JP2004151000A

JP2004151000A - 抗ミトコンドリアｍ２抗体の検出方法及び該検出方法を用いた抗ミトコンドリアｍ２抗体の免疫学的検出用キット

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Publication number: JP2004151000A
Application number: JP2002317969A
Authority: JP
Inventors: Ryuichi Yajima; 隆一矢嶋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2002-10-31
Publication date: 2004-05-27

Abstract

【課題】抗ミトコンドリアＭ２抗体を高感度、特異的かつ迅速に検査することができる免疫学的検出方法及び該検出方法を用いた抗ミトコンドリアＭ２抗体の免疫学的検出用キットを提供する。
【解決手段】ミトコンドリアＭ２抗原を感作した不溶性担体粒子と検体を混合し、抗原抗体反応による不溶性担体粒子の凝集反応が生じた場合反応液の吸光度が変化するが、その吸光度変化量を測定し抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する。不溶性担体粒子として合成高分子ラテックス粒子を用いる。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出する方法、詳細にはラテックス凝集法による抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出方法及び抗ミトコンドリアＭ２抗体の免疫学的検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗ミトコンドリアＭ２抗体（以下、抗Ｍ２抗体）は、自己免疫性疾患の１つである原発性胆汁性肝硬変（ＰｒｉｍａｒｙＢｉｌｉａｒｙＣｉｒｒｈｏｓｉｓ：ＰＢＣ）の患者の血清中に高頻度かつ特異的に出現する自己抗体であり、ＰＢＣの診断において極めて重要な検査項目の１つとなっている。ＰＢＣの発症機序や抗Ｍ２抗体の発生機序はいまだに解明されていないが、ＰＢＣの病態と抗Ｍ２抗体の抗体価とは相関しないと考えられている。
【０００３】
１９６０年代においてＰＢＣ患者の血清中にミトコンドリア成分に対する自己抗体が発見されて以来、本抗体の対応抗原の検索が行われてきた。当初ミトコンドリア成分はＭ１〜Ｍ９の抗原成分に分類されたが、その後、Ｍ２がＰＢＣ自己抗体の特異的対応抗原であることが判明した［例えば、Ｌａｎｃｅｔ、ｉ、ｐ．８２７〜ｐ．８３１（１９６５）、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２、ｐ．１２３〜ｐ．１３１（１９８６）］。さらに、抗Ｍ２抗体の対応抗原は呼吸系酵素の２−オキソ酸脱水素酵素複合体（２−ＯＡＤＣ）であることが明らかにされた［例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、ｐ．８６５４〜ｐ．８６５８（１９８８）］。２−ＯＡＤＣは３種類の２−オキソ酸を酵素基質とする３種類の類似の酵素群であり、それらはピルビン酸脱水素酵素複合体（ＰＤＣ）、分岐鎖２−オキソ酸脱水素酵素複合体（ＢＣＯＡＤＣ）及び２−オキソグルタル酸脱水素酵素複合体（ＯＧＤＣ）である。さらに、これらの酵素複合体は主に３種類のサブユニット（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）から構成されている。ＰＤＣはさらにもう１つのサブユニットＥ３ＢＰ（Ｅ３ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ、ＰｒｏｔｅｉｎＸ）を結合している。
【０００４】
抗Ｍ２抗体の主要な対応抗原は、これらのサブユニットの中の４つ、すなわちＰＤＣ−Ｅ２、Ｅ３ＢＰ、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２、ＯＧＤＣ−Ｅ２であるが、抗Ｍ２抗体はこれらの抗原に対する抗体の組合せとしてＰＢＣ患者の血清中に出現する。例えば、抗Ｍ２抗体として４種類の抗原に対する抗体をすべて含む検体もあれば、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２に対する抗体のみが単独で出現する場合もある。頻度は小さいがＰＤＣ−Ｅ１のような主要４抗原以外の抗原に対する抗体も検出される場合もある。さらにＰＢＣ患者血清中の抗Ｍ２抗体の抗体タイプとしてはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡが検出され、やはりそれらの組合せで出現する［例えば、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、８、ｐ．２９０〜ｐ．２９５（１９８８）］。従って、抗Ｍ２抗体は、上記数種類の抗原に対する抗体の組合せであり、さらに各抗体は３種類の抗体タイプの組合せから構成される抗体群と考えることができる。抗Ｍ２抗体のスクリーニング目的には１種類の抗体成分からなる抗Ｍ２抗体でも検出できることが重要であり、より性能の優れた抗Ｍ２抗体の検査方法が開発されることが期待されている。以下、ここでは、抗Ｍ２抗体に対する対応抗原としての２−ＯＡＤＣをミトコンドリアＭ２抗原と呼称する。
【０００５】
従来、抗Ｍ２抗体の検査方法としては、例えば、ＷＯ９７／４９７２０、ＤＥ１９６２４６２０Ａ１、特開平３−２９１５６８、ＷＯ８９／０５９７６、ＤＥ３２３７６０２Ａ１及び特開昭５５−３０６９５にも開示されているように、間接蛍光抗体法（ＩＩＦ法）、ウェスタンブロット法（ＷＢ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）が知られている。しかしながら、ラット腎切片を用いたＩＩＦ法は特異性に問題があり、ＰＢＣ以外の疾患、例えば梅毒や心筋炎などでも陽性判定となる場合がある。ＷＢ法は放射性同位元素等を用いることでより高感度な検出もでき、さらに個々の抗原に対する抗体を同定できるという長所があるが、手技が煩雑であり大量検体の処理には適さない。近年、本発明者らは、高感度で特異性の高いＥＬＩＳＡ法による抗Ｍ２抗体の測定キットを開発した［臨床検査機器・試薬、２４、ｐ．３２３〜ｐ．３３０（２００１）；Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、２１、ｐ．１〜ｐ．７（２００１）；Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３６，ｐ．３３〜ｐ．３８（２００１）］。しかし、ＥＬＩＳＡ法は、反応に要する時間が２時間程度もかかり長く、又使用する試薬の種類も多く高価であり、抗Ｍ２抗体をスクリーニングする目的には必ずしも適していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、この発明の目的は、抗Ｍ２抗体を高感度、特異的かつ迅速に検査することができる免疫学的検出方法及び該検出方法を用いた抗Ｍ２抗体の免疫学的検出用キットを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による抗Ｍ２抗体の検出方法は、詳細には、ミトコンドリアＭ２抗原又は合成されたミトコンドリアＭ２抗原を感作した不溶性担体粒子と検体を混合し、抗原抗体反応による不溶性担体粒子の凝集反応が生じた場合、反応液の吸光度が変化するが、その吸光度変化量を測定し抗Ｍ２抗体を検出することを特徴とする方法である。このような不溶性担体粒子を用いた方法は、例えば、感染症マーカー、凝固繊溶系、腫瘍マーカー等の検出のために用いられてきたが、抗Ｍ２抗体の測定には、適切なミトコンドリアＭ２抗原の入手が困難であった等の理由により適用されてこなかった。本発明者らは、ＰＢＣ患者血清を適宜希釈した液と、適切な方法で調製したミトコンドリアＭ２抗原を適切に感作したポリスチレンラテックスを適当な濃度で分散した液とを混合して反応させることにより、意図した感度範囲内で迅速に抗Ｍ２抗体を検出できることを発見し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、検出上有効量の哺乳類のミトコンドリア由来の２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子の懸濁液と検体とを混合し、検体中に抗ミトコンドリアＭ２抗体が存在する場合に生じる担体粒子の凝集反応に基づく反応液の吸光度変化量を変化量測定可能な波長で測定する工程を含む、検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出方法を提供する。
【０００９】
本発明でいう「２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体」は、ピルビン酸脱水素酵素複合体（ＰＤＣ）、分岐鎖２−オキソ酸脱水素酵素複合体（ＢＣＯＡＤＣ）及び２−オキソグルタル酸脱水素酵素複合体（ＯＧＤＣ）からなる群から選択される複数の酵素複合体の、又はＰＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むもの、ＢＣＯＡＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むもの及びＯＧＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むものからなる群から選択される複数の酵素複合体の一部の、複合物（各要素が会合したもの）又は混合物をいう。
【００１０】
本発明でいう「２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体」は、公知の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９１、ｐ．１４７〜ｐ．１５４（１９８０）］でブタ、ウマ等の哺乳類動物の心臓、腎臓、肝臓等の臓器から抽出精製されたもの、又は市販のＰＤＣ（Ｓｉｇｍａ社製）やＯＧＤＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を利用することもできる。さらに遺伝子組み換え技術により得られるリコンビナントタンパク質抗原を用いることができる。ＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣの各Ｅ２サブユニットリポイルドメインのリコンビナント融合タンパク質抗原を使用することも提案されている［ＷＯ９７／４９７２０、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１１０１６］。しかし、これらのリコンビナント抗原のみで抗Ｍ２抗体に対するすべての抗原に対応することは困難である。従って、感作ミトコンドリアＭ２抗原としては抗Ｍ２抗体の検出に必要な対応抗原が含まれているものであればよく、抗原の調製法によって制限されるものではない。本発明者らは、ＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ、ＯＧＤＣを適量含むミトコンドリアＭ２抗原を調製し、ＥＬＩＳＡに用いてその有用性を証明した［臨床検査機器・試薬、２４、ｐ．３２３〜ｐ．３３０（２００１）；Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、２１、ｐ．１〜ｐ．７（２００１）；Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３６、ｐ．３３〜ｐ．３８（２００１）］。このようにＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ、ＯＧＤＣを適量含むように再構成されたものもまた、本発明でいう「２−オキソ酸脱水素酵素複合体、及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体」に含まれる。
【００１１】
本発明の方法は、ミトコンドリアＭ２抗原、好ましくはそれらのサブユニットから選択されるＰＤＣ−Ｅ２、Ｅ３ＢＰ、ＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２及びＯＧＤＣ−Ｅ２又はそれらのリコンビナント抗原を認識し、かつＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭからなる群より選択されるタイプの抗Ｍ２抗体の少なくとも１種を検出しうるものであり、より好ましくは、抗Ｍ２抗体の２種以上の組合せを同時に検出しうるものである。
【００１２】
そのため、本発明の方法の好ましい実施態様の一つにおいては、「２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体」として、ＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣを適量含む混合物、あるいはＰＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むもの、ＢＣＯＡＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むもの及びＯＧＤＣの一部であって抗Ｍ２抗体の対応抗原を含むものを含有する混合物を用いる。各複合体又はその一部の混合比は、それぞれの複合体又はその一部の由来、分子量、検定に供する検体に含まれうる抗Ｍ２抗体の種類、検体の由来する対象者の状態、検定条件等に応じて適宜設計可能である。例えば、ブタ心臓由来のＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣを用いる場合は、ＰＤＣ６重量部に対し、好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．１〜１００重量部、より好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．２〜２０重量部、さらに好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．５〜５重量部用いる。なお、「それぞれ独立に」とは、ＢＣＯＡＤＣとＯＧＤＣとが別個にその数値範囲内の重量比をとりうることをいい、ＢＣＯＡＤＣとＯＧＤＣとが異なる重量比である場合と、同一の重量比である場合とを含む。
【００１３】
本発明者らが検討した結果、検出上有効な量比でＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ、ＯＧＤＣを適量含むように２−オキソ酸脱水素酵素複合体を再構成することに成功した。したがって、本発明はまた、ＰＤＣ６重量部に対し、好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．１〜１００重量部、より好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．２〜２０重量部、さらに好ましくはＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣをそれぞれ独立に約０．５〜５重量部を含む混合物（組成物）をも提供する。
【００１４】
本発明による抗Ｍ２抗体の免疫学的検出用キットは、上記記載の抗Ｍ２抗体を検出する方法に基づき抗Ｍ２抗体を検出するキットであって、ミトコンドリアＭ２抗原感作不溶性担体粒子懸濁液又は反応促進剤や非特異反応抑制剤等を含む検体希釈液及びミトコンドリアＭ２抗原感作不溶性担体粒子懸濁液からなる。
【００１５】
本発明における検体は、基本的には適切な方法で採取された血清であるが、本発明における検出方法の反応を阻害するようなものでなければ血漿や何らかの前処理を施した検体でもかまわず、特に血清に限定されるものではない。
【００１６】
不溶性担体粒子としては、粒径の均一な合成有機高分子ラテックスであり、一般にラテックス凝集法で用いられる粒子を使用することができる。例えば、疎水性粒子の代表であるポリスチレンラテックス粒子、化学修飾が可能な親水性のアミノ基、カルボキシル基などを粒子表面に導入した共重合ラテックス粒子などを用いることができる。特に抗原タンパク質の物理吸着性に優れたポリスチレン系ラテックスが好ましい。ラテックス粒子の粒径は０．０５〜１．０μｍ、好ましくは０．１〜０．５μｍである。
【００１７】
２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子は、例えば、ブタ心臓由来のＰＤＣ、ＢＣＯＡＤＣ及びＯＧＤＣを重量比６：２：２で混合してなるミトコンドリアＭ２抗原と、平均粒径約０．１〜０．５μｍのポリスチレンラテックス粒子とを用いる場合は、約１０〜１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００〜１０００μｇ／ｍＬのミトコンドリアＭ２抗原溶液と、該粒子の約０．１〜１０％（ｗ／ｖ）懸濁液とを混合することにより得られる。このようにして得られるミトコンドリアＭ２抗原感作不溶性担体粒子と同様の反応性及び検出性を有する担体は、本発明でいう「２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子」の範囲に含まれる。
【００１８】
本発明におけるミトコンドリアＭ２抗原感作不溶性担体粒子懸濁液は、ミトコンドリアＭ２抗原を公知の手段によってラテックス粒子表面に物理（化学）吸着又は化学結合によって感作（結合）したミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックス粒子を約０．００１〜４．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．０１〜２．０％（ｗ／ｖ）の濃度になるように感作ラテックス粒子懸濁用緩衝液に懸濁した液である。なお、本明細書で不溶性担体の濃度に関し、「％（ｗ／ｖ）」というときは、特別な場合を除き、ｗは懸濁質（不溶性担体粒子）の重量を表し、ｖは懸濁媒（不溶性担体粒子懸濁用の緩衝液）の容積を表す。
【００１９】
感作ラテックス粒子の懸濁用緩衝液は、ｐＨ６〜９に調整されたものであれば従来公知の緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液やＭＥＳ緩衝液などのグッド緩衝液である。さらに、反応促進剤として公知のポリエチレングリコール、デキストラン、プルランなどの有機高分子や感作ラテックス粒子の自己凝集を防止するためのキレート剤、高分子電解質等を添加してもよい。
【００２０】
ミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックス粒子懸濁液とは別に用いる検体希釈液には、ｐＨ６〜９のリン酸緩衝液、トリス緩衝液やグッド緩衝液等の公知の緩衝液を用いることができる。緩衝液には、上記反応促進剤やキレート剤、アジド化合物、高分子電解質等の安定化剤、さらに非特異反応を抑制するために動物正常血清などを加えてもよい。検体は希釈せずに用いることもできるが、検体が血清であり、かつ約０．０４〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度の感作ラテックス粒子懸濁液を用いる場合は、予め約２〜１０^５倍に希釈して用いることが好ましく、約１０〜１０００倍に希釈して用いることがより好ましい。
【００２１】
ミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックス粒子と検体との反応は、感作ラテックス粒子表面での特異的抗原抗体反応と該反応の結果起こる感作ラテックス粒子の凝集反応であり、凝集の程度を測定することにより検体中の抗Ｍ２抗体の存在を調べることができる。
【００２２】
該ラテックス凝集反応は、スライドガラス上で目視により検知することもできるが、分光光度計を用いて反応液の吸光度の変化（増加）を一定温度の下で経時的に、例えば、検体の希釈液へラテックス懸濁液を添加した直後と、その約１〜６０分後、好ましくは約３〜２０分後に測定することで正確に追跡することができる。さらに、汎用の生化学自動分析装置を利用することが好ましい。
【００２３】
凝集反応に伴う濁度の変化を吸光度の変化量で計測するために吸光度を測定する際用いられる光の波長は約３００〜１，０００ｎｍ、好ましくは約５００〜９００ｎｍ、最も好ましくは約７２０〜８８０ｎｍの範囲から適宜選ばれる。
【００２４】
汎用の生化学自動分析装置、例えば日立７１７０型装置を用いて検体中の抗Ｍ２抗体を検出する場合次のような手順で行うことができる。検体２μＬを反応セルに分注し検体希釈液１００μＬを加え攪拌後５分間インキュベートする。次に、ラテックス懸濁液１００μＬを加え攪拌後５分間反応させる。この間反応液は恒温（３７℃）に保たれ一定時間間隔で吸光度（波長８００ｎｍ）が測定される。ラテックス懸濁液添加直後の反応液の吸光度（Ａｉ）と約５分後の反応液の吸光度（Ａｆ）の差すなわち吸光度変化量（ΔＡ８００＝Ａｆ−Ａｉ）の測定値から検体中の抗Ｍ２抗体の存在を評価することができる。検体量、試薬量、波長、反応時間などの測定条件は使用する分析機器等に合った適切な条件が設定される。
【００２５】
本発明の方法は、抗ミトコンドリアＭ２抗体のみならず、自己免疫疾患患者に認められる他の自己抗体の検出にも適用可能である。このような自己抗体には、自己免疫性肝炎に認められる平滑筋抗体、抗核抗体、潰瘍性大腸炎患者に認められる結腸リポ多糖体抗体、シェーグレン症候群患者に認められる唾液腺管抗体、甲状腺抗体、ＩｇＧ抗体が含まれる。
【００２６】
【実施例】
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２７】
＜実施例１＞
（１）ミトコンドリアＭ２抗原の調製
１）ＰＤＣ及びＯＧＤＣの調製
ブタ心臓を氷冷下細切し、その約２５０ｇに２容の２．７ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）緩衝液を加え、さらに、ＰＭＳＦ及びベンズアミジンを０．１ｍＭの濃度になるように添加した後、ポリトロンを用いてホモジナイズした。得られたホモジネートに等容の２．７ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）緩衝液を加えた混合物を１００００ｇで２０分間遠心分離した。得られた上清のｐＨを１０％（ｖ／ｖ）酢酸で６．５に調整し、０．１２容の３５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えてから、３０分間攪拌した。混合物を２５０００ｇで１０分間遠心分離して得た沈殿を約４００ｍＬの２．７ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）緩衝液に再懸濁した。さらに、２５０００ｇで４０分間遠心分離し上清を回収した。この上清にＭｇＣｌ２を１３ｍＭになるように加えて３０℃に加温した後、溶液を１０℃以下に冷却し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％の濃度になるように加え、さらに、イオン強度を上げるために終濃度５０ｍＭとなるように１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を加えた。溶液のｐＨを１０％（ｖ／ｖ）酢酸で６．５に調整し、０．１２容の３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加えて３０分間攪拌した後、２５０００ｇで１０分間遠心分離し沈殿を集めた。沈殿を約１００ｍＬの２．７ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）緩衝液に再懸濁した。室温で１時間攪拌した後、４００００ｇで６０分間遠心分離した。上清を回収し１０％（ｖ／ｖ）酢酸でｐＨを６．４に調整してから、０．０８容の３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加え攪拌した後、２５０００ｇで１０分間遠心分離した。得られた沈殿を１０ｍＬの２．７ｍＭＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）緩衝液に再懸濁してＯＧＤＣ液を得た。遠心分離して得た上清のｐＨを０．５ＭＮａＯＨで６．５に調整してから、０．１２容の３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加え３０分間攪拌した後、２５０００ｇで１０分間遠心分離した。得られた沈殿を上記リン酸緩衝液の１０ｍＬに再懸濁してＰＤＣ液を得た。
【００２８】
２）ＢＣＯＡＤＣの調製
ブタ心臓を氷冷下細切しその約２００ｇに２容の２ｍＭＥＤＴＡ、３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、０．１ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）緩衝液を加えポリトロンでホモジナイズした。さらに、等容の同緩衝液を加え攪拌した後、２６０００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清に０．１２容の３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加えて３０分間攪拌した後、３００００ｇで１５分間遠心分離し沈殿を集めた。沈殿を初期容積の１／３の０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＤＴＴ、３０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．３）緩衝液に充分再懸濁し３０分間攪拌した後、混合物を３００００ｇで３０分間遠心分離した。さらに、上清に０．１２容の３５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加えて３０分間遠心分離し沈殿を集めた。再度、沈殿を初期容積の１／２０の０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＤＴＴ、３０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．３）緩衝液に懸濁し、上記の操作と同様に遠心分離し沈殿を回収した。得られた沈殿を１０ｍＬの０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＤＴＴ、３０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．３）緩衝液に懸濁してＢＣＯＡＤＣ液を得た。
【００２９】
３）ミトコンドリアＭ２抗原の調製
上記１）、２）により得られたＰＤＣ液、ＯＧＤＣ液及びＢＣＯＡＤＣ液のタンパク質濃度をブラッドフォード法で測定し、各抗原（酵素）の量比を約ＰＤＣ：ＯＧＤＣ：ＢＣＯＡＤＣ＝６：２：２となるように混合して感作用ミトコンドリアＭ２抗原を調製した。
【００３０】
（２）ミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックス懸濁液の調製
平均粒径０．４５μｍのポリスチレンラテックス（イムテックス、固形分１０％（ｗ／ｖ）、日本合成ゴム社製）８０μＬを４℃にて１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離し上清を除去した後、リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％ＮａＮ_３）の１ｍＬを加えて分散した。再び４℃にて１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、ラテックスを一度リン酸緩衝液で前洗浄した。ラテックスに最終的に体積０．５ｍＬとなるようにリン酸緩衝液を加えて分散し抗原感作用ラテックス懸濁液（１．６％（ｗ／ｖ））とした。次に、前述の方法で調製したミトコンドリアＭ２抗原をリン酸緩衝液で希釈して濃度３００μｇ／ｍＬの抗原液を調製した。この抗原液０．５ｍＬに上記ラテックス懸濁液０．５ｍＬを添加混合して、２５℃で３時間ローターを用いて攪拌した。このようにミトコンドリアＭ２抗原をラテックス粒子に感作した。次いで、４℃にて１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離し上清を除去した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（０．１％ＢＳＡ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１％ＮａＮ_３）の１ｍＬを抗原感作ラテックスに加えて充分分散させてから２５℃で２時間攪拌した。このようにしてＢＳＡでブロッキング処理をした後、４℃にて１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。同様に同じＢＳＡ溶液で抗原感作ラテックスを３回洗浄した。得られた抗原感作ラテックスをＢＳＡを含むリン酸緩衝液（０．１％ＢＳＡ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％ＮａＮ_３）の１０ｍＬに超音波処理により均一に分散して固形分０．０６％（ｗ／ｖ）のミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックス粒子懸濁液（Ｒ２）を調製した。
【００３１】
（３）検体希釈液の調製
０．５％ポリアクリル酸（重量平均分子量３０，０００、アルドリッチ社製）、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％ＮａＮ_３を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）−生理食塩水（５０ｍＭＰＢＳ）を検体希釈液（Ｒ１）として調製した。
【００３２】
（４）検体測定
ＥＬＩＳＡ法により測定された抗Ｍ２抗体価既知のＰＢＣ患者血清（４７００Ｕ／ｍＬ）を用いて希釈系列（２１２〜０．１Ｕ／ｍＬ）を作製し検体とした。さらに検体希釈液及び一般検体５例も検体とした。測定は日立自動分析装置（７１７０型）を用いて行なった。分析パラメータは、２ポイントエンド法、測光ポイント２２−３４、反応時間１０分、測定波長８００ｎｍに設定した。検体量は２０、４及び２μＬとした。検体希釈液（Ｒ１）と抗原感作ラテックス懸濁液（Ｒ２）は夫々１００μＬとした。ただし、１実験例ではＲ１を１５０μＬで測定した。検体とＲ１を混合攪拌し３７℃で５分間インキュベートした後、これにＲ２を加え攪拌した。そのまま３７度で５分間反応させた。測光ポイント２２（Ｒ２を添加攪拌した直後）と３４（Ｒ２を添加して５分後）における波長８００ｎｍでの吸光度の値から吸光度変化量（ΔＡ８００）を算出した。
【００３３】
（５）結果
測定結果を表１及び図１に示した。
【００３４】
【表１】

【００３５】
この結果から分かるように、検体量が増加するに従って検出感度が高くなる一方、プロゾーン現象は抗Ｍ２抗体の低濃度域から観察されるようになった。また、検体量が多いと非特異反応の発生頻度は大きくなることが予想される。具体的には、検体量が２０μＬでは、抗Ｍ２抗体の抗体価が２０Ｕ／ｍＬ付近からプロゾーンが観察され抗体価の増加に伴い吸光度変化量（ΔＡ８００×１０^４）が５００程度まで低下した。しかし、その値は検体希釈液や正常検体（１〜４）の測定値まで下がることはなかった。正常検体５の値は非特異反応が起こった結果と考えられる。検体量４μＬでのプロゾーン域の抗Ｍ２抗体価は約１００Ｕ／ｍＬであった。検体量が２μＬの場合、吸光度変化量は抗Ｍ２抗体価が１００〜２００Ｕ／ｍＬでプラトーに達するが、検体量４μＬや２０μＬの場合のように低下することはなかった。検体量２μＬでＲ１を１５０μＬとすると１００μＬの場合と比較して吸光度変化量は全体的に小さくなった。
【００３６】
＜実施例２＞
（１）ミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックスの調製：
実施例１の（２）に記載の方法でミトコンドリアＭ２抗原をラテックスに感作した後、固形分０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）及び０．０４％（ｗ／ｖ）濃度の感作ラテックス懸濁液を調製した。
【００３７】
（２）検体希釈液の調製：
実施例１の（３）で調製した検体希釈液と同じものを用いた。
【００３８】
（３）検体測定：
実施例１の（４）で作製した抗Ｍ２抗体の希釈系列を検体として測定した。日立７１７０型自動分析装置の分析パラメータは、実施例１の（４）と同じに設定した。検体量は２μＬとし、試薬量はＲ１、Ｒ２ともに１００μＬとした。
【００３９】
（４）結果：
測定結果を表２と図２に示した。
【００４０】
【表２】

【００４１】
この結果から明らかなように、ラテックス濃度が小さくなるに従って吸光度変化量が低下し、さらに、より低い抗Ｍ２抗体価でプロゾーン現象が観察された。しかし、ラテックス濃度０．０８％（ｗ／ｖ）の場合では抗Ｍ２抗体価が２００Ｕ／ｍＬでプロゾーンは起こらなかった。抗Ｍ２抗体価が約２Ｕ／ｍＬより高濃度で抗体価に対応して吸光度変化量が変化（増加）した。
【００４２】
＜実施例３＞
（１）ミトコンドリアＭ２抗原感作ラテックスの調製
実施例１の（２）に記載の方法でミトコンドリアＭ２抗原をラテックスに感作した後、固形分０．０８％（ｗ／ｖ）濃度の感作ラテックス懸濁液を調製した。
【００４３】
（２）検体希釈液の調製
０．５％ポリアクリル酸（重量平均分子量３０，０００、アルドリッチ社製）、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．１％ＮａＮ_３及び０．７ｍｇ／ｍＬのウマ変性ガンマグロブリンを含む５０ｍＭＰＢＳを検体希釈液（Ｒ１）として調製した。
【００４４】
（３）検体測定
ＰＢＣ検体４５例、自己免疫性肝炎検体１５例、Ａ型急性肝炎検体７例、Ｂ型慢性肝炎検体３３例、Ｃ型慢性肝炎検体３７例、アルコール性肝炎検体３例、アルコール性疾患検体１２例、ウィルス性及びアルコール性肝硬変検体１４例を用いた。
【００４５】
抗Ｍ２抗体の測定又は検出は、市販のＥＬＩＳＡキットすなわちＡ社ＥＬＩＳＡキット（メサカップミトコンドリアＭ２、医学生物学研究所製）、Ｂ社ＥＬＩＳＡキット（イムニスミトコンドリア抗体ＥＩＡ、特殊免疫研究所製）、Ｃ社ＥＬＩＳＡキット（カルスタットＥＩＡ３抗ミトコンドリア抗体、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ製）及び本発明による方法を用いて行なった。さらに、ＷＢ法による抗Ｍ２抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の検索も行なった。
【００４６】
ＥＬＩＳＡキットによる測定及び判定はキットに添付されている取扱説明書に従った。本発明による測定は日立７１７０型自動分析装置を用い実施例２の（３）に記載の分析パラメータで行なった。ＷＢ法による抗Ｍ２抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の検索は以下の手順で行なった。公知の方法でウシ心筋からミトコンドリアを調製し、これを用いてミトコンドリアＭ２抗原をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。転写膜を１００倍希釈した検体とインキュベートした後、膜を洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＩｇＧとＩｇＭ）とインキュベートした。さらに膜を洗浄後、コニカイムノステインＨＲＰ−１０００（コニカ社製）で染色し抗Ｍ２抗体の検索を行なった。
【００４７】
（４）結果
ＰＢＣ患者検体４５例の結果を表３に示した。
【００４８】
【表３】

【００４９】
ＰＢＣ以外の検体（１２１例）はすべて各ＥＬＩＳＡ法及びＷＢ法で抗Ｍ２抗体が陰性であった。本実施例におけるラテックス凝集法でのＰＢＣ以外の検体の吸光度変化量（ΔＡ８００×１０^４）の平均値（Ｍ）は５．９であり標準偏差（ＳＤ）３９．２であった。
これよりＭ＋３ＳＤは１２３となることからラテックス凝集法のカットオフ値（ΔＡ８００
×１０^４）を１２０とし、１２０以上の場合を抗Ｍ２抗体が陽性で１２０未満を陰性と判定した。この基準によるＰＢＣ検体４５例の判定結果を各方法での結果と比較して表４に示した。
【００５０】
【表４】

ここでは、ＷＢ法の結果における±は抗体陽性とみなした。本発明によるラテックス凝集法と他の検査方法との一致率は、Ａ社ＥＬＩＳＡキット（抗体価カットオフ参考値：２０Ｕ／ｍＬ）で７３％、Ｂ社ＥＬＩＳＡキット（抗体価カットオフ参考値：１０Ｕ／ｍＬ）で８７％、Ｃ社ＥＬＩＳＡキット（カットオフインデックスカットオフ値１．０）で７６％、ＷＢ法で８４％であった。この結果から明らかなように、本ラテックス凝集法はＢ社ＥＬＩＳＡキットとほぼ同等の性能を有することがわかった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、ＥＬＩＳＡ法又はＷＢ法と同程度の高い検出感度で迅速、簡便に検体中の抗Ｍ２抗体を検出することができる。さらに、汎用の生化学自動分析装置を利用して大量検体の抗Ｍ２抗体のスクリーニングが可能となる免疫学的検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】検体量を変化させた場合の抗Ｍ２抗体価と吸光度変化量の関係を説明した図である。
【図２】感作ラテックス濃度を変化させた場合の抗Ｍ２抗体価と吸光度変化量の関係を説明した図である。

Claims

検出上有効量の哺乳類のミトコンドリア由来の２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子の懸濁液と検体とを混合し、検体中に抗ミトコンドリアＭ２抗体が存在する場合に生じる担体粒子の凝集反応に基づく反応液の吸光度変化量を変化量測定可能な波長で測定する工程を含む、検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体の検出方法。
検出上有効量の哺乳類のミトコンドリア由来の２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体が、検出上有効な量比でピルビン酸脱水素酵素複合体、分岐鎖２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び２−オキソグルタル酸脱水素酵素複合体を含む混合物である、請求項１記載の検出方法。
ピルビン酸脱水素酵素複合体６重量部、分岐鎖２−オキソ酸脱水素酵素複合体０．１〜１００重量部、及び２−オキソグルタル酸脱水素酵素複合体０．１〜１００重量部を含む組成物。
２−オキソ酸脱水素酵素複合体の各抗原を認識し、かつＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭからなる群より選択されるタイプの抗ミトコンドリアＭ２抗体の少なくとも１種を検出しうる、請求項１又は２記載の検出方法。
抗ミトコンドリアＭ２抗体の２種以上の組合せを同時に検出しうる、請求項４記載の検出方法。
不溶性担体粒子が合成高分子ラテックス粒子である、請求項１、２、４及び５のいずれか１項記載の検出方法。
不溶性担体粒子が粒径が０．０５〜１．０μｍの、ポリスチレンラテックス粒子、又はカルボキシル基若しくはアミノ基を導入したポリスチレンラテックス粒子である、請求項１、２及び４〜６のいずれか１項記載の検出方法。
哺乳類のミトコンドリア由来の２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子の懸濁液、又は検体希釈のための液と哺乳類のミトコンドリア由来の２−オキソ酸脱水素酵素複合体及び／又は合成された２−オキソ酸脱水素酵素複合体を感作した不溶性担体粒子の懸濁液とを含む、請求項１、２及び４〜７のいずれか１項記載の検出方法を用いて検体中の抗ミトコンドリアＭ２抗体を検出するためのキット。