JPH06130066A - Ｔａｔの安定化方法およびｔａｔ測定キット用標準物質 - Google Patents
Ｔａｔの安定化方法およびｔａｔ測定キット用標準物質Info
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- JPH06130066A JPH06130066A JP6930692A JP6930692A JPH06130066A JP H06130066 A JPH06130066 A JP H06130066A JP 6930692 A JP6930692 A JP 6930692A JP 6930692 A JP6930692 A JP 6930692A JP H06130066 A JPH06130066 A JP H06130066A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 採血から測定までの間におけるＴＡＴ（トロ
ンビン−アンチトロンビンIII 複合体）の分解、生成を
抑制し、ヒト体内におけるＴＡＴ量を正確に測定できる
ようにすること 【構成】 ＴＡＴ含有血漿にアルガトロバンを少なくと
も０．００５ｍＭ添加して血漿中のＴＡＴを安定化す
る。アルガトロバンを含有するＴＡＴ測定キット用標準
物質およびそれを用いるＴＡＴの測定法。
ンビン−アンチトロンビンIII 複合体）の分解、生成を
抑制し、ヒト体内におけるＴＡＴ量を正確に測定できる
ようにすること 【構成】 ＴＡＴ含有血漿にアルガトロバンを少なくと
も０．００５ｍＭ添加して血漿中のＴＡＴを安定化す
る。アルガトロバンを含有するＴＡＴ測定キット用標準
物質およびそれを用いるＴＡＴの測定法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＴＡＴ含有血漿、ＴＡＴ
の安定化方法およびＴＡＴの測定キット用標準物質に関
し、さらに詳細にはアルガトロバンを含有するＴＡＴ含
有血漿、アルガトロバンによるＴＡＴの安定化方法、Ｔ
ＡＴの測定キットおよび該キット用標準物質に関する。
の安定化方法およびＴＡＴの測定キット用標準物質に関
し、さらに詳細にはアルガトロバンを含有するＴＡＴ含
有血漿、アルガトロバンによるＴＡＴの安定化方法、Ｔ
ＡＴの測定キットおよび該キット用標準物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液凝固系の主要な酵素であるトロンビ
ンはその生理的インヒビターであるアンチトロンビンII
I （ＡＴ−III)によりその活性が阻害される。このと
き、トロンビンとＡＴ−III は複合体（以下「ＴＡＴ」
という）を形成することが知られており、このＴＡＴは
各種血栓症、ＤＩＣなど種々の凝固系の亢進状態を診断
する指標として、その測定に臨床的有用性が認められつ
つある。
ンはその生理的インヒビターであるアンチトロンビンII
I （ＡＴ−III)によりその活性が阻害される。このと
き、トロンビンとＡＴ−III は複合体（以下「ＴＡＴ」
という）を形成することが知られており、このＴＡＴは
各種血栓症、ＤＩＣなど種々の凝固系の亢進状態を診断
する指標として、その測定に臨床的有用性が認められつ
つある。
【０００３】しかしながら、ＴＡＴを測定するための採
血がスムースに行われなかったり、採血の際に組織損傷
などにより組織因子を吸引するとその凝固促進作用によ
り凝固を引起し、ＴＡＴが急激に増加し、測定に際し、
検体中の正確なＴＡＴ量を知ることができない。また、
採血後、血漿を分離して保存すると、測定までの間にＴ
ＡＴが分解しやすく、正確な定量を行うことが困難であ
る。
血がスムースに行われなかったり、採血の際に組織損傷
などにより組織因子を吸引するとその凝固促進作用によ
り凝固を引起し、ＴＡＴが急激に増加し、測定に際し、
検体中の正確なＴＡＴ量を知ることができない。また、
採血後、血漿を分離して保存すると、測定までの間にＴ
ＡＴが分解しやすく、正確な定量を行うことが困難であ
る。
【０００４】そこで、ＥＤＴＡナトリウム塩、クエン酸
ナトリウム塩などの抗凝固剤を血漿中に添加することが
行われているが、この方法によってもＴＡＴの安定化は
困難であり、その正確な測定値を得ることは難しい。
ナトリウム塩などの抗凝固剤を血漿中に添加することが
行われているが、この方法によってもＴＡＴの安定化は
困難であり、その正確な測定値を得ることは難しい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＴＡＴ測定
に際し、採血後から測定までの間におけるＴＡＴの安定
化をはかり、その分解、生成を抑制して、ヒト体内にお
ける正確なＴＡＴの量を測定する方法および該測定用キ
ットを提供することを目的とする。
に際し、採血後から測定までの間におけるＴＡＴの安定
化をはかり、その分解、生成を抑制して、ヒト体内にお
ける正確なＴＡＴの量を測定する方法および該測定用キ
ットを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、アルガトロバ
ンを含有するＴＡＴ含有血漿であり、またＴＡＴ含有血
漿にアルガトロバンを添加することを特徴とするＴＡＴ
の安定化方法である。
ンを含有するＴＡＴ含有血漿であり、またＴＡＴ含有血
漿にアルガトロバンを添加することを特徴とするＴＡＴ
の安定化方法である。
【０００７】本発明で用いるアルガトロバンは、（２
Ｒ，４Ｒ）−メチル−１−〔Ｎ2 −（（ＲＳ）−３−メ
チル−１，２，３，４−テトラハイドロ−８−キノリン
スルフォニル）−Ｌ−アルギニル〕−２−ピペリジンカ
ルボン酸水和物であり、下記式化１で表される化合物で
ある。
Ｒ，４Ｒ）−メチル−１−〔Ｎ2 −（（ＲＳ）−３−メ
チル−１，２，３，４−テトラハイドロ−８−キノリン
スルフォニル）−Ｌ−アルギニル〕−２−ピペリジンカ
ルボン酸水和物であり、下記式化１で表される化合物で
ある。
【０００８】
【化１】
【０００９】アルガトロバンとしては、ノバスタン〔登
録商標、東京田辺製薬（株）〕、スロンノン〔登録商
標、第一製薬（株）〕などを用いることができる。
録商標、東京田辺製薬（株）〕、スロンノン〔登録商
標、第一製薬（株）〕などを用いることができる。
【００１０】本発明においては、クエン酸ナトリウムな
どの抗凝固剤を含む採血管にあらかじめアルガトロバン
を添加しておき、この採血管に血液を採取する方法、ま
たは採血後、血液を分離し、これにアルガトロバンを添
加する方法により、ＴＡＴ測定までの間に血漿中のＴＡ
Ｔが分解しまたは新たに生成することを防止して体内に
おける正確なＴＡＴ量を知ることができる。
どの抗凝固剤を含む採血管にあらかじめアルガトロバン
を添加しておき、この採血管に血液を採取する方法、ま
たは採血後、血液を分離し、これにアルガトロバンを添
加する方法により、ＴＡＴ測定までの間に血漿中のＴＡ
Ｔが分解しまたは新たに生成することを防止して体内に
おける正確なＴＡＴ量を知ることができる。
【００１１】アルガトロバンの添加量は、最終濃度とし
て、少なくとも０．００５ｍＭとすることが好ましく、
さらに好ましくは０．０１ｍＭ以上である。アルガトロ
バンの添加量が０．００５ｍＭ未満ではＴＡＴの安定化
が充分ではない。添加量の上限は、常識的、経済的観点
から決められ、最終濃度として１ｍＭ程度である。
て、少なくとも０．００５ｍＭとすることが好ましく、
さらに好ましくは０．０１ｍＭ以上である。アルガトロ
バンの添加量が０．００５ｍＭ未満ではＴＡＴの安定化
が充分ではない。添加量の上限は、常識的、経済的観点
から決められ、最終濃度として１ｍＭ程度である。
【００１２】血液または血漿に対してアルガトロバンを
添加するとき、アルガトロバンは所望の最終濃度の１０
〜５０倍濃度として、血液または血漿量の１／１０〜１
／５０量を添加することができる。
添加するとき、アルガトロバンは所望の最終濃度の１０
〜５０倍濃度として、血液または血漿量の１／１０〜１
／５０量を添加することができる。
【００１３】また、本発明のＴＡＴ含有血漿には、公知
のベンズアミジン、アプロチニン、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミドな
どの蛋白分解酵素阻害剤を添加してもよい。また、抗凝
固剤として、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリ
ン、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）などを添加しても
よい。これらは、単独もしくは２種類以上をアルガトロ
バンと併用して用いることができる。なかでもＦＯＹを
併用することは、凝固系活性化で最終的に生成されるト
ロンビンを阻害するばかりでなくＦ−Ｘａを阻害できる
ので優れている。
のベンズアミジン、アプロチニン、フェニルメチルスル
ホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、Ｎ−エチルマレイミドな
どの蛋白分解酵素阻害剤を添加してもよい。また、抗凝
固剤として、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ヘパリ
ン、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）などを添加しても
よい。これらは、単独もしくは２種類以上をアルガトロ
バンと併用して用いることができる。なかでもＦＯＹを
併用することは、凝固系活性化で最終的に生成されるト
ロンビンを阻害するばかりでなくＦ−Ｘａを阻害できる
ので優れている。
【００１４】本発明のＴＡＴ含有血漿は、例えば、３．
８重量％のクエン酸ナトリウム液０．５ｍｌと１ｍＭア
ルガトロバン溶液０．０５ｍｌを加えた採血用チューブ
に血液４．５ｍｌを加え、よく混和した後、遠心分離
（２０００Ｇ×１０分）して得ることができる。また、
３．８重量％のクエン酸ナトリウム０．５ｍｌを加えた
採血用チューブに血液４．５ｍｌを採取し、混和した
後、遠心分離して得られた血漿に、１ｍＭアルガトロバ
ン溶液０．０５ｍｌを加える方法によることもできる。
８重量％のクエン酸ナトリウム液０．５ｍｌと１ｍＭア
ルガトロバン溶液０．０５ｍｌを加えた採血用チューブ
に血液４．５ｍｌを加え、よく混和した後、遠心分離
（２０００Ｇ×１０分）して得ることができる。また、
３．８重量％のクエン酸ナトリウム０．５ｍｌを加えた
採血用チューブに血液４．５ｍｌを採取し、混和した
後、遠心分離して得られた血漿に、１ｍＭアルガトロバ
ン溶液０．０５ｍｌを加える方法によることもできる。
【００１５】本発明はまた、検体試料中に含まれるＴＡ
Ｔを測定するためのＴＡＴ測定用キットを構成する標準
物質であって、アルガトロバンを含有することを特徴と
する標準物質を提供するものである。本発明の標準物質
中のアルガトロバン濃度は最終濃度で少なくとも０．０
０５ｍＭとすることが好ましい。
Ｔを測定するためのＴＡＴ測定用キットを構成する標準
物質であって、アルガトロバンを含有することを特徴と
する標準物質を提供するものである。本発明の標準物質
中のアルガトロバン濃度は最終濃度で少なくとも０．０
０５ｍＭとすることが好ましい。
【００１６】本発明の標準物質は、アルガトロバンを含
むほか、必要に応じて、ベンズアミジン、アプロチニ
ン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、
Ｎ−エチルマレイミドなどの蛋白分解酵素阻害剤；ウシ
血清アルブミン、チキン血清などの蛋白質、シュクロー
スなどの糖類、アジ化ナトリウムなどの防腐剤などを含
むことができる。
むほか、必要に応じて、ベンズアミジン、アプロチニ
ン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ＥＤＴＡ、
Ｎ−エチルマレイミドなどの蛋白分解酵素阻害剤；ウシ
血清アルブミン、チキン血清などの蛋白質、シュクロー
スなどの糖類、アジ化ナトリウムなどの防腐剤などを含
むことができる。
【００１７】この標準物質は、例えば、トロンビンとＡ
Ｔ−III を反応させて合成したＴＡＴを用いて作成する
ことができる。例えば、トロンビンとＡＴ−III を反応
させた後、ヘパリン化ゲルを用いたゲル濾過（ＨＰＬ
Ｃ）で分離、精製した合成ＴＡＴの所定量を、アルガト
ロバンおよびウシ血清アルブミンなどの添加物を含む緩
衝液あるいはヒトまたは動物血清のなかに添加して作成
することができる。
Ｔ−III を反応させて合成したＴＡＴを用いて作成する
ことができる。例えば、トロンビンとＡＴ−III を反応
させた後、ヘパリン化ゲルを用いたゲル濾過（ＨＰＬ
Ｃ）で分離、精製した合成ＴＡＴの所定量を、アルガト
ロバンおよびウシ血清アルブミンなどの添加物を含む緩
衝液あるいはヒトまたは動物血清のなかに添加して作成
することができる。
【００１８】また、他の方法として、血漿にトロンビン
やエラジン酸、組織トロンボプラスチンなどの凝固系活
性化剤を添加して、血漿中のＡＴ−III とトロンビンの
間でＴＡＴを生ぜしめ、アルガトロバンなどのトロンビ
ン阻害剤で停止させる。次いで、得られたＴＡＴ含有血
漿を所定濃度となるように、ＴＡＴ欠損血漿あるいは低
濃度ＴＡＴ含有血漿で希釈するか、または緩衝液で希釈
して作成することができる。以上、ＴＡＴ測定用キット
を構成する標準物質について述べたが、これは標準物質
のみならず、コントロール血漿にも同様に適用できる。
やエラジン酸、組織トロンボプラスチンなどの凝固系活
性化剤を添加して、血漿中のＡＴ−III とトロンビンの
間でＴＡＴを生ぜしめ、アルガトロバンなどのトロンビ
ン阻害剤で停止させる。次いで、得られたＴＡＴ含有血
漿を所定濃度となるように、ＴＡＴ欠損血漿あるいは低
濃度ＴＡＴ含有血漿で希釈するか、または緩衝液で希釈
して作成することができる。以上、ＴＡＴ測定用キット
を構成する標準物質について述べたが、これは標準物質
のみならず、コントロール血漿にも同様に適用できる。
【００１９】これら標準物質としては、前記のようにし
て作成された溶液をそのまま、または凍結乾燥して使用
することができる。凍結乾燥した場合には、使用時に精
製水などを添加して粉末状の標準物質を溶解して使用す
る。
て作成された溶液をそのまま、または凍結乾燥して使用
することができる。凍結乾燥した場合には、使用時に精
製水などを添加して粉末状の標準物質を溶解して使用す
る。
【００２０】本発明は、さらに前記の標準物質を用い
て、検体試料中に含まれるＴＡＴを測定する方法であ
る。すなわち、ヒト・トロンビンに対する抗体またはそ
れと同等のフラグメント（第１抗体）を適当な不溶性担
体（例えばプラスチック容器）に固定化する（以下これ
を「固相抗体」という）。次いで、不溶性担体と測定に
使用される試薬または検体試料との非特異的結合を避け
るために適当な物質（例えばウシ血清アルブミン）で不
溶性担体の表面を被覆する。このようにして得られた固
相担体をヒト検体試料と一定時間および温度で接触させ
反応させる。この間に固相抗体とヒト検体試料中のヒト
・トロンビン・ＡＴ−III （ＴＡＴ）が結合する。
て、検体試料中に含まれるＴＡＴを測定する方法であ
る。すなわち、ヒト・トロンビンに対する抗体またはそ
れと同等のフラグメント（第１抗体）を適当な不溶性担
体（例えばプラスチック容器）に固定化する（以下これ
を「固相抗体」という）。次いで、不溶性担体と測定に
使用される試薬または検体試料との非特異的結合を避け
るために適当な物質（例えばウシ血清アルブミン）で不
溶性担体の表面を被覆する。このようにして得られた固
相担体をヒト検体試料と一定時間および温度で接触させ
反応させる。この間に固相抗体とヒト検体試料中のヒト
・トロンビン・ＡＴ−III （ＴＡＴ）が結合する。
【００２１】次いで、適当な洗浄液で洗った後、適当な
標準物質（例えば酵素）で標識したヒト・ＡＴ−III に
対する抗体またはそれと同等のフラグメント（第２抗
体）、すなわち標識抗体を含有する溶液（例えば水溶
液）を、固相抗体に結合したＴＡＴと一定時間および温
度で接触させ反応させる。標識抗体が、固相抗体によっ
て固定されたＴＡＴと反応した後、これを適当な洗浄液
で洗い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標識
された標準物質の量を測定する。
標準物質（例えば酵素）で標識したヒト・ＡＴ−III に
対する抗体またはそれと同等のフラグメント（第２抗
体）、すなわち標識抗体を含有する溶液（例えば水溶
液）を、固相抗体に結合したＴＡＴと一定時間および温
度で接触させ反応させる。標識抗体が、固相抗体によっ
て固定されたＴＡＴと反応した後、これを適当な洗浄液
で洗い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標識
された標準物質の量を測定する。
【００２２】かかる免疫反応の際に、チキン血清などの
鳥類の血清を３〜５０（ｖ）％、あるいは必要に応じて
ウシ血清アルブミンやスキムミルクなどの蛋白質類や界
面活性剤などを共存させて反応させると非特異的反応を
低下させることができ好ましい。かくしてその値からヒ
ト検体試料中のＴＡＴの量を算出することができる。
鳥類の血清を３〜５０（ｖ）％、あるいは必要に応じて
ウシ血清アルブミンやスキムミルクなどの蛋白質類や界
面活性剤などを共存させて反応させると非特異的反応を
低下させることができ好ましい。かくしてその値からヒ
ト検体試料中のＴＡＴの量を算出することができる。
【００２３】本発明は、さらに前記の標準物質を含むＴ
ＡＴ測定用キットである。かかるＴＡＴ測定用キット
は、例えば、前記標準物質、固相抗体、標識抗
体、溶解剤、洗浄剤、さらに標識物質として酵素を
用いる場合には、基質液、発色剤、反応停止剤な
ど通常の測定に用いられる試薬から構成される。
ＡＴ測定用キットである。かかるＴＡＴ測定用キット
は、例えば、前記標準物質、固相抗体、標識抗
体、溶解剤、洗浄剤、さらに標識物質として酵素を
用いる場合には、基質液、発色剤、反応停止剤な
ど通常の測定に用いられる試薬から構成される。
【００２４】かかるＴＡＴ測定用キットを構成する前記
標準物質以外の試薬は、例えば次のようにして作成する
ことができる。
標準物質以外の試薬は、例えば次のようにして作成する
ことができる。
【００２５】固相抗体は、ヒト・トロンビンに対する抗
体またはそのフラグメント〔Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａｂな
ど〕を公知の水不溶性担体に物理的吸着法あるいは化学
的結合法により固定することによって作成することがで
きる。
体またはそのフラグメント〔Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａｂな
ど〕を公知の水不溶性担体に物理的吸着法あるいは化学
的結合法により固定することによって作成することがで
きる。
【００２６】不溶性担体としては、例えばポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライドなどの高分子、その他、紙、ガラス、
金属、アガロース、磁性体およびこれらの組合せなどを
例示することができる。また、不溶性担体の形状として
は、例えばトレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器
状、セル、試験管などの種々の形状であることができ
る。
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライドなどの高分子、その他、紙、ガラス、
金属、アガロース、磁性体およびこれらの組合せなどを
例示することができる。また、不溶性担体の形状として
は、例えばトレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器
状、セル、試験管などの種々の形状であることができ
る。
【００２７】標識抗体は、ヒト・ＡＴ−III に対する抗
体またはそのフラグメントに酵素、蛍光物質、発光物
質、放射性物質などの標識物質を公知の方法、例えば、
マレイミド法などによって標識化することにより作成す
ることができる。
体またはそのフラグメントに酵素、蛍光物質、発光物
質、放射性物質などの標識物質を公知の方法、例えば、
マレイミド法などによって標識化することにより作成す
ることができる。
【００２８】酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、βーＤ−ガラクトシダーゼ、蛍光
物質としてフルオレッセインイソチオシアネート、フィ
コビリプロテインなど、発光物質としてはイソルシノー
ル、ルシゲニン、アクリジニウム・エステルなど、そし
て、放射性物質としては 125Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、 3Ｈな
どを用いることができるが、これらは例示したものに限
らず、免疫学的測定法に使用しうるものであれば、他の
ものでも使用できる。
リフォスファターゼ、βーＤ−ガラクトシダーゼ、蛍光
物質としてフルオレッセインイソチオシアネート、フィ
コビリプロテインなど、発光物質としてはイソルシノー
ル、ルシゲニン、アクリジニウム・エステルなど、そし
て、放射性物質としては 125Ｉ、 131Ｉ、14Ｃ、 3Ｈな
どを用いることができるが、これらは例示したものに限
らず、免疫学的測定法に使用しうるものであれば、他の
ものでも使用できる。
【００２９】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために、基質、必要により発色剤が用いられ
る。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基
質としてＨ2 Ｏ2 を用い、発色剤として２，２′−アジ
ノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アン
モニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−
フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジンなど、酵素に
アルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質として
ｏ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（２′−スピ
ロアダマンタン）−４−めと−４−（３″−ホスフォリ
ロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン二ナトリウム
塩（ＡＭＰＰＤ）など、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼを用いる場合は、基質としてフルオレセイン−ジ−
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを用いるこ
とができる。
を測定するために、基質、必要により発色剤が用いられ
る。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基
質としてＨ2 Ｏ2 を用い、発色剤として２，２′−アジ
ノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アン
モニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ−
フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジンなど、酵素に
アルカリフォスファターゼを用いる場合は、基質として
ｏ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（２′−スピ
ロアダマンタン）−４−めと−４−（３″−ホスフォリ
ロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン二ナトリウム
塩（ＡＭＰＰＤ）など、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼを用いる場合は、基質としてフルオレセイン−ジ−
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを用いるこ
とができる。
【００３０】溶解剤は、凍結乾燥した試薬の溶解あるい
は検体を希釈するためのものであり、免疫学的測定に通
常使用されるものであればよく、例えばリン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨが６．
０〜８．０の範囲のものが好適な例として示される。
は検体を希釈するためのものであり、免疫学的測定に通
常使用されるものであればよく、例えばリン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨが６．
０〜８．０の範囲のものが好適な例として示される。
【００３１】洗浄剤としては、同様に免疫学的測定に一
般的に用いられているものがそのまま使用される。その
例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩
衝液およびこれらの混合液が挙げられる。これら洗浄剤
には、さらにトリトン×１００、Ｔｗｅｅｎ２０または
Ｂｒｉｇ３５の如き非イオン系界面活性剤、ドデシル硫
酸ナトリウムの如きイオン系界面活性剤を加えてもよ
い。
般的に用いられているものがそのまま使用される。その
例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩
衝液およびこれらの混合液が挙げられる。これら洗浄剤
には、さらにトリトン×１００、Ｔｗｅｅｎ２０または
Ｂｒｉｇ３５の如き非イオン系界面活性剤、ドデシル硫
酸ナトリウムの如きイオン系界面活性剤を加えてもよ
い。
【００３２】本発明のＴＡＴ測定用キットを用いると、
血漿中のＴＡＴを安定化することができ、その分解、生
成を抑制することができるので、体内におけるＴＡＴの
量を正確に測定することができ、血栓症などの病態の診
断に役立てることができる。
血漿中のＴＡＴを安定化することができ、その分解、生
成を抑制することができるので、体内におけるＴＡＴの
量を正確に測定することができ、血栓症などの病態の診
断に役立てることができる。
【００３３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例中、同定法、定量法は次のよ
うにして行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） ２〜４０重量％のグラジエントスラブゲル〔第一化学薬
品（株）〕を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従って
行った。銀染色はＯａｋｌｅｙらの方法に従い、分子量
マーカーとしては電気泳動用キャブレーションキット
（ファルマシア社製）を用いた。
に説明する。なお、実施例中、同定法、定量法は次のよ
うにして行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） ２〜４０重量％のグラジエントスラブゲル〔第一化学薬
品（株）〕を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従って
行った。銀染色はＯａｋｌｅｙらの方法に従い、分子量
マーカーとしては電気泳動用キャブレーションキット
（ファルマシア社製）を用いた。
【００３４】ＴＡＴの定量 サンドイッチＥＩＡ法〔ＴＡＴテスト用キット「テイジ
ン」、帝人（株）製〕を用いて測定した。
ン」、帝人（株）製〕を用いて測定した。
【００３５】また、実施例中、材料としては下記のもの
を用いた。アルガトロバン ノバスタン（東京田辺製薬）注射剤１ｍＭ溶液を生理食
塩水にて、希釈調整して用いた。トロンビン ヒトトロンビン（シグマ社製）１，０００ＮＩＨユニッ
トをトリス塩酸緩衝液にて２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ
に調整して用いた。ＡＴ−III 乾燥濃縮ヒトＡＴ−III （ヘキスト社製）５００単位を
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、μ＝０．１５）にて１
ユニット／ｍｌに調整して用いた。ヘパリン 注射用ヘパリンナトリウム（ノボ社製）１，０００ユニ
ットを生理食塩水にて調整して用いた。
を用いた。アルガトロバン ノバスタン（東京田辺製薬）注射剤１ｍＭ溶液を生理食
塩水にて、希釈調整して用いた。トロンビン ヒトトロンビン（シグマ社製）１，０００ＮＩＨユニッ
トをトリス塩酸緩衝液にて２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ
に調整して用いた。ＡＴ−III 乾燥濃縮ヒトＡＴ−III （ヘキスト社製）５００単位を
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、μ＝０．１５）にて１
ユニット／ｍｌに調整して用いた。ヘパリン 注射用ヘパリンナトリウム（ノボ社製）１，０００ユニ
ットを生理食塩水にて調整して用いた。
【００３６】 実施例１（アルガトロバンのＴＡＴ生成抑制効果） 新鮮血漿９００μｌに予め、５０μｌのアルガトロバン
（最終濃度０．０１ｍＭ）を添加し（最終濃度０．０１
Ｍ）、これに２００μｌの凝固系活性化剤〔エラジン酸
１×１０-6Ｍ、セファリン０．０２５ＭＣａＣｌ2 の混
合物〕を混合したのち、３７℃で６０分間インキュベー
トし、ＴＡＴの定量を行った。結果を図１に示す。
（最終濃度０．０１ｍＭ）を添加し（最終濃度０．０１
Ｍ）、これに２００μｌの凝固系活性化剤〔エラジン酸
１×１０-6Ｍ、セファリン０．０２５ＭＣａＣｌ2 の混
合物〕を混合したのち、３７℃で６０分間インキュベー
トし、ＴＡＴの定量を行った。結果を図１に示す。
【００３７】比較例１ アルガトロバンに変えて生理食塩水を用いるほかは実施
例１と同様にしてＴＡＴの定量を行った。結果を図１に
併せて示す。
例１と同様にしてＴＡＴの定量を行った。結果を図１に
併せて示す。
【００３８】図１にみるとおり、アルガトロバンを添加
した実施例１の場合、インキュベーション６０分までＴ
ＡＴ量は３．０〜７．０ｎｇ／ｍｌと大きな変化はみら
れなかった。一方アルガトロバンを添加しない比較例１
の場合はインキュベーション開始後からＴＡＴの量が上
昇しており、アルガトロバンがＴＡＴの上昇を抑制する
ことがわかる。
した実施例１の場合、インキュベーション６０分までＴ
ＡＴ量は３．０〜７．０ｎｇ／ｍｌと大きな変化はみら
れなかった。一方アルガトロバンを添加しない比較例１
の場合はインキュベーション開始後からＴＡＴの量が上
昇しており、アルガトロバンがＴＡＴの上昇を抑制する
ことがわかる。
【００３９】実施例２（純化系におけるアルガトロバン
のＴＡＴ分解抑制効果） ９００μｌのＡＴ−III （１．０ユニット／ｍｌ）と９
００μｌのトロンビン（２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ）
を混合し、３７℃で１時間インキュベートしたのち、２
００μｌのアルガトロバン（１．０ｍＭ）を添加し、３
７℃で７２時間さらにインキュベートを続け、経時的に
サンプリングを行い、０．２Ｍのジイソプロピルフルオ
ロフォスフェート（ＤＦＰ）で反応を停止させ、ＴＡＴ
を定量した。結果を図２に示す。またＴＡＴの定量と同
時にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。結果を図３（Ｂ）
に示す。
のＴＡＴ分解抑制効果） ９００μｌのＡＴ−III （１．０ユニット／ｍｌ）と９
００μｌのトロンビン（２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ）
を混合し、３７℃で１時間インキュベートしたのち、２
００μｌのアルガトロバン（１．０ｍＭ）を添加し、３
７℃で７２時間さらにインキュベートを続け、経時的に
サンプリングを行い、０．２Ｍのジイソプロピルフルオ
ロフォスフェート（ＤＦＰ）で反応を停止させ、ＴＡＴ
を定量した。結果を図２に示す。またＴＡＴの定量と同
時にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。結果を図３（Ｂ）
に示す。
【００４０】比較例２ アルガトロバンに変えて生理食塩水を用いるほかは実施
例２と同様にしてＴＡＴの定量を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分析を行った。結果を図２および図３（Ａ）に
併せて示す。なお、トロンビン、ＡＴ−III をそれぞれ
単独でインキュベートしたところ７２時間までそれぞれ
の分子量に変化は認められなかった。
例２と同様にしてＴＡＴの定量を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分析を行った。結果を図２および図３（Ａ）に
併せて示す。なお、トロンビン、ＡＴ−III をそれぞれ
単独でインキュベートしたところ７２時間までそれぞれ
の分子量に変化は認められなかった。
【００４１】図２にみるとおり、アルガトロバンを含ま
ない比較例２においては、インキュベーション６時間後
より順次ＴＡＴ量が低下（６７〜２２．８ｎｇ／ｍｌ）
しているのに対し、アルガトロバンを含む実施例２にお
いては、２４時間経過後まで変化は認められず、ＴＡＴ
の分解が抑制され、比較例２に比べ４倍も長くその効果
が維持されることがわかる。
ない比較例２においては、インキュベーション６時間後
より順次ＴＡＴ量が低下（６７〜２２．８ｎｇ／ｍｌ）
しているのに対し、アルガトロバンを含む実施例２にお
いては、２４時間経過後まで変化は認められず、ＴＡＴ
の分解が抑制され、比較例２に比べ４倍も長くその効果
が維持されることがわかる。
【００４２】また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果のとおり、
比較例２〔図３（Ａ）〕においてはインキュベーション
時間とともに分子量７８，０００〜９３，０００の複数
の複合体が認められ、インキュベーション初期に形成さ
れる複合体に比しインキュベーション後期に形成される
複合体はその分子量が小さい。これに対し、実施例２
〔図３（Ｂ）〕においては、インキュベーション後期ま
で分子量９０，０００の単一の複合体（ＴＡＴと推定さ
れる）しか認められない。
比較例２〔図３（Ａ）〕においてはインキュベーション
時間とともに分子量７８，０００〜９３，０００の複数
の複合体が認められ、インキュベーション初期に形成さ
れる複合体に比しインキュベーション後期に形成される
複合体はその分子量が小さい。これに対し、実施例２
〔図３（Ｂ）〕においては、インキュベーション後期ま
で分子量９０，０００の単一の複合体（ＴＡＴと推定さ
れる）しか認められない。
【００４３】比較例３（従来の抗凝固剤） 健常人５名より、３種類の抗凝固剤（３．１３重量％ク
エン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＮａＦ）を用い
て、２シリンジ法にて血液を採取し、これから得られた
血漿を３７℃で９６時間インキュベートし、血漿中のＴ
ＡＴ量を経時的に測定した。結果を図４に示す。
エン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＮａＦ）を用い
て、２シリンジ法にて血液を採取し、これから得られた
血漿を３７℃で９６時間インキュベートし、血漿中のＴ
ＡＴ量を経時的に測定した。結果を図４に示す。
【００４４】図４にみるとおり、いずれの凝固剤を用い
た血漿においても、インキュベーション２４〜４８時間
で採取直後のＴＡＴ値よりも約４５％の低値を示してお
り、その後は上昇に転じ、変動が大きく、体内における
ＴＡＴの定量に用いるには好ましくないことがわかる。
た血漿においても、インキュベーション２４〜４８時間
で採取直後のＴＡＴ値よりも約４５％の低値を示してお
り、その後は上昇に転じ、変動が大きく、体内における
ＴＡＴの定量に用いるには好ましくないことがわかる。
【００４５】実施例３（純化系におけるアルガトロバン
のＴＡＴ生成抑制作用） ２４５μｌのＡＴ−III （１．０ユニット／ｍｌ）と１
０μｌのアルガトロバン（最終濃度０．１ｍＭ）を混合
して３７℃で５分間インキュベートしたのち、２４５μ
ｌのトロンビン（２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ）を添加
して、３７℃で６０分間インキュベートした。この間経
時的にサンプリングして０．２ＭのＤＦＰを添加して反
応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果
を図５（Ａ）に示す。
のＴＡＴ生成抑制作用） ２４５μｌのＡＴ−III （１．０ユニット／ｍｌ）と１
０μｌのアルガトロバン（最終濃度０．１ｍＭ）を混合
して３７℃で５分間インキュベートしたのち、２４５μ
ｌのトロンビン（２５０ＮＩＨユニット／ｍｌ）を添加
して、３７℃で６０分間インキュベートした。この間経
時的にサンプリングして０．２ＭのＤＦＰを添加して反
応を停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果
を図５（Ａ）に示す。
【００４６】比較例４ アルガトロバンにかえて、生理食塩水を用いるほかは実
施例３と同様にして複合体の生成を調べた。結果を図５
（Ｂ）に示す。
施例３と同様にして複合体の生成を調べた。結果を図５
（Ｂ）に示す。
【００４７】図５にみるとおり、アルガトロバンを存在
させた実施例３においては、インキュベーション６０分
間において複合体（ＴＡＴ）の形成は認められない。一
方、アルガトロバンを存在させない比較例４において
は、インキュベーション３０秒後から複合体（ＴＡＴ）
の形成が認められ、純化系におけるアルガトロバンのＴ
ＡＴ生成抑制作用が理解される。
させた実施例３においては、インキュベーション６０分
間において複合体（ＴＡＴ）の形成は認められない。一
方、アルガトロバンを存在させない比較例４において
は、インキュベーション３０秒後から複合体（ＴＡＴ）
の形成が認められ、純化系におけるアルガトロバンのＴ
ＡＴ生成抑制作用が理解される。
【００４８】実施例４（アルガトロバンの添加量） 新鮮なヒト血漿３６０μｌとエラジン酸８０μｌを混合
したものに、種々の濃度のアルガトロバン２０μｌを添
加して、３７℃で６０分間インキュベートしたのち、１
０μｌの０．２ＭＤＦＰを添加して反応を停止させ、血
漿中のＴＡＴを定量した。結果を図６に示す。
したものに、種々の濃度のアルガトロバン２０μｌを添
加して、３７℃で６０分間インキュベートしたのち、１
０μｌの０．２ＭＤＦＰを添加して反応を停止させ、血
漿中のＴＡＴを定量した。結果を図６に示す。
【００４９】図６から明らかなように、アルガトロバン
の添加量が最終濃度で０．００４ｍＭを超える場合ＴＡ
Ｔ量の増加は僅かであるが、０．００４ｍＭの添加では
ＴＡＴの増加が大であることがわかる。
の添加量が最終濃度で０．００４ｍＭを超える場合ＴＡ
Ｔ量の増加は僅かであるが、０．００４ｍＭの添加では
ＴＡＴの増加が大であることがわかる。
【００５０】実施例５（標準物質の作成） 健常人の血漿２７ｍｌに１３ＮＩＨユニット／ｍｌのヒ
トトロンビン溶液０．６ｍｌを加えて３７℃で１時間反
応させ、ＴＡＴを生成させた。次いで、アルガトロバン
の最終濃度が０．０１ｍＭおよび０．１ｍＭとなるよう
に調整した溶液３．０ｍｌを各々添加した。血漿中のＴ
ＡＴ濃度を前記健常人血漿で希釈して約３０ｎｇ／ｍｌ
に調整し、標準物質を作成した。この標準物質を４℃で
３０日間保存し、血漿中のＴＡＴ濃度の変化をみた。結
果を表１に示す。
トトロンビン溶液０．６ｍｌを加えて３７℃で１時間反
応させ、ＴＡＴを生成させた。次いで、アルガトロバン
の最終濃度が０．０１ｍＭおよび０．１ｍＭとなるよう
に調整した溶液３．０ｍｌを各々添加した。血漿中のＴ
ＡＴ濃度を前記健常人血漿で希釈して約３０ｎｇ／ｍｌ
に調整し、標準物質を作成した。この標準物質を４℃で
３０日間保存し、血漿中のＴＡＴ濃度の変化をみた。結
果を表１に示す。
【００５１】比較例５ アルガトロバンのかわりにＰＰＡＣＫ（Ｄ−フェニルア
ラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケ
トン）を最終濃度０．１ｍＭとなるように調整した溶液
３．０ｍｌを添加して実施例５と同様にＴＡＴ濃度の変
化をみた。結果を表１に併せて示す。
ラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケ
トン）を最終濃度０．１ｍＭとなるように調整した溶液
３．０ｍｌを添加して実施例５と同様にＴＡＴ濃度の変
化をみた。結果を表１に併せて示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】表１から明らかなように、アルガトロバン
を添加した標準物質が安定であることがわかる。
を添加した標準物質が安定であることがわかる。
【００５４】
【発明の効果】本発明によれば、採血後から測定までの
間における血漿中のＴＡＴの安定化をはかることがで
き、ヒト体内における正確なＴＡＴの量を測定すること
ができ、各種血栓症、ＤＩＣなど種々の凝固系の亢進状
態を診断することができる。
間における血漿中のＴＡＴの安定化をはかることがで
き、ヒト体内における正確なＴＡＴの量を測定すること
ができ、各種血栓症、ＤＩＣなど種々の凝固系の亢進状
態を診断することができる。
【図１】アルガトロバンの血漿中におけるＴＡＴ生成抑
制作用を示すグラフである。
制作用を示すグラフである。
【図２】アルガトロバンのＴＡＴ分解抑制作用を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図３】アルガトロバンのＴＡＴ分解抑制作用を示すＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。Ａは比較例２、Ｂは実施
例２の結果である。
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。Ａは比較例２、Ｂは実施
例２の結果である。
【図４】従来の抗凝固剤を添加した血漿中のＴＡＴ量の
変動を示すグラフである。
変動を示すグラフである。
【図５】アルガトロバンのＴＡＴ生成抑制作用を示すＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。Ａは実施例３、Ｂは比較
例４の結果である。
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。Ａは実施例３、Ｂは比較
例４の結果である。
【図６】アルガトロバンの添加量を示すグラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１０月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】アルガトロバンの血漿中におけるＴＡＴ生成抑
制作用を示すグラフである。
制作用を示すグラフである。
【図２】アルガトロバンのＴＡＴ分解抑制作用を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図３】アルガトロバンのＴＡＴ分解抑制作用を示すＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である電気泳動の写真である。Ａ
は比較例２、Ｂは実施例２の結果である。
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である電気泳動の写真である。Ａ
は比較例２、Ｂは実施例２の結果である。
【図４】従来の抗凝固剤を添加した血漿中のＴＡＴ量の
変動を示すグラフである。
変動を示すグラフである。
【図５】アルガトロバンのＴＡＴ生成抑制作用を示すＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である電気泳動の写真である。Ａ
は実施例３、Ｂは比較例４の結果である。
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果である電気泳動の写真である。Ａ
は実施例３、Ｂは比較例４の結果である。
【図６】アルガトロバンの添加量を示すグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
Claims (7)
- 【請求項１】 アルガトロバンを含有するＴＡＴ含有血
漿。 - 【請求項２】 ＴＡＴ含有血漿にアルガトロバンを添加
することを特徴とするＴＡＴの安定化方法。 - 【請求項３】 アルガトロバンの添加量が最終濃度で少
なくとも０．００５ｍＭである請求項２記載のＴＡＴの
安定化方法。 - 【請求項４】 検体試料中に含まれるＴＡＴを測定する
ためのＴＡＴ測定用キットを構成する標準物質であっ
て、アルガトロバンを含有することを特徴とする標準物
質。 - 【請求項５】 溶液のまま、または凍結乾燥されている
請求項４記載の標準物質。 - 【請求項６】 検体試料中に含まれるＴＡＴを測定する
方法において、請求項４または５記載の標準物質を用い
ることを特徴とする測定方法。 - 【請求項７】 請求項４または５記載の標準物質を含む
ことを特徴とするＴＡＴを測定するための測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4069306A JP2645774B2 (ja) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Ｔａｔの安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4069306A JP2645774B2 (ja) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Ｔａｔの安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06130066A true JPH06130066A (ja) | 1994-05-13 |
| JP2645774B2 JP2645774B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=13398747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4069306A Expired - Fee Related JP2645774B2 (ja) | 1992-02-20 | 1992-02-20 | Ｔａｔの安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2645774B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1213302A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-12 | Mitsubishi Chemical Corporation | Specific antibody directed to active but not inactive hepatocyte growth factor activator (HGFA) |
| CN117568445A (zh) * | 2024-01-18 | 2024-02-20 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108051284A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-18 | 青海省地质矿产测试应用中心 | 一种制备卤水标准物质的方法 |
| CN107957366A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-04-24 | 青海省地质矿产测试应用中心 | 一种制备地下水中钾钠钙镁元素标准物质的方法 |
-
1992
- 1992-02-20 JP JP4069306A patent/JP2645774B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THROMBOSIS RESEARCH 59=1990 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1213302A1 (en) * | 2000-12-05 | 2002-06-12 | Mitsubishi Chemical Corporation | Specific antibody directed to active but not inactive hepatocyte growth factor activator (HGFA) |
| US7045602B2 (en) | 2000-12-05 | 2006-05-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Specific antibody directed to active hepatocyte growth factor activator and method for using the same |
| CN117568445A (zh) * | 2024-01-18 | 2024-02-20 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
| CN117568445B (zh) * | 2024-01-18 | 2024-04-09 | 西南交通大学 | 一种tat、pic复合质控品的制备方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2645774B2 (ja) | 1997-08-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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