JPH02247564A - 免疫診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特定の抗体の存在を検知するために、該抗体
に対する抗原性物質を使用する免疫診断試薬に関するも
のである。

〔従来の技術〕

従来、担体を用いた免疫診断試薬において、該担体に、
例えば、生理活性物質のような抗原性物質を固定化する
場合には、物理吸着による方法が、多く用いられてきた
。すなわち、ラテックス、プラスチックプレートなどの
疎水性材料に、緩衝溶液中、生理食塩水中または精製水
中で、直接生理活性物質であるタンパク質を接触させる
ことにより、疎水性相互作用を利用して、固定化させて
いた。赤血球もタンニン酸処理後同様の方法で、固定化
を行っていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

今日、市販されている多くの担体を用いた免疫診断試薬
（ラテックス試薬、血球凝集法、ＥＩＡ、ＲＩＡなど）
の試薬化にあたって、最も技術的な障害があると思われ
るのは、担体表面への生理活性物質の固定化方法である
。従来の物理吸着による固定化方法では、固定化量の制
御が難しい、低分子量（分子量１万以下くらい）のもの
は固定化されにくい、オリゴ糖などのｔＪ！類も固定化
されにくいなどの問題点がある。

さらに、担体に固定化しようとする生理活性物質を、例
えば、微生物菌体や細胞などから抽出するためや、また
溶液中で安定に存在させるために、界面活性剤を用いる
場合が多々ある。このような、界面活性剤を含む生理活
性物質を担体に固定化するとき、物理吸着による固定化
方法では、吸着反応系中に含まれる界面活性剤が疎水性
相互作用を弱めてしまい、該生理活性物質を固定化する
ことかぐ −できないという問題があった。また、従来技術として
、共有結合により固定化する方法も報告されているが、
反応の制御が難しく、担体の単位面積当りの固定化量が
制御しにくいという問題があった。また場合によっては
、共有結合で固定化した場合、固定化した物質の活性が
著しく失われるなどの問題があった。

そこで、本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行い、従来の物理吸着では固定化量が少なかったり、
固定化できなかった抗原性を有する物質を、ラテックス
、プラスチックプレート、無機材質のような疎水性材料
又はタンニン酸で処理した赤血球などに固定化し、血清
中の該抗原に対する抗体を検出する免疫診断試薬を完成
するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、第１の発明はアビジンを結合した担体にビオ
チンを標識した抗原性物質を結合してなる免疫診断試薬
であり、第２の発明は上記担体が疎水性材料又はタンニ
ン酸で処理した赤血球である免疫診断試薬である。

アビジンとビオチンが強い親和性をもつことは、周知の
事実であるが、本発明はこの性質を利用してアビジンを
担体表面に結合させ、これにビオチンで標識された抗原
性を有する物質を結合させて、診断試薬としたものであ
る。

本発明の免疫診断試薬は、次のように調製される。担体
表面に、アビジンを共有結合又は物理吸着により結合さ
せる。一方、抗原性物質をビオチンで標識しておく。次
に、アビジン結合担体とビオチン標識した抗原性物質を
接触させ、アビジンとビオチンとの間に結合を生じさせ
る。これにより、担体に抗原性物質を固定化させ、免疫
診断試薬を調製する。

以下に、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用する担体は、その担体表面に、アビジンを
結合し得る素材ならば、表面が疎水性であるもの、官能
基を有するものなどいずれでもよく特に制限はない。好
適な、担体は、疎水性材料又はタンニン酸で処理した赤
血球である。疎水性材料としては、ラテックス、プラス
チックプレートのような合成高分子化合物でなる材料、
およびシリカなどの無機材料が挙げられる。また担体表
面へのアビジンの固定化は、共有結合又は物理吸着いず
れの方法も、ビオチンとの結合活性が保持されている限
り適用される。

担体とアビジンとの結合比率は、担体の種類、形状およ
び大きさにより異なるが、担体としてラテックス粒子を
使用する場合は、ラテックス粒子１個あたりの結合アビ
ジン分子数で５〜ｓ、　ｏｏｏ個好ましくは、５０〜５
００個が適当である。

抗原性物質としては、ビオチンによる標識が可能であり
、アビジンを介して担体に吸着された後も抗原性を示す
ものなら、いずれの生理活性物質も適用可能であるが、
特にタンパク質、脂質などが適している。特に、本発明
の効果が著しく発揮されるのは、生理活性物質を抽出、
安定化する為に界面活性剤の存在が不可欠な場合である
。この他にウィルスの抗原、細胞膜上に存在する各種抗
原、レセプター、酵素等も本発明は適用し得るものであ
る。これらの抗原性を示す物質としては、天然に存在す
るものばかりでなく、合成品でも可能である。また、遺
伝子工学的手法によって製造されたものでもよい。

ビオチンと生理活性物質の反応比率は、重量比で１００
：１から、１０００：１で反応させるのが望ましい。

ビオチンの比率がこれ以上でも以下でも、生理活性物質
のビオチンによる標識率は極端に低下してしまう。

担体表面に吸着させたアビジンと、抗原に標識したビオ
チンを結合させるときには、ｐＨ８，０以上の緩衝液中
で行うと、アビジンとビオチンの結合がより促進される
。得られた試薬を保存しておく緩衝液は、それぞれ抗原
の活性を維持するのに最も適した塩濃度およびｐＨＯも
のを選択すればよい。

本発明は、きわめて広範囲に適用されるが、特に有効に
利用される分野としては、−量的にＲＩＡ、Ｅ　ＩＡＸ
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、ラテックス試薬、血球凝集法とよばれ
ている方法による診断試薬に関してである。これらの中
でも、特に生理活性物質を固定化するのが困難とされて
いるラテックス試薬において、固定される生理活性物質
の量的な制御に最も有効に利用される。

上記のように本発明を適用したラテックス試薬を調製し
た場合に、場合によっては測定系の特異性を高めたり、
感度を上げたりするために、塩化コリン、ＥＤＴＡ、糖
類、多糖類、デキストラン、ポリエチレングリコール等
の親水性ポリマーなどを反応系に添加することも可能で
ある。

〔実施例〕

以下の実施例で本発明の詳細な説明する。但し、本発明
は、これら実施例に限定されるものでない。

１　　−−　クス−（凝集観察板によ るマニュアル法） 梅毒トレポネーマ抗原を固定化し、抗体アッセイ用のラ
テックス試薬を調製し、この試薬を用いて本発明の効果
をマニュアルによる凝集観察法によって確認した。

この実施例で用いられる試薬類は次の通りである。

ａ、　ＰＢＳ リン酸１ナトリウム（２水和物）、リン酸２ナトリウム
（２水和物）、塩化ナトリウムから、０．０２１リン酸
、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，４）を調製した
。

ｂ、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ ＰＢＳに≠染巷無Ｂ　Ｓ　Ａ　　（ウシ血清アルブミン
）を１％（ｗ／ｗ）に溶解させたもの。

ｃ、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐ　Ｈ８，２０）グリシ
ン（牛丼化学、試薬特級）　、ＩＮ　Ｎａ０ＩＩ　　を
用いて、ｐＨが８．２０±０．０１になるように０．１
　Ｍグリシン−ＮａＯＨ水溶液を調製した。

ｄ、リン酸−クエン酸緩衝液 ０．２？Ｉ　リン酸２ナトリウム水溶液と０．１Ｍクエ
ン酸水溶液を混合し、ｐＨ５，５０±０．０１になるよ
うに調製した。

。、アビジン 和光純薬社より購入したものを用いた。アビジンはペプ
チドサブユニット４個をもつ分子量６６．０００の糖蛋
白であるが本試薬はストレプトミセス・アビジニイ（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ）によって
産生されたストレプトアビジンを用いた。

ｆ、ビオチン標識用試薬 ＥＮＺＯＢＩＯＣ）ＩＢＭ、ＩＮＣ，より購入したエン
ゾチンとして用いた。

ｇ、１％トリトンＸ−１００ ＰＢＳにトリトンＸ−１００を１％になるように溶解し
たもの。

ｈ、　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド シグマ社より購入したものを用いた。

ｉ、ＮａＮ３ 東京化成社より購入したものを用いた。

ｊ、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　２０ 和光純薬社より購入したものを用いた。

ｋ、梅毒抗原液 家兎翠丸中で１０〜１４日間培養したトレボネーマパリ
ダム［ヒ町甜但■Ｈ上１ｉｄｕｍ；ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅ
ｒ　ｆｏｒＤｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｐｕｂｌ
ｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｅｄｕ
ｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ。

Ａｔ１ａｎｔａ、　Ｇｅｏｒｇｉａ）より入手したもの
を家兎翠丸に接種し、継代培養したものを用いた］を生
理食塩水中に１０９個菌体／ｄとなるように懸濁した菌
体懸濁液ＩＩｄを採り、リン酸緩衝液中で遠心分離（６
，０００ｒｐｍＸ　５分、３回）することにより洗浄し
た。

次いで、得られた沈澱に１％トリトンＸ−１００をｌ酸
添加し、３７°Ｃにて３０分間インキュベートした。

その後、これを超遠心分離機にかけて（５０，００Ｏｒ
ｐｍ×１時間）上清を採取したものを１％トリトンＸ１
００で１０００倍希釈し、これを梅毒抗原液とした。

１、梅毒陽性家兎血清 トレボネーマ　パリダムを翠丸に接種後４５日間飼育し
た家兎から血清を採取した。この血清を１％ＢＳＡ　−
ＰＢＳで１００倍、２００倍および４００倍に希釈して
使用した。

ｍ、正常家兎血清 トレボネーマ　パリダムを接種されていない家兎から採
取した血清を用いた。市販のＴＰＨＡキット（セロディ
アＴＰ、冨士しビオ製）を用いてタイターを測定したと
ころ、結果は陰性を示した。この血清を１％ＢＳＡ　−
ＰＢＳで１００倍から４００倍に希釈して用いた。

ｎ、ラテックス 表面にカルボキシル基を有するラテックス（以下、カル
ボキシレート・ラテックスという）として積木化学工業
■製のメタクリル酸−スチレン共重合体ラテックス（直
径０．２０２μｍ）を用いた。

また表面に官能基を持たない通常のラテックスとして同
社のポリスチレンラテックス（直径０．２３２μｍ）　
　（以下、通常ラテックスという）を用いた。

ｏ、　０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，ＯＯ）又は
（ｐＨ８，００）ニリン酸１ナトリウム（２水和物）、
リン酸２ナトリウム（２水和物）から、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，００）又は（ｐＨ８，００）を調製し
た。

梅毒ラテックス試薬の調製及びその凝集結果を次に説明
する。

１、ラテックス表面へのアビジンの結合１−１　　共有
結合によるアジピンの固定化固形分１０％のカルボキシ
レート・ラテックス１ｄを蒸留水４．０　ｍに懸濁させ
、固形分２．０％とした。これに、０，０５Ｍ　ＫＨｚ
ＰＯ４（ｐＨ４，５０）水溶液１．Ｏｄを添加した。こ
の懸濁液を、マグネチックスターラーに乗せ、２２°Ｃ
に保持し、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドの２重量％の０．０５Ｍ）（Ｈｔ
ＰＯ４水溶液５Ｉ！Ｉｉを添加し、ラテックスとともに
３．５時間反応させた。次いで、カルボジイミド活性化
したカルボキシレート・ラテックスをＰＢＳで１回遠心
洗浄（１５，ＯＯＯｒｐｍ　Ｘ１５分）し、ついでＰＢ
３５ｄに再懸濁した。

アビジン１．０■を、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
５０）５ｉに溶解し、これに上記のカルボジイミド活性
化したカルボキシレート・ラテックス懸濁液５ｄを加え
、該ラテックスとアビジンを２２℃で２００時間反応せ
た０次に、アビジンと結合していない表面カルボキシル
基を中和するために、エタノールアミンを終濃度が５ｍ
Ｍになるように添加し、次いで、ＢＳＡを２重量％の濃
度になるように添加した。

このアビジン−ラテックスをＮａＮｚ　Ｏ，２％、ＢＳ
八へ、２％およびツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２００，
０５％を含有する０、１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，２
０）　　（以下、このＮａＮ３、ＢＳＡ　、およびツイ
ーンを含有するグリシン緩衝液のことを、ラテックス保
存用緩衝液という＞５ｍｌで遠心（１５，ＯＯＯｒｐｍ
　Ｘ１５分）洗浄し、次に同じ緩衝液５ｄに懸濁させ、
４°Ｃで保存した。

１２　　物理吸着によるアビジンの固定化アビジン１．
０　ｍｇを１％ＢＳＡ　・ＰＢＳ　４　ｄに溶解し、こ
れに固形分１０％の通常ラテックス１戚を添加した。こ
れを室温で１時間混和・攪拌した。反応終了後、５−の
１％ＢＳＡ・ＰＢＳで３回遠心洗浄（１５゜０００ｒｐ
ｍ　Ｘ　１５分）後、５＃ｌｌ！の１％ＢＳ＾・ＰＢＳ
に懸濁した。次に、ＢＳＡを２重量％の濃度になるまで
添加した。このアビジン−ラテックスを、ラテックス保
存用緩衝液５戚で遠心洗浄（１５，０００ｒｐｍ　Ｘ　
１５分）後、同じ緩衝液５　ｒｒｄｌに懸濁させ、４°
Ｃで保存した。

２、トレボネーマ抗原のビオチン標識化梅毒抗原液ｌ−
を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，００）　５０ｄに
て２回透析を行った。この透析液５００ｕｌに、５ｍｇ
／ｄｘンゾチン（ＤＭＳＯ溶液）を１０．６μｌ添加し
、室温で３時間反応・攪拌した。反応終了後、反応液を
透析チューブに移し、１％トリトンｘ−１００を含むＯ
，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，００）５０ｄに対して３
回透析を行った。この透析液をビオチン標識トレポネー
マ抗原液とした。

３、トレボネーマ抗原のラテックスへの固定化１−１お
よび１−２で調製した、各アビジン固定化ラテックスｌ
ｄ（固形分２％）に、２．のビオチン標識トレポネーマ
抗原液を５００μ！と１％トリトンｘ−１００を含む０
．ＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，００）　　５００μｌ
を混合した感作液を素早く添加し、室温で１時間反応さ
せた。

反応後、１．で用いた、ラテックス保存用の緩衝液５−
で３回遠心洗浄（１５，ＯＯＯｒｐｍ　Ｘ　１５分）し
た後に、同緩衝液２戚にラテックスを懸濁させ、いずれ
も固形分１．０％のラテックス試薬として４°Ｃで保存
した。

４゜トレボネーマ抗原のラテックスへの固定化（従来法
） 比較のために、本発明のアビチン・ビオチン反応を利用
せずに従来の方法を用いてトレポネーマ抗原をラテック
スへ固定化した。その方法は下記の通りである。

カルボキシレート・ラテックスあるいは通常ラテックス
Ｉｎ＋ｉ　　（固形分２％）に梅毒抗原液５００μり°
。

ｌを添加し、マ―ネチック・スターシー上で室温で１時
間反応・攪拌させた。反応終了後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
５ｍｌで３回遠心洗浄（１５，０００ｒｐｍ　Ｘ１５分
）したのち１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２ｍｌに懸濁・分散させ
、固形分１％のラテックス試薬として４°Ｃで保存した
。

５、抗原抗体反応 梅毒陽性家兎血清と各ラテックス試薬を各々５０μβず
つ凝集観察板上に採り、混合・攪拌したのち３分間反応
させた。対照として、正常家兎血清についても同様に反
応させた。反応後、ラテックス試薬が凝集したかどうか
を目視で判定した。その結果を第１表に示す。

比較例として、梅毒抗原液を上記４．に述べた従来法で
ラテックスに吸着させて調製した梅毒ラテックス試薬を
用いた場合についても同様の操作を行い、その結果も第
１表に示した。

（木頁以下余白） 第１表の結果から明らかなように、本発明によるラテッ
クス試薬ではアビジンを共有結合又は物理吸着させた試
薬のいずれでも従来法では凝集がみられなかった高希釈
率の陽性血清での凝集が観察された。また正常血清での
非特異吸着も見られず、高感度のラテックス試薬を得る
ことができた。

２　　−″　クスー　　（全自動分析装置を用いた測定
法） 梅毒トレボネーマ抗原に対する抗体を定量する場合の本
発明の効果を、全自動分析装置を用いてラテックス診断
試薬の凝集を測定することによりｆｉ認した。

使用した試薬類は特に断わらない限り実施例１と同じも
のを用いた。ただし、ラテックス試薬は、懸濁させるの
に用いた緩衝液で０．２５％に調製して用いた。又、希
釈液（Ｒ１試薬）として３％ポリチレングリコール（Ｍ
Ｗ、６０００）を含む１％ＢＳ八・ＰＢＳを用いた。

測定は日立７０５０型　全自動分析装置を用いて行った
。

１、条件の設定 測定条件を以下のように設定した。

ＳＡＭＰＬＥ　ＶＯＬＵＭＥ　　　２０μｌ　　（検体
）Ｒ２ＶＯＬＵＭＥ５０ｕｌ　　（ラテックス試薬）Ｒ
Ｉ　　　ＶＯＬＵＭＥ　　３５０１！　（希釈液）測定
開始後、５分後と１０分後の５７０＋ｖにおける吸光度
の差（Δ０．０．５７０）を測定した。

梅毒陽性家兎血清を検体として用いた。対照として正常
家兎血清を用いた。

比較例として、実施例１の４６項で述べた従来法で調製
した梅毒ラテックス試薬を用いた場合についても同様の
測定を行った。

第２表に、各側について５７０ｎｎ＋における吸光度の
変化を示した。（ｎ＝４でおこなった平均値）。

また梅毒陽性家兎血清についてこの結果をグラフに表し
たのが第１図である。第１図において横軸は陽性血清の
希釈倍率を示し、また縦軸はΔ０．Ｄ。

５７０を示す。

第２表および第１図の結果から明らかなように、本発明
によるラテックス試薬では、従来の試薬では凝集が見ら
れなかった高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判
定し得る感度が得られた。また、アビジンの固定化法に
よる、感度その他の大きな差はなく、正常血清について
は、従来の試薬で見られていた非特異反応による凝集が
解消されるなど、本ラテックス試薬は、特異性が高く、
感度のよいものであるという結果が得られた。

３−　ＨＢｓ　−−クス−（凝集板を用いたマニュアル
法） 本発明をＨＢｓ抗体アッセイ用のラテックス試薬に応用
した場合の効果を確認した。

梅毒抗原液のかわりにＨＢｓ抗原液、梅毒陽性家兎血清
の代わりに抗ＨＢｓ抗血清を用いた他は、実施例１と同
じ試薬を用いた。ただし１％トリトンＸ−１００は用い
なかった。

この実施例に用いるＨＢｓ抗原液及び抗ＨＢｓ抗血清は
次の通り調製した。

ａ、ＨＢｓ抗原液 ヒト血漿よりアフィニティークロマトグラフィーにより
精製した精製ＨＢｓ抗原を使用した。抗原は０．１ＭＩ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、濃度をローリ−
法により測定した。使用直前に、０．１１リン酸緩衝液
（Ｐ　Ｈ７，０）により希釈し、濃度を１−１０μｇｏ
ｄになるように調製して、これをＨＢＳ抗原液とした。

ｂ、抗ＨＢｓ抗血清 精製ＨＢｓ抗原をフロイントの完全アジュバントととも
に家兎に免疫して得られた抗血清を、正常ヒト血清を結
合させたカラムで吸収操作を行ったものを用いた。正常
ヒト血清を結合させたカラムＬＩＣＮＢｒ活性化セファ
ロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）を用い、メーカー（
ファルマシア）の使用説明書に従って作製した。

吸収操作を行った抗ＨＢｓ抗血清は１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
により、実施例１と同様に１００から４００倍に希釈し
て用いた。

ＨＢｓラテックス試薬の調製法及びその凝集結果を次に
説明する。

１、ラテックス表面へのアビジンの結合実施例１の１−
１項及び１−２項と同様に行った。

２、ＨＢｓ抗原のビオチン標識化 ＨＢｓ抗原液ＩＩｄを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１
７．００）　５０ｄで２回透析を行った。この透析液５
００μ！に、５■／Ｉｄエンゾチン（ＤＭＳＯ溶液）を
１Ｏ３６μ！添加し、室温で３時間反応した。反応終了
後、反応液を透析チューブに移し、０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，００）　５（ｌＩＩｄｌに対して３回透析
を行った。この透析液をビオチン標識ＨＢＳ抗原液とし
た。

３、ＨＢｓ抗原のラテックスへの固定化１、で調製した
、各アビジン固定化ラテックス１Ｉｄ（固形分２％）に
、２．のビオチン標識ＨＢｓ抗原液を５００μｌと０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐｉ−１８，００）５００μ！を混
合した感作液を素早（添加し、室温で１時間攪拌した。

反応後、実施例１の１９項で用いた、ラテックス保存用
の緩衝液５ａｉ！で３回洗浄したのちに同緩衝液２ｄに
ラテックスを懸濁させ、固形分１．０％のラテックス試
薬として４°Ｃで保存した。

４、ＨＢｓ抗原のラテックスへの固定化（従来法）カル
ボキシレート・ラテックスあるいは通常ラテックスｌｄ
（固形分２％）にＨＢｓ抗原液５００μｌを添加し、マ
グネチック・スターシー上で室温で１時間反応・攪拌さ
せた。反応終了後、１％ＢＳＡ　　−ＰＢＳ　５ｄで３
回遠心洗浄（１５，０００μ！ｍ　ｘ　１５分）したの
ち、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　２−に懸濁させ、固形分１％
のラテックス試薬として４°Ｃで保存した。

５、抗原抗体反応 抗ＨＢｓ抗血清と各ラテックス試薬を各々５０μｌずつ
凝集観察板上に採り、混合・攪拌したのち３分間反応さ
せた。対照として、正常家兎血清についても同様に反応
させた。反応後、ラテックス試薬が凝集したかどうかを
目視で判定した。その結果を第３表に示す。

比較例として、ＨＢｓ抗原液を、上記４．に述べた従来
法で調製したＨＢｓラテックス試薬を用いた場合につい
ても同様の測定を行った。

その結果も第３表に示した。

（本頁以下余白） 第３表に示す結果から明らかなように、本発明によれば
従来の方法では偽陽性が生じる検体でも、特異性高く診
断することができる。

４ＨＢｓ−−クスー　　（全自動分析装置を用いた測定
法） 本発明の効果をＨＢｓ抗体アッセイ用のラテックス試薬
に応用し、全自動分析装置を用いてラテックス診断試薬
の凝集を測定することにより確認した。使用した試薬類
は特に断わらない限り実施例３と同じものを用いた。但
し、ラテックス試薬は懸濁させるのに用いた緩衝液で０
．２５％に希釈して用いた。又、希釈液（Ｒ１試薬）と
して３％ポリエチレングリコール（ＭＷ、６０００）を
含む１％ＢＳＡ・ＰＢＳを用いた。

測定は日立７０５０型　全自動分析装置を用いて行った
。

１、条件の設定 測定条件を以下のように設定した。

ＳＡＭＰＬＥ　ＶＯＬＵＭＥ　　　２０ｕ　ｌ　　（検
体）Ｒ２ＶＯＬＵＭＥ　　　５０ｕ１．　　（ラテック
ス試薬）ＲＩ　　　ＶＯＬＵＭＥ　　３５０ｕｊ２　　
＜希釈液）測定開始後、５分後と１０分後の５７０ｎａ
における吸光度の差（Δｏ、ｏ、５７０）を測定した。

検体として抗ＨＢｓ抗血清を用いた。対照としては正常
家兎血清を用いた。

比較例として、実施例３の４６項で述べた、従来の物理
的吸着法で調製したＨＢｓ抗体のラテックス試薬につい
ても同様の測定を行った。

第４表に、各側について５７０ｎｍにおける吸光度の変
化を示した。（ｎ＝４でおこなった平均値）。

また抗ＨＢｓ抗血清についての第４表の結果をグラフに
表したのが第２図である。横軸は抗ＨＢｓ抗血清の希釈
倍率を示す。縦軸はΔ０，０．５７０を示す。

（本頁以下余白） 第４表および第２図の結果から明らかなように、本発明
によるラテックス試薬では、従来の試薬では凝集が見ら
れなかった高希釈倍率の抗ＨＢｓ抗血清においても、陽
性と判定し得る感度が得られた。また、正常血清につい
ては、従来の試薬で見られていた非特異反応による凝集
が解消されるなど、本ラテックス試薬は、特異性が高く
、感度がきわめてよいものであることが判る。

５、　　ＥＬＩＳＡによる　　　　ア　セイ梅毒トレポ
ネーマ抗原に対する抗体を測定する際の本発明の効果を
、ＥＬＩＳＡ法によりｌｉＩ認した。

緩衝液、梅毒抗原液などは特に断わらない限り実施例１
に用いたものを使用した。

この実施例に用いる試薬類は次の通り調製した。

ａ、ペルオキシダーゼ標識抗つサギＩｇＧマイルズ・ラ
ボラトリ−社のペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを
１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１０００倍に希釈して用いた。

ｂ、マイクロタイタープレート ヌンク社の９６穴マイクロタイタープレートを用いた。

Ｃ，ペルオキシダーゼ基質 リン酸−クエン酸緩衝液に０−フェニレンジアミン（２
塩酸塩）を２ａ＋ｇ／Ｉｄ、過酸化水素水を０．０３％
になるように溶解した。基質の調製は使用直前に行った
。

＠＠ＥＬＩＳＡによる梅毒抗体アッセイ法及びその効果
を次に説明する。

■、アビジンの固定化 アビジン１．０ｍｇを、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，５０）５戚に溶解し、同緩衝液で分注直前に５０倍希
釈したものをマイクロタイタープレートの各ウェルに、
５０μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした
。

２、ビオチンの担体への固定化法 実施例１と同様にしてビオチン標識した梅毒抗原を、分
注直前に、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜５０）で５
０倍希釈し、マイクロタイタープレートの各ウェルに５
０μｌずつ分注し室温で１時間インキュベートした。１
時間後、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ　２００μ尼で１回洗浄
した後、０．９％ＮａＣ１水溶液２００μ２で３回洗浄
を行った。

３、抗原抗体反応 第１抗体として、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳの代わりに、３
％ポリエチレングリコール（ＭＷ、６０００）を含む１
％ＢＳ＾・ＰＢＳで１００．２００．４００倍に希釈し
た梅毒陽性血清を各ウェルに５０μｌずつ分注し、室温
で１時間インキュベートした。対照として、正常家兎血
清を同様に希釈したものも同様に分注・インキュベート
した。

４、第２抗体との反応 １時間後、反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２
００μｌで３回洗浄したのち、ペルオキシダーゼ標識抗
ウサギＩｇＧ（第２抗体溶液）を各ウェルに５０μ！ず
つ分注した。室温で１時間インキュベートしたのちに反
応液を吸引除去し１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ　２００μｌで
３回洗浄した。洗浄後ただちに各ウェルに結合した酵素
活性を測定した。

５、酵素反応 各ウェルに１００μ！ずつペルオキシダーゼ基質を分注
し、室温で１５分間インキュベートした。基質ブランク
として、第１抗体および第２抗体のいずれも添加してい
ないウェルを用意し、同様に基質液を添加してインキュ
ベートした。インキュベート後、ｌＮ硫酸を１００μβ
ずつ分注し、酵素反応を停止させた。各ウェルの酵素反
応時間は一定になるように行った。

反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー（ＭＴ
Ｐ−１００、コロナ社）により、基質ブランクを対照と
して４９２ｎｉの吸光度を測定した。

比較例として、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５０）
で５０倍希釈した梅毒抗原液を直接マイクロタイタープ
レートに吸着させた場合にも同様の操作を行った。

各ウェルのＯ，０，４９２ｎｍの平均値（ｎ＝４）を第
５表に示す。

また、陽性血清についての第５表の結果をグラフに示し
たのが第３図である。横軸は陽性血清の希釈倍率を示す
。縦軸はＯ，０，４９２ｎｍの平均値を示す。

（本頁以下余白） 第５表および第３図の結果から明らかなように、本発明
に依れば、従来の方法では抑制できなかった正常家兎血
清での非特異反応を吸光度０から０．００５の間に低下
させることを可能とした。また、陽性血清に関しては、
抗原・抗体反応を特異的に促進した結果、はぼ２倍感度
を向上させることが可能となった。

６、ＴＰＨＡによる　　　　ア　セイ 梅毒トレボネーマ抗原に対する抗体を測定する際の本発
明の効果を、Ｔ　Ｐ　ＩＩ　Ａ試薬により確認した。

緩衝液、梅毒抗原液などは特に断わらない限り実施例１
に用いたものを使用した。

この実施例に用いる試薬類は次の通りである。

ａ、タン゛ニン酸 牛丼化学■より購入したものを用いた。

ｂ、市販ＴＰＨＡキット セロクリットＴ、Ｐ、　：化学および血清療法研究所セ
ロディアＴ、Ｐ、　　：富士レビオから購入したものを
用いた。

Ｃ，ヒツジ赤血球 ｄ０判定プレート ヌンク社製のＵ字型９６六マイクロタイタープレートを
用いた。

ｅ、ＰＨＡ緩衝液 リン酸１ナトリウム（２水和物）とリン酸２ナトリウム
（２水和物）より調製した０、１５Ｍ　リン酸緩衝液（
ｐＨ７，４０）を生理食塩水で１０倍に希釈し、ＮａＮ
、を０．１％、正常家兎血清を２％、ストローマ１％と
なるよう添加したもの。

Ｔ　Ｐ　１１　Ａによる梅毒抗体アッセイ法及びその効
果を次に説明する。

ｌ、羊赤血球へのアビジン固定化 常法によりタンニン酸処理した羊赤血球６％血球液５ｄ
をスターシー上で攪拌しながら、アビジン１．０■を、
０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，５０）　５　ｍｌに
溶解した感作液を素早く添加し、３７°Ｃで１時間イン
キュベートした。この後、十分量の０，９％ＮａＣ１水
溶液で遠心洗浄した後、０．１Ｍグリシン緩衝液に懸濁
させ、６％血球液とした。

２、ビオチンの担体への固定化法 実施例１の２０項と同様にしてビオチン標識したトレボ
ネーマ抗原液ａＩＩＩＩｄに６％血球液を等量添加し、
マグネチックスクーラーで攪拌しながら室温でインキュ
ベートした。１時間後、十分量の０．９％ＮａＣ１水溶
液で３回洗浄した後、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで６％血球
液とし、４°Ｃで保存した。

３、梅毒抗原の羊赤血球への固゛・定量（従来法）常法
により、タンニン酸処理した羊赤血球６％血球液１Ｉｌ
ｉに梅毒抗原液ｌｌｌ１１を添加し、マグネチック・ス
ターラーで攪拌しながら、室温でインキュベートした。

１時間後、十分量の０．９％ＮａＣＩ水溶液で３回洗浄
した後、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで６％血球液とし、４℃
で保存した。

４、抗原抗体反応 市販キット　セロディアＴ、Ｐ、の使用説明書に従って
、定量を行った。なお判定プレートは、添付のものを使
わず、すべてヌンク社のマイクロタイタープレートを用
いた。

上記２６項で作成した血球液はアッセイ時には０．９％
ＮａＣ１水溶液で１度洗浄し、ＰＨＡ緩衝液で０゜６％
とし、室温で１時間インキュベートした後で用いた。

比較例として上記３０項に述べた従来法で調製したＴＰ
ＨＡについて、また市販のＴＰ）ＩＡキットについても
実施例と同じ検体を用いて判定を行った。

２時間の反応後、血球凝集像を目視で観察し、セロディ
アＴ、Ｐ、の添付書の判定基準によって陰性・陽性を判
定した。その結果を第６表に示す。

（本頁以下余白） 第６表の結果から明らかなように、本発明に依れば、従
来の試薬では定量できなかった高希釈倍率の陽性血清で
も本実施例では、陽性と判定することができた。また、
正常家兎血清での非特異反応も見られず、優れたＴＰＨ
Ａ試薬を調製することができた。

〔発明の効果〕

本発明により、ラテックス、プラスチックプレート、無
機材質のような疎水性材料又はタンニン酸で処理した赤
血球などの担体に、抗原性物質の固定化量が制御された
免疫診断試薬が得られる。

また、抗原性物質が例えば界面活性剤を含んでいる場合
、分子量が低い場合または糖類である場合などのため、
従来、固定化量が少なかったりまたは固定化できなかっ
たものでも、良好に固定化された免疫診断試薬が得られ
る。従って、本発明の免疫診断試薬を使用すると、該抗
原性物質に対応する抗体を、非特異反応がなく、特異性
高く、高感度で容易に検出できる。

【図面の簡単な説明】

のＨＢｓラテックス試薬と従来のＨＢｓラテ・ンクス試
薬を比較した図、第３図は梅毒トレボネーマ抗原に対す
る抗体を測定する際の本発明の効果をＥＬＩＳＡ法で確
認した図を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アビジンを結合した担体にビオチンを標識した抗
   原性物質を結合してなる免疫診断試薬。
2. （２）担体が疎水性材料又はタンニン酸で処理した赤血
   球であることを特徴とする請求項１記載の免疫診断試薬
   。