JPS6161055A - ウイルス赤血球凝集反応試験用鳥類固定赤血球の保存液 - Google Patents

ウイルス赤血球凝集反応試験用鳥類固定赤血球の保存液

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JPS6161055A
JPS6161055A JP59183039A JP18303984A JPS6161055A JP S6161055 A JPS6161055 A JP S6161055A JP 59183039 A JP59183039 A JP 59183039A JP 18303984 A JP18303984 A JP 18303984A JP S6161055 A JPS6161055 A JP S6161055A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ１発明の目的 星東上立■貝公里 ウィルスは一般にその表面に動物赤血球を凝集させる性
質を有するＨＡ抗原［Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｔｏ
ｎａｎｔｉｇｅｎ］と呼ばれる成分を保有している。Ｈ
Ａ抗原と赤血球との凝集反応は、ウィルスの種類によっ
て凝集させる赤血球の動物種が異なることも知られてい
る。例えば、風疹ウィルスはヒヨコおよびガチョウの赤
血球を凝集させるし、インフルエンザウィルスはニワト
リ（ヒヨコおよび成鳥）の赤血球を、パラインフルエン
ザウィルスはモルモットおよびニワトリの赤血球を、ま
た麻疹ウィルスはサルの赤血球を凝集きせるなどである
。この性質を利用してウィルスの同定や定量を行うこと
ができる。
本発明はこのようなウィルスと赤血球の凝集反応に基づ
いて行なう赤血球凝集反応（ＨＡ反応）または赤血球凝
集抑制反応（ＨＩ反応）に用いる固定赤血球の保存液に
関するものであり、ＨＡ反応およびＨＩ反応は臨床検査
分野でウィルス感染の有無の診断に広く用いられている
。
更米辣オ 各種ウィルスの上記のような特異抗原性を利用してウィ
ルスの同定や力価測定にＨＡ反応が用いられており、ま
た、ウィルス感染に対する免疫反応の結果生体が保有す
るＨＡ抗原の抗体すなわちＨ１抗体を測定するには、Ｈ
Ｉ反応が利用詐れ、共に赤血球を反応試薬として必要と
する。明確な凝集または凝集抑制反応を起こさせるには
新鮮な赤血球の使用が望まれるが、試験時毎に新鮮面を
得ることは煩雑で、実際には不可部である。そのため長
期保存後も赤血球の被凝集能力が低下しない赤血球の保
存方法の研究が続けられている６例えば、ホルマリン等
による固定化や固定赤血球の凍結保存、凍結乾燥などの
方法がある。凍結乾燥においては、更に洗浄により無塩
状態にすること（特公昭５０−３７７２４号）およびグ
ルツースや血清アルブミンの添加（特開昭５４−２３１
１９号）等の凍結乾燥前の処理により、安定化が試みら
れている。しかし、凍結乾燥の処理をせずに溶液中で固
定赤血球を長期保存する方法は未だ見い出されていない
。
明が　決しようとする。　。
赤血球が被凝集能力を失わずに長期間安定に維持されて
いる保存液を開発するにあたり、先ず固定赤血球を用い
て、風疹ウィルスの特異的赤血球凝集反応を妨害して正
確な結果を与えない非特異的凝集抑制の原因解明を試み
た。その結果、非特異的凝集抑制は従来より赤血球保存
液として使われているリン酸緩衝液や生理食塩水に因る
ものであり、これらの使用が固定赤血球のβ−リボ蛋白
質の滲出をもたらし、非特異的に赤血球凝集反応を抑制
することが明らかになった。それゆえに、風疹Ｈ１抗体
価検査においても固定赤血球液にβ−リボ蛋白質が含ま
れていると、陰性検体（抗体価８倍以上）が陽性となり
、検査判定が不能になることが判明した。
アルデヒド類で固定化した赤血球は一般に、長期保存が
可能であるが、振盪、混和などの機械的刺激を与えると
、赤血球が破壊され、赤血球浮遊中β−リボ蛋白質が滲
出してくる。このβ−リボ蛋白質の滲出が多い原因は、
固定赤血球を従来の生理食塩水などの塩類を含む水溶液
で保存した場合には、塩類の影響により赤血球同志の吸
着が強くなり、したがって、使用時に分散させるために
はより多くの機械的刺激を長時間かけねばならないため
と考えられる。それに反し、精製水に保存すると、上記
の血球同志の吸着も少なく、β−リボ蛋白質の滲出が抑
制される。
口０発明の構成 ４１．を　決するための手段 前記のβ−リボ蛋白質の滲出を阻止するためには、した
がって、リン酸緩衝液や生理食塩水を用いずに、精製水
に固定赤血球を浮遊させることが必要で、この方法によ
り非特異的凝集抑制反応を阻止できる。
また、この精製水よりなる保存液に血清アルブミン、グ
リセリンまたはメチルスルホキシドを適当量添加するこ
とにより赤血球の安定性が高められ、さらに細菌増殖肪
止剤を添加すると、赤血球はより一層長期の保存に耐え
うろことが確認きれた。
本発明の保存液の対象となる固定赤血球は鳥類の赤血球
であって、例えば、ガチョウ、ニワトリなどの固定赤血
球を用いるとよく、特にガチョウの固定赤血球に対する
効果が顕著である。なお、固定化はホルムアルデヒドや
グルタルアルデヒドなどの通常用いられる固定化剤を用
いて常法に従って行なわれる。例えば、グルタルアルデ
ヒド約０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）溶液で約１〜２時間
固定化を行なう。
保存液は精製水（蒸留水、イオン交換水など）よりなる
。
所望により、血清アルブミン、グリセリンまたはジメチ
ルスルホキシドを添加してもよく、血清アルブミンの場
合は、保存液の約０．０１〜１．０％（ｗ／　ｖ　）、
好ましくは約０．０５〜０．２％（ｗ／Ｖ）を添加する
とよい、血清アルブミンとしては、人、牛、馬、兎など
のものが用いうるが、牛血清アルブミンがより好ましい
、グリセリンまたはジメチルスルホキシドを添加する場
合は、約５〜１０％（ｖ／ｖ）を加える。
きらに必要に応じて、細菌増殖防止剤（例えば、アジ化
ナトリウム、チメロサールなど）を加えてもよく、添加
量は通常防腐の目的で用いられる濃度でよく、例えば、
保存液の０．０１〜０゜２％（ｗ／　Ｖ　）前後がよい
、特にアジ化ナトリウムの使用により高い安定性が得ら
れる。
本発明の保存液に上記の鳥類固定赤血球を浮遊許せて、
ウィルス、特に風疹、日本脳炎、ムンプス、インフルエ
ンザなどに対するＨＡ試験および血清中のＨＩ抗体を測
定するＨ１試験を行いうる。
闘 本発明にかかる保存液に鳥類固定赤血球を所望濃度、好
ましくは約８〜１２％（ｖ／ｖ）に浮遊きせると、赤血
球の分散がよくかつ長期冷蔵保存後も赤血球は安定であ
る。したがって、凝集パターンの崩れがなく鮮明で凝集
反応の判定が容易である。長期保存後も非特異的凝集反
応の抑制がなく、正確なＨＡ価またはＨＩ価が得られる
。同赤血球浮遊液は風疹、日本脳炎、ムンプスなどのウ
ィルス、特に風疹ウィルスのＨＡ反応、Ｈ１反応におい
て、鮮明な凝集パターンを与え、長期保存後も効果にお
いて変わりがないことが認められた。
夾農週 以下に実施例により本発明の実施態様を示すがこれら実
施例は何ら本発明を限定するものではない。
実施例１ 精製水１０１００Ｏにガチョウ固定赤血球１００ｍ１を
分散させ、１０％赤血球浮遊液とする。
実施例２ ウシ血清アルブミン１ｇとアジ化ナトリウム１ｇを、精
製水に攪拌溶媒し、全量を１０１００Ｏとし、固定赤血
球の保存に使用する。
実施例３〜１０ 下記の成分および精製水（全量で１０１００Ｏとする）
を実施例２と同様の方法で混合し保存液を調製する。
（以下余白） 第　　１　　表 ハ１発明の効果 （１）下記の方法で調製したガチョウ固定赤血球を用い
て、実施例１の赤血球浮遊液および実施例２〜４の保存
液に固定赤血球を浮遊させて得た１０％浮遊液を、冷蔵
工時々混和し１．３５．３９および６４日後のβ−リボ
蛋白質の滲出量を測定し、第１図の結果を得た。これら
保存液においてはβ−リボ蛋白質の滲出は認められなか
った。
実験方法 ａ、ガチョウ固定赤血球の調製 市販のガチョウ赤血球を生理食塩水で３回、下記組成の
リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄したのち
、同ＰＢＳの約５％（ｖ／ｖ）浮遊液とした。この血球
浮遊液にＰＢＳで希釈した１、５％グルタルアルデヒド
溶液を血球量の１７９量加えて、スターラーでゆっくり
攪拌しながら室温６０分間反応許せた。得られた固定赤
血球を精製水で６回洗浄後、保存液に浮遊許せた。
ＰＢＳ　：塩化カリウム　　　　　　０．２　ｇリン酸
−水素ナトリウム　１．１５ｇ リン酸二水素カリウム　　０．２　ｇ 塩化ナナトリウム　　　　８．０　ｇ 精製水　　全量で１０１００Ｏとする。
ｂ、リボ蛋白質の測定法 風疹ＨＡ抗原による血球凝集の抑制能で測定した。すな
わち、固定赤血球をよく分散させた保存液０．４ｍｌを
試験管にとり、その遠心上清につき風疹Ｈ１試験を行な
った。ただし、β−リボ蛋白質の検出感度を上げるため
に２単位の風疹ＨＡ抗原を用いた。風疹ウィルスの赤血
球凝集を抑制する最大希釈倍数をもってβ−リボ蛋白質
の値とした。なお、この測定法において、８倍以上のβ
−リボ蛋白質の滲出のみられた固定血球を用いて風疹Ｈ
１試験（予研マイクロプレート法）を行なうと、陰性血
清が陽性と判定きれた。
（り実施例２の保存液、ＰＢＳおよび生理食塩水に（１
）に記載のガチョウ固定赤血球を浮遊きせて、１０％浮
遊液をつくり、これらと実施例１の浮遊液を、冷蔵下１
日１回混和し、８および２８日後のβ−リボ蛋白質の滲
出量を測定した。結果を第２図に示す、実施例２の保存
液ではβ−リボ蛋白質の滲出は認められなかった。
０）実施例２の保存液に浮遊せしめたガチョウ固定赤血
球と、ＤＧＶ（デキストロース−ゲラチン−ベロナール
）緩衝液に浮遊許せた生ガチョウ赤血球を使用し予研マ
イクロプレート法により４８例の臨床患者血清検体を用
いて、風疹ＨＡ（抗原力価）試験およびＨＩ（抗体力価
）試験を行なった。結果は第２表および第３表に示すと
おりであり、本発明の保存液に浮遊させたガチョウ固定
赤血球は生血球と全く同一の結果を示した。
第２表　風疹ＨＡ抗原力価の比較 第３表　風疹ＨＩ抗体価の比較 ＜８　８　１６　３２　６４１２８２５６生赤血球−Ｄ
ＧＶ緩衝液のＨＩ抗体価 特許出願人　　塩野義製薬株式会社 第１図 第２図 昭和６０年　２月２８日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、精製水から成るウィルス赤血球凝集反応試験用鳥類
    固定赤血球の保存液。 ２、血清アルブミン約０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）を
    含有する特許請求の範囲第１項記載の保存液。 ３、血清アルブミンが牛血清アルブミンである特許請求
    の範囲第２項記載の保存液。 ４、グリセリン約５〜１０％（ｖ／ｖ）を含有する特許
    請求の範囲第１項記載の保存液。 ５、ジメチルスルホキシド約５〜１０％（ｖ／ｖ）を含
    有する特許請求の範囲第１項記載の保存液。 ６、細菌増殖防止剤を含有する特許請求の範囲第１、２
    、４または５項記載の保存液。 ７、細菌増殖防止剤がアジ化ナトリウムである特許請求
    の範囲第５項記載の保存液。
JP59183039A 1984-08-31 1984-08-31 ウイルス赤血球凝集反応試験用鳥類固定赤血球の保存液 Granted JPS6161055A (ja)

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