JPH0578788B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

イ 発明の目的 産業上の利用分野 ウイルスは一般にその表面に動物赤血球を凝集
させる性質を有するHA光源
［Hemagglutinationantigen］と呼ばれる成分を
保有している。HA抗原と赤血球との凝集反応
は、ウイルスの種類によつて凝集させる赤血球の
動物種が異なることも知られている。例えば、風
疹ウイルスはヒヨコおよびガチヨウの赤血球を凝
集させるし、インフルエンザウイルスはニワトリ
（ヒヨコおよび成鳥）の赤血球を、パラインフル
エンザウイルスはモルモツトおよびニワトリの赤
血球を、また麻疹ウイルスはサルの赤血球を凝集
させるなどである。この性質を利用してウイルス
の同定や定量を行うことができる。 本発明はこのようなウイルスと赤血球の凝集反
応に基づいて行なう赤血球凝集反応（HA反応）
または赤血球凝集抑制反応（HI反応）に用いる
固定赤血球の保存液に関するものであり、HA反
応およびHI反応は臨床検査分野でウイルス感染
の有無の診断に広く用いられている。 従来技術 各種ウイルスの上記のような特異抗原性を利用
してウイルスの同定や力価測定にHA反応が用い
られており、また、ウイルス感染に対する免疫反
応の結果生体が保有するHA抗原の抗体すなわち
HI抗体を測定するには、HI反応が利用され、共
に赤血球を反応試薬として必要とする。明確な凝
集または凝集抑制反応を起こさせるには新鮮な赤
血球の使用が望まれるが、試験時毎に新鮮血を得
ることは煩雑で、実際には不可能である。そのた
め長期保存後も赤血球の被凝集能力が低下しない
赤血球の保存方法の研究が続けられている。例え
ば、ホルマリン等による固定化や固定赤血球の凍
結保存、凍結乾燥などの方法がある。凍結乾燥に
おいては、更に洗浄により無塩状態にすること
（特公昭50−37724号）およびグルコースや血清ア
ルブミンの添加（特開昭54−23119号）等の凍結
乾燥前の処理により、安定化が試みられている。
しかし、凍結乾燥の処理をせずに溶液中で固定赤
血球を長期保存する方法は未だ見い出されていな
い。 発明が解決しようとする問題点 赤血球が被凝集能力を失わずに長期間安定に維
持されている保存液を開発するにあたり、先ず固
定赤血球を用いて、風疹ウイルスの特異的赤血球
凝集反応を妨害して正確な結果を与えない非特異
的凝集抑制の原因解明を試みた。その結果、非特
異的凝集抑制は従来より赤血球保存液として使わ
れているリン酸緩衝液や生理食塩水に因るもので
あり、これらの使用が固定赤血球のβ−リポ蛋白
質の滲出をもたらし、非特異的に赤血球凝集反応
を抑制することが明らかになつた。それゆえに、
風疹HI抗体価検査においても固定赤血球液にβ
−リポ蛋白質が含まれていると、陰性検体（抗体
価８倍未満）が陽性となり、検査判定が不能にな
ることが判明した。 アルデヒド類で固定化した赤血球は一般に、長
期保存が可能であるが、振盪、混和などの機械的
刺激を与えると、赤血球が破壊され、赤血球浮遊
中β−リポ蛋白質が滲出してくる。このβ−リポ
蛋白質の滲出が多い原因は、固定赤血球を従来の
生理食塩水などの塩類を含む水溶液で保存した場
合には、塩類の影響により赤血球同志の吸着が強
くなり、したがつて、使用時に分散させるために
はより多くの機械的刺激を長時間かけねばならな
いためと考えられる。それに反し、精製水に保存
すると、上記の血球同志の吸着も少なく、β−リ
ポ蛋白質の滲出が抑制される。 ロ 発明の構成 問題点を解決するための手段 前記のβ−リポ蛋白質の滲出を阻止するために
は、したがつて、リン酸緩衝液や生理食塩水を用
いずに、精製水に固定赤血球を浮遊させることが
必要で、この方法により非特異的凝集抑制反応を
阻止できる。 また、この精製水よりなる保存液に血清アルブ
ミン、グリセリンまたはメチルスルホキシドを適
当量添加することにより赤血球の安定性が高めら
れ、さらに細菌増殖防止剤を添加すると、赤血球
はより一層長期の保存に耐えうることが確認され
た。 本発明の保存液の対象となる固定赤血球は鳥類
の赤血球であつて、例えば、ガチヨウ、ニワトリ
などの固定赤血球を用いるとよく、特にガチヨウ
の固定赤血球に対する効果が顕著である。なお、
固定化はホルムアルデヒドやグルタルアルデヒド
などの通常用いられる固定化剤を用いて常法に従
つて行なわれる。例えば、グルタルアルデヒド約
0.1〜0.3％（Ｖ／Ｖ）溶液で約１〜２時間固定化
を行なう。 本発明の保存液は、精製水に、以下のＡ群から
選択される試薬およびＢ群から選択される試薬を
含有することを特徴とする。 Ａ群：血清アルブミン約0.01〜1.0％（ｗ／ｖ） グリセリン約５〜10％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド約５〜10％（ｖ／
ｖ） Ｂ群：アジ化ナトリウム約0.01〜0.2％（ｗ／
ｖ） メチロサール約0.01〜0.2％（ｗ／ｖ） 精製水は、蒸留水、イオン交換水などを意味す
る。 血清アルブミンの濃度は、約0.05〜0.2％
（ｗ／ｖ）がより好ましい。血清アルブミンとし
ては、人、牛、馬、兎などのものが用いうるが、
牛血清アルブミンがより好ましい。 Ｂ群から選択される試薬としては、特にアジ化
ナトリウムの使用により高い安定性が得られる。 本発明の保存液に上記の鳥類固定赤血球を浮遊
させて、ウイルス、特に風疹、日本脳炎、ムンプ
ス、インフルエンザなどに対するHA試験および
血清中のHI抗体を測定するHI試験を行いうる。 作 用 本発明にかかる保存液に鳥類固定赤血球を所望
濃度、好ましくは約８〜12％（ｖ／ｖ）に浮遊さ
せると、赤血球の分散がよくかつ長期冷蔵保存後
も赤血球は安定である。したがつて、凝集パター
ンの崩れがなく鮮明で凝集反応の判定が容易であ
る。長期保存後も凝集反応の非特異的抑制がな
く、正確なHA価またはHI価が得られる。同赤血
球浮遊液は風疹、日本脳炎、ムンブスなどのウイ
ルス、特に風疹ウイルスのHA反応、HI反応にお
いて、鮮明な凝集パターンを与え、長期保存後も
効果において変わりがないことが認められた。 実施例 以下に実施例により本発明の実施態様を示すが
これら実施例は何ら本発明を限定するものではな
い。 実施例 １ 精製水1000mlにガチヨウ固定赤血球100mlを分
散させ、10％赤血球浮遊液とする。 実施例 ２ ウシ血清アルブミン１ｇとアジ化ナトリウム１
ｇを、精製水に攪拌溶媒し、全量を1000mlとし、
固定赤血球の保存に使用する。 実施例 ３〜10 下記の成分および精製水（全量で1000mlとす
る）を実施例２と同様の方法で混合し保存液を調
整する。

【表】

【表】 ハ 発明の効果 (1) 下記の方法で調整したガチヨウ固定赤血球を
用いて、実施例１の赤血球浮遊液および実施例
２〜４の保存液に固定赤血球を浮遊させて得た
10％浮遊液を、冷蔵下時々混和し、35，39およ
び64日後のβ−リポ蛋白質の滲出量を測定し、
第１図の結果を得た。これら保存液においては
β−リポ蛋白質の滲出は認められなかつた。 実験方法 ａ ガチヨウ固定赤血球の調整 市販のガチヨウ赤血球を生理食塩水で３回、下
記組成のリン酸緩衝液生理食塩水（PBS）で１
回洗浄したのち、同PBSの約５％（ｖ／ｖ）浮
遊液とした。この血球浮遊液にPBSで希釈した
1.5％グルタルアルデヒド溶液を血球量の1/9量加
えて、スターラーでゆつくり攪拌しながら室温60
分間反応させた。得られた固定赤血球を精製水で
６回洗浄後、保存液に浮遊させた。 PBS：塩化カリウム 0.2ｇ リン酸一水素ナトリウム 1.15ｇ リン酸二水素カリウム 0.2ｇ 塩化ナトリウム 8.0ｇ 精製水 全量で1000mlとする。 ｂ リポ蛋白質の測定法 風疹HA抗原による血球凝集の抑制能で測定し
た。すなわち、固定赤血球をよく分解させた保存
液0.5mlを試験管にとり、その遠心上清につき風
疹HI試験を行なつた。ただし、β−リポ蛋白質
の検出感度を上げるために２単位の風疹HA抗原
を用いた。風疹ウイルスの赤血球凝集を抑制する
最大希釈倍数をもつてβ−リポ蛋白質の値とし
た。なお、この測定法において、８倍以上のβ−
リポ蛋白質の滲出のみられた固定血球を用いて風
疹HI試験（予研マイクロプレート法）を行なう
と、陰性血清が陽性と判定された。 (2) 実施例２の保存液、PBSおよび生理食塩水
に(1)に記載のガチヨウ固定赤血球を浮遊させ
て、10％浮遊液をつくり、これらと実施例１の
浮遊液を、冷蔵下１日１回混和し、８および28
日後のβ−リポ蛋白質の滲出量を測定した。結
果を第２図に示す。実施例２の保存液ではβ−
リポ蛋白質の滲出は認められなかつた。 (3) 実施例２の保存液に浮遊せしめたガチヨウ固
定赤血球と、DGV（デキストロース−ゲラチン
−ベロナール）緩衝液に浮遊させた生ガチヨウ
赤血球を使用し予研マイクロプレート法により
48例の臨床患者血清検体を用いて、風疹HA
（抗原力価）試験およびHI（抗体力価）試験を
行なつた。結果は第２表および第３表に示すと
おりであり、本発明の保存液に浮遊させたガチ
ヨウ固定赤血球は生血球と全く同一の結果を示
した。

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の赤血球浮遊液および実施例
２，３，４の保存液を用いた各赤血球浮遊液のβ
−リポ蛋白質滲出量の経時変化を示し、第２図は
実施例１の赤血球浮遊液ならびに実施例２の保存
液、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）および生
理食塩水を用いた各赤血球浮遊液のβ−リポ蛋白
質滲出量の経時変化を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 精製水に、以下のＡ群から選択される試薬お
   よびＢ群から選択される試薬を含有するウイルス
   赤血球凝集反応試験用鳥類固定赤血球の保存液。 Ａ群：血清アルブミン＿0.01〜1.0％（ｗ／ｖ） グリセリン＿５〜10％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド＿５〜10％（ｖ／
   ｖ） Ｂ群：アジ化ナトリウム＿0.01〜0.2％（ｗ／
   ｖ） チメロサール＿0.01〜0.2％（ｗ／ｖ） ２ 血清アルブミンが牛血清アルブミンである特
   許請求の範囲第１項記載の保存液。