JPH02173567A - 免疫反応測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高感度で非特異反応が少ない免疫反応測定用試
薬および測定方法に関する。

（従来の技術） 各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば、抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテックスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては、上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法。

酵素免疫測定法（ＥＩＡ）　、放射免疫測定法（ＲＩＡ
）など各種方法が知られている。

これらの免疫反応の測定法において、抗原抗体反応を促
進させ、あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば２反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のポリマーであり、これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば、これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし、これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため、バ
ックグラウンド値が上がる。

そのため、バックグラウンド値を越える量の測定値でな
いと検出することができない。つまり多量の試料を必要
とする。従って、この方法は、短時間で反応を進行させ
ることは可能であるが、非特異反応を抑制するには充分
な方法とはいえない。

さらに、使用されるポリエチレングリコールの市販品は
、　２９０ｎｍ付近に吸収を有する不純物を含有するこ
とが多い。そのため、使用前に精製する必要があり、取
扱いが煩雑となる。

（発明が解決しようとする課Ｂ） 本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定用試薬。

および免疫反応測定法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の免疫反応測定用試薬は、被測定物質である抗原
または抗体に対する抗体または抗原、およびアルキル化
多糖類を含有し、そのことにより上記目的が達成される
。

本発明の免疫反応測定法は、抗原または抗体でなる被測
定物質を該抗原または抗体に対する抗体または抗原を用
いて測定する方法であって、該免疫反応の反応系にはア
ルキル北条ｔｉｅが存在し。

そのことにより上記目的が達成される。

本発明に用いられるアルキル化多糖類としては。

メチル基、エチル基などの炭素数１〜５のアルキル基を
有する多糖類であって、水溶性の化合物が用いられる。

それには９例えば、メチルセルロース、エチルセルロー
スなどがある。アルキル北条Ｉ！類の分子量はｉ　、　
ｏｏｏ〜５００　、０００が適当である。

分子量が大きすぎると水に溶解させたときの粘度が高く
なるため、取り扱いが困難となる。水に溶解させたとき
の粘度が適当になるように、２種以上のアルキル北条ｔ
Ｉ！類を組み合わせて用いることも可能である。

本発明により測定されるべき物質は特に限定されず、一
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては、タン
パク、脂質などがあり、それには例えば、各種抗原、レ
セプター、酵素などが挙げられる。具体的には、　ＨＢ
Ｓ抗体、　ＨＢｃ抗体。

梅毒抗体（トレボネーマ抗原および脂質抗原に対する抗
体）、抗旧ν　（ヒト免疫不全ウィルス）抗体、抗ＡＴ
ＬＡ　（成人Ｔ細胞白血病関連抗原）抗体などの、感染
症に関係する抗体が挙げられる。

本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は特に
限定されず２通常の免疫比濁法、　Ｅ４Ａ、　ＲＩＡ。

血球凝集法などが利用され得る。例えば、ラテックス試
薬を用いた免疫反応により被測定物質を測定する場合に
は、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
は抗原を含有するラテックス試薬にあらかじめアルキル
化多糖類を添加しておく。このような試薬を用いて免疫
凝集反応を行ない、生じた凝集の程度を光学的に観察も
しくは目視観察することにより被測定物質が測定され得
る。

あるいは、アルキル化多糖類を含まないラテックスを使
用することも可能で、この場合には免疫反応時にアルキ
ル化多糖類が該反応系に存在するようにすればよい。例
えば、検体にあらかじめアルキル北条ｔｉｎを添加して
おく方法；使用する緩衝液にアルキル化多糖類を加えて
おく方法などかあり、特に限定されない。このときに、
アルキル北条ｔＩ！類は、該反応系に０．０１〜３．０
％（−／す）、好ましくは０．０５〜１．０％（Ｗ／Ｗ
）　、　　さらに好ましくは。

０．１〜０．５％（Ｗ／Ｗ）の割合で含有されるように
調整を行なう。

上記免疫反応の条件は通常の場合と同様であり。

反応媒体としては、被測定物質の種類に応じた各種緩衝
液が用いられる。この緩衝液は、被測定物質を失活させ
ることがな（、かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイ
オン強度やｐＨを有するものであればよい。反応時には
、さらに測定系の特異性を高めるために、塩化コリン、
　ＥＤＴＡなどを添加することも可能である。

本発明によれば、アルキル化多糖類の働きにより、免疫
反応における非特異反応が抑制され、かつ高感度に被測
定物質が測定され得る。以下に。

本発明の実施例を述べ、その効果を具体的に説明する。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実１１１七 （凝集板を用いたマニュアル法による梅毒抗体の測定） 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。

本実施例においては３次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例２〜６および比較例１〜６に
おいても、特に指示されない限り、同名の試薬および検
体については、同様のものを使用した。

ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）ニリン酸−ナトリウム（２水
和物）、リン酸二ナトリウム（２水和物）および塩化ナ
トリウムを、リン酸および塩化ナトリウムノ終濃度がそ
れぞれ０．０２Ｍおよび０．１５Ｍ、　ｐＨが７．４と
なるように精製水に加えて、調製を行なった。

１％　ＢＳＡ　−ＰＢＳ　：　ＰＢＳ　ニ試薬特級ＢＳ
Ａ　　（ウシ血清アルブミン）を１％（Ｗ／Ｗ　）とな
るように溶解させて調製した。

１％トリトンＸ−１００ニリン酸緩衝液にトリトンＸ−
１００を１％（訂讐）となるように溶解させた。

０．３％メチルセルロース：１％ＢＳＡ　−ＰＢＳにメ
チルセルロース（牛丼化学社製；平均粘度１００ｃｐｓ
　）を０．３％（Ｗ／Ｗ　）となるように？８解させた
。

０．３％エチルセルロース：１％ＢＳＡ　−ＰＢＳにエ
チルセルロース（牛丼化学社製：平均粘度４０ｃｐｓ　
）を０．３％（Ｗ／Ｗ　）となるように？８解させた。

３％ポリエチレングリコール：１％ＢＳＡ　　−ＰＢＳ
にポリエチレングリコール（牛丼化学社製；平均分子量
６０００　）を３％（−ハ）となるように溶解させた。

３％デキストラン：１％ＢＳＡ・ＰＢＳにデキストラン
（和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｗ　）となるように溶解
させた。

梅毒抗原液：家兎翠丸中で１０〜１４日間培養したトレ
ボネーマ　パリダム「ｎ」連些μ−巨１１ｉｄ憇；ＣＤ
Ｃ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ、　Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ
、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌ
ｔｈ、　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ　
、　Ａｔ１ａｎｔａ　、　Ｇｅｏｒｇｉａ　）より入手
したものを家兎翠丸に接種し、継代培養したものを用い
たコを生理食塩水中に１０９個菌体／ｍｌとなるように
！Ｑ濁した菌体懸濁液１ｍｌを採り、リン酸緩衝液中で
遠心分離（６，０００ｒｐｍ　Ｘ　５分、３回）するこ
とにより洗浄した。次いで、得られた沈澱に１％トリト
ンＸ−１００を１ｍｌ添加し、３７’Ｃにて３０分間イ
ンキュベートした。その後、これを超遠心分離機にかけ
て（５０，０００ｒｐｍ　Ｘ　１時間）上清を採取し。

１％トリトンＸ−１００で１，０００倍希釈して使用し
た。

梅毒陽性家兎血清：トレボネーマ　パリダムを翠丸に接
種後４５日間飼育した家兎から血清を採取した。この血
清を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１００倍、２００倍および
４００倍に希釈して使用した。

正常家兎血清：トレボネーマ　パリダムを接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のＴＰＨＡキ
ット（セロディアＴＰ；富士しビオ製）を用いてタイタ
ーを測定したところ、結果は陰性を示した。この血清を
１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１００倍から４００倍に希釈し
て用いた。

ラテックス：積水化学工業株製の粒径０．２３μｍのポ
リスチレンラテックス（固形分１０％）を用いた。

（Ａ）ラテックスへの梅毒抗原の感作ニラテックス１０
０μ２と、梅毒抗原液４００μｌとを速やかに混合し、
室温で撹拌した。１時間後に１％ＢＳＡＰＢＳを５　ｍ
ｌ加え、　１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。これを
２回繰り返してラテックスを洗浄した。洗浄後のペレッ
トを２ｄの０，３％メチルセルロースあるいは０．３％
エチルセルロースに懸濁させ、よく分散して固形分０．
５％のラテックス試薬を得た。

これを４°Ｃにて保存した。

（Ｂ）梅毒抗体の測定：梅毒陽性家兎血清と（Ａ）項で
得られたラテックス試薬とを５０μ！ずつ凝集観察板上
に採り、混合・撹拌したのち３分間反応させた。対照と
して、正常家兎血清についても同様に反応を行なった。

ラテックス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を
陽性、凝集の認められなかった検体を陰性とした。その
結果を表１に示す。表１において＋および＋十は陽性（
＋士は凝集の度合が大きい）２士は偽陽性、そして−は
陰性を示す。

止較拠上 ０．３％メチルセルロ−ス ＰＢＳ　、　　３％ポリエチレングリコールまたは３％
デキストランを用いて実施例１と同様に反応を行なった
。その結果を表１に示す。

（以下余白） 表１から，本発明のラテックス試薬を用いると。

従来の試薬では偽陽性が生じる検体でも，非特異反応を
起こすことなく正確に測定し得ることが明らかである。

１１皿ｌ （全自動分析装置を用いた梅毒抗体の測定）実施例１と
同様の検体および試薬を用い，日立７０５０型全自動分
析装置により測定を行なった。但し，ラテックス試薬に
はメチルセルロース（またはエチルセルロース）は加え
ず，１％ＢＳＡ　−　ＰＢＳで希釈して固形分０．２５
％に調整した。後述の希釈液としては０．３％メチルセ
ルロースまたは０．３％エチルセルロースを使用した。

測定条件は次のとおりである。

検体容量　　　　　２０μｌ ラテックス試薬（Ｒ２）　５０μｌ 希釈液（Ｒ１）　　　　　３５０μｌ 測定波長　　　　　５７０ｎｍ 測定開始後，５分後と１０分後の５７０ｎｍにおける吸
光度の差（八〇〇ｓ，。）を測定し，この吸光度の変化
量を表２に示した（ｎ＝４の平均値）、梅毒陽性家兎血
清の希釈倍率とΔＯＤ，，。との関係を，比較例２の結
果とあわせて第１図に示す。第１図および後述の第２図
において・はメチルセルロースを用いた場合の測定値，
そして○はエチルセルロースを用いた場合の測定値を示
す。

比較■主 希釈液として，１％ＵＳＡ・ＰＢＳ，　　３％ポリエチ
レングリコールまたは３％デキストランを用いたこと以
外は実施例２と同様である。その結果を表２および第１
図に示す。

第１図および後述の第２図において△は１％ＢＳＡ・Ｐ
ｕｓ　、ムはポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００
）　。

そして口は３％デキストランを用いた場合の測定値を示
す。

（以下余白） 表２および第１図の結果から明らかなように。

本発明によれば従来の方法では凝集が認められなかった
高希釈率の陽性血清においても、陽性と判定し得る程度
の高い感度が得られた。さらに、非特異反応による凝集
が認められない。このように。

特異性が高く、高感度の測定が達成された。

実施拠主 （ＥＬＩＳＡによる梅毒抗体の測定） 実施例１に挙げられた試薬および検体に加えて。

本実施例では、さらに次の試薬およびプレートを用いた
。

ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ　　：ベルオキシ
ダーゼ標識抗つサギＩｇＧ　　（マイルズ・ラボラトリ
ーズ社）を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１　、０００倍に希
釈して用いた。

ペルオキシダーゼ基質ニリン酸−クエン酸緩衝液に０−
フェニレンジアミン（２塩酸塩）を２ｍｇＺ戚、そして
過酸化水素水を０．０３％（Ｈ２０□）となるように加
えた。基質の調製は使用直前に行った。

（Ａ）抗原の固定化：梅毒抗原液をマイクロタイタープ
レートの各ウェルに、５０μ２ずつ分注し。

室温で１時間インキュベートした。ウェルを１％ＢＳＡ
　−ＰＢＳ　２００μ２で１回洗浄した後、１％ＢＳＡ
・ＰＢＳ　２００μ℃を加えて室温で１時間インキュベ
ートし、ブロッキングを行った。その後、１％ＢＳＡ・
ＰＢＳを吸引除去し、直ちにＩＥＬ　ＩＳＡ分析に使用
した。

（Ｂ）梅毒抗体の測定＝１％ＢＳＡ　−Ｐ２Ｓ５代わり
に、０．３％メチルセルロースまたは０．３％エチルセ
ルロースを用いて１００　、２００および４００倍に希
釈した梅毒陽性家兎血清を第１抗体溶液とした。

これを各ウェルに５０μ２ずつ分注し、室温で１時間イ
ンキュベートした。対照として、正常家兎血清を同様に
希釈した溶液を調製し、これを用いて同様に分注・イン
キュベートした。

１時間後に１反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡＰＢＳ　
２００μ２で３回洗浄したのち、ペルオキシダーゼ標識
抗ウサギＩｇＧ　　（第２抗体溶液）を各ウェルに５０
μｌずつ分注した。室温で１時間インキュベートした後
１反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ　２００μ
２で３回洗浄した。

各ウェルに直ちにペルオキシダーゼ基質１００μ℃ずつ
を分注し、室温で１５分間インキュベートした。

基質ブランクとして、第１抗体および第２抗体のいずれ
も添加していないウェルを用意し、同様に基質液を添加
してインキュベートした。インキュベート後、ＩＮ硫酸
を１００μ２ずつ分注し、酵素反応を停止させた。各ウ
ェルの酵素反応時間が一定となるように操作を行った。

反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー（ＭＴ
Ｐ−１００、コロナ社製）により、基質ブランクを対照
として、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を表
３に示す（ｎ＝４の平均値）。

北較拠ユ 梅毒陽性血清の希釈液として１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ　。

３％ポリエチレングリコールまたは３％デキストランを
用いたこと以外は実施例３と同様である。

その結果を表３に示す。

（以下余白） 表３の結果から明らかなように２本発明によれば、従来
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度Ｏからｏ、ｏｏｓＯ間に低下させることが可
能となる。陽性血清に関しては。

抗原・抗体反応を特異的に促進した結果、感度をほぼ３
倍またはそれ以上に向上させることが可能となった。

スＪｉｌｔ（１先 （凝集板を用いたマニュアル法によるＨＢ、抗体の測定
） 本実施例において、実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。

１１Ｂ、抗原液：ヒト血漿よりアフィニティークロマト
グラフィーにより精製した精製ＨＢＳ抗原を使用した。

抗原はリン酸緩衝液に溶解し、ｉ４度をローリ−法によ
り測定した。使用直前に、リン酸緩衝液により希釈し、
濃度を１〜１０μｇ／ｄとなるように調整し、これをＨ
Ｂ、抗原液とした。

ＨＢ、陽性家兎血清：精製ＨＢ、抗原を、フロイントの
完全アジュバントとともに家兎に免疫してｌｊｔられた
抗血清を、正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作
をしてから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムは
ＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社
）を用い、メーカー（ファルマシア）の使用説明書に従
って行った。吸収操作を行った抗ＨＢｓ血清は、１％Ｂ
ＳＡ　−ＰＢＳにより、１００から４００倍に希釈して
用いた。

（八）ラテックスへのＨＢ３抗原の感作ニラテックス１
００μ２と、　ＨＢ、抗原液４００μ２とを速やかに混
合し、室温で撹拌した。１時間後に１％ＢＳＡ　−ＰＢ
Ｓを５ｄ加え、　１５０００ｒｐｍで１時間遠心した。

これを２回繰り返してラテックスを洗浄した。洗浄後の
ペレットを２−の０．３％メチルセルロースあるいは０
．３％エチルセルロースに懸濁させ、よく分散して固形
分０．５％のラテックス試薬を得た。これを４　’Ｃに
て保存した。

（Ｂ）　Ｈａｓ抗体の測定 ＨＢ、陽性家兎血清と本実施例（八）項で得られたラテ
ックス試薬とを５０μｉずつ凝集観察板上に採り、混合
・撹拌したのち３分間反応させた。対照として、正常家
兎血清についても同様に反応を行なった。ラテックス試
薬の凝集を実施例１と同様に行なった。その結果を表４
に示す。

土較■土 ０．３％メチルセルロースの代わりに１％ＢＳＡ・ＰＢ
Ｓ、３％ポリエチレングリコールまたは３％デキストラ
ンを用いて実施例４と同様に反応を行なった。その結果
を表４に示す。

（以下余白） 表４から明らかなように２本発明によれば従来の方法で
は偽陽性が生じる検体でも、特異性高く診断することが
可能である。

実施１ （全自動分析装置を用いたＨａｓ抗体の測定）実施例４
の検体および試薬を用い、実施例２の方法に従ってＨＢ
ｓ抗体の測定を行なった。ラテックス試薬についても実
施例２と同様に０．２５％とし。

希釈液に０．３％メチルセルロースまたは０．３％エチ
ルセルロースを使用した。その結果を表５および第２図
に示す。

ル較開ｌ 希釈液として、１％ＢＳＡ　　−ＰＢＳ　、　　３％ポ
リエチレングリコールまたは３％デキストランを用いた
こと以外は実施例５と同様である。その結果を表５およ
び第２図に示す。

（以下余白） 表５および第２図の結果から明らかなように。

本発明によれば従来の方法では凝集が認められなかった
高希釈率の陽性血清においても、陽性と判定し得る強度
の高い感度が得られた。さらに、非特異反応による凝集
が認められない。このために。

特異性が高く、高感度の測定が達成された。

災施拠旦 （ＥＩＡによるインスリンの測定） 本実施例において、実施例１と同一名の試薬は実施例１
と同様に調製を行なった。ＥＩＡキットおよび検体は２
次のキットおよび血清を使用した。

インスリン測定用Ｅｌへキット：ｌＮ５ＩＩＬＩＮ　　
（ＭＩＴＳＵＩ）■（カイノス社製）。

糖尿病患者血清：ｗ！尿尿意患者血清で、他のインスリ
ン測定用キット［Ｉｎ５ｕｌｉｎ　Ｂ−Ｔｅｓｔ　Ｈａ
ｋｏ　　（和光純薬社製）］により、インスリンを含有
することが確認されている血清。

キット構成品である酵素標識抗体溶液中に、メチルセル
ロースまたはエチルセルロースを添加し。

終濃度が０．３％（Ｗ／Ｗ）　となるようにした。この
酵素標識抗体溶液を使用し、カイノス社のキットの使用
添付書に従って、糖尿病患者血清について。

インスリン濃度の測定を行った。対照として、他のイン
スリン測定法（Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｂ−Ｔｅｓｔ　Ｗａｋ
ｏ　）によりインスリン値が正常範囲であると確認され
た正常ヒト血清も同時に測定した。４２０ｎｍにおける
吸光度（ｎ＝４の平均値）を表６に示す。

ル較拠旦 実施例６において、酵素標識抗体にメチルセルロースあ
るいはエチルセルロースを添加しない場合、メチルセル
ロースあるいはエチルセルロースの代わりにポリエチレ
ングリコールまたはデキストランを終濃度が３％となる
ように添加した場合についてそれぞれ測定を行なった。

その結果を表６に示す。

（以下余白） 表６から明らかなように１本発明の試薬を用いると、非
特異反応が抑制され、かつバックグラウンド値を低下さ
せることが可能である。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、免疫反応を利用した被測
定物質の測定において、非特異反応が抑制され、かつ高
感度に被測定物質が測定され得る。

本発明は、ラテックス試薬を利用した免疫測定法。

ＥＩＡ　、　ＲＩＡなどに利用され得、各種生理活性物
質が効果的に測定され得る。

４　°゛　の　−なｉ′■ 第１図および第２図は９本発明により血清中の梅毒抗体
およびＨＢ、抗体をそれぞれ測定したときの、血清希釈
倍率と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフ
である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
   は抗原；およびアルキル化多糖類を含有する免疫反応測
   定用試薬。 ２、抗原または抗体でなる被測定物質を該抗原または抗
   体に対する抗体または抗原を用いて測定する免疫反応測
   定法であって、該免疫反応の反応系にアルキル化多糖類
   を存在させる、免疫反応測定法。