JP3188974B2 - ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 - Google Patents
ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ミエロペルオキシダー
ゼの抗原性を安定化する方法に関する。
ゼの抗原性を安定化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミエロペルオキシダーゼは、ヘムａ類似
のヘムを持つ酵素であって、主に白血球の好中球に存在
し、ハロゲン化物イオンを介してバクテリア等の解毒作
用を担っている。１９８２年、蛍光抗体間接法（ＩＩＦ
法）により、Daviesらが抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣ
Ａ）を報告し、その染色パターンからCytoplasmic-ＡＮ
ＣＡ（Ｃ-ＡＮＣＡ）とperinuclear-ＡＮＣＡ（Ｐ-ＡＮ
ＣＡ）の２つのサブセットに分けられた。このＰ-ＡＮ
ＣＡの対応抗原の一つがミエロペルオキシダーゼであ
り、免疫学的作用における抗原として用いられるように
なった。
のヘムを持つ酵素であって、主に白血球の好中球に存在
し、ハロゲン化物イオンを介してバクテリア等の解毒作
用を担っている。１９８２年、蛍光抗体間接法（ＩＩＦ
法）により、Daviesらが抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣ
Ａ）を報告し、その染色パターンからCytoplasmic-ＡＮ
ＣＡ（Ｃ-ＡＮＣＡ）とperinuclear-ＡＮＣＡ（Ｐ-ＡＮ
ＣＡ）の２つのサブセットに分けられた。このＰ-ＡＮ
ＣＡの対応抗原の一つがミエロペルオキシダーゼであ
り、免疫学的作用における抗原として用いられるように
なった。
【０００３】近年、血液検査において、P-ANCAのような
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を測定することが腎疾患
の診断に有用であることに注目され、ミエロペルオキシ
ダーゼを抗原抗体反応における抗原として用いられた酵
素免疫測定（ＥＩＡ）による試薬が市販されている。こ
れは、合成樹脂製のプレート等の表面にミエロペルオキ
シダーゼを吸着等によって付着させ、乾燥状態にしたも
のに検体を入れ、発色剤等を加えてその吸光度を測定す
るものである。
抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を測定することが腎疾患
の診断に有用であることに注目され、ミエロペルオキシ
ダーゼを抗原抗体反応における抗原として用いられた酵
素免疫測定（ＥＩＡ）による試薬が市販されている。こ
れは、合成樹脂製のプレート等の表面にミエロペルオキ
シダーゼを吸着等によって付着させ、乾燥状態にしたも
のに検体を入れ、発色剤等を加えてその吸光度を測定す
るものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ミエロ
ペルオキシダーゼは通常（凍結乾燥状態）では安定だ
が、水溶液中や固定化状態では抗原性（免疫学的作用）
が不安定であり、すぐにその抗原性を失ってしまうた
め、長期間（例えば３カ月以上）保存しておくことは不
可能であった。そのため、免疫学的作用における抗原と
してミエロペルオキシダーゼを用いた酵素免疫測定試薬
などでは経時的に抗原性が変化するゆえ、試薬調製後の
試薬性能を一定に保つことが難しく、保存が困難である
という欠点があった。
ペルオキシダーゼは通常（凍結乾燥状態）では安定だ
が、水溶液中や固定化状態では抗原性（免疫学的作用）
が不安定であり、すぐにその抗原性を失ってしまうた
め、長期間（例えば３カ月以上）保存しておくことは不
可能であった。そのため、免疫学的作用における抗原と
してミエロペルオキシダーゼを用いた酵素免疫測定試薬
などでは経時的に抗原性が変化するゆえ、試薬調製後の
試薬性能を一定に保つことが難しく、保存が困難である
という欠点があった。
【０００５】本発明は、ミエロペルオキシダーゼの抗原
性を安定化し、免疫学的作用における抗原としてミエロ
ペルオキシダーゼを用いた免疫測定試薬を長期（例えば
６カ月以上）にわたり、その試薬性能を損なうことなく
保存できる方法を提供することを目的とする。
性を安定化し、免疫学的作用における抗原としてミエロ
ペルオキシダーゼを用いた免疫測定試薬を長期（例えば
６カ月以上）にわたり、その試薬性能を損なうことなく
保存できる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ミエロペルオ
キシダーゼに０．０５〜４Ｗ／Ｖ％のデキストラン溶液
を添加することを特徴とするミエロペルオキシダーゼの
抗原性を安定化する方法を要旨とする。
キシダーゼに０．０５〜４Ｗ／Ｖ％のデキストラン溶液
を添加することを特徴とするミエロペルオキシダーゼの
抗原性を安定化する方法を要旨とする。
【０００７】本発明は、抗原性安定剤としてデキストラ
ンを使用する。デキストランとは、Ｄ−グルコースがα
−１，６結合を主体として結合した粘質性の細菌性多糖
類である。
ンを使用する。デキストランとは、Ｄ−グルコースがα
−１，６結合を主体として結合した粘質性の細菌性多糖
類である。
【０００８】本発明において用いるデキストランはα−
１，６結合以外の結合、例えばα−１，３結合やα−
１，２結合などが含まれていても良いが、α−１，６結
合が６５％以上であるものが望ましい。また、その重合
度は多様であるが低分子量、例えば分子量約３０，００
０〜９０，０００程度のものが望ましい。
１，６結合以外の結合、例えばα−１，３結合やα−
１，２結合などが含まれていても良いが、α−１，６結
合が６５％以上であるものが望ましい。また、その重合
度は多様であるが低分子量、例えば分子量約３０，００
０〜９０，０００程度のものが望ましい。
【０００９】本発明においてはミエロペルオキシダーゼ
に０．０５Ｗ／Ｖ％以上のデキストラン溶液を添加する
場合に有効である。デキストラン溶液を４Ｗ／Ｖ％より
多い量にしても何等差支えないが、デキストランの高濃
度溶液は粘性が高く、採用しにくい。デキストラン溶液
の溶媒としては、タンパクの性質を損なわない溶液が使
用可能である。すなわちｐＨ５〜８の中性以上の緩衝
液、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を使用す
るのが好ましい。ミエロペルオキシダーゼの形態として
は、凍結乾燥粉末以外のいかなる形態でもよい。例え
ば、ミエロペルオキシダーゼを不溶性担体に吸着させた
ものやミエロペルオキシダーゼを含有する水溶液などが
挙げられる。
に０．０５Ｗ／Ｖ％以上のデキストラン溶液を添加する
場合に有効である。デキストラン溶液を４Ｗ／Ｖ％より
多い量にしても何等差支えないが、デキストランの高濃
度溶液は粘性が高く、採用しにくい。デキストラン溶液
の溶媒としては、タンパクの性質を損なわない溶液が使
用可能である。すなわちｐＨ５〜８の中性以上の緩衝
液、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を使用す
るのが好ましい。ミエロペルオキシダーゼの形態として
は、凍結乾燥粉末以外のいかなる形態でもよい。例え
ば、ミエロペルオキシダーゼを不溶性担体に吸着させた
ものやミエロペルオキシダーゼを含有する水溶液などが
挙げられる。
【００１０】本発明のミエロペルオキシダーゼを抗原と
して用いるには、例えば、ミエロペルオキシダーゼをプ
レート状の不溶性担体に付着させ、必要であれば牛血清
アルブミン、ゼラチン、カゼイン等を用いてブロツキン
グを行い乾燥して固相化する。
して用いるには、例えば、ミエロペルオキシダーゼをプ
レート状の不溶性担体に付着させ、必要であれば牛血清
アルブミン、ゼラチン、カゼイン等を用いてブロツキン
グを行い乾燥して固相化する。
【００１１】不溶性担体には、ガラス、アガロース、セ
ルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ホモポ
リペプチド、ラテックス、ポリカボーネート、ポリプロ
ピレン、アミノアルキルシリカガラス、シリコンゴム等
の担体が使用され、その表面に共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着等によりミエロペルオキシダーゼを付着
させた後乾燥させて固相化されている。
ルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ホモポ
リペプチド、ラテックス、ポリカボーネート、ポリプロ
ピレン、アミノアルキルシリカガラス、シリコンゴム等
の担体が使用され、その表面に共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着等によりミエロペルオキシダーゼを付着
させた後乾燥させて固相化されている。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明
するが、これらに限定されるものではない。なお、実施
例の数値は特に記載しない限り、重量パーセントで示
す。 〔実施例１〕 リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用してタンパク濃度５
μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ（カミヤバイオメ
デイカル社製）溶液を調製し、マイクロタイタープレー
ト（ヌンク社製、９６−wells）に２００μl/wellずつ
分注し、４℃で１８時間放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。
その後、デキストラン（分子量約３０，０００〜９０，
０００、ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で表１に示す濃度に調製した溶液を、上記プレ
ートに２００μl/wellずつ添加した。２５℃で６０分間
反応後、該溶液を除去し、デシケーター中で風乾させ
た。
するが、これらに限定されるものではない。なお、実施
例の数値は特に記載しない限り、重量パーセントで示
す。 〔実施例１〕 リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用してタンパク濃度５
μｇ／ｍｌのミエロペルオキシダーゼ（カミヤバイオメ
デイカル社製）溶液を調製し、マイクロタイタープレー
ト（ヌンク社製、９６−wells）に２００μl/wellずつ
分注し、４℃で１８時間放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。
その後、デキストラン（分子量約３０，０００〜９０，
０００、ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で表１に示す濃度に調製した溶液を、上記プレ
ートに２００μl/wellずつ添加した。２５℃で６０分間
反応後、該溶液を除去し、デシケーター中で風乾させ
た。
【００１３】これらのプレートを４０℃で保存し、乾燥
直後（０日）、７日後、１４日後に各々のプレートに検
体として顕微の結節性多発動脈炎の患者血清（抗ミエロ
ペルオキシダーゼ抗体含有）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で５０倍に稀釈した試料を２００μl/wellずつ分注
した。
直後（０日）、７日後、１４日後に各々のプレートに検
体として顕微の結節性多発動脈炎の患者血清（抗ミエロ
ペルオキシダーゼ抗体含有）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で５０倍に稀釈した試料を２００μl/wellずつ分注
した。
【００１４】２５℃で６０分間反応後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で上記
プレートの洗浄を行い、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を
使用して調製したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（シグマ社製）を２００μl/wellずつ分注し
た。
ｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で上記
プレートの洗浄を行い、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を
使用して調製したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（シグマ社製）を２００μl/wellずつ分注し
た。
【００１５】２５℃で６０分間反応後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で上記
プレートの洗浄を行い、ジエタノールアミン−ＨＣＬ緩
衝液（ｐＨ９．８）で調製したｐ−ニトロフェニルリン
酸２ナトリウム（シグマ社製）を発色剤として２００μ
l/wellずつ加え、発色剤添加後、０分と６０分との吸光
度差を測定した。吸光度の測定は４０５ｎｍで行い、マ
イクロプレートリーダーＴｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０（コ
ロナ社製）を用いた。
ｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で上記
プレートの洗浄を行い、ジエタノールアミン−ＨＣＬ緩
衝液（ｐＨ９．８）で調製したｐ−ニトロフェニルリン
酸２ナトリウム（シグマ社製）を発色剤として２００μ
l/wellずつ加え、発色剤添加後、０分と６０分との吸光
度差を測定した。吸光度の測定は４０５ｎｍで行い、マ
イクロプレートリーダーＴｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０（コ
ロナ社製）を用いた。
【００１６】乾燥直後の吸光度値を１００％として７日
後および１４日後の吸光度差の相対値（残存活性）を％
で求め、４０℃保持での経時変化によるミエロペルオキ
シダーゼの安定性を調べた。その結果を表１に示す。
後および１４日後の吸光度差の相対値（残存活性）を％
で求め、４０℃保持での経時変化によるミエロペルオキ
シダーゼの安定性を調べた。その結果を表１に示す。
【００１７】〔比較例１〕 実施例１と同様にミエロペルオキシダーゼを固定化した
プレートを作成し、デキストランを添加せず、同様に検
体の測定を行なってミエロペルオキシダーゼの安定性を
調べた。その結果も表１に示す。
プレートを作成し、デキストランを添加せず、同様に検
体の測定を行なってミエロペルオキシダーゼの安定性を
調べた。その結果も表１に示す。
【００１８】表１の結果より、乾燥直後７日目および１
４日目ともデキストラン無添加のプレートに比べると、
デキストランの添加により残存抗原性が高くなってい
る。このことから、ミエロペルオキシダーゼの安定性に
は、デキストランを添加することが有効である。
４日目ともデキストラン無添加のプレートに比べると、
デキストランの添加により残存抗原性が高くなってい
る。このことから、ミエロペルオキシダーゼの安定性に
は、デキストランを添加することが有効である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、ミエロペルオキシダー
ゼの抗原性は著しく安定され、また熱に対しても安定化
される。従って、免疫学的作用における抗原としてミエ
ロペルオキシダーゼを用いた免疫測定試薬でも、長期に
わたり試薬性能を損なうことなく保存できるゆえ、試薬
を浪費せず、有効に利用することができる。
ゼの抗原性は著しく安定され、また熱に対しても安定化
される。従って、免疫学的作用における抗原としてミエ
ロペルオキシダーゼを用いた免疫測定試薬でも、長期に
わたり試薬性能を損なうことなく保存できるゆえ、試薬
を浪費せず、有効に利用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/96 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ミエロペルオキシダーゼに０．０５〜４
Ｗ／Ｖ％のデキストラン溶液を添加することを特徴とす
るミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法。 - 【請求項２】 ミエロペルオキシダーゼが固相化ミエロ
ペルオキシダーゼである請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05248294A JP3188974B2 (ja) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05248294A JP3188974B2 (ja) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213284A JPH07213284A (ja) | 1995-08-15 |
| JP3188974B2 true JP3188974B2 (ja) | 2001-07-16 |
Family
ID=12915944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05248294A Expired - Fee Related JP3188974B2 (ja) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | ミエロペルオキシダーゼの抗原性を安定化する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3188974B2 (ja) |
-
1994
- 1994-01-28 JP JP05248294A patent/JP3188974B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07213284A (ja) | 1995-08-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |