JP2890250B2 - ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定法および免疫学的測定用試薬 - Google Patents
ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定法および免疫学的測定用試薬Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体（Ｐｌａｓｍｉｎ
−α２−Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｍ
ｐｌｅｘ：以下ＰＩＣと略す）の免疫学的測定法および
免疫学的測定用試薬に関する。
α２−プラスミンインヒビター複合体（Ｐｌａｓｍｉｎ
−α２−Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｍ
ｐｌｅｘ：以下ＰＩＣと略す）の免疫学的測定法および
免疫学的測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】汎発性血管内凝固症候群（以下ＤＩＣ
（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌ
ａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）と略す）患者等の血漿
中では、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）が組織型プラスミ
ノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）等のアクチベ
ータにより活性化されて、プラスミン（Ｐｍ）が生成す
る。生成したＰｍのほとんどは、循環血漿中では即座に
α２−プラスミンインヒビター（α２ＰＩ：Ｍｏｒｏ
ｉ，Ｍ． ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５１，５９５６−５９６５，１９７６）と
１：１の割合で結合し、複合体すなわち前記のＰＩＣを
形成する（Ｂ．Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，９２９１−９２９
７，１９７９）。したがって、ヒトＰＩＣを測定するこ
とは、Ｐｍの生成、ＤＩＣの診断や血栓溶解療法のモニ
ターに重要である。このためには、血液または血漿中の
ヒトＰＩＣの量を正確かつ簡便に測定する必要がある。
（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌ
ａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）と略す）患者等の血漿
中では、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）が組織型プラスミ
ノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）等のアクチベ
ータにより活性化されて、プラスミン（Ｐｍ）が生成す
る。生成したＰｍのほとんどは、循環血漿中では即座に
α２−プラスミンインヒビター（α２ＰＩ：Ｍｏｒｏ
ｉ，Ｍ． ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５１，５９５６−５９６５，１９７６）と
１：１の割合で結合し、複合体すなわち前記のＰＩＣを
形成する（Ｂ．Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，９２９１−９２９
７，１９７９）。したがって、ヒトＰＩＣを測定するこ
とは、Ｐｍの生成、ＤＩＣの診断や血栓溶解療法のモニ
ターに重要である。このためには、血液または血漿中の
ヒトＰＩＣの量を正確かつ簡便に測定する必要がある。
【０００３】従来知られているヒトＰＩＣ測定方法とし
ては、特公平７−２１４９９号公報、特開平６−９４号
公報、特開昭６２−２３８４６３号公報、特公平５−３
５８２７号公報等に記載された方法が知られているが、
これらは検体を希釈したり、半定量性であるため、より
優れた方法の開発が望まれていた。他方、プラスミンが
Ｋ１〜Ｋ５からなる５つのループを有し、その内Ｋ５を
除く全てのループがリジンバインディングサイトを有す
ること（Ｗｉｒｎ，Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕ
ｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０４， ５７９−５
８６， １９８０； Ｍｏｒｏｉ，Ｍ． ａｎｄ Ａｏ
ｋｉ，Ｎ．， 前掲文献）、およびε−アミノカプロン
酸やｔｒａｎｓ−４−（アミノメチル）シクロヘキサン
カルボン酸（以下ＡＭＣＨＡと略す）がリジンバインデ
ィングサイトと結合すること（Ｍａｒｈｕｓ，Ｇ． ｅ
ｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５
３， ７２７−７３２， １９７８； Ｔｈｏｒｓｅ
ｎ，Ｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ ３９５， ５５−６５， １９７５）が知られてい
る。
ては、特公平７−２１４９９号公報、特開平６−９４号
公報、特開昭６２−２３８４６３号公報、特公平５−３
５８２７号公報等に記載された方法が知られているが、
これらは検体を希釈したり、半定量性であるため、より
優れた方法の開発が望まれていた。他方、プラスミンが
Ｋ１〜Ｋ５からなる５つのループを有し、その内Ｋ５を
除く全てのループがリジンバインディングサイトを有す
ること（Ｗｉｒｎ，Ｅ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕ
ｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０４， ５７９−５
８６， １９８０； Ｍｏｒｏｉ，Ｍ． ａｎｄ Ａｏ
ｋｉ，Ｎ．， 前掲文献）、およびε−アミノカプロン
酸やｔｒａｎｓ−４−（アミノメチル）シクロヘキサン
カルボン酸（以下ＡＭＣＨＡと略す）がリジンバインデ
ィングサイトと結合すること（Ｍａｒｈｕｓ，Ｇ． ｅ
ｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５
３， ７２７−７３２， １９７８； Ｔｈｏｒｓｅ
ｎ，Ｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ ３９５， ５５−６５， １９７５）が知られてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】抗ヒトプラスミノーゲ
ンモノクローナル抗体またはその性質を有するポリクロ
ーナル抗体と抗ヒトα２−プラスミンインヒビターモノ
クローナル抗体またはその性質を有するポリクローナル
抗体を用いてヒトＰＩＣを免疫学的に測定すると、非特
異反応が生じ、ヒトＰＩＣを正確にかつ再現性良く測定
できない。本発明者らは、鋭意研究をした結果、上記の
免疫反応系にＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一
つを存在させる場合には、非特異反応を抑制できること
を見出した。
ンモノクローナル抗体またはその性質を有するポリクロ
ーナル抗体と抗ヒトα２−プラスミンインヒビターモノ
クローナル抗体またはその性質を有するポリクローナル
抗体を用いてヒトＰＩＣを免疫学的に測定すると、非特
異反応が生じ、ヒトＰＩＣを正確にかつ再現性良く測定
できない。本発明者らは、鋭意研究をした結果、上記の
免疫反応系にＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一
つを存在させる場合には、非特異反応を抑制できること
を見出した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かかる課題を解決する本
発明は、抗ヒトプラスミノーゲン抗体と抗ヒトα２−プ
ラスミンインヒビター抗体を用いて、ヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体（ヒトＰＩＣ）を
免疫学的に測定するに際し、免疫反応の反応系にＥＡＣ
ＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを存在させること
を特徴とするヒトＰＩＣの免疫学的測定法、およびＥＡ
ＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含有してな
る、ヒトＰＩＣの免疫学的測定用試薬に関する。
発明は、抗ヒトプラスミノーゲン抗体と抗ヒトα２−プ
ラスミンインヒビター抗体を用いて、ヒトプラスミン−
α２−プラスミンインヒビター複合体（ヒトＰＩＣ）を
免疫学的に測定するに際し、免疫反応の反応系にＥＡＣ
ＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを存在させること
を特徴とするヒトＰＩＣの免疫学的測定法、およびＥＡ
ＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含有してな
る、ヒトＰＩＣの免疫学的測定用試薬に関する。
【０００６】本発明によりヒトＰＩＣを測定する場合の
測定系は特に限定されず、通常の酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法、ラ
テックス凝集法等を利用することができるが、ラテック
ス凝集法が特に好適に用いられる。本発明では、ヒトＰ
ＩＣの免疫学的測定をＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少な
くとも一つの存在下に行う点に特徴を有するのであっ
て、他の点、例えば、使用抗体（一方は必要に応じ酵素
標識、放射標識または蛍光標識されていてもよい）、そ
れらの使用量、反応媒体（緩衝液等）、使用する場合の
ラテックス、その粒径および濃度、免疫反応の温度、ｐ
Ｈ条件、免疫反応時間等については、通常使用される物
および条件をそのまま用いることができる。
測定系は特に限定されず、通常の酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法、ラ
テックス凝集法等を利用することができるが、ラテック
ス凝集法が特に好適に用いられる。本発明では、ヒトＰ
ＩＣの免疫学的測定をＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少な
くとも一つの存在下に行う点に特徴を有するのであっ
て、他の点、例えば、使用抗体（一方は必要に応じ酵素
標識、放射標識または蛍光標識されていてもよい）、そ
れらの使用量、反応媒体（緩衝液等）、使用する場合の
ラテックス、その粒径および濃度、免疫反応の温度、ｐ
Ｈ条件、免疫反応時間等については、通常使用される物
および条件をそのまま用いることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるＥＡＣＡまた
はＡＭＣＨＡを免疫反応系に存在させる方法としては、
反応前に、被測定抗原ヒトＰＩＣに対する抗体（すなわ
ち、抗ヒトプラスミノーゲン抗体または抗ヒトα２−プ
ラスミンインヒビター抗体）、検体または緩衝液中に添
加しておく等の方法を用い得る。これらの抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれ
も使用可能である。ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なく
とも一つの反応系での濃度（＝免疫反応開始時の濃度）
は、０．１ｍＭ〜１Ｍ、さらには１ｍＭ〜５００ｍＭ、
特に１０ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましい。０．
１ｍＭ未満では非特異的を抑制できず、１Ｍより高い場
合は経済的でない。
はＡＭＣＨＡを免疫反応系に存在させる方法としては、
反応前に、被測定抗原ヒトＰＩＣに対する抗体（すなわ
ち、抗ヒトプラスミノーゲン抗体または抗ヒトα２−プ
ラスミンインヒビター抗体）、検体または緩衝液中に添
加しておく等の方法を用い得る。これらの抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれ
も使用可能である。ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なく
とも一つの反応系での濃度（＝免疫反応開始時の濃度）
は、０．１ｍＭ〜１Ｍ、さらには１ｍＭ〜５００ｍＭ、
特に１０ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましい。０．
１ｍＭ未満では非特異的を抑制できず、１Ｍより高い場
合は経済的でない。
【０００８】本発明における抗原抗体反応は、一般的な
抗原抗体反応の条件下で行われ、例えば、中性、弱塩基
性または弱酸性に調整したリン酸緩衝液、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液等の緩衝液を液媒体として、４℃
〜４０℃で３０秒〜７２時間行う。反応系には、ポリエ
チレングリコール等の反応の促進剤、アルブミン（例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））等の安定化剤、ア
ジ化ナトリウム等の防腐剤等を適宜添加することができ
る。これらの添加剤は、被測定物を失活させることがな
く、かつ抗原抗体反応または免疫凝集反応を阻害しない
ものであればいずれも使用できる。
抗原抗体反応の条件下で行われ、例えば、中性、弱塩基
性または弱酸性に調整したリン酸緩衝液、グリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液等の緩衝液を液媒体として、４℃
〜４０℃で３０秒〜７２時間行う。反応系には、ポリエ
チレングリコール等の反応の促進剤、アルブミン（例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））等の安定化剤、ア
ジ化ナトリウム等の防腐剤等を適宜添加することができ
る。これらの添加剤は、被測定物を失活させることがな
く、かつ抗原抗体反応または免疫凝集反応を阻害しない
ものであればいずれも使用できる。
【０００９】本発明によりヒトＰＩＣを測定する場合の
測定系は特に限定されず、通常のＥＩＡ、ＲＩＡ、蛍光
免疫測定法、ラテックス凝集法等を利用することができ
るが、ラテックス凝集法が特に好適に用いられる。ラテ
ックス凝集法により、ヒトＰＩＣを測定する場合の本発
明は、抗ヒトプラスミノーゲン抗体および抗ヒトα２−
プラスミンインヒビター抗体で感作したラテックス懸濁
液と、ヒトＰＩＣの含有を検査する検体とを、ＥＡＣＡ
およびＡＭＣＨＡの少なくとも一つの存在下に、混合
し、生じるラテックス粒子の凝集の程度を混合物の吸光
度または光の透過度として測定することによってＰＩＣ
を測定することを特徴とするＰＩＣの免疫学的測定法、
およびＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含
有してなる、ヒトＰＩＣをラテックス凝集法により免疫
学的に測定する際に使用する試薬と表現することができ
る。
測定系は特に限定されず、通常のＥＩＡ、ＲＩＡ、蛍光
免疫測定法、ラテックス凝集法等を利用することができ
るが、ラテックス凝集法が特に好適に用いられる。ラテ
ックス凝集法により、ヒトＰＩＣを測定する場合の本発
明は、抗ヒトプラスミノーゲン抗体および抗ヒトα２−
プラスミンインヒビター抗体で感作したラテックス懸濁
液と、ヒトＰＩＣの含有を検査する検体とを、ＥＡＣＡ
およびＡＭＣＨＡの少なくとも一つの存在下に、混合
し、生じるラテックス粒子の凝集の程度を混合物の吸光
度または光の透過度として測定することによってＰＩＣ
を測定することを特徴とするＰＩＣの免疫学的測定法、
およびＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含
有してなる、ヒトＰＩＣをラテックス凝集法により免疫
学的に測定する際に使用する試薬と表現することができ
る。
【００１０】ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一
つを免疫反応系に存在させる態様としては、感作ラテッ
クス懸濁液に存在させる、検体に添加して存在させる、
検体を希釈するための緩衝液に存在させる等の態様が可
能である。換言すれば、本発明の測定用試薬は、例え
ば、ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つおよび
抗体を含有する１液系の試薬（またはキット）、例えば
ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含有する
感作ラテックス懸濁液；抗体を含有する第１試薬、例え
ば感作ラテックス懸濁液とＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの
少なくとも一つを含有する緩衝液とで構成される２液系
の試薬（またはキット）等の形態であり得る。
つを免疫反応系に存在させる態様としては、感作ラテッ
クス懸濁液に存在させる、検体に添加して存在させる、
検体を希釈するための緩衝液に存在させる等の態様が可
能である。換言すれば、本発明の測定用試薬は、例え
ば、ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つおよび
抗体を含有する１液系の試薬（またはキット）、例えば
ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも一つを含有する
感作ラテックス懸濁液；抗体を含有する第１試薬、例え
ば感作ラテックス懸濁液とＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの
少なくとも一つを含有する緩衝液とで構成される２液系
の試薬（またはキット）等の形態であり得る。
【００１１】本発明で使用するラテックス粒子として
は、ラテックス凝集法に通常使用されるポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、アクリル酸ポリマー、
メタクリル酸ポリマー、アクリルニトリル−ブタジエン
−スチレン共重合体、ポリビニルピリジン、ポリ酢酸ビ
ニルアクリレート等からなるものを挙げることができ
る。ラテックス粒子の平均粒径は、通常使用される０．
０３〜３μｍ、特に０．０８〜１μｍが好ましい。抗ヒ
トプラスミノーゲン抗体および抗ヒトα２−プラスミン
インヒビター抗体によるラテックスの感作は、例えば、
４℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜４５℃の温度で行う
のが適当である。感作ラテックス懸濁液におけるラテッ
クス粒子の濃度は、通常使用される０．０１〜５重量
％、特に０．１〜３重量％が好ましい。また、感作時の
各抗体のラテックス粒子に対する使用量は、ラテックス
粒子単位ｇ当たり、１〜１０００ｍｇ、特に１０〜３０
０ｍｇが適当である。
は、ラテックス凝集法に通常使用されるポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合体、アクリル酸ポリマー、
メタクリル酸ポリマー、アクリルニトリル−ブタジエン
−スチレン共重合体、ポリビニルピリジン、ポリ酢酸ビ
ニルアクリレート等からなるものを挙げることができ
る。ラテックス粒子の平均粒径は、通常使用される０．
０３〜３μｍ、特に０．０８〜１μｍが好ましい。抗ヒ
トプラスミノーゲン抗体および抗ヒトα２−プラスミン
インヒビター抗体によるラテックスの感作は、例えば、
４℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜４５℃の温度で行う
のが適当である。感作ラテックス懸濁液におけるラテッ
クス粒子の濃度は、通常使用される０．０１〜５重量
％、特に０．１〜３重量％が好ましい。また、感作時の
各抗体のラテックス粒子に対する使用量は、ラテックス
粒子単位ｇ当たり、１〜１０００ｍｇ、特に１０〜３０
０ｍｇが適当である。
【００１２】
【実施例】以下に本発明を実施例によって具体的に説明
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。 実施例１ （１）抗原ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体の作製 １００ｍｌのヒト血漿（健常人）に、ウロキナーゼ（Ｊ
ＣＲ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を１００
０Ｉ．Ｕ．／ｍｌとなるように添加し、２５℃で１時間
保温した。１時間後にフルオロリン酸ジイソプロピル
（和光純薬社製）を１ｍＭ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（和光
純薬社製）を１０００Ｕ／ｍｌ、ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ
ｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を５ｍＭとなるように添加し、２
５℃で１時間保温し、反応を停止した。このウロキナー
ゼ処理血漿をトリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、
ｐＨ７．４緩衝液（以下、「ＴＢＳ」という）で平衡化
したリジン−セファロース４Ｂカラム（３０ｍｌベッド
容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．０２
５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒトプラスミン−α２−プ
ラスミンインヒビター複合体を溶出させ、イオン交換ク
ロマト法（ＤＥＡＥ−セファロースカラム）で精製し
て、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体（ヒトＰＩＣ）１ｍｇを得た。
するが、本発明はこれらによって限定されるものではな
い。 実施例１ （１）抗原ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビ
ター複合体の作製 １００ｍｌのヒト血漿（健常人）に、ウロキナーゼ（Ｊ
ＣＲ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を１００
０Ｉ．Ｕ．／ｍｌとなるように添加し、２５℃で１時間
保温した。１時間後にフルオロリン酸ジイソプロピル
（和光純薬社製）を１ｍＭ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（和光
純薬社製）を１０００Ｕ／ｍｌ、ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ
ｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を５ｍＭとなるように添加し、２
５℃で１時間保温し、反応を停止した。このウロキナー
ゼ処理血漿をトリス０．０５Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍ、
ｐＨ７．４緩衝液（以下、「ＴＢＳ」という）で平衡化
したリジン−セファロース４Ｂカラム（３０ｍｌベッド
容）に通し、ＴＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．０２
５Ｍ ＥＡＣＡ含有ＴＢＳでヒトプラスミン−α２−プ
ラスミンインヒビター複合体を溶出させ、イオン交換ク
ロマト法（ＤＥＡＥ−セファロースカラム）で精製し
て、ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複
合体（ヒトＰＩＣ）１ｍｇを得た。
【００１３】（２）ラテックス試薬の調製 ２．５ｍｇの抗ヒトプラスミノーゲンモノクローナル抗
体（（株）コスモバイオより入手）と２．５ｍｇの抗ヒ
トα２−プラスミンインヒビターモノクローナル抗体
（（株）コスモバイオより入手）を、０．１Ｍグリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）で０．５％（ｖ／ｖ）
になるように調製した粒径０．１２μｍのポリスチレン
ラテックス（積水化学社製）５ｍｌに添加し、３７℃で
１時間攪拌した。混合物を１５０００ｒｐｍで３０分間
遠心分離した。０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム
を含有する０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
８．５）５ｍｌを残渣に添加し、超音波でよく分散させ
てＰＩＣ測定用ラテックス試薬を得た。
体（（株）コスモバイオより入手）と２．５ｍｇの抗ヒ
トα２−プラスミンインヒビターモノクローナル抗体
（（株）コスモバイオより入手）を、０．１Ｍグリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）で０．５％（ｖ／ｖ）
になるように調製した粒径０．１２μｍのポリスチレン
ラテックス（積水化学社製）５ｍｌに添加し、３７℃で
１時間攪拌した。混合物を１５０００ｒｐｍで３０分間
遠心分離した。０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム
を含有する０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
８．５）５ｍｌを残渣に添加し、超音波でよく分散させ
てＰＩＣ測定用ラテックス試薬を得た。
【００１４】（３）ＥＡＣＡまたはＡＭＣＨＡを含有す
るか含有しない検体希釈用緩衝液の調製 表１に示す通りの組成の、７種の検体希釈用緩衝液を調
製した。
るか含有しない検体希釈用緩衝液の調製 表１に示す通りの組成の、７種の検体希釈用緩衝液を調
製した。
【００１５】
【表１】
【００１６】（４）標準抗原および検体の調製 （１）で得られたヒトＰＩＣを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを
含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
または正常血漿で４０、２０、１０、５および２．５μ
ｇ／ｍｌに希釈し標準抗原とした。また、３人のＤＩＣ
患者の血漿を検体とした。
含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
または正常血漿で４０、２０、１０、５および２．５μ
ｇ／ｍｌに希釈し標準抗原とした。また、３人のＤＩＣ
患者の血漿を検体とした。
【００１７】（５）測定 標準抗原または検体５μｌと、（３）で調製したＥＡＣ
ＡもしくはＡＭＣＨＡを含有するか含有しない検体希釈
用緩衝液１〜７それぞれ２００μｌとを混合し、５分後
に、該ＰＩＣ測定用ラテックス試薬５０μｌを添加混合
し、５分間反応させた。この操作は自動分析装置（日立
社製７１５０形）で行い、２ポイント法（２７−５０）
による吸光度（５７０ｎｍ）変化を測定した。各標準抗
原の検量線を図１および２に示す。図１のそれぞれの検
量線から検体のＰＩＣ濃度を求めた。また、参考例とし
て同じ検体をＰＩＣ測定用ＥＩＡキット（帝人社製）で
測定した。結果を表２に示す。
ＡもしくはＡＭＣＨＡを含有するか含有しない検体希釈
用緩衝液１〜７それぞれ２００μｌとを混合し、５分後
に、該ＰＩＣ測定用ラテックス試薬５０μｌを添加混合
し、５分間反応させた。この操作は自動分析装置（日立
社製７１５０形）で行い、２ポイント法（２７−５０）
による吸光度（５７０ｎｍ）変化を測定した。各標準抗
原の検量線を図１および２に示す。図１のそれぞれの検
量線から検体のＰＩＣ濃度を求めた。また、参考例とし
て同じ検体をＰＩＣ測定用ＥＩＡキット（帝人社製）で
測定した。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】図１および２、および表１および２から分
かるごとく、緩衝液にＥＡＣＡまたはＡＭＣＨＡを１ｍ
Ｍ以上添加した場合と添加しなかった場合とを比較する
と、添加した緩衝液において、非特異的結合が減少し、
ＥＩＡ法と同様正確に定量された。
かるごとく、緩衝液にＥＡＣＡまたはＡＭＣＨＡを１ｍ
Ｍ以上添加した場合と添加しなかった場合とを比較する
と、添加した緩衝液において、非特異的結合が減少し、
ＥＩＡ法と同様正確に定量された。
【００２０】実施例２ （１）で得られたヒトＰＩＣを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを
含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で希釈した希釈液（ＰＩＣ ２０μｇ／ｍｌまたは２μ
ｇ／ｍｌ含有）に、ＰＩＣ測定法において影響を受ける
と思われるヒトプラスミノーゲン（（株）コスモバイオ
より入手）（図４、および図６〜１１では単にＰＬＧと
表示）またはヒトα２−プラスミンインヒビター
（（株）コスモバイオより入手）（図３および５では単
にα２Ｐ１と表示）を図３〜１１に示す種々の濃度とな
るように添加したものを検体とし、検体中のヒトＰＩＣ
を実施例１と同様の操作で、表１に示した、ＥＡＣＡも
しくはＡＭＣＨＡを含有するか含有しない検体希釈用緩
衝液１〜７を用いて測定した。結果を図３〜１１に示
す。図３と図５においてヒトα２−プラスミンインヒビ
ターの影響は、ＥＡＣＡの添加するしないに拘らず、
影響がなかったので、３以降の緩衝液については実施し
ていない。また、ヒトプラスミノーゲンの影響は、緩衝
液３、４、６および７（それぞれ図７、８、１０および
１１に対応）は影響をほとんど受けなかったが、それ以
外の緩衝液では、ヒトプラスミノーゲン濃度依存的に非
特異凝集が認められた。
含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で希釈した希釈液（ＰＩＣ ２０μｇ／ｍｌまたは２μ
ｇ／ｍｌ含有）に、ＰＩＣ測定法において影響を受ける
と思われるヒトプラスミノーゲン（（株）コスモバイオ
より入手）（図４、および図６〜１１では単にＰＬＧと
表示）またはヒトα２−プラスミンインヒビター
（（株）コスモバイオより入手）（図３および５では単
にα２Ｐ１と表示）を図３〜１１に示す種々の濃度とな
るように添加したものを検体とし、検体中のヒトＰＩＣ
を実施例１と同様の操作で、表１に示した、ＥＡＣＡも
しくはＡＭＣＨＡを含有するか含有しない検体希釈用緩
衝液１〜７を用いて測定した。結果を図３〜１１に示
す。図３と図５においてヒトα２−プラスミンインヒビ
ターの影響は、ＥＡＣＡの添加するしないに拘らず、
影響がなかったので、３以降の緩衝液については実施し
ていない。また、ヒトプラスミノーゲンの影響は、緩衝
液３、４、６および７（それぞれ図７、８、１０および
１１に対応）は影響をほとんど受けなかったが、それ以
外の緩衝液では、ヒトプラスミノーゲン濃度依存的に非
特異凝集が認められた。
【００２１】
【発明の効果】抗ヒトプラスミノーゲン抗体と抗ヒトα
２−プラスミンインヒビター抗体を用いてヒトＰＩＣを
免疫学的に測定するに際し、免疫反応系にＥＡＣＡおよ
びＡＭＣＨＡの少なくとも一つを存在させることによっ
て、非特異反応を抑制できる。
２−プラスミンインヒビター抗体を用いてヒトＰＩＣを
免疫学的に測定するに際し、免疫反応系にＥＡＣＡおよ
びＡＭＣＨＡの少なくとも一つを存在させることによっ
て、非特異反応を抑制できる。
【図１】希釈剤として、検体希釈用緩衝液１〜７（ＥＡ
ＣＡまたはＡＭＣＨＡを含有しないか種々の濃度で含有
する）を用いた場合の、標準抗原（実施例１の（１）で
得られたヒトＰＩＣを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する
０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で種々の
倍率に希釈したもの）の検量線である。
ＣＡまたはＡＭＣＨＡを含有しないか種々の濃度で含有
する）を用いた場合の、標準抗原（実施例１の（１）で
得られたヒトＰＩＣを１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する
０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で種々の
倍率に希釈したもの）の検量線である。
【図２】希釈剤として、検体希釈用緩衝液１〜７（ＥＡ
ＣＡまたはＡＭＣＨＡを含有しないか種々の濃度で含有
する）を用いた場合の、標準抗原（実施例１の（１）で
得られたヒトＰＩＣを正常血漿で種々の倍率に希釈した
もの）の検量線である。
ＣＡまたはＡＭＣＨＡを含有しないか種々の濃度で含有
する）を用いた場合の、標準抗原（実施例１の（１）で
得られたヒトＰＩＣを正常血漿で種々の倍率に希釈した
もの）の検量線である。
【図３】種々の濃度のヒトα２−プラスミンインヒビタ
ー存在下で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液１
（ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡ不含有）を用いて測定した
場合の測定結果を示す図である。
ー存在下で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液１
（ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡ不含有）を用いて測定した
場合の測定結果を示す図である。
【図４】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下で、
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液１（ＥＡＣＡおよ
びＡＭＣＨＡ不含有）を用いて測定した場合の測定結果
を示す図である。
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液１（ＥＡＣＡおよ
びＡＭＣＨＡ不含有）を用いて測定した場合の測定結果
を示す図である。
【図５】種々の濃度のヒトα２−プラスミンインヒビタ
ー存在下で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液２
（ＥＡＣＡ １ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定
結果を示す図である。
ー存在下で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液２
（ＥＡＣＡ １ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定
結果を示す図である。
【図６】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下で、
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液２（ＥＡＣＡ １
ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図で
ある。
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液２（ＥＡＣＡ １
ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図で
ある。
【図７】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下で、
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液３（ＥＡＣＡ ５
０ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図
である。
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液３（ＥＡＣＡ ５
０ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図
である。
【図８】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下で、
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液４（ＥＡＣＡ １
００ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す
図である。
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液４（ＥＡＣＡ １
００ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す
図である。
【図９】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下で、
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液５（ＡＭＣＨＡ
１ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図
である。
既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液５（ＡＭＣＨＡ
１ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を示す図
である。
【図１０】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下
で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液６（ＡＭＣＨ
Ａ ５０ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を
示す図である。
で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液６（ＡＭＣＨ
Ａ ５０ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果を
示す図である。
【図１１】種々の濃度のヒトプラスミノーゲン存在下
で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液７（ＡＭＣＨ
Ａ １００ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果
を示す図である。
で、既知濃度のＰＩＣを検体希釈用緩衝液７（ＡＭＣＨ
Ａ １００ｍＭ含有）を用いて測定した場合の測定結果
を示す図である。
図１および図２において、△ｍＡＢＳは５０ポイントで
の吸光度と２７ポイントでの吸光度の差を示し、１〜７
の番号は検体希釈用緩衝液の番号を示す。
の吸光度と２７ポイントでの吸光度の差を示し、１〜７
の番号は検体希釈用緩衝液の番号を示す。
フロントページの続き (72)発明者 近藤 績 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531
Claims (3)
- 【請求項１】 抗ヒトプラスミノーゲン抗体と抗ヒトα
２−プラスミンインヒビター抗体を用いて、ヒトプラス
ミン−α２−プラスミンインヒビター複合体を免疫学的
に測定するに際し、免疫反応の反応系にε−アミノカプ
ロン酸（以下ＥＡＣＡと略す）およびｔｒａｎｓ−４−
（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（以下ＡＭ
ＣＨＡと略す）の少なくとも一つを存在させることを特
徴とするヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ
ー複合体の免疫学的測定法。 - 【請求項２】 ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも
一つを０．１ｍＭ〜１Ｍ存在させることを特徴とする請
求項１記載の免疫学的測定法。 - 【請求項３】 ＥＡＣＡおよびＡＭＣＨＡの少なくとも
一つを含有してなる、ヒトプラスミン−α２−プラスミ
ンインヒビター複合体の免疫学的測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11973296A JP2890250B2 (ja) | 1996-04-17 | 1996-04-17 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定法および免疫学的測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11973296A JP2890250B2 (ja) | 1996-04-17 | 1996-04-17 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定法および免疫学的測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09281103A JPH09281103A (ja) | 1997-10-31 |
| JP2890250B2 true JP2890250B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=14768760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11973296A Expired - Fee Related JP2890250B2 (ja) | 1996-04-17 | 1996-04-17 | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定法および免疫学的測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2890250B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019026569A1 (ja) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | 藤倉化成株式会社 | 不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段 |
| JP6919499B2 (ja) | 2017-08-01 | 2021-08-18 | 藤倉化成株式会社 | 不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段 |
| CN117568445B (zh) * | 2024-01-18 | 2024-04-09 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
-
1996
- 1996-04-17 JP JP11973296A patent/JP2890250B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09281103A (ja) | 1997-10-31 |
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