JPH04369478A - ヒト顆粒球エラスターゼの免疫学的測定方法 - Google Patents
ヒト顆粒球エラスターゼの免疫学的測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、被測定検体中に遊離エ
ラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複合物が混在
する場合、被測定検体中のヒト顆粒球エラスターゼ量を
ヒト顆粒球エラスターゼの総量として正確に測定する方
法に係わる。 【０００２】 【従来の技術とその課題】ヒト顆粒球は生体防御機構の
最前線にあり、侵襲のごく早期に局所に集積しプロテア
ーゼや活性酸素を産生して、異物や細菌の分解、変性、
殺菌を行う。産生されるプロテアーゼのなかでもエラス
ターゼは最も強力な作用を有し、生体防御の中心的な存
在であるが、一方、本酵素の基質特異性は低く、種々の
結合組織成分（エラスチン、コラーゲン、プロテオグリ
カン等）をも分解し、生体側の組織、構成蛋白の消化、
変性などによって組織破壊をも同時に惹起する。 【０００３】通常、生体は侵襲を受けていない組織を本
酵素による強力な消化作用から護るため血液中に多量の
α１ −アンチトリプシン等のインヒビターを備えてお
り、侵襲局所に集積した顆粒球より放出されたエラスタ
ーゼが循環する血液により生体中に拡散されても直ちに
エラスターゼ／インヒビター複合物を形成することよっ
てエラスターゼ活性を不活性化し、必要以上の組織破壊
を防いでいる。 【０００４】この様な働きをなすヒト顆粒球エラスター
ゼの測定は、炎症の診断や慢性炎症の原因追及、治療効
果や予後の判定に非常に有用とされ、血液中の顆粒球エ
ラスターゼ量を免疫学的に測定するための方法が、特許
出願公開昭５７−５５１号に開示されている。同法は、
血液中に存在するエラスターゼ／インヒビター複合物を
、第一抗体としてヒト顆粒球エラスターゼに対する抗体
、第二抗体としてインヒビターに対する酵素標識抗体を
使用して測定するものであった。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら同法はエ
ラスターゼ／インヒビター複合物のみを測定するもので
あるため、被測定検体として放出されたヒト顆粒球エラ
スターゼがエラスターゼ／インヒビター複合物としての
み存在する循環血液を用いる場合には適すが、存在する
インヒビターの量が少なく遊離エラスターゼとエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物が混在する炎症組織粘液等を
検体として測定する場合には、正確なヒト顆粒球エラス
ターゼ量を知ることができないという問題点があった。 【０００６】また、第一抗体としてヒト顆粒球エラスタ
ーゼに対する抗体、第二抗体として酵素標識したヒト顆
粒球エラスターゼに対する抗体を使用して免疫学的に測
定した場合においても、同抗体の遊離エラスターゼに対
する反応性とエラスターゼ／インヒビター複合物に対す
る反応性が異なることから正確なヒト顆粒球エラスター
ゼ量を知ることができないという問題点があった。 【０００７】以上のような現状に鑑み本発明者らは遊離
エラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複合物が混
在する検体を測定する場合においても、正確なヒト顆粒
球エラスターゼ量を測定できるよう鋭意研究した結果、
本発明を完成させた。 【０００８】 【課題を解決するための手段及び方法】本発明によれば
、従来法の課題を解決するために、遊離エラスターゼと
エラスターゼ／インヒビター複合物を含む検体を遊離エ
ラスターゼと結合するインヒビターを含む緩衝液により
希釈し、その過程において遊離エラスターゼをエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物に変換させ、すでに存在して
いたエラスターゼ／インヒビター複合物との総量として
、免疫法を用い測定することにより達成される。 【０００９】この測定法の実施において用いることので
きる遊離エラスターゼと結合するインヒビターとして、
ヒトα１ −アンチトリプシン、ヒトα１ −アンチト
リプシンを含むヒト血清あるいは血漿、ヒトα１ −ア
ンチトリプシンと同様の結合様式にて結合し、エラスタ
ーゼ活性を阻害する物質を含む動物血清あるいは血漿、
ヒトα１ −アンチトリプシンと同様の結合様式にて結
合し、エラスターゼ活性を阻害する合成物質を使用する
ことができる。 【００１０】 【発明の効果】本発明によれば、遊離エラスターゼとエ
ラスターゼ／インヒビター複合物が混在する検体を測定
する場合においても、正確なエラスターゼ量を測定する
ことができ、臨床の場に正確な判断情報を提供すること
が可能となる。 【００１１】たとえば、存在するインヒビター量が少な
く、遊離エラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複
合物が混在する妊婦子宮頸管粘液を検体として用いた場
合、その顆粒球エラスターゼ量を正確に知ることにより
切迫早産、早産、前期破水の予知、予防が可能となる。 つまり、切迫早産、早産あるいは前期破水の原因の一つ
に絨毛羊膜炎があるが、これは子宮頸管の炎症の上行性
波及により発生するとされているため、子宮頸管の炎症
の有無を、感染による生体防御のため顆粒球から放出さ
れるエラスターゼ量をパラメーターとして知ることによ
り、早期に感染あるいは炎症の治療を施すことが可能と
なり炎症の上行波及を防ぐことができるためである。 【００１２】また、喀痰あるいは気管支肺胞洗浄液も存
在するインヒビター量が少なく遊離エラスターゼとエラ
スターゼ／インヒビター複合物が混在する検体であるが
、喀痰あるいは気管支肺胞洗浄液中のエラスターゼ量を
知ることによりエラスターゼが原因となる慢性気道疾患
を基礎とした慢性、反復性気道感染症や肺気腫等の存在
を知ることができ、早期に適切な治療を施すことが可能
となる。 【００１３】以下に本発明を更に詳細に説明するための
実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。 【００１４】 【実施例】１）遊離エラスターゼにα１ −アンチトリ
プシンを含んだヒト血清、ヒトα１ −アンチトリプシ
ンと同様の効果を有す物質を含むヒツジ血清、同じくウ
サギ血清を添加した場合の効果 【００１５】遊離エラスターゼを、ヒト血清、ヒツジ血
清、ウサギ血清をそれぞれ ０， ０．０５， ０．１
， ０．２， ０．５， １．０ ％含んだ １０ ｍ
Ｍ， ｐＨ ７．４のリン酸／生理食塩水緩衝液（以下
ＰＢＳ）にて ５００ ｎｇ／ｍｌ（酵素活性として
２２．４ Ｕ／ｌ ）となるよう希釈調整した後、それ
らを被測定検体として、顆粒球エラスターゼに特異的に
反応する合成基質テストチームＳ−２４８４（第一化学
）（以下Ｓ−２４８４）を用いその酵素活性を測定した
（ Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎ
ｖｅｓｔ．， ４３， ４２７， １９８３）。すなわ
ち上記検体を８０μｌ と ０．４ Ｍ 塩化ナトリ
ウムと ０．１２５ ％の牛血清アルブミン（ベーリン
ガー）（以下ＢＳＡ）を含む ０．０５ Ｍ ，ｐＨ
８．３ トリス塩酸緩衝液（以下 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液）を６４０μｌ 加え３７℃、５分インキュベー
トした後、６ ｍＭ のＳ−２４８４を８０μｌ 加え
３７℃、３分インキュベートさせ、次いで５０％酢酸を
１６０μｌ 加え反応を停止させた。なお、検体ブラン
クとして５０％酢酸をＳ−２４８４の先に添加し、３７
℃、３分のインキュベートを省略したものも用意した。 これをバイオラッド社マイクロプレートリーダー（Ｍｏ
ｄｅｌ ４５０）にて４０５ ｎｍ における吸光度を
測定した。 【００１６】表１、図１は、各種血清添加量とエラスタ
ーゼ活性阻害率を示したものであり、ヒツジ血清、ウサ
ギ血清はα１ −アンチトリプシンを含むヒト血清と同
様遊離エラスターゼに対するインヒビターとして作用し
、エラスターゼ／インヒビター複合物を形成することに
よりエラスターゼの酵素活性を阻害することが判明した
。 また、酵素活性の阻害率は添加量に応じて上昇し、ヒト
血清については ０．１ ％ 、ヒツジ血清、ウサギ
血清については １．０ ％添加することでほぼ完全に
阻害することがわかった。 【００１７】表１：添加したヒト血清、ヒツジ血清、ウ
サギ血清のエラスターゼ活性阻害率 【００１８】２）ヒト血清添加により得られたエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物の反応性 【００１９】遊離エラスターゼを、インヒビターとして
のα１ −アンチトリプシンを含むヒト血清を ０．０
， ０．０１， ０．０５， ０．１， ０．２ ％含
むよう調整したＰＢＳにて ０．０，０．２， ０．８
， ３．２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したもの
を各 ５０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗
体（バインディングサイト社）を感作したマイクロプレ
ート（コースター社）に添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキシエ
チレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）
を含むＰＢＳにて十分洗浄し、次いでペルオキシダーゼ
（以下ＰＯＤ）標識した抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツ
ジ抗体（バインディングサイト社）溶液を ５０ μｌ
添加し３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．
５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄する。これに１ ｍ
ｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣｌ（和光純
薬）（以下ＯＰＤ），０．０５％の過酸化水素水（三菱
瓦斯）を含む ｐＨ ５．５， ０．１ Ｍクエン酸／
０．２ Ｍ リン酸２ナトリウム緩衝液（以下 ＭｃＩ
ｒｖｅｉｎ 緩衝液）を １００μｌ添加し、室温にて
１０ 分間反応後、３ Ｎ 硫酸（和光純薬）を １
００μｌ添加し反応を停止させる。その発色程度をバイ
オラッド社マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ４
５０）にて ４９０ｎｍ における吸光度として測定し
た。 【００２０】表２、図２は、遊離エラスターゼにヒト血
清を添加することにより得られたエラスターゼ／インヒ
ビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する
反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆粒
球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反応
性は、遊離エラスターゼよりもヒト血清添加により変換
されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良いこ
とが判明した。また、添加するヒト血清の量に応じて変
換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量は増加
するが、 ０．１ ％のヒト血清の添加によりエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物への変換は終了することが判
明した。 【００２１】表２：ヒト血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 ヒト血清 ｅｌａｓｔ
ａｓｅ 吸光度 吸光度差
添加量（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ）
４９０ｎｍ ４９０ｎｍ
０．０ ０．０
０．１１９
０．２
０．１５６ ０．０３７
０．８
０．３０８ ０．１８
９
３．２ ０．８３４
０．７１５ ０．０１
０．０ ０．１２
３
０．２ ０．１８３
０．０６０
０．８ ０．３３
６ ０．２１３
３．２
０．９６８ ０．８４５
０．０５ ０．０
０．１６３
０．２
０．２３４ ０．０７１
０．８
０．４２６ ０．２６３
３．２ １．１１４
０．９５１ ０．１
０．０ ０．２１１
０．２ ０．２８４
０．０７３
０．８ ０．５２０
０．３０９
３．２
１．２１０ ０．９９９
０．２ ０．０
０．３０６
０．２
０．３８７ ０．０８１
０．８
０．６０１ ０．２９５
３．２ １．３０８
１．００２ 【００２２】３）ヒツジ血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 【００２３】遊離エラスターゼを、ヒツジ血清を ０．
０， ０．１， １．０， ５．０ ％ 含むよう調整
したＰＢＳにて ０．０， ０．２， ０．８， ３．
２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したものを各 ５
０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作
したマイクロプレートに添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後 ０．５ ％のポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳに
て十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラ
スターゼヒツジ抗体溶液を５０ μｌ 添加し３７℃、
１時間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキ
シエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰ
ＢＳにて十分洗浄する。 これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸
化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００
μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫
酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。 その発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダ
ー（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍ におけ
る吸光度として測定した。 【００２４】表３、図３は、遊離エラスターゼにヒツジ
血清を添加することにより得られたエラスターゼ／イン
ヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対す
る反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆
粒球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反
応性は、遊離エラスターゼよりもヒツジ血清添加により
変換されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良
いことが判明した。また、添加するヒツジ血清の量に応
じて変換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量
は増加するが、 １．０ ％のヒツジ血清の添加により
エラスターゼ／インヒビター複合物への変換は終了する
ことが判明した。 【００２５】表３：ヒツジ血清添加により得られたエラ
スターゼ／インヒビター複合物の反応性
ヒツジ血清 ｅｌａｓｔａｓｅ
吸光度 吸光度差 添加量
（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ） ４９０ｎｍ
４９０ｎｍ
０．０
０．０ ０．１６２
０．
２ ０．２１０ ０．０
４８
０．８
０．３３４ ０．１７２
３．２
０．８８９ ０．７２７
０．１
０．０ ０．１４４
０．２ ０．２１３
０．０６９
０．
８ ０．４０２ ０．２
５８
３．２
１．０３３ ０．８８９
１
．０ ０．０
０．１５７
０．２ ０．２４４
０．０８７
０．８ ０．４９２
０．３３５
３．
２ １．１５８ １．０
０１
５．０ ０．０
０．１５８
０．２ ０
．２４６ ０．０８８
０．８
０．４９０ ０．３３２
３
．２ １．１５６ ０．
９９８ 【００２６】４）ウサギ血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 【００２７】遊離エラスターゼを、ウサギ血清を ０．
０， ０．１， １．０， ５．０ ％ 含むよう調整
したＰＢＳにて ０．０， ０．２， ０．８， ３．
２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したものを各 ５
０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作
したマイクロプレートに添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後 ０．５ ％のポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳに
て十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラ
スターゼヒツジ抗体溶液を５０ μｌ 添加し３７℃、
１時間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキ
シエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰ
ＢＳにて十分洗浄する。 これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸
化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００
μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫
酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。 その発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダ
ー（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍ におけ
る吸光度として測定した。 【００２８】表４、図４は、遊離エラスターゼにウサギ
血清を添加することにより得られたエラスターゼ／イン
ヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対す
る反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆
粒球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反
応性は、遊離エラスターゼよりもウサギ血清添加により
変換されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良
いことが判明した。また、添加するウサギ血清の量に応
じて変換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量
は増加するが、 １．０ ％のウサギ血清の添加により
エラスターゼ／インヒビター複合物への変換は終了する
ことが判明した。 【００２９】表４：ウサギ血清添加により得られたエラ
スターゼ／インヒビター複合物の反応性
ウサギ血清 ｅｌａｓｔａｓｅ
吸光度 吸光度差 添加量
（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ） ４９０ｎｍ
４９０ｎｍ
０．０
０．０ ０．１６２
０．２
０．２１０ ０．０４
８
０．８
０．３３４ ０．１７２
３．２ ０
．８８９ ０．７２７
０．１
０．０ ０．１４１
０．２ ０．２０７
０．０６６
０．８
０．４０１ ０．２６
０
３．２
０．９８５ ０．８４４
１．
０ ０．０ ０
．１３６
０．２ ０．２３３
０．０９７
０．８ ０．４９６
０．３６０
３．２
１．１９８ １．０６
２
５．０ ０．０
０．１３８
０．
２ ０．２３５ ０．０
９７
０．８ ０．５０１
０．３６３
３．２ １．２
０５ １．０６７ 【００３０】５）インヒビターとしてのα１ −アンチ
トリプシン、ヒト血清、ヒツジ血清、ウサギ血清の比較
【００３１】遊離エラスターゼを、α１ −アンチトリ
プシン ２．０ μｇ／ｍｌ、ヒト血清 ０．１％、
ヒツジ血清を １．０ ％、ウサギ血清を １．０ ％
含むよう調整した各ＰＢＳと何も含まないＰＢＳにて
０．０， ０．２， ０．８， ３．２ ｎｇ／ｍｌ
になるよう希釈調整したものを各 ５０ μｌ 抗ヒト
顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作したマイクロプレ
ートに添加する。これを３７℃、１時間インキュベート
した後 ０．５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄し、次
いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗
体溶液を ５０ μｌ 添加し３７℃、１時間インキュ
ベートした後、 ０．５ ％のポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて十分洗
浄する。これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５
％の過酸化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を
１００μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３
Ｎ 硫酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。そ
の発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダー
（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍにおける吸
光度として測定した。 【００３２】表５、図５は、遊離エラスターゼに、α１
−アンチトリプシン ２．０ μｇ／ｍｌ、ヒト血
清 ０．１ ％、ヒツジ血清を １．０ ％、ウサギ血
清を １．０ ％添加することにより得られたエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ
抗体に対する反応性を吸光度変化により示したものであ
る。各種血清添加により得られたエラスターゼ／インヒ
ビター複合物の反応性は、上記量にて添加される限り血
清の種類に関係なく、α１ −アンチトリプシン ２．
０ μｇ／ｍｌを添加したものとほぼ同等であること
が判明した。 【００３３】表５：インヒビターとしてのα１ −アン
チトリプシン、ヒト血清、ヒツジ血清、ウサギ血清の比
較 添加物 添加量
ｅｌａｓｔａｓｅ 吸光度
吸光度差
濃度（ｎｇ／ｍｌ）
４９０ｎｍ ４９０ｎｍ 無
添加 無添加
０．０ ０．１１９
０．２ ０．１５６
０．０３７
０．８
０．３０８ ０．１８９
３．２ ０．８３
４ ０．７１５ α１ −アン
２．０ μｇ／ｍｌ ０．０
０．１２３ チトリプシン
０．２
０．２０６ ０．０８３
０．８ ０．４１
８ ０．２９５
３．２ １．１６３ １
．０４０ ヒト血清 ０．１
％ ０．０ ０
．２１１
０．２
０．２８４ ０．０７３
０．８ ０．５００
０．２８９
３．２ １．１９０ ０．９
７９ ヒツジ血清 １．０ ％
０．０ ０．１５
７
０．２
０．２４４ ０．０８７
０．８ ０．４９２
０．３３５
３．２
１．１５８ １．００１
ウサギ血清 １．０ ％
０．０ ０．１３６
０．２ ０．２
３３ ０．０９７
０．８ ０．４９６
０．３６０
３．２
１．１９８ １．０６２ 【００３４】５）子宮頸管擦過検体中顆粒球エラスター
ゼの免疫学的測定妊婦子宮頸管の粘液を綿棒（アボット
社）にて採取し、これをＰＢＳ １ ｍｌに浸し十分攪
拌した後、 １０００ ｒｐｍ で５分間遠心しその上
清を測定用検体とする。 【００３５】測定に際しては、上記検体を １．０ ％
ヒツジ血清を含むＰＢＳにて５００ 倍希釈し、こ
れを抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作したマ
イクロプレートに ５０ μｌ 添加する。同時に標準
直線作成用として ０．２， ０．４， ０．８， １
．６， ３．２ ｎｇ／ｍｌの遊離エラスターゼ標準液
を同様の検体希釈液にて調整し、各 ５０ μｌ を検
体を添加した同じマイクロプレートに添加する。これを
３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．５ ％の
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
を含むＰＢＳにて十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗
ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体溶液を ５０ μｌ
添加し３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．
５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄する。これに １
ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸化水素水を含
む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００μｌ 添加し
、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫酸を１００
μｌ 添加し反応を停止させる。その発色程度をバイオ
ラッド社マイクロプレートリーダー （Ｍｏｄｅｌ ４
５０）にて ４９０ ｎｍ における吸光度として測定
し、標準液の吸光度と検体の吸光度から検体のエラスタ
ーゼ濃度を知ることができた。表５はその結果を示した
ものである。 【００３６】表６：子宮頸管粘液を検体として測定した
結果 ［子宮頸管粘液の測定結果］
吸光度 ｅｌａｓｔａｓｅ濃度 臨床症状
検体 Ｎｏ．
（４９０ｎｍ） （ｎｇ／ｍｌ）
１
０．６１２ １．３
１ 切迫早産
２ ０．１９０
０．１５ 正常
３ ０．２９
７ ０．４４ 正常
４
０．７２２ １．６１
切迫早産 ５
０．２３８ ０．２７
正常 【００３７】
ラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複合物が混在
する場合、被測定検体中のヒト顆粒球エラスターゼ量を
ヒト顆粒球エラスターゼの総量として正確に測定する方
法に係わる。 【０００２】 【従来の技術とその課題】ヒト顆粒球は生体防御機構の
最前線にあり、侵襲のごく早期に局所に集積しプロテア
ーゼや活性酸素を産生して、異物や細菌の分解、変性、
殺菌を行う。産生されるプロテアーゼのなかでもエラス
ターゼは最も強力な作用を有し、生体防御の中心的な存
在であるが、一方、本酵素の基質特異性は低く、種々の
結合組織成分（エラスチン、コラーゲン、プロテオグリ
カン等）をも分解し、生体側の組織、構成蛋白の消化、
変性などによって組織破壊をも同時に惹起する。 【０００３】通常、生体は侵襲を受けていない組織を本
酵素による強力な消化作用から護るため血液中に多量の
α１ −アンチトリプシン等のインヒビターを備えてお
り、侵襲局所に集積した顆粒球より放出されたエラスタ
ーゼが循環する血液により生体中に拡散されても直ちに
エラスターゼ／インヒビター複合物を形成することよっ
てエラスターゼ活性を不活性化し、必要以上の組織破壊
を防いでいる。 【０００４】この様な働きをなすヒト顆粒球エラスター
ゼの測定は、炎症の診断や慢性炎症の原因追及、治療効
果や予後の判定に非常に有用とされ、血液中の顆粒球エ
ラスターゼ量を免疫学的に測定するための方法が、特許
出願公開昭５７−５５１号に開示されている。同法は、
血液中に存在するエラスターゼ／インヒビター複合物を
、第一抗体としてヒト顆粒球エラスターゼに対する抗体
、第二抗体としてインヒビターに対する酵素標識抗体を
使用して測定するものであった。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら同法はエ
ラスターゼ／インヒビター複合物のみを測定するもので
あるため、被測定検体として放出されたヒト顆粒球エラ
スターゼがエラスターゼ／インヒビター複合物としての
み存在する循環血液を用いる場合には適すが、存在する
インヒビターの量が少なく遊離エラスターゼとエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物が混在する炎症組織粘液等を
検体として測定する場合には、正確なヒト顆粒球エラス
ターゼ量を知ることができないという問題点があった。 【０００６】また、第一抗体としてヒト顆粒球エラスタ
ーゼに対する抗体、第二抗体として酵素標識したヒト顆
粒球エラスターゼに対する抗体を使用して免疫学的に測
定した場合においても、同抗体の遊離エラスターゼに対
する反応性とエラスターゼ／インヒビター複合物に対す
る反応性が異なることから正確なヒト顆粒球エラスター
ゼ量を知ることができないという問題点があった。 【０００７】以上のような現状に鑑み本発明者らは遊離
エラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複合物が混
在する検体を測定する場合においても、正確なヒト顆粒
球エラスターゼ量を測定できるよう鋭意研究した結果、
本発明を完成させた。 【０００８】 【課題を解決するための手段及び方法】本発明によれば
、従来法の課題を解決するために、遊離エラスターゼと
エラスターゼ／インヒビター複合物を含む検体を遊離エ
ラスターゼと結合するインヒビターを含む緩衝液により
希釈し、その過程において遊離エラスターゼをエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物に変換させ、すでに存在して
いたエラスターゼ／インヒビター複合物との総量として
、免疫法を用い測定することにより達成される。 【０００９】この測定法の実施において用いることので
きる遊離エラスターゼと結合するインヒビターとして、
ヒトα１ −アンチトリプシン、ヒトα１ −アンチト
リプシンを含むヒト血清あるいは血漿、ヒトα１ −ア
ンチトリプシンと同様の結合様式にて結合し、エラスタ
ーゼ活性を阻害する物質を含む動物血清あるいは血漿、
ヒトα１ −アンチトリプシンと同様の結合様式にて結
合し、エラスターゼ活性を阻害する合成物質を使用する
ことができる。 【００１０】 【発明の効果】本発明によれば、遊離エラスターゼとエ
ラスターゼ／インヒビター複合物が混在する検体を測定
する場合においても、正確なエラスターゼ量を測定する
ことができ、臨床の場に正確な判断情報を提供すること
が可能となる。 【００１１】たとえば、存在するインヒビター量が少な
く、遊離エラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複
合物が混在する妊婦子宮頸管粘液を検体として用いた場
合、その顆粒球エラスターゼ量を正確に知ることにより
切迫早産、早産、前期破水の予知、予防が可能となる。 つまり、切迫早産、早産あるいは前期破水の原因の一つ
に絨毛羊膜炎があるが、これは子宮頸管の炎症の上行性
波及により発生するとされているため、子宮頸管の炎症
の有無を、感染による生体防御のため顆粒球から放出さ
れるエラスターゼ量をパラメーターとして知ることによ
り、早期に感染あるいは炎症の治療を施すことが可能と
なり炎症の上行波及を防ぐことができるためである。 【００１２】また、喀痰あるいは気管支肺胞洗浄液も存
在するインヒビター量が少なく遊離エラスターゼとエラ
スターゼ／インヒビター複合物が混在する検体であるが
、喀痰あるいは気管支肺胞洗浄液中のエラスターゼ量を
知ることによりエラスターゼが原因となる慢性気道疾患
を基礎とした慢性、反復性気道感染症や肺気腫等の存在
を知ることができ、早期に適切な治療を施すことが可能
となる。 【００１３】以下に本発明を更に詳細に説明するための
実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるも
のではない。 【００１４】 【実施例】１）遊離エラスターゼにα１ −アンチトリ
プシンを含んだヒト血清、ヒトα１ −アンチトリプシ
ンと同様の効果を有す物質を含むヒツジ血清、同じくウ
サギ血清を添加した場合の効果 【００１５】遊離エラスターゼを、ヒト血清、ヒツジ血
清、ウサギ血清をそれぞれ ０， ０．０５， ０．１
， ０．２， ０．５， １．０ ％含んだ １０ ｍ
Ｍ， ｐＨ ７．４のリン酸／生理食塩水緩衝液（以下
ＰＢＳ）にて ５００ ｎｇ／ｍｌ（酵素活性として
２２．４ Ｕ／ｌ ）となるよう希釈調整した後、それ
らを被測定検体として、顆粒球エラスターゼに特異的に
反応する合成基質テストチームＳ−２４８４（第一化学
）（以下Ｓ−２４８４）を用いその酵素活性を測定した
（ Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎ
ｖｅｓｔ．， ４３， ４２７， １９８３）。すなわ
ち上記検体を８０μｌ と ０．４ Ｍ 塩化ナトリ
ウムと ０．１２５ ％の牛血清アルブミン（ベーリン
ガー）（以下ＢＳＡ）を含む ０．０５ Ｍ ，ｐＨ
８．３ トリス塩酸緩衝液（以下 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液）を６４０μｌ 加え３７℃、５分インキュベー
トした後、６ ｍＭ のＳ−２４８４を８０μｌ 加え
３７℃、３分インキュベートさせ、次いで５０％酢酸を
１６０μｌ 加え反応を停止させた。なお、検体ブラン
クとして５０％酢酸をＳ−２４８４の先に添加し、３７
℃、３分のインキュベートを省略したものも用意した。 これをバイオラッド社マイクロプレートリーダー（Ｍｏ
ｄｅｌ ４５０）にて４０５ ｎｍ における吸光度を
測定した。 【００１６】表１、図１は、各種血清添加量とエラスタ
ーゼ活性阻害率を示したものであり、ヒツジ血清、ウサ
ギ血清はα１ −アンチトリプシンを含むヒト血清と同
様遊離エラスターゼに対するインヒビターとして作用し
、エラスターゼ／インヒビター複合物を形成することに
よりエラスターゼの酵素活性を阻害することが判明した
。 また、酵素活性の阻害率は添加量に応じて上昇し、ヒト
血清については ０．１ ％ 、ヒツジ血清、ウサギ
血清については １．０ ％添加することでほぼ完全に
阻害することがわかった。 【００１７】表１：添加したヒト血清、ヒツジ血清、ウ
サギ血清のエラスターゼ活性阻害率 【００１８】２）ヒト血清添加により得られたエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物の反応性 【００１９】遊離エラスターゼを、インヒビターとして
のα１ −アンチトリプシンを含むヒト血清を ０．０
， ０．０１， ０．０５， ０．１， ０．２ ％含
むよう調整したＰＢＳにて ０．０，０．２， ０．８
， ３．２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したもの
を各 ５０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗
体（バインディングサイト社）を感作したマイクロプレ
ート（コースター社）に添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキシエ
チレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬）
を含むＰＢＳにて十分洗浄し、次いでペルオキシダーゼ
（以下ＰＯＤ）標識した抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツ
ジ抗体（バインディングサイト社）溶液を ５０ μｌ
添加し３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．
５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄する。これに１ ｍ
ｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン・２ＨＣｌ（和光純
薬）（以下ＯＰＤ），０．０５％の過酸化水素水（三菱
瓦斯）を含む ｐＨ ５．５， ０．１ Ｍクエン酸／
０．２ Ｍ リン酸２ナトリウム緩衝液（以下 ＭｃＩ
ｒｖｅｉｎ 緩衝液）を １００μｌ添加し、室温にて
１０ 分間反応後、３ Ｎ 硫酸（和光純薬）を １
００μｌ添加し反応を停止させる。その発色程度をバイ
オラッド社マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ ４
５０）にて ４９０ｎｍ における吸光度として測定し
た。 【００２０】表２、図２は、遊離エラスターゼにヒト血
清を添加することにより得られたエラスターゼ／インヒ
ビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する
反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆粒
球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反応
性は、遊離エラスターゼよりもヒト血清添加により変換
されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良いこ
とが判明した。また、添加するヒト血清の量に応じて変
換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量は増加
するが、 ０．１ ％のヒト血清の添加によりエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物への変換は終了することが判
明した。 【００２１】表２：ヒト血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 ヒト血清 ｅｌａｓｔ
ａｓｅ 吸光度 吸光度差
添加量（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ）
４９０ｎｍ ４９０ｎｍ
０．０ ０．０
０．１１９
０．２
０．１５６ ０．０３７
０．８
０．３０８ ０．１８
９
３．２ ０．８３４
０．７１５ ０．０１
０．０ ０．１２
３
０．２ ０．１８３
０．０６０
０．８ ０．３３
６ ０．２１３
３．２
０．９６８ ０．８４５
０．０５ ０．０
０．１６３
０．２
０．２３４ ０．０７１
０．８
０．４２６ ０．２６３
３．２ １．１１４
０．９５１ ０．１
０．０ ０．２１１
０．２ ０．２８４
０．０７３
０．８ ０．５２０
０．３０９
３．２
１．２１０ ０．９９９
０．２ ０．０
０．３０６
０．２
０．３８７ ０．０８１
０．８
０．６０１ ０．２９５
３．２ １．３０８
１．００２ 【００２２】３）ヒツジ血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 【００２３】遊離エラスターゼを、ヒツジ血清を ０．
０， ０．１， １．０， ５．０ ％ 含むよう調整
したＰＢＳにて ０．０， ０．２， ０．８， ３．
２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したものを各 ５
０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作
したマイクロプレートに添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後 ０．５ ％のポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳに
て十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラ
スターゼヒツジ抗体溶液を５０ μｌ 添加し３７℃、
１時間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキ
シエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰ
ＢＳにて十分洗浄する。 これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸
化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００
μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫
酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。 その発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダ
ー（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍ におけ
る吸光度として測定した。 【００２４】表３、図３は、遊離エラスターゼにヒツジ
血清を添加することにより得られたエラスターゼ／イン
ヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対す
る反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆
粒球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反
応性は、遊離エラスターゼよりもヒツジ血清添加により
変換されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良
いことが判明した。また、添加するヒツジ血清の量に応
じて変換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量
は増加するが、 １．０ ％のヒツジ血清の添加により
エラスターゼ／インヒビター複合物への変換は終了する
ことが判明した。 【００２５】表３：ヒツジ血清添加により得られたエラ
スターゼ／インヒビター複合物の反応性
ヒツジ血清 ｅｌａｓｔａｓｅ
吸光度 吸光度差 添加量
（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ） ４９０ｎｍ
４９０ｎｍ
０．０
０．０ ０．１６２
０．
２ ０．２１０ ０．０
４８
０．８
０．３３４ ０．１７２
３．２
０．８８９ ０．７２７
０．１
０．０ ０．１４４
０．２ ０．２１３
０．０６９
０．
８ ０．４０２ ０．２
５８
３．２
１．０３３ ０．８８９
１
．０ ０．０
０．１５７
０．２ ０．２４４
０．０８７
０．８ ０．４９２
０．３３５
３．
２ １．１５８ １．０
０１
５．０ ０．０
０．１５８
０．２ ０
．２４６ ０．０８８
０．８
０．４９０ ０．３３２
３
．２ １．１５６ ０．
９９８ 【００２６】４）ウサギ血清添加により得られたエラス
ターゼ／インヒビター複合物の反応性 【００２７】遊離エラスターゼを、ウサギ血清を ０．
０， ０．１， １．０， ５．０ ％ 含むよう調整
したＰＢＳにて ０．０， ０．２， ０．８， ３．
２ ｎｇ／ｍｌ になるよう希釈調整したものを各 ５
０ μｌ 抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作
したマイクロプレートに添加する。これを３７℃、１時
間インキュベートした後 ０．５ ％のポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳに
て十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラ
スターゼヒツジ抗体溶液を５０ μｌ 添加し３７℃、
１時間インキュベートした後、 ０．５ ％のポリオキ
シエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含むＰ
ＢＳにて十分洗浄する。 これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸
化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００
μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫
酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。 その発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダ
ー（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍ におけ
る吸光度として測定した。 【００２８】表４、図４は、遊離エラスターゼにウサギ
血清を添加することにより得られたエラスターゼ／イン
ヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対す
る反応性を吸光度変化により示したものであり、ヒト顆
粒球エラスターゼ抗体の顆粒球エラスターゼに対する反
応性は、遊離エラスターゼよりもウサギ血清添加により
変換されたエラスターゼ／インヒビター複合物の方が良
いことが判明した。また、添加するウサギ血清の量に応
じて変換されるエラスターゼ／インヒビター複合物の量
は増加するが、 １．０ ％のウサギ血清の添加により
エラスターゼ／インヒビター複合物への変換は終了する
ことが判明した。 【００２９】表４：ウサギ血清添加により得られたエラ
スターゼ／インヒビター複合物の反応性
ウサギ血清 ｅｌａｓｔａｓｅ
吸光度 吸光度差 添加量
（％） 濃度（ｎｇ／ｍｌ） ４９０ｎｍ
４９０ｎｍ
０．０
０．０ ０．１６２
０．２
０．２１０ ０．０４
８
０．８
０．３３４ ０．１７２
３．２ ０
．８８９ ０．７２７
０．１
０．０ ０．１４１
０．２ ０．２０７
０．０６６
０．８
０．４０１ ０．２６
０
３．２
０．９８５ ０．８４４
１．
０ ０．０ ０
．１３６
０．２ ０．２３３
０．０９７
０．８ ０．４９６
０．３６０
３．２
１．１９８ １．０６
２
５．０ ０．０
０．１３８
０．
２ ０．２３５ ０．０
９７
０．８ ０．５０１
０．３６３
３．２ １．２
０５ １．０６７ 【００３０】５）インヒビターとしてのα１ −アンチ
トリプシン、ヒト血清、ヒツジ血清、ウサギ血清の比較
【００３１】遊離エラスターゼを、α１ −アンチトリ
プシン ２．０ μｇ／ｍｌ、ヒト血清 ０．１％、
ヒツジ血清を １．０ ％、ウサギ血清を １．０ ％
含むよう調整した各ＰＢＳと何も含まないＰＢＳにて
０．０， ０．２， ０．８， ３．２ ｎｇ／ｍｌ
になるよう希釈調整したものを各 ５０ μｌ 抗ヒト
顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作したマイクロプレ
ートに添加する。これを３７℃、１時間インキュベート
した後 ０．５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄し、次
いでＰＯＤ標識した抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗
体溶液を ５０ μｌ 添加し３７℃、１時間インキュ
ベートした後、 ０．５ ％のポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳにて十分洗
浄する。これに １ ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５
％の過酸化水素水を含む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を
１００μｌ添加し、室温にて １０ 分間反応後、３
Ｎ 硫酸を １００μｌ添加し反応を停止させる。そ
の発色程度をバイオラッド社マイクロプレートリーダー
（Ｍｏｄｅｌ ４５０）にて ４９０ ｎｍにおける吸
光度として測定した。 【００３２】表５、図５は、遊離エラスターゼに、α１
−アンチトリプシン ２．０ μｇ／ｍｌ、ヒト血
清 ０．１ ％、ヒツジ血清を １．０ ％、ウサギ血
清を １．０ ％添加することにより得られたエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ
抗体に対する反応性を吸光度変化により示したものであ
る。各種血清添加により得られたエラスターゼ／インヒ
ビター複合物の反応性は、上記量にて添加される限り血
清の種類に関係なく、α１ −アンチトリプシン ２．
０ μｇ／ｍｌを添加したものとほぼ同等であること
が判明した。 【００３３】表５：インヒビターとしてのα１ −アン
チトリプシン、ヒト血清、ヒツジ血清、ウサギ血清の比
較 添加物 添加量
ｅｌａｓｔａｓｅ 吸光度
吸光度差
濃度（ｎｇ／ｍｌ）
４９０ｎｍ ４９０ｎｍ 無
添加 無添加
０．０ ０．１１９
０．２ ０．１５６
０．０３７
０．８
０．３０８ ０．１８９
３．２ ０．８３
４ ０．７１５ α１ −アン
２．０ μｇ／ｍｌ ０．０
０．１２３ チトリプシン
０．２
０．２０６ ０．０８３
０．８ ０．４１
８ ０．２９５
３．２ １．１６３ １
．０４０ ヒト血清 ０．１
％ ０．０ ０
．２１１
０．２
０．２８４ ０．０７３
０．８ ０．５００
０．２８９
３．２ １．１９０ ０．９
７９ ヒツジ血清 １．０ ％
０．０ ０．１５
７
０．２
０．２４４ ０．０８７
０．８ ０．４９２
０．３３５
３．２
１．１５８ １．００１
ウサギ血清 １．０ ％
０．０ ０．１３６
０．２ ０．２
３３ ０．０９７
０．８ ０．４９６
０．３６０
３．２
１．１９８ １．０６２ 【００３４】５）子宮頸管擦過検体中顆粒球エラスター
ゼの免疫学的測定妊婦子宮頸管の粘液を綿棒（アボット
社）にて採取し、これをＰＢＳ １ ｍｌに浸し十分攪
拌した後、 １０００ ｒｐｍ で５分間遠心しその上
清を測定用検体とする。 【００３５】測定に際しては、上記検体を １．０ ％
ヒツジ血清を含むＰＢＳにて５００ 倍希釈し、こ
れを抗ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体を感作したマ
イクロプレートに ５０ μｌ 添加する。同時に標準
直線作成用として ０．２， ０．４， ０．８， １
．６， ３．２ ｎｇ／ｍｌの遊離エラスターゼ標準液
を同様の検体希釈液にて調整し、各 ５０ μｌ を検
体を添加した同じマイクロプレートに添加する。これを
３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．５ ％の
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
を含むＰＢＳにて十分洗浄し、次いでＰＯＤ標識した抗
ヒト顆粒球エラスターゼヒツジ抗体溶液を ５０ μｌ
添加し３７℃、１時間インキュベートした後、 ０．
５ ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラ
ウレートを含むＰＢＳにて十分洗浄する。これに １
ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ，０．０５ ％の過酸化水素水を含
む ＭｃＩｒｖｅｉｎ 緩衝液を １００μｌ 添加し
、室温にて １０ 分間反応後、３ Ｎ 硫酸を１００
μｌ 添加し反応を停止させる。その発色程度をバイオ
ラッド社マイクロプレートリーダー （Ｍｏｄｅｌ ４
５０）にて ４９０ ｎｍ における吸光度として測定
し、標準液の吸光度と検体の吸光度から検体のエラスタ
ーゼ濃度を知ることができた。表５はその結果を示した
ものである。 【００３６】表６：子宮頸管粘液を検体として測定した
結果 ［子宮頸管粘液の測定結果］
吸光度 ｅｌａｓｔａｓｅ濃度 臨床症状
検体 Ｎｏ．
（４９０ｎｍ） （ｎｇ／ｍｌ）
１
０．６１２ １．３
１ 切迫早産
２ ０．１９０
０．１５ 正常
３ ０．２９
７ ０．４４ 正常
４
０．７２２ １．６１
切迫早産 ５
０．２３８ ０．２７
正常 【００３７】
【図１】 各種血清のエラスターゼ活性阻害率を示し
たものであり、ヒツジ血清、ウサギ血清はα１ −アン
チトリプシンを含むヒト血清と同様、顆粒球エラスター
ゼの酵素活性を阻害する、つまりエラスターゼ／インヒ
ビター複合物を形成することが判明した。
たものであり、ヒツジ血清、ウサギ血清はα１ −アン
チトリプシンを含むヒト血清と同様、顆粒球エラスター
ゼの酵素活性を阻害する、つまりエラスターゼ／インヒ
ビター複合物を形成することが判明した。
【図２】 遊離エラスターゼにヒト血清を添加するこ
とにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物の
、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示した
ものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／イ
ンヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した。 また、添加するヒト血清の量に応じて変換されるエラス
ターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 ０．１
％のヒト血清の添加によりエラスターゼ／インヒビター
複合物への変換は終了することが判明した。
とにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物の
、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示した
ものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／イ
ンヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した。 また、添加するヒト血清の量に応じて変換されるエラス
ターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 ０．１
％のヒト血清の添加によりエラスターゼ／インヒビター
複合物への変換は終了することが判明した。
【図３】 遊離エラスターゼにヒツジ血清を添加する
ことにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物
の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示し
たものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／
インヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した
。また、添加するヒツジ血清の量に応じて変換されるエ
ラスターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 １．
０％のヒツジ血清の添加によりエラスターゼ／インヒビ
ター複合物への変換は終了することが判明した。
ことにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物
の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示し
たものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／
インヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した
。また、添加するヒツジ血清の量に応じて変換されるエ
ラスターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 １．
０％のヒツジ血清の添加によりエラスターゼ／インヒビ
ター複合物への変換は終了することが判明した。
【図４】 遊離エラスターゼにウサギ血清を添加する
ことにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物
の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示し
たものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／
インヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した
。また、添加するウサギ血清の量に応じて変換されるエ
ラスターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 １．
０％のウサギ血清の添加によりエラスターゼ／インヒビ
ター複合物への変換は終了することが判明した。
ことにより得られたエラスターゼ／インヒビター複合物
の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性を示し
たものであり、遊離エラスターゼよりもエラスターゼ／
インヒビター複合物の方が反応性は良いことが判明した
。また、添加するウサギ血清の量に応じて変換されるエ
ラスターゼ／インヒビター複合物は増加するが、 １．
０％のウサギ血清の添加によりエラスターゼ／インヒビ
ター複合物への変換は終了することが判明した。
【図５】 遊離エラスターゼに、α１ −アンチトリ
プシン ２．０μｇ／ｍｌ、ヒト血清 ０．１ ％、ヒ
ツジ血清を １．０ ％、ウサギ血清を １．０ ％添
加することにより得られたエラスターゼ／インヒビター
複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性
を吸光度変化により示したものである。各種血清添加に
より得られたエラスターゼ／インヒビター複合物の反応
性は、上記量にて添加される限り血清の種類に関係なく
、α１ −アンチトリプシン ２．０ μｇ／ｍｌを
添加したものとほぼ同等であることが判明した。
プシン ２．０μｇ／ｍｌ、ヒト血清 ０．１ ％、ヒ
ツジ血清を １．０ ％、ウサギ血清を １．０ ％添
加することにより得られたエラスターゼ／インヒビター
複合物の、ヒト顆粒球エラスターゼ抗体に対する反応性
を吸光度変化により示したものである。各種血清添加に
より得られたエラスターゼ／インヒビター複合物の反応
性は、上記量にて添加される限り血清の種類に関係なく
、α１ −アンチトリプシン ２．０ μｇ／ｍｌを
添加したものとほぼ同等であることが判明した。
Claims (5)
- 【請求項１】不溶性担体と結合したヒト顆粒球エラスタ
ーゼに対する抗体を用いて検体中のヒト顆粒球エラスタ
ーゼを測定する方法において、被測定検体中における同
酵素が、遊離状態のもの（以下遊離エラスターゼ）と、
被測定検体中に存在するインヒビターと結合した複合状
態のもの（以下エラスターゼ／インヒビター複合物）と
が混在する場合、遊離エラスターゼを同酵素と結合する
インヒビターを添加することによりエラスターゼ／イン
ヒビター複合物に変換させ、変換後のエラスターゼ／イ
ンヒビター複合物と既に存在するエラスターゼ／インヒ
ビター複合物を同時に測定することによってヒト顆粒球
エラスターゼの総量として測定することを特徴とする免
疫学的測定方法。 - 【請求項２】添加するインヒビターがヒトα１ −アン
チトリプシン、ヒトα１ −アンチトリプシンを含むヒ
ト血清あるいは血漿、ヒトα１ −アンチトリプシンと
同様の結合様式にて結合しエラスターゼ活性を阻害する
物質を含む動物の血清あるいは血漿、ヒトα１ −アン
チトリプシンと同様の結合様式にて結合しエラスターゼ
活性を阻害する合成物質である請求項１記載の測定方法
。 - 【請求項３】被測定検体が遊離エラスターゼとエラスタ
ーゼ／インヒビター複合物が混在するものである、請求
項１，２記載の測定方法。 - 【請求項４】被測定検体が妊婦子宮頸管粘液、喀痰、気
管支肺胞洗浄液、組織抽出液、羊水、血液、尿、その他
、遊離エラスターゼとエラスターゼ／インヒビター複合
物が混在するものであり、検体採取部位の炎症の診断に
利用することを特徴とする請求項１〜３記載の測定方法
。 - 【請求項５】被測定検体中の妊婦子宮頸管粘液中ヒト顆
粒球エラスターゼ総量を測定することにより切迫早産、
早産、前期破水の予知、予防、あるいはまたヒト顆粒球
エラスターゼが原因となる慢性気道疾患を基礎とした慢
性、反復性気道感染症や肺気腫等を診断することを特徴
とする請求項１〜４記載の測定方法
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3146221A JP2614155B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | ヒト顆粒球エラスターゼの免疫学的測定方法 |
| US07/898,681 US5290679A (en) | 1991-06-18 | 1992-06-15 | Method of predicting threatened premature delivery in a pregnant woman |
| AT92305600T ATE142022T1 (de) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Immunoassay von menschlicher granulocyte-elastase |
| EP92305600A EP0519720B1 (en) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Immunoassay of human granulocyte elastase |
| ES92305600T ES2092043T3 (es) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Inmunoensayo de elastasa de granulocitos humanos. |
| DK92305600.6T DK0519720T3 (ja) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | |
| DE69213114T DE69213114T2 (de) | 1991-06-18 | 1992-06-18 | Immunoassay von menschlicher Granulocyte-Elastase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3146221A JP2614155B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | ヒト顆粒球エラスターゼの免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04369478A true JPH04369478A (ja) | 1992-12-22 |
| JP2614155B2 JP2614155B2 (ja) | 1997-05-28 |
Family
ID=15402852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3146221A Expired - Fee Related JP2614155B2 (ja) | 1991-06-18 | 1991-06-18 | ヒト顆粒球エラスターゼの免疫学的測定方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0519720B1 (ja) |
| JP (1) | JP2614155B2 (ja) |
| AT (1) | ATE142022T1 (ja) |
| DE (1) | DE69213114T2 (ja) |
| DK (1) | DK0519720T3 (ja) |
| ES (1) | ES2092043T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999046599A1 (fr) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Arkray, Inc. | Procede pour denombrer les leucocytes et compteur de leucocytes |
| US9340820B2 (en) | 2009-08-26 | 2016-05-17 | Queen's University Of Belfast | Compounds and methods for protease detection |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL9301134A (nl) * | 1993-06-29 | 1995-01-16 | Inst Voor Agrotech Onderzoek | Werkwijze voor het detekteren en eventueel kwantificeren van aktiviteit van ten minste één protease-inhibitor in een te analyseren mengsel, alsmede toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de (rest)aktiviteit van één (of meer) afzonderlijke (iso)type(s) protease-inhibitor(en) en toepassing van de werkwijze voor het bepalen van de totale (rest)aktiviteit van een mengsel eventueel na een verwerkingsproces zoals een proces ter verwijdering of inaktivatie van protease-inhibitor(en). |
| CA2554899C (en) * | 2004-02-06 | 2013-01-29 | Universite De Liege | Method and kit for the measurement of neutrophil cell activation |
| JP7355140B2 (ja) * | 2022-02-28 | 2023-10-03 | 住友ベークライト株式会社 | セリンプロテアーゼの検出用または測定用試薬 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5925183B2 (ja) * | 1978-07-05 | 1984-06-15 | ダイナボット株式会社 | エラスタ−ゼ−１の測定方法 |
| DE3016575A1 (de) * | 1980-04-30 | 1981-11-05 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
-
1991
- 1991-06-18 JP JP3146221A patent/JP2614155B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
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Cited By (2)
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