahme, daß die beiden Probenträger für jede Probe wie folgt präpariert wurdens

Eine kreisförmige Scheibe aus "Millipore" Typ ¹¹HAMK¹¹, einem Copolymer aus Zellulosenitrat und Zelluloseazetat, wurde an einem Probenträger durch doppelseitig klebendes Band befestigt« Eine Menge von 10 /ul lösbarem Antigen zu Toxoplasma gondii, das nach dem Verfahren von Walls u.a. bereitet worden war, (K.W₀ Walls; S.L. Bullock; D.K₀ English; in J. Clin, Microbiol. 5:273 (1977) ) wurde auf die Scheibe aufgetupft. Die Probenträger wurden bis auf eine relative Feuchtigkeit von etwa 1O# bei 0 bis 8 ⁰C 24 Stunden lang getrocknet.

Bei einer Gruppe von Serumproben wurden Tests nach dem Verfahren von Kelen u.a. ausgeführt, (Kelen, A.E.j Ayllon-Leindl, N.A.; Labzoffsky, in Can. J. Microbiol. 8:^3 (1962) ) um die "erwarteten Titer" festzulegen. Die Proben wurden dann,wie im Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben, durchgeführt, und die folgenden Ergebnisse (Tabelle VII) erhalten.

909823/0661

28511

	Piter	33	Kontroll-	Differenz
1	512	1 e VII	Probe
	512	Antigen-	35	112
D a b e 1	256	Probe	40	131
Probe, Erwarteter	256	147	28	73
Kennziffer 5	64	171	28	73
Eichlösg. I	64	101	20	45
Eichlösg. I	16	101	21	24
Eichlösg.II	16	65	20	16
Eichlösg.II	16	45	19	14
Eichlösg.III	16	36	72	12
Eichlösg.III	16	33	17	24
Eichlösg„IV	64	84	35	18
Eichlösg.IV	64	41	26	39
Nassau 1	64	53	28	72
2	256	65	29	45
3	256	100	36	73
4	256	74	30	82
5	1024	109	28	84
6	1024	112.	38	53
7	1024	112	57	43
8	4096	91	30	51
9	4096	100	27	60
10	4096	81	51	183
11	16384	87	34	70
12	234	24	181
13	104
14	205
15
16

In der vorhergehenden Beschreibung der Erfindung wird ein neuartiges Zweioberflächen-Verfahren zur Ausführung von immunologischen Proben beschrieben, und in allen Beispielen wird das Verfahren als immunologische Probe mit Fluoreszenzmessung veranschaulicht. Es ist jedoch ebenfalls zu berücksichtigen, daß bei allgemeinen Anwendungen des Erfin-

909823/0661

dungsgegenstandes diese neue Zweioberflächen-Verfahren unter Einsatz von radioaktiven und mit Enzymen arbeitenden immunologischen Probenverfahren eingesetzt werden kann. Somit kann, wie in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 beschrieben, eine immunologische Probe auf Rubella mit einem mit radioaktivem Anhängerstoff versehenen Antikörper anstatt mit einem fluoreszierenden Antikörper ausgeführt werden, und abschließend werden die Oberflächen mit einem Zähler für radioaktive Strahlung anstelle eines Fluoreszenzmessers gemessen. Bei Verwendung radioaktiver Anhängerstoffe gibt es einen bedeutsamen Unterschieds Die beiden Oberflächen, die beide der Serumprobe ausgesetzt werden, sind nicht, wie im Ausführungsbeispiel 4- beschrieben, auf einem einzigen Probenträger angebracht, wegen der Möglichkeit, daß die Strahlung von einer Oberfläche die Messung der Strahlung von der anderen Oberfläche beeinflußt» Es ist vorstellbar, daß ein Probenträger mit zwei Oberflächen für radioaktive immunologische Proben mit hinreichender Schirmung oder räumlicher Trennung zwischen den Oberflächen entwickelt werden könnte, aber bei einem radioaktiven Testverfahren für die immunologische Untersuchung ist die Schaffung von zwei Testoberflächen auf demselben (einem einzigen) Probenträger nicht so angebracht wie bei Fluoreszenztests.

Soweit das Zweioberflächen-Verfahren nach der Erfindung bei immunologischen Proben mit Enzymen eingesetzt wird,

909823/0661

kann es erforderlich sein, beide Oberflächen in verschiedenen Mengen desselben Serums zu behandeln, um störende Reaktionen zu zu unterbinden, jedoch könnte es unter gewissen Umständen angebracht sein, einen Zweioberflächen-Probenträger für immunologische Proben in derselben Weise zu behandeln wie den Probenträger in den oben gezeigten Ausführungsbeispielen. Außer diesen Unterschieden zwischen immunologischen Proben mit radioaktiven Substanzen, Enzymen und fluoreszierenden Anhängerstoffen kann das erfindungsgemäße Verfahren in allen drei Fällen verwendet werden, wo die beiden Oberflächen auf verschiedene Weise auf das Serum reagieren, wobei eine Oberfläche mit einem breiten Spektrum von Bestandteilen unter Ausschluß des gewünschten Bestandteils reagiert, so daß beide Oberflächen mit demselben Serum in Berührung gebracht und eine quantitative Messung für einen bestimmten Antikörper als Meßwertdifferenz bei der Messung an beiden Oberflächen erhalten werden kann.

909823/0661

Claims

■ ■ -■" * -.■""" 2851160

PATENTANWÄLTE Ü.RICHTER F. WERDERMANN R. SPLANEMANN dr. B, REITZNER

DIPL.-ING. DIPL.-ING. DIPL.-INe. DiPL.-CHEM.

HAMBURG MÜNCHEN

Anm: International Diagnostic Technology, Inc. Santa Clara, Kalif., V. St. A.-

2OOO HAMBURG 36 "■%. 1", /3

NEUER WALL 1O TEL. CO4O) 34ΟΟ45 34 OO 56 TELEGRAMME: INVENTIUSHAMBURG

UNSEREAKTE: j yg 533 jj_H IHR ZEICHEN:

Patentansprüche

1 λ Verfahren sum Teaten auf das Vorhandenseiη eines Analyten, wobei die Testprobe eine unbekannte Menge eines störenden Stoffes enthalten kann, dadurch gekennzeichnet, daß es die Präparierung p.iner ersten Oberflüche umfaßt, an die ein Antigen als Analyt gebunden wird, auf den der störende Stoff einwirken kann, daß eine zweite Oberfläche präpariert wird, die dafür ausgelegt ist, ein breites Spektrum von Proteinsubstanzen einschließlich des genannten störenden Stoffes zu binden, doch die keine wesentliche Menge des genannten Analyten bindet, daß rr.it der genannten ersten und zweiten Oberfläche eine immunologische Probe an einer unbekannten Serumprobe in ein- und derselben Menge an Probenserum ausgeführt wird, daß daran anschließend gleichseitig die beiden Oberflächen in eine Menge einer mit einem Anhängerstoff versehenen Substanz eingetaucht wird, und daß schließlich die Differenz zwischen den Beträgen an mit Anhängerstoff versehener Substanz auf der ersten und der zweiten Oberfläche gemessen wird.

909823/0661 ORONAL inspected

Konton: Deutsche Bank AG Hamburg (BLZ 20070000) Konto-Nr. 8/10 055 · Postscheckamt Hamburg (BLZ 20010020) Konto-Nr. 262080-201
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte zur Durchfährung der genannten immunologischen Probe wie folgt ausgeführt v/erden:

(a) gleichzeitiges Eintauchen der genannten Oberflächen in dieselbe Menge des zu testenden Serums,

(b) daran anschließendes Eintauchen der ersten und zweiten Oberfläche in dieselbe Menge einer mit einem fluoreszierenden Anhängerstoff versehenen Substanz, und daraufhin Messung der Differenz in den von der ersten und von der zweiten Oberfläche ausgesendeten fluoreszierenden Licht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Präparierung der genannten ersten Oberfläche ausgeführt wird mit einem ersten Antigen an einer polymeren Trägeroberfläche, und daß der genannte Schritt der Ausführung einer immunologischen Probe dadurch ausgeführt wird, daß nacheinander die erste und die zweite Oberfläche durch die folgenden Medien bewegt wird:

(a) eine erste Menge, die eine Probe eines unbekannten Serums enthält,

(b) eine zweite Menge, die eine Salzlösung zur Waschung enthält,

(c) eine dritte Menge, die mit fluoreszierendem Anhängerstoff versehene Antihuman-Antigene enthält, und

(d) eine zweite Salzlösung zur Waschung,

wobei die erste und die zweite Oberfläche zusammengehalten werden, so daß sie sich gleichzeitig in jeder der genannten Mengen befinden.

909823/0661
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Virus-Antigen ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Antigen des Rubellavirus ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Cytomegalovirus-Antigen ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Antigen des Herpes-Simplex-Virus ist.
8ο Verfahren nach Anspruch 3»dadurch gekennzeichnet, da& das erste Antigen ein bakterielles Antigen ist.
9. Verfahren nach Anspruch. 8, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen das Antigen von Treponema-palliduni-Bakterien ist. : .
10. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Antigen eines parasitären
Organismus ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Antigen ein Antigen von Toxoplasma Gondii ist.
12. Verfahren nach Anspruch 3.» dadurch gekennzeichnet-,

daß das Antihunian-Antigen ein Antxhurnan-Tramunog"! ot-ulin ist.

909823/0861
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antihuman-Antigen das Antihuman-Immunoglobulin M ist.
14. Verfahren zum Testen auf das Vorhandensein eines Analyten, wobei eine Testprobe eine unbekannte Menge eines störenden Stoffes enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es die Präparierung einer ersten Oberfläche umfaßt, an die ein Antigen für den Analyten gebunden ist, auf den der störende Stoff störend einwirken kann, sowie die Präparierung einer zweiten Oberfläche, die zur Bindung eines breiten Spektrums von Proteinsubstanzen einschließlich der störenden Stoffe ausgelegt ist, die Jedoch nicht irgendeine wesentliche Menge des genannten Analyten bindet, daß sodann eine immunologische Probe an einer Probe eines unbekannten Serums mit der genannten ersten und zweiten Oberfläche wie folgt ausgeführt wird:

(a) Eintauchen der genannten ersten Oberfläche in eine Menge des genannten unbekannten Serums,

(b) Eintauchen der genannten ersten Oberfläche in eine Menge einer mit einem Anhängerstoff versehenen Substanz, die zur Bindung an Antikörper in der Serumprobe ausgelegt ist,

(c) Eintauchen der zweiten Oberfläche in eine Menge des genannten unbekannten Serums,

(d) Eintauchen der genannten zweiten Oberfläche in eine Menge eines mit einem Anhängerstoff versehenen Stoffes, der dazu ausgelegt ist, Antikörper in der

909823/0661

Serumprobe zu binden, und darauffolgend eine Messung der Differenz in den Mengen an mit Anhängerstoff versehener Substanz auf der ersten und der zweiten (Jberf lache.

909823/0661