JPS5819066B2 - トガウ イルス ｈｉ反応方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトガウィルスＨＩ反応方法に関する。

風疹ウィルスなどのトガウィルスのＨＩ（赤血球凝集抑
制）反応は中和試験や補体結合試験に比べて感度が高く
簡便であるため、血清学的診断に非常に有用な手段とな
っている。

しかしながらこれらのＨＩ反応に付される人その他の血
清中にはトガウィルス凝集素（特異ＨＡ抗原）に対する
非特異凝集阻害物質が存在するため強い偽陽性反応がみ
られる。

この凝集阻害物質の除去法としてカオリンによる吸着法
およびアセトンによる抽出法などが広く用いられており
、風疹ＨＩ試験の場合にはより再現性の高い方法として
ヘパリン−ＭｎＣＩ２あるいはデキストラン硫酸−Ｃａ
ＣＩ□による沈澱法が用いられている３ しかしながら
、カオリンは非選択的な吸着剤で非特異凝集阻害物質と
共に抗体をも吸着し偽陰性反応を与える。

またアセトンは抗体分子を変性失活させ、同様に偽陰性
反応を与える。

ヘパリン−ＭｎＣＩ２法およびデキストラン硫酸−Ｃａ
ＣＩ□法では非特異凝集阻害物質を完全に除去するため
には高濃度の試薬を用いねばならないため、血球パター
ンが乱れＩ（Ｉ抗体価の読み取りを誤まらせることがあ
る。

更にこれらの非特異凝集阻害物質除去法はいずれも非特
異凝集阻害物質をＨＩ抗体から分離するための遠心分離
操作が必要であるため、大規模なＨＩ試験の実施にあた
って多くの時間、労力を要する結果となっていた。

本発明はかかる技術的背景のもとに、簡便な操作で実質
的に完全にトガウィルス凝集素に対する非特異凝集阻害
物質を不活化させたトガウィルスＥ（Ｉ反応血清ならび
に該血清を用いることにより正確かつ高感度で血清中の
ＨＩ抗体価を測定しうるトガウィルスＨＩ反応方法を提
供するものである。

すなわち、本発明は、 （１）ホスホリパーゼＣを作用させて非特異凝集阻害物
質を不活化させた血清、トガウィルスＨＡ抗原および固
定赤血球を混合し、赤血球凝集の有無を測定することを
特徴とするトガウィルスＨＩ反応方法、ならびに （２）ホスホリパーゼＣを作用させて非特異凝集阻害物
質を不活化させたトガウィルスＨＩ反応用血清である。

本発明は、ＨＩ反応可能なトガウィルスのいずれに対し
ても適用することができ、かかるトガウィルスとしては
たとえば風疹ウィルス、アルボウィルス群（たとえば日
本脳炎ウィルス、黄熱ウィルスなど）などが挙げられる
。

血清としては上記したトガウィルスＨＩ反応において被
検血清として用いられうる血清であればどのような血清
を用いてもよく、たとえばヒト、ウシ、ラット、マウス
、モルモットなどの温血動物血清が挙げられ、とりわけ
ヒト血清中のトガウィルス特異ＨＩ抗体を測定する目的
でヒト血清が繁用される。

本発明においては、上記した血清にホスホリパーゼＣを
作用させることによりきわめて簡便な操作で実質的に完
全にトガウィルス凝集素に対する非特異凝集阻害物質を
不活化せしめたトガウィルスＨＩ反応用血清を得ること
ができる。

ホスホリパーゼＣはいかなる起源のものを使用してもよ
く、一般に約０．０４〜０．１２ ｕｎ ｉｔ／ｍ ］
好ましくは０．０６ ｕｎｉｔ／ｍｌ程度のホスホリパ
ーゼＣの水性溶媒（たとえば水、生理食塩水、各種緩衝
液など）溶液として用いるのがよい。

本酵素処理は、一般に血清もしくは通常の希釈液で希釈
した希釈血清に上記したホスホリパーゼＣの水性溶媒溶
液を添加し約１０〜５０℃好ましくは３７℃程度で約３
〜２０時間静置することにより行われる。

このホスホリパーゼＣ処理により、血清中の非特異凝集
阻害物質が分解され不活化されるが、該血清中に存在す
るトガウィルス特異ＨＩ抗体の活性はなんら悪影響を受
けない。

また、処理後の血清は、従来のカオリン、アセトン、ヘ
パリン−ＭｎＣＩ□あるいはデキストラン硫酸−ＣａＣ
１２で処理された血清とは異なり、非特異凝集阻害物質
をトガウィルス特異ＨＩ抗体から分離するための遠心分
離操作が全く不要であり、通常の血清非動化（たとえば
５６℃の加温）を行ない所望により希釈するのみでトガ
ウィルスＨＩ反応に供することができる。

ちなみに、ホスホリパーゼＡ、ＢおよびＤのいずれを血
清に作用させてもトガウィルス凝集素に対する非特異凝
集阻害物質を不活化するという本発明の目的は全く達成
されえない。

本発明においては、上記のようにして非特異凝集阻害物
質を不活化させた血清を用いてトガウィルスＨＩ反応を
行なうことにより、該血清中のトガウィルスＨＩ抗体価
を正確かつ高感度で測定することができる。

この場合、新鮮赤血球は該血清中に残存するホスホリパ
ーゼＣにより溶血されるが、固定赤血球は意外にも残存
するホスホリパーゼＣにより全く溶血されず明確な凝集
像を与える。

すなわち、本発明は上記したトガウィルスＨＩ反応用血
清を固定赤血球と組み合せて使用するトガウィルスＨＩ
反応方法をも提供するものである。

赤血球としてはトガウィルス特異ＨＡ抗原により凝集さ
れうる赤血球のいずれを用いてもよく、たとえば咄乳類
（ヒツジ、サル、ヒトＯ型など）。

鳥類にワトリ〔ヒナおよび成鳥〕、ガチョウ、ハト、ウ
ズラなど）の赤血球が好都合に用いられる。

これら赤血球の固定処理は自体公知の手段のいずれで行
なったものでもよく。

とりわけホルマリンで固定したものが好ましい。

かかる固定赤血球としては、本出願べにより開発された
凍結もしくは凍結乾燥せしめた凝集反応用赤血球（特開
昭４８−２６９１３号公報参照）を融解もしくは再浮遊
せしめたものを好都合に使用することができる。

本発明においては、ホスホリパーゼＣ処理により非特異
凝集阻害物質を不活化させた血清と、トガウィルス特異
ＨＡ抗原とを混合しさらに上記固定赤血球を混合して赤
血球凝集の有無を観察することにより血清中のＨＩ抗体
を正確かつ高感度に測定することができる。

本ＨＩ反応においては、トガウィルスＨＩ反応に採用し
うる術式のいずれを用いてもよく、たとえば、マイクロ
タイター法などにより行なうことができる。

かかるトガウィルスＨＩ反応は、たとえば非特異凝集阻
害物質を。

不活化させた血清０．０２５ｍ１をマイクロプレート上
で２倍階段希釈し、更にＨＡ価４挙位の特異ＨＡ抗原０
．０２５ｍ１ を添加する。

室温で３０分間放置したのち０．２５％の固定赤血球浮
遊液０．０２５ｍ１を混合し、室温で６０分間放置後、
赤血球凝集の有無を測定するものである。

なお。ＨＩ価はＨＡを完全に抑制した血清の最高希釈倍
数の逆数で以って表わされるものである。

以下に１本発明の実施例、実験例によりさらに具体的に
説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでな
いことはいうまでもない。

実施例 １ ０．１ｍｌのヒト血清に０．２ｍｌのＨ８ＡＧ”）を加
え、得られる希釈血清にＱ、 Ｑ ６ ｕｎｉｔ／ｍｌ
のホスホリパーゼＣ＊２）溶液を０．１ ｍｌ加えて３
７℃で一夜インキュベートしたのち、５６℃で３０分加
温して血清の非動化を行ない、トガウィル１１１反応用
血清を得た。

＊１）Ｈ８ＡＧはＨＥＰＦＳ Ｓａｌｉｎｅ−Ａｌｂ
ｕｍｉｎ −Ｇｅｌａｔｉｎの略でその組成は下記のと
うりである。

へペス（ドータイト試薬） ２．９７ｇＮａＣ］
４．０９ ｇＣａＣＩ２（
無水） ５５．５ ｍｇ牛血清アルブ
ミン １．０ｇゼラチン
１．２５ｍｇ適当量の蒸留水に溶解し、Ｎ−Ｎ
ａ０１（でｐＨを６．２に調整したのち蒸留水で全量５
００ ｍｌとする。

＊２）使用ホスホリパーゼ゛ＣはＣＩ ｏｓｔｒ ｉｄ
ｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ 超厚の市販品で、
１単位の酵素はｐＨ３，７、３７℃で１分間に１μｍｏ
ｌｅの酸溶性リンを遊離する能力を有する。

実施例 ２ 実施例１で使用したＨ８ＡＧＯ代りに■ＢＳ＊４〕ある
いはＰＢＳ”４）を用い全く同様に処理してトガウィル
スＨＩ反応用血清を得た。

＊３） Ｖ Ｂ ＳはＶｅｒｏｎａｌ−Ｂｕｆｆｅｒｅ
ｄ ５ａｌｉｎｅの略でその組成は次の通りである。

５×ベロナール緩衝液 ２００ ｍ１ ＣａＣ１２（無水） ０．２ｇＭｇＣＩ
２・６Ｈ２００，２ｇ 牛血清アルブミン １．０ｇ ゼラチン １０ｍｇ 蒸留水で全量１００ｍ１とする。

＊４）ＰＢＳはＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ
５ａｌｉｎｅの略でその組成は次の通りである。

ＮａＣｌ ’ ” ８．０ ｇＫＣ
Ｉ ０．２ｇＫＨ２ＰＯ，０，
２ｇ Ｎａ２ ＨＰＯ４・２Ｈ２０１，４４ｇ ＣａＣ１２（無水）０．１ｇ ＭｇＣｌ ２・６Ｆ（，２００，１ｇ 牛血清アルブミン ２．０ｇ ゼラチン １０ｍｇ 蒸留水で全量ＬＯＯＯｍｌとする。

実施例 ３ ウシ、ラット、マウス、モルモット血清をそれぞれ実施
例１と全く同様に処理してトガウィルスＨＩ反応用血清
を得た。

実験例 ｌ 無処理血清、ホスホリパーゼＣ処理血清、カオリン処理
血清およびデキストラン硫酸−ＣａＣ１□処理血清の風
疹ＨＩ反応における比較 被検ヒト血清のそれぞれにつき下記（１）〜（勾の前処
理血清を調製した。

（力 無処理血清 （イ）ホスホリパーゼＣ処理血清 実施例１にしたがって得られるホスホリパーゼＣ処理血
清０．４ｍｌをＨＳ Ａ Ｇｏ、 ３ ｍｌで希釈した
もの （ウ カオリン処理血清 ０、１ ｍｌの被検血清に０．３ｍｌのＨ８ＡＧを加え
、得られた希釈血清に０．４ｍｌの２５係カオリン懸濁
液を加えて３０℃で３０分間インキュベートしたのち、
遠心分離）−て上清をとり５６℃で３０分加温して血清
の非働化を行った。

匡）デキストラン硫酸−ＣａＣＩ□処理血清０、１ ｍ
ｌの被検血清に０．４ｍｌのＨ８ＡＧを加え、得られた
希釈血清に１係デキストラン硫酸および０．５’ Ｍ
Ｃａ ＣＩ ２をそれぞれ０．１ ｍｌずつ加えて４℃
で６０分放置後遠心分離して上清をとり５６℃で３０分
加温して血清の非働化を行った。

上記血清（７１〜（罵はそれぞれ１０係固定赤血球（下
記参照）浮遊液０．１ｍｌを加えて自然凝集素の吸収を
行なったのち、ＨＩ反応に供した。

ホスホリパーゼＣ処理血清（イ）については１日令ニワ
トリヒナのホルマリン固定赤血球（特開昭４８−２６９
１３号公報の実施例１により得られる凍結乾燥赤血球を
蒸留水に再浮遊せしめたもの：以下同様）および新鮮赤
血球の両者を用い、その他の血清については上記ホルマ
リン固定赤血球のみを用いて、パーマネント■型プレー
ト上で５ｅ−ｖｅｒのマイクロタイター法（”Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆＩ晶男ｕｎｏｌｏｇＭ”第８８巻（１９
６２年）第３２０〜３２９頁参照）により風疹ウィルス
ＨＩ価を測定した。

なお、血清、ＨＡ抗原、固定赤血球の希釈にはすべてＨ
８ＡＧを用いた。

給米は第１表に示すとおりであった。

実験例 ２ 無処理血清、ホスホリパーゼＣ処理血清およびアセトン
処理血清の日本脳炎ＨＩ反応における比較 被検ヒト血清のそれぞれにつき下記力〜（り）の前処理
血清を調製した。

力）無処理血清 キ）ホスホリパーゼＣ処理血清 ＰＢＳを用い実施例２にしたがって得られるホスホリパ
ーゼＣ処理血清０．４ｍｌをｏ、ｏｔＭ−ホウ酸すｌ−
ＩＪウム水溶液０．３ｍｌで希釈したもの （り） アセトン処理血清 ０、１ ｍｌの被検血清に２ｍｌのアセトンを加え、Ｌ
５００ｒｐｍで５分間遠心して上清をすて、ふたたび２
ｍｌ のアセトンを加えて同様に遠心して上清をすてた
。

沈渣を乾燥後、０．０１Ｍ−ホウ酸ナトリウム水溶液０
．７ ｍｌを加え一夜４℃で放置する。

上記血清（至）〜（り）はそれぞれ１０係固定赤血球浮
遊液０．１ ｍｌを加えて自然凝集素の吸収を行なった
のち、）ＩＩ試験に供した。

各血清につきパーマネント■型プレートを用いてＣ１ａ
ｒｋｅらのマイクロタイター法（”Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ ”第７巻（１９５８
年）第５６１〜５７３頁参照）により日本脳炎ウィルス
ＨＩ価を測定した。

結果は第２表に示すとおりであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ホスホリパーゼＣを作用させて非特異凝集阻害物質
   を不活化させた血清、トガウィルス特異ＨＡ抗原および
   固定赤血球を混合し、赤血球凝集の有無を測定するどと
   を特徴とするトガウィルスＨＩ反応方法。 ２ ホスホリパーゼＣを作用させて非特異凝集阻害物質
   を不活化させたトガウィルスＨＩ反応用血清。