JPH02238361A - 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 - Google Patents
免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬Info
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- JPH02238361A JPH02238361A JP5922489A JP5922489A JPH02238361A JP H02238361 A JPH02238361 A JP H02238361A JP 5922489 A JP5922489 A JP 5922489A JP 5922489 A JP5922489 A JP 5922489A JP H02238361 A JPH02238361 A JP H02238361A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は高惑度で非特異反応が少ない免疫反応測定方法
および測定用試薬に関する。
および測定用試薬に関する。
(従来の技術)
各種生体成分から特定の被測定物質を検出もしくは定量
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば,抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテックスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては5上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法,
酵素免疫測定法(EIA) ,放射免疫測定法(RIA
)など各種方法が知られている。
するために抗原抗体反応が利用されている。例えば,抗
原もしくは抗体である被測定物質に対する抗体もしくは
抗原を担持させたラテックスなどを試薬として凝集反応
を測定することにより被測定物質の測定がなされる。こ
のような免疫反応の測定方法としては5上記のように凝
集反応を光学的もしくは肉眼により目視観察する方法,
酵素免疫測定法(EIA) ,放射免疫測定法(RIA
)など各種方法が知られている。
これらの免疫反応の測定法において,抗原抗体反応を促
進させ,あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば.反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のボリマーであり,これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば,これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし,これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため,バ
ックグラウンド値がとがる。
進させ,あるいは微量成分を効果的に測定することを目
的として種々の添加剤が用いられている。例えば.反応
系にポリエチレングリコールやデキストランを添加する
方法が採用されている。これらは水溶性もしくは親水性
のボリマーであり,これらを加えることにより疎水性相
互作用により進行する抗原抗体反応が促進される。例え
ば,これらの化合物を加えることによりラテックス試薬
の凝集反応が促進される。しかし,これらの化合物によ
り反応系における非特異反応もまた促進されるため,バ
ックグラウンド値がとがる。
そのため,バックグラウンド値を越える量の測定値でな
いと検出することができない。つまり多量の試料を必要
とする。従って,この方法は,短時間で反応を進行させ
ることは可能であるが,非特異反応を抑制するには充分
な方法とはいえない。
いと検出することができない。つまり多量の試料を必要
とする。従って,この方法は,短時間で反応を進行させ
ることは可能であるが,非特異反応を抑制するには充分
な方法とはいえない。
さらに,使用されるポリエチレングリコールの市販品は
, 290nm 44近に吸収を有する不純物を含有す
ることが多い。そのため,使用前に精製する必要があり
,取扱いが煩雑となる。
, 290nm 44近に吸収を有する不純物を含有す
ることが多い。そのため,使用前に精製する必要があり
,取扱いが煩雑となる。
非特異反応を抑制する方法として,特開昭57−182
169号公報には測定すべき試料にポリアニオンを添加
する方法が開示されている。ポリアニオンとしては,デ
キストラン硫酸,ヘパリン8ボリスチレンスルホン酸,
コンドロイチン硫酸などが挙げられる。これらを添加す
ることにより非特異反応が抑制される。L記公報の方法
においては,ポリアニオンは. 0.001〜0.5重
量%の割合で反応系に含有される。しかし,上限の0.
5重量%付近の濃度においては.反応液の粘度が高いた
め反応性が高くなりすぎ,バックグランド値が上がる。
169号公報には測定すべき試料にポリアニオンを添加
する方法が開示されている。ポリアニオンとしては,デ
キストラン硫酸,ヘパリン8ボリスチレンスルホン酸,
コンドロイチン硫酸などが挙げられる。これらを添加す
ることにより非特異反応が抑制される。L記公報の方法
においては,ポリアニオンは. 0.001〜0.5重
量%の割合で反応系に含有される。しかし,上限の0.
5重量%付近の濃度においては.反応液の粘度が高いた
め反応性が高くなりすぎ,バックグランド値が上がる。
下限の0.001重量%付近では,非特異反応の抑制が
充分に行なわれ得ない。さらにこの方法においては,測
定の感度自体がいまだ充分であるとはいえない。
充分に行なわれ得ない。さらにこの方法においては,測
定の感度自体がいまだ充分であるとはいえない。
(発明が解決しようとする課題)
本発明は,上記従来の問題点を解決するものであり,そ
の目的とするところは,非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法.および免疫反応測定用試
薬を提供することにある。
の目的とするところは,非特異反応が抑制されかつ高感
度の得られる免疫反応測定法.および免疫反応測定用試
薬を提供することにある。
(課題を解決するための手段)
本発明の免疫反応測定法は,抗原または抗体で′/′ζ
イ,被測定物質を該抗原または抗体に対する抗体または
抗原を用いて測定する免疫反応測定法であ、,゛乙該免
疫反応の反応系にコンドロイチン硫酸が0.1〜0.3
%(重量/重量)の割合で存在し,そのことにより上記
目的が達成される。
イ,被測定物質を該抗原または抗体に対する抗体または
抗原を用いて測定する免疫反応測定法であ、,゛乙該免
疫反応の反応系にコンドロイチン硫酸が0.1〜0.3
%(重量/重量)の割合で存在し,そのことにより上記
目的が達成される。
本発明の免疫反応測定用試薬は,被測定物質である抗原
または抗体に対する抗体または抗原,お4ζびコンドロ
イチン硫酸を含有する免疫反応測定用試薬であって;該
免疫反応の反応系に該コントロイチン硫酸が0.1〜0
.3%(重量/重量)の割合で含有されるようにして用
いられ,そのことにより上記目的が達成される。
または抗体に対する抗体または抗原,お4ζびコンドロ
イチン硫酸を含有する免疫反応測定用試薬であって;該
免疫反応の反応系に該コントロイチン硫酸が0.1〜0
.3%(重量/重量)の割合で含有されるようにして用
いられ,そのことにより上記目的が達成される。
本発明に用いられるコンドロイチノ硫酸の分子量は1
, 000〜・boo,oooが適当である。分子量が
小さすぎると,抗原および抗体との相互作用が小さくな
るため所期の効果が得られない。分子量が大きすぎると
水に溶解させたときの粘度が高くなるため,取り扱いが
困難となる。
, 000〜・boo,oooが適当である。分子量が
小さすぎると,抗原および抗体との相互作用が小さくな
るため所期の効果が得られない。分子量が大きすぎると
水に溶解させたときの粘度が高くなるため,取り扱いが
困難となる。
本発明により測定されるべき物質は特に限定されず.一
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては,タン
パク5脂質などがあり、それには例えば、各種抗原,レ
セプター,酵素などが挙げられる。具体的には, HB
S抗体, IIBc抗体,梅毒抗体(トレボネーマ抗原
および脂質抗原に対する抗体),抗旧■ (ヒト免疫不
全ウィルス)抗体,抗ATLA (成人′1゛細胞白血
病関連抗原)抗体などの,怒染症に関係する抗体が挙げ
られる。
般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生理活性物質は
いずれも測定が可能である。被測定物質としては,タン
パク5脂質などがあり、それには例えば、各種抗原,レ
セプター,酵素などが挙げられる。具体的には, HB
S抗体, IIBc抗体,梅毒抗体(トレボネーマ抗原
および脂質抗原に対する抗体),抗旧■ (ヒト免疫不
全ウィルス)抗体,抗ATLA (成人′1゛細胞白血
病関連抗原)抗体などの,怒染症に関係する抗体が挙げ
られる。
本発明により被測定物質を測定する場合の測定系は特に
限定されず,通常の免疫比濁法, II!IA, RI
A,蛍光免疫測定法,血球凝集法などが利用され得る。
限定されず,通常の免疫比濁法, II!IA, RI
A,蛍光免疫測定法,血球凝集法などが利用され得る。
凝集反応,特にラテックス凝集反応のような逆受ム・凝
集反応が好適に用いられる。例えば,ラテックス試薬を
用いた免疫反応により被測定物質を測定する場合には,
被測定物質である抗原または抗体に対する抗体または抗
原を含有するラテックス試薬シ1″.あらかじめコンド
ロイチン硫酸を添加して,おく。このような試薬を用い
て免疫凝集反応を行ない.生じた凝集の程度を光学的に
観察もしくは目視観,察することにより被測定物質が測
定され得る、′Ij)るいは,コンドロイチン硫酸を含
まないラテユ・クスを使用することも可能で.この場合
には免疫反応時にコンドロイチン硫酸が該反応系に存在
するようにすればよい。例えば,検体にあらかしめコン
ドロイチン硫酸を添加してお《方法;使川ずろ緩衝液に
コンドロイチン硫酸を加えておく方法などがあり,特に
限矩されない。言いかえれば,本発明の測定用試薬は.
例えば.抗体または抗原,およびコンドロイチン硫酸を
含む,1液系の試薬;抗体または抗原を含む第1試薬と
,コンドロイチン硫酸を含む緩衝液でなる,第2試薬と
で構成される2液系の試薬;など種々の形態であり得る
。上記免疫反応においては,コンドロイチン硫酸は,該
反応系に0.1〜0.3%(W/W) ,好ましくは0
.2〜0.3%(訂■の割合で含有されるように調整さ
れる。コンドロイチン硫酸の濃度が0.1%(W/W)
を下まわると.該コンドロイチン硫酸の抗原および抗体
との相互作用が小さくなる結果,増感効果が得られない
。逆に0.3%(讐ハ)を上まわると反応液の粘度が高
くなるため反応性が必要以上に高《なり,非特異反応が
促進される。その結果,バックグランド値が上昇する。
集反応が好適に用いられる。例えば,ラテックス試薬を
用いた免疫反応により被測定物質を測定する場合には,
被測定物質である抗原または抗体に対する抗体または抗
原を含有するラテックス試薬シ1″.あらかじめコンド
ロイチン硫酸を添加して,おく。このような試薬を用い
て免疫凝集反応を行ない.生じた凝集の程度を光学的に
観察もしくは目視観,察することにより被測定物質が測
定され得る、′Ij)るいは,コンドロイチン硫酸を含
まないラテユ・クスを使用することも可能で.この場合
には免疫反応時にコンドロイチン硫酸が該反応系に存在
するようにすればよい。例えば,検体にあらかしめコン
ドロイチン硫酸を添加してお《方法;使川ずろ緩衝液に
コンドロイチン硫酸を加えておく方法などがあり,特に
限矩されない。言いかえれば,本発明の測定用試薬は.
例えば.抗体または抗原,およびコンドロイチン硫酸を
含む,1液系の試薬;抗体または抗原を含む第1試薬と
,コンドロイチン硫酸を含む緩衝液でなる,第2試薬と
で構成される2液系の試薬;など種々の形態であり得る
。上記免疫反応においては,コンドロイチン硫酸は,該
反応系に0.1〜0.3%(W/W) ,好ましくは0
.2〜0.3%(訂■の割合で含有されるように調整さ
れる。コンドロイチン硫酸の濃度が0.1%(W/W)
を下まわると.該コンドロイチン硫酸の抗原および抗体
との相互作用が小さくなる結果,増感効果が得られない
。逆に0.3%(讐ハ)を上まわると反応液の粘度が高
くなるため反応性が必要以上に高《なり,非特異反応が
促進される。その結果,バックグランド値が上昇する。
上記免疫反応の条件は通常の場合と同様であり,反応媒
体としては,被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は,被測定物質を失活させること
がな《,かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオンへ
度やpHを有するものであればよい。反応時には,さら
に測定系の特異性を高めるために,塩化コリン, ED
TAなどを添加することも可能である。
体としては,被測定物質の種類に応じた各種緩衝液が用
いられる。この緩衝液は,被測定物質を失活させること
がな《,かつ抗原抗体反応を阻害しないようなイオンへ
度やpHを有するものであればよい。反応時には,さら
に測定系の特異性を高めるために,塩化コリン, ED
TAなどを添加することも可能である。
本発明によれば,コンドロイチン硫酸の働きにより.免
疫反応における非特異反応が抑制され,かつ高感度に被
測定物質が測定され得る。以下に,本発明の実施例を述
べ,その効果を具体的に説明する。
疫反応における非特異反応が抑制され,かつ高感度に被
測定物質が測定され得る。以下に,本発明の実施例を述
べ,その効果を具体的に説明する。
(実施例)
以下に本発明を実施例につき説明する。
尖施貞土
(凝集板を用いたマニュアル法による梅毒抗体の測定)
梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体の測定を行なった。
本実施例においては,次に挙げる試薬および測定用検体
を使用した。後述の実施例2〜6および比較例1〜6に
おいて〜も,特に指示されない限り,同名の試薬および
検体については,同様のものを使用した。
を使用した。後述の実施例2〜6および比較例1〜6に
おいて〜も,特に指示されない限り,同名の試薬および
検体については,同様のものを使用した。
PBS (リン酸緩衝液):リン酸一ナトリウム(2水
和物),リン酸二ナトリウム(2水和物)および塩化ナ
トリウムを,リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそ
れぞれ0.02Mおよび0.15M, pHが7.4と
なるように精製水に加えて,調製を行なった。
和物),リン酸二ナトリウム(2水和物)および塩化ナ
トリウムを,リン酸および塩化ナトリウムの終濃度がそ
れぞれ0.02Mおよび0.15M, pHが7.4と
なるように精製水に加えて,調製を行なった。
1% BSA − PBS : PBSに試薬特級RS
A (ウシ血清アルブミン)を1%(W/W )とな
るように溶解させて調製した。
A (ウシ血清アルブミン)を1%(W/W )とな
るように溶解させて調製した。
1%トリトンx−ioo :リン酸緩衝液に1・リト
ンX−100を1%(誓八)となるように?容解させた
。
ンX−100を1%(誓八)となるように?容解させた
。
コンドロイチン硫酸溶液:1%BSA − PBS41
: :+ンドロイチン硫酸ナトリウム(東京化成社製;
特級試薬)を,それぞれ0.005, 0.01 ,
O..05, 0.1..0.2. 0.3, 0.4
. 0.5, 0.6, 0.8および1、O%(IQ
/りとなるように溶解させた。
: :+ンドロイチン硫酸ナトリウム(東京化成社製;
特級試薬)を,それぞれ0.005, 0.01 ,
O..05, 0.1..0.2. 0.3, 0.4
. 0.5, 0.6, 0.8および1、O%(IQ
/りとなるように溶解させた。
3%ポリエチレングリコール:1%BSA −PBS
にポリエチレングリコール(半井化学社製;平均分子i
16000 )を3%(一ハ)となるように溶解させた
。
にポリエチレングリコール(半井化学社製;平均分子i
16000 )を3%(一ハ)となるように溶解させた
。
3%デキストラン.:1%BSA − PBSにデキス
トラン(和光純薬社製)を3%(W/W )となるよう
に溶解させた。
トラン(和光純薬社製)を3%(W/W )となるよう
に溶解させた。
デキストラン硫酸溶液:1%BSA −PBSにデキ
ストラン硫酸ナトリウム(Sigma社製;特級試薬)
を,それぞれ0.005. 0.01,0.05, 0
.1. 0.2, 0.3,0.4,0.5.0.6.
0.8および1.0%(一八)となるように溶解させた
。
ストラン硫酸ナトリウム(Sigma社製;特級試薬)
を,それぞれ0.005. 0.01,0.05, 0
.1. 0.2, 0.3,0.4,0.5.0.6.
0.8および1.0%(一八)となるように溶解させた
。
梅毒抗原液一家兎翠丸中で10〜14日間培養したトレ
ボネーマ パリダム「肛肛匹竺虹U旦旦」;CDC (
(:enter for Disease Cc−r+
*vo1, Public IlealtbServi
ce, U.S. Department of He
alth, Educationand Welfar
e , Atlanta , G+lorgia )よ
り入手し〆たちのを家兎翠丸に接種し,81代培養した
ものを用いた〕を生理食塩水中に109個菌体/mlと
なるように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り2 リン酸
緩衝液中で遠心分離(6, 000rpm X 5分,
3回)することにより洗浄した。次いで,得られた沈澱
に1%トリトンX−100をlml添加し,37゜Cに
て30分間インキユベートした。その後,これを超遠心
分離機にか,けて(50, 000rpm X 1時間
)上清を採取し,1%トリトンX−100で1 , 0
00倍希釈して使用した。
ボネーマ パリダム「肛肛匹竺虹U旦旦」;CDC (
(:enter for Disease Cc−r+
*vo1, Public IlealtbServi
ce, U.S. Department of He
alth, Educationand Welfar
e , Atlanta , G+lorgia )よ
り入手し〆たちのを家兎翠丸に接種し,81代培養した
ものを用いた〕を生理食塩水中に109個菌体/mlと
なるように懸濁した菌体懸濁液1mlを採り2 リン酸
緩衝液中で遠心分離(6, 000rpm X 5分,
3回)することにより洗浄した。次いで,得られた沈澱
に1%トリトンX−100をlml添加し,37゜Cに
て30分間インキユベートした。その後,これを超遠心
分離機にか,けて(50, 000rpm X 1時間
)上清を採取し,1%トリトンX−100で1 , 0
00倍希釈して使用した。
梅毒陽性家兎血清:トレポネーマ パリダムを來丸に接
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血
清を1%BSA・PBSで100倍,200倍および4
00倍に希釈して使用した。
種後45日間飼育した家兎から血清を採取した。この血
清を1%BSA・PBSで100倍,200倍および4
00倍に希釈して使用した。
正常家兎血清:トレポネーマ バリダムを接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキ
ット(セロディアTP;富士レビオ製)およびセロクリ
ットTP(化血研)を用いてタイター(力価)を測定し
たところ,結果は陰性を示した。この血清を1%BSA
− PBSで100倍から400倍に希釈して用いた
。
ない家兎から採取した血清を用いた。市販のTPHAキ
ット(セロディアTP;富士レビオ製)およびセロクリ
ットTP(化血研)を用いてタイター(力価)を測定し
たところ,結果は陰性を示した。この血清を1%BSA
− PBSで100倍から400倍に希釈して用いた
。
ラテックス:積水化学工業■製の粒径0.23μmのポ
リスチレンラテックス(固形分10%)を用いた。
リスチレンラテックス(固形分10%)を用いた。
(A)ラテックスへの梅毒抗原の惑作:ラテックス10
0μ2と,梅毒抗原液400μ2とを速やかに混合し,
室温で撹拌した。1時間後に1%BSAPBSを5d加
え,室温で1時間撹拌した後, 15000rpmで1
時間遠心した。これを2回繰り返してラテックスを洗浄
した。洗浄後のべレフトを2dのコンドロイチン硫酸溶
液(0.01, 0.1, 0.2, 0.40.6,
0.8または1.0%(W/W) )に懸濁させ,よ
く分散して固形分0.5%のラテックス試薬を得た。
0μ2と,梅毒抗原液400μ2とを速やかに混合し,
室温で撹拌した。1時間後に1%BSAPBSを5d加
え,室温で1時間撹拌した後, 15000rpmで1
時間遠心した。これを2回繰り返してラテックスを洗浄
した。洗浄後のべレフトを2dのコンドロイチン硫酸溶
液(0.01, 0.1, 0.2, 0.40.6,
0.8または1.0%(W/W) )に懸濁させ,よ
く分散して固形分0.5%のラテックス試薬を得た。
これを4゜Cにて保存した。
(B)梅毒抗体の測定:梅毒陽性家兎血清と(A)項で
得られたラテックス試薬とを50μβずつ凝集観察板上
に採り,混合・撹拌したのち3分間反応させた。対照と
して,正常家兎血清についても同様に反応を行なった。
得られたラテックス試薬とを50μβずつ凝集観察板上
に採り,混合・撹拌したのち3分間反応させた。対照と
して,正常家兎血清についても同様に反応を行なった。
ラテックス試薬の凝集を目視観察した。凝集した検体を
陽性,凝集の認められなかった検体を陰性とした。その
結果を表1に示す。表1における判定の基準は,次のと
おりである。
陽性,凝集の認められなかった検体を陰性とした。その
結果を表1に示す。表1における判定の基準は,次のと
おりである。
コンドロイチン硫酸溶液の代わりに1%BSA・PBS
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液〔0.Ol, 0.1,0.2
. 0.4. 0.6. 0.8または1.0%(W/
W) )を用いて実施例1と同様に反応を行なった。そ
の結果を表1に示す。
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液〔0.Ol, 0.1,0.2
. 0.4. 0.6. 0.8または1.0%(W/
W) )を用いて実施例1と同様に反応を行なった。そ
の結果を表1に示す。
(以下余白)
表1
1′0.01〜1.0の数値は各溶液中の濃度(重量/
重量)%を示す。
重量)%を示す。
表1から,本発明のラテックス試薬を用いると.従来の
試薬では偽陽性が生じる検体でも.非特異反応を起こす
ことなく正確に測定し得ることが明らかである。さらに
,高希釈率の検体も高惑度で測定し得ることがわかる。
試薬では偽陽性が生じる検体でも.非特異反応を起こす
ことなく正確に測定し得ることが明らかである。さらに
,高希釈率の検体も高惑度で測定し得ることがわかる。
実崖五又
(全自動分析装置を用いた梅毒抗体の測定)実施例1と
同様の検体および試薬を用い.日立7050型全自動分
析装置により測定を行なった。但し,ラテックス試薬に
はコンドロイチン硫酸は加えず,1%BSA − PB
Sで希釈して固形分0.25%に調整した。後述の希釈
液としてはコンドロイチン硫酸溶液(0.005,0.
05. 0.1. 0.2. 0.3, 0.4または
0.5%(W/W) )を使用した。測定条件は次のと
おりである。
同様の検体および試薬を用い.日立7050型全自動分
析装置により測定を行なった。但し,ラテックス試薬に
はコンドロイチン硫酸は加えず,1%BSA − PB
Sで希釈して固形分0.25%に調整した。後述の希釈
液としてはコンドロイチン硫酸溶液(0.005,0.
05. 0.1. 0.2. 0.3, 0.4または
0.5%(W/W) )を使用した。測定条件は次のと
おりである。
検体容量 20μ!
ラテックス試薬(R2) 50μ2
希釈液(Rl) 350μ2
測定波長 570nm
測定温度 37゛C
測定開始後,5分後と10分後の570nmにおける吸
光度の差(Δ0ロ,,。)を測定し.この吸光度の変化
量を表2に示した(n−4の平均値)。各希釈倍率の陽
性血清試料を用いて試験したときの,使用したコンドロ
イチン硫酸の濃度と八00,ク。との関係を,第1図(
a)に示す. 工較拠呈 希釈液として,l%BSA−PBS, 3%ポリエチ
レングリコール,3%デキストランまたはデキストラン
硫酸溶液(0.O05.0.05. 0.1, 0.2
. 0.3. 0.4または0.5%(W/W) ]を
用いたこと以外は実施例2と同様である。その結果を表
2に示す。
光度の差(Δ0ロ,,。)を測定し.この吸光度の変化
量を表2に示した(n−4の平均値)。各希釈倍率の陽
性血清試料を用いて試験したときの,使用したコンドロ
イチン硫酸の濃度と八00,ク。との関係を,第1図(
a)に示す. 工較拠呈 希釈液として,l%BSA−PBS, 3%ポリエチ
レングリコール,3%デキストランまたはデキストラン
硫酸溶液(0.O05.0.05. 0.1, 0.2
. 0.3. 0.4または0.5%(W/W) ]を
用いたこと以外は実施例2と同様である。その結果を表
2に示す。
各希釈倍率の陽性血清試料を用いて試験したときの,使
用したデキストラン硫酸の濃度とΔOD,,。
用したデキストラン硫酸の濃度とΔOD,,。
との関係を第1図Φ)に示す。
(以下余白)
表2および第1図(a)および(b)の結果から明らか
なように,本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかうた高希釈率の陽性血清においても,陽性と判定
し得る程度の高い感度が得られた。さらに,非特異反応
による凝集が認められない。特開昭57−182169
号公報に記載のデキストラン硫酸を用いても比較的良好
な結果が得られるが.例えば.0.3%の濃度の場合を
比較すると,本発明のコンドロイチン硫酸を用いた方法
のほうが,その効果がはるかに大きいことがわかる。こ
のように.本発明により,特異性が高く,高感度の測定
が達成された. 1隻■工 (ELISAによる梅毒抗体の測定) 実施例1に挙げられた試薬および検体に加えて,本実施
例では,さらに次の試薬およびプレートを用いた. ベルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG :ベルオキシ
ダーゼ標識抗ウサギIgG (マイルズ・ラボラトリ
ーズ社)を1%BSA − PBSで1 . 000倍
に希釈して?いた. マイクロタイタープレート:96六マイクロタイタープ
レート(ヌンク社製)を用いた。
なように,本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかうた高希釈率の陽性血清においても,陽性と判定
し得る程度の高い感度が得られた。さらに,非特異反応
による凝集が認められない。特開昭57−182169
号公報に記載のデキストラン硫酸を用いても比較的良好
な結果が得られるが.例えば.0.3%の濃度の場合を
比較すると,本発明のコンドロイチン硫酸を用いた方法
のほうが,その効果がはるかに大きいことがわかる。こ
のように.本発明により,特異性が高く,高感度の測定
が達成された. 1隻■工 (ELISAによる梅毒抗体の測定) 実施例1に挙げられた試薬および検体に加えて,本実施
例では,さらに次の試薬およびプレートを用いた. ベルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG :ベルオキシ
ダーゼ標識抗ウサギIgG (マイルズ・ラボラトリ
ーズ社)を1%BSA − PBSで1 . 000倍
に希釈して?いた. マイクロタイタープレート:96六マイクロタイタープ
レート(ヌンク社製)を用いた。
ベルオキシダーゼ基質:リン酸−クエン酸緩衝液にO−
フェニレンジアミン(2塩酸塩)を2■/d,そして過
酸化水素水を0.03%(H20■)となるように加え
た。基質の調製は使用直前に行った。
フェニレンジアミン(2塩酸塩)を2■/d,そして過
酸化水素水を0.03%(H20■)となるように加え
た。基質の調製は使用直前に行った。
IN硫酸:濃硫酸と精製水で希釈してIN硫酸水溶液と
した. (A)抗原の固定化:梅毒抗原液をマイクロタイタープ
レートの各ウェルに,50μ2ずつ分注し,室温で1時
間インキヱベートした。ウエルをl%BSA−PBS
200 11 1テ1回洗浄した後,1%BSA ・P
BS 200μlを加えて室温で1時間インキユベート
シ,プロッキングを行った。その後.l%BSA・PB
Sを吸引除去し,直ちにELIS八分析に使用した。
した. (A)抗原の固定化:梅毒抗原液をマイクロタイタープ
レートの各ウェルに,50μ2ずつ分注し,室温で1時
間インキヱベートした。ウエルをl%BSA−PBS
200 11 1テ1回洗浄した後,1%BSA ・P
BS 200μlを加えて室温で1時間インキユベート
シ,プロッキングを行った。その後.l%BSA・PB
Sを吸引除去し,直ちにELIS八分析に使用した。
(B)梅毒抗体の測定:1%BSA − PBSの代わ
りに,コンドロイチン硫酸溶液(0.005. 0.0
5, 0.1,0.2, 0.3. 0.4または0.
5%(訂り〕を用いて100,200および400倍に
希釈した梅毒陽性家兎血清を第1抗体溶液とした。これ
を各ウエルに50μlずつ分注し,室温で1時間インキ
ユベートした。対照として,正常家兎血清を同様に希釈
した溶液を調製し.これを用いて同様に分注・インキユ
ベートした。
りに,コンドロイチン硫酸溶液(0.005. 0.0
5, 0.1,0.2, 0.3. 0.4または0.
5%(訂り〕を用いて100,200および400倍に
希釈した梅毒陽性家兎血清を第1抗体溶液とした。これ
を各ウエルに50μlずつ分注し,室温で1時間インキ
ユベートした。対照として,正常家兎血清を同様に希釈
した溶液を調製し.これを用いて同様に分注・インキユ
ベートした。
1時間後に,反応液を吸引除去し,1%BSAPBS
200μlで3回洗浄したのち,ベルオキシダーゼ標識
抗ウサギIgG (第2抗体溶液)を各ウエルに50
μiずつ分注した。室温で1時間インキュ.ベートした
後,反応液を吸引除去し,1%BSA −PBS 20
0μtで3回洗浄した。
200μlで3回洗浄したのち,ベルオキシダーゼ標識
抗ウサギIgG (第2抗体溶液)を各ウエルに50
μiずつ分注した。室温で1時間インキュ.ベートした
後,反応液を吸引除去し,1%BSA −PBS 20
0μtで3回洗浄した。
各ウェルに直ちにベルオキシダーゼ基質100μ!ずつ
を分注し,室温で15分間インキユベートした。
を分注し,室温で15分間インキユベートした。
基質ブランクとして,第1抗体および第2抗体のいずれ
も添加していないウェルを用意し,同様に基質液を添加
してインキユベートした。インキュベート後,IN硫酸
を100μβずつ分注し,酵素反応を停止させた。各ウ
ェルの酵素反応時間が一定となるように操作を行った。
も添加していないウェルを用意し,同様に基質液を添加
してインキユベートした。インキュベート後,IN硫酸
を100μβずつ分注し,酵素反応を停止させた。各ウ
ェルの酵素反応時間が一定となるように操作を行った。
反応停止後,マイクロタイタープレートリーダー(MT
P−100 ,コロナ社製)により,基質ブランクを対
照として,492nmの吸光度を測定した.その結果を
表3に示す(n−4の平均値).各希釈倍率の陽性血清
試料を用いて試験したときの,使用したコンドロイチン
硫酸の濃度とODaqzとの関係を第2図(a)に示す
。
P−100 ,コロナ社製)により,基質ブランクを対
照として,492nmの吸光度を測定した.その結果を
表3に示す(n−4の平均値).各希釈倍率の陽性血清
試料を用いて試験したときの,使用したコンドロイチン
硫酸の濃度とODaqzとの関係を第2図(a)に示す
。
上較■主
梅毒陽性血清の希釈液として1%BSA − PBS
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液(0.005, 0.05.
0.1.0.2, 0.3, 0.4または0。5%(
W/W) )用いたこと以外は実施例3と同様である。
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液(0.005, 0.05.
0.1.0.2, 0.3, 0.4または0。5%(
W/W) )用いたこと以外は実施例3と同様である。
その結果を表3に示す。各希釈倍率の陽性血清試料を用
いて試験したときの,使用したデキストラン硫酸の濃度
と004qzとの関係を第2図(b)に示す. (以下余白) 表3の結果から明らかなように,本発明によれば.従来
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度0から0.005の間に低下させることが可
能となる。陽性血清に関しては.抗原・抗体反応を特異
的に促進した結果,感度をほぼ2倍に向上させることが
可能となった.裏旌開工 (凝集板を用いたマニュアル法によるHB,抗体の測定
) 本実施例において.実施例lと同一名の試薬は実施例1
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
いて試験したときの,使用したデキストラン硫酸の濃度
と004qzとの関係を第2図(b)に示す. (以下余白) 表3の結果から明らかなように,本発明によれば.従来
の方法では抑制できなかった正常家兎血清での非特異反
応を吸光度0から0.005の間に低下させることが可
能となる。陽性血清に関しては.抗原・抗体反応を特異
的に促進した結果,感度をほぼ2倍に向上させることが
可能となった.裏旌開工 (凝集板を用いたマニュアル法によるHB,抗体の測定
) 本実施例において.実施例lと同一名の試薬は実施例1
と同様に調製を行なった。その他の試薬の調製法を次に
示す。
HB.抗原液:ヒト血漿よりアフィニティーク口マトグ
ラフィーにより精製した精製11Bs抗原を使用した。
ラフィーにより精製した精製11Bs抗原を使用した。
抗原はリン酸緩衝液に溶解し,濃度をローリー法により
測定した。使用直前に,リン酸緩衝液により希釈し,濃
度を1〜10μg/rtriとなるように調整し,これ
をHB3抗原液とした。
測定した。使用直前に,リン酸緩衝液により希釈し,濃
度を1〜10μg/rtriとなるように調整し,これ
をHB3抗原液とした。
HB.陽性家兎血清:精製HBI抗原を,フロイントの
完全アジュバントとともに家兎に免疫して得られた抗血
清を,正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をし
てから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはCN
Br活性化セファロースCL4B(ファルマシア社)を
用い,メーカー(ファルマシア)の使用説明書に従って
行った。吸収操作を行った抗Has血清は.l%BSA
− PBSにより,l00から400倍に希釈して用
いた。
完全アジュバントとともに家兎に免疫して得られた抗血
清を,正常ヒト血清を結合させたカラムで吸収操作をし
てから用いた。正常ヒト血清を結合させたカラムはCN
Br活性化セファロースCL4B(ファルマシア社)を
用い,メーカー(ファルマシア)の使用説明書に従って
行った。吸収操作を行った抗Has血清は.l%BSA
− PBSにより,l00から400倍に希釈して用
いた。
(A)ラテックスへのHBs抗原の感作:ラテックス1
00μ!と, HBs抗原液400tt!.とを速やか
に混合し,室温で撹拌した。1時間後に1%BSA −
PBSを5一加え,室温で1時間撹拌した後, 15
000rpmで1時間遠心した。これを2回繰り返して
ラテックスを洗浄した。洗浄後のペレットを2蔵のコン
ドロイチン硫酸溶液(0.01, 0.1, 0.2.
0.4. 0.6,0.8または1.0%(一/り〕
に懸濁させ,よく分散して固形分0.5%のラテックス
試薬を得た。これを4℃にて保存した。
00μ!と, HBs抗原液400tt!.とを速やか
に混合し,室温で撹拌した。1時間後に1%BSA −
PBSを5一加え,室温で1時間撹拌した後, 15
000rpmで1時間遠心した。これを2回繰り返して
ラテックスを洗浄した。洗浄後のペレットを2蔵のコン
ドロイチン硫酸溶液(0.01, 0.1, 0.2.
0.4. 0.6,0.8または1.0%(一/り〕
に懸濁させ,よく分散して固形分0.5%のラテックス
試薬を得た。これを4℃にて保存した。
(B) HB,抗体の測定:HB,陽性家兎血清と本実
施例(A)項で得られたラテックス試薬とを50μβず
つ凝集観察板上に採り,混合・撹拌したのち3分間反応
させた。対照として,正常家兎血清についても同様に反
応を行なった。ラテックス試薬の凝集を実施例1と同様
に行なった。その結果を表4に示す。
施例(A)項で得られたラテックス試薬とを50μβず
つ凝集観察板上に採り,混合・撹拌したのち3分間反応
させた。対照として,正常家兎血清についても同様に反
応を行なった。ラテックス試薬の凝集を実施例1と同様
に行なった。その結果を表4に示す。
北殿班土
コンドロイチン硫酸溶液の代わりに1%BS八・PBS
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液(0.01, 0.1.0.2
. 0.4. 0.6. 0.8または1.0%01/
W))を用いて実施例4と同様に反応を行なった。その
結果を表4に示す。
,3%ポリエチレングリコール,3%デキストランまた
はデキストラン硫酸溶液(0.01, 0.1.0.2
. 0.4. 0.6. 0.8または1.0%01/
W))を用いて実施例4と同様に反応を行なった。その
結果を表4に示す。
(以下余白)
表4
”0.01〜1.0の数値は各溶液中の濃度(重量/重
量)%を示す。
量)%を示す。
表4から明らかなように,本発明によれば従来の方法で
は偽陽性が生じる検体でも,特異性高く診断することが
可能である。
は偽陽性が生じる検体でも,特異性高く診断することが
可能である。
裏隻■旦
(全自動分析装置を用いたHBS抗体の測定)実施例4
の検体および試薬を用い.実施例2の方法に従って11
B,抗体の測定を行なった。ラテックス試薬についても
実施例2と同様に0.25%とし,希釈液にコンドロイ
チン硫酸溶液(0.005. 0.05.・0.1,
0.2. 0.3. 0.4または0.5%(W/W)
:lを使用した。その結果を表5および第3図(a)
に示す。
の検体および試薬を用い.実施例2の方法に従って11
B,抗体の測定を行なった。ラテックス試薬についても
実施例2と同様に0.25%とし,希釈液にコンドロイ
チン硫酸溶液(0.005. 0.05.・0.1,
0.2. 0.3. 0.4または0.5%(W/W)
:lを使用した。その結果を表5および第3図(a)
に示す。
止較拠l
希釈液として,1%BSA −PBS , 3%ポ
リエチレングリコール,3%デキストランまたはデキス
トラン硫酸溶液(0.005. 0.05, 0.1.
0.2, 0.3,0.4または0.5%(W/W)
)を用いたこと以外は実施例5と同様である。その結
果を表5および第3図(ロ)に示す. (以下余白) 表5および第3図(a)および(b)の結果から明らか
なように,本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかった高希釈率の陽性血清においても,陽性と判定
し得る強度の高い感度が得られた。さらに,非特異反応
による凝集が認められない.このために,特異性が高《
,高感度の測定が達成された. 実l己1灸 (EIAによるインスリンの測定) 本実施例において,実施例1と同一名の試薬は実施例1
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は,
次のキットおよび血清を使用した。
リエチレングリコール,3%デキストランまたはデキス
トラン硫酸溶液(0.005. 0.05, 0.1.
0.2, 0.3,0.4または0.5%(W/W)
)を用いたこと以外は実施例5と同様である。その結
果を表5および第3図(ロ)に示す. (以下余白) 表5および第3図(a)および(b)の結果から明らか
なように,本発明によれば従来の方法では凝集が認めら
れなかった高希釈率の陽性血清においても,陽性と判定
し得る強度の高い感度が得られた。さらに,非特異反応
による凝集が認められない.このために,特異性が高《
,高感度の測定が達成された. 実l己1灸 (EIAによるインスリンの測定) 本実施例において,実施例1と同一名の試薬は実施例1
と同様に調製を行なった。EIAキットおよび検体は,
次のキットおよび血清を使用した。
インスリン測定用EIAキット:INSUIjN (
MITSUI)■(カイノス社製). インスリン高値血清:インスリン濃度が高値の血清で,
インスリン測定用キット[Insulin B−Tes
tWako (和光純薬社製)]により,インスリンを
含有することが確認されている血清(3種[0,f!.
F) .キット構成品である酵素標識抗体溶液中に,コ
ンドロイチン硫酸を添加し,終濃度が0.005, 0
.05.0.1. 0.2. 0.3. 0.4または
0.5%(一/りとなるようにした。この酵素標識抗体
溶液を使用し,カイノス社のキットの使用添付書に従っ
て,インスリン高値血清について,インスリン濃度の測
定を行った。対照として,他のインスリン測定法(In
sulin B−Test Wako )によりインス
リン濃度が低値(10μU/一以下)であると確認され
たインスリン低値血清(3種類A,B,C )も同時に
測定した。
MITSUI)■(カイノス社製). インスリン高値血清:インスリン濃度が高値の血清で,
インスリン測定用キット[Insulin B−Tes
tWako (和光純薬社製)]により,インスリンを
含有することが確認されている血清(3種[0,f!.
F) .キット構成品である酵素標識抗体溶液中に,コ
ンドロイチン硫酸を添加し,終濃度が0.005, 0
.05.0.1. 0.2. 0.3. 0.4または
0.5%(一/りとなるようにした。この酵素標識抗体
溶液を使用し,カイノス社のキットの使用添付書に従っ
て,インスリン高値血清について,インスリン濃度の測
定を行った。対照として,他のインスリン測定法(In
sulin B−Test Wako )によりインス
リン濃度が低値(10μU/一以下)であると確認され
たインスリン低値血清(3種類A,B,C )も同時に
測定した。
420nmにおける吸光度(n=4の平均値)を表6お
よび第4図(a)に示す。
よび第4図(a)に示す。
止較■l
実施例6において,酵素標識抗体にコンドロイチン硫酸
を添加しない場合.コンドロイチン硫酸の代わりにポリ
エチレングリコールまたはデキストランを終濃度が3%
となるように添加した場合,およびデキストラン硫酸を
終濃度が0.005, 0.05.0.1. 0.2,
0.3. 0.4または0.5%(一/一)となるよ
うに添加した場合についてそれぞれ測定を行なった。そ
の結果を表6および第4図5)に示す。
を添加しない場合.コンドロイチン硫酸の代わりにポリ
エチレングリコールまたはデキストランを終濃度が3%
となるように添加した場合,およびデキストラン硫酸を
終濃度が0.005, 0.05.0.1. 0.2,
0.3. 0.4または0.5%(一/一)となるよ
うに添加した場合についてそれぞれ測定を行なった。そ
の結果を表6および第4図5)に示す。
示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、抗原または抗体でなる被測定物質を該抗原または抗
体に対する抗体または抗原を用いて測定する免疫反応測
定法であって、該免疫反応の反応系にコンドロイチン硫
酸が0.1〜0.3%(重量/重量)の割合で存在する
、免疫反応測定法。 2、被測定物質である抗原または抗体に対する抗体また
は抗原、およびコンドロイチン硫酸を含有する免疫反応
測定用試薬であって;該免疫反応の反応系に該コンドロ
イチン硫酸が0.1〜0.3%(重量/重量)の割合で
含有されるようにして用いられる、免疫反応測定用試薬
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5922489A JPH02238361A (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5922489A JPH02238361A (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02238361A true JPH02238361A (ja) | 1990-09-20 |
Family
ID=13107193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5922489A Pending JPH02238361A (ja) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | 免疫反応測定法および免疫反応測定用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02238361A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0829420A (ja) * | 1994-07-15 | 1996-02-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫反応干渉作用の除去方法 |
JP2009053195A (ja) * | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | イムノアッセイにおける非特異結合を低減するためのグリコサミノグリカンの使用 |
JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
-
1989
- 1989-03-10 JP JP5922489A patent/JPH02238361A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0829420A (ja) * | 1994-07-15 | 1996-02-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫反応干渉作用の除去方法 |
JP2009053195A (ja) * | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | イムノアッセイにおける非特異結合を低減するためのグリコサミノグリカンの使用 |
US8617820B2 (en) | 2007-08-28 | 2013-12-31 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Use of glycosaminoglycans to reduce non-specific binding in immunoassays |
EP2031392B1 (en) * | 2007-08-28 | 2014-09-24 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Use of chondroitin sulphate to reduce non-specific binding in Troponin I immunoassays |
JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
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