JP3534703B2 - エイズ診断のための尿中トリプシン阻害剤 - Google Patents
エイズ診断のための尿中トリプシン阻害剤Info
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Description
【０００１】本発明は尿中トリプシン阻害剤のエイズ発
症診断への利用に関する。特に、本発明はエイズ発症診
断のために尿中トリプシン阻害剤に対する抗体の使用に
関する。本発明の別の態様において、抗体がエイズ発症
を決定するためのキット内に提供される。
症診断への利用に関する。特に、本発明はエイズ発症診
断のために尿中トリプシン阻害剤に対する抗体の使用に
関する。本発明の別の態様において、抗体がエイズ発症
を決定するためのキット内に提供される。
【０００２】80年代初期、複数の病院で重篤な免疫不全
に罹った患者が見られた。異常な日和見感染に罹った患
者もいたし、これまではまれであった皮膚腫瘍であるカ
ポジ肉腫に罹患した患者も見出された。このような患者
の免疫学的な評価により、細胞の免疫機能の極端な減少
及び、細胞性免疫反応を媒介するT細胞の亜集団の一種
であるT4（ヘルパー）細胞の数の選択的な減少が示され
た。合併症状すべてを含むこの症状は「後天性免疫不全
症候群」（エイズ(AIDS)）と名付けられた。その後、ヒ
ト免疫不全ウイルス（HIVウイルス）と呼ばれる病原性
レトロウイルスにより、病気自体は引き起こされること
が判明した。
に罹った患者が見られた。異常な日和見感染に罹った患
者もいたし、これまではまれであった皮膚腫瘍であるカ
ポジ肉腫に罹患した患者も見出された。このような患者
の免疫学的な評価により、細胞の免疫機能の極端な減少
及び、細胞性免疫反応を媒介するT細胞の亜集団の一種
であるT4（ヘルパー）細胞の数の選択的な減少が示され
た。合併症状すべてを含むこの症状は「後天性免疫不全
症候群」（エイズ(AIDS)）と名付けられた。その後、ヒ
ト免疫不全ウイルス（HIVウイルス）と呼ばれる病原性
レトロウイルスにより、病気自体は引き起こされること
が判明した。
【０００３】HIVがエイズの原因であることが見出され
た直後、このウイルスが特にT4細胞に対し細胞壊死性で
あることが観察された。従って、エイズにおける免疫学
的な異常は、少なくとも一部は、HIVによるT4細胞の感
染と破壊によるT4細胞数の進行性欠乏によるという仮説
が立てられた。
た直後、このウイルスが特にT4細胞に対し細胞壊死性で
あることが観察された。従って、エイズにおける免疫学
的な異常は、少なくとも一部は、HIVによるT4細胞の感
染と破壊によるT4細胞数の進行性欠乏によるという仮説
が立てられた。
【０００４】臨床学的見地から、「疾患」としてのエイ
ズは、既知の潜在的免疫不全、および、例えば免疫抑制
治療または悪性リンパ性細網（lymphoreticular malign
ancy）のような疾患に関連すると報告されている任意の
他の抵抗力低下の非存在下で、少なくとも中程度の細胞
性免疫不全を示す、信頼性のある診断をされた疾患の存
在であると定義されている。
ズは、既知の潜在的免疫不全、および、例えば免疫抑制
治療または悪性リンパ性細網（lymphoreticular malign
ancy）のような疾患に関連すると報告されている任意の
他の抵抗力低下の非存在下で、少なくとも中程度の細胞
性免疫不全を示す、信頼性のある診断をされた疾患の存
在であると定義されている。
【０００５】ゆっくりと、しかし常に身体の通常の機能
の衰弱が進行し続ける最終段階であるエイズ疾患には、
総称して「前駆的エイズ (predromal AIDS)」と呼ばれ
る種々の疾患が先行する。そのような疾患はARC（エイ
ズ関連コンプレックス(Aids Related Complex)）を含
み、この症状はの後のエイズ発病に対して高度に予測的
であると考えられている。ARCは、例えば3ヶ月以上続く
発熱、10％以上の体重減少、下痢、T4細胞数の減少など
の症状を含む。この病状は、ついには、口腔カンジダ
症、ヘルペス帯状庖疹、突発性血小板減少症、およびそ
の他の致死性ではないが免疫抑制を示す疾患が生じるこ
とによって特徴づけられる、いわゆるLAIDS（レッサー
エイズ(Lesser AIDS)）に発展することが知られてい
る。
の衰弱が進行し続ける最終段階であるエイズ疾患には、
総称して「前駆的エイズ (predromal AIDS)」と呼ばれ
る種々の疾患が先行する。そのような疾患はARC（エイ
ズ関連コンプレックス(Aids Related Complex)）を含
み、この症状はの後のエイズ発病に対して高度に予測的
であると考えられている。ARCは、例えば3ヶ月以上続く
発熱、10％以上の体重減少、下痢、T4細胞数の減少など
の症状を含む。この病状は、ついには、口腔カンジダ
症、ヘルペス帯状庖疹、突発性血小板減少症、およびそ
の他の致死性ではないが免疫抑制を示す疾患が生じるこ
とによって特徴づけられる、いわゆるLAIDS（レッサー
エイズ(Lesser AIDS)）に発展することが知られてい
る。
【０００６】将来のエイズ発症に対して予測的なもう1
つの症状としてはいわゆる「LAS(リンパ節症症候群)」
があり、これは鼠径部の外側に直径1cm以上のリンパ節
が少なくとも3つ以上存在することによって同定され
る。
つの症状としてはいわゆる「LAS(リンパ節症症候群)」
があり、これは鼠径部の外側に直径1cm以上のリンパ節
が少なくとも3つ以上存在することによって同定され
る。
【０００７】さらに、エイズが発症しつつあることを示
すもう一つの指標として、ADC症候群（エイズ痴呆コン
プレックス）があり、脳の活動に対しての有害な影響が
増加していることが観察される。
すもう一つの指標として、ADC症候群（エイズ痴呆コン
プレックス）があり、脳の活動に対しての有害な影響が
増加していることが観察される。
【０００８】分子生物学、および細胞生物学技術の発達
により、HIVウイルス自体の様々な抗原決定基を決定す
ることが可能となっている。その結果、患者の血液中の
HIVウイルスを検出できる抗体が調製される。しかし、
これらの試験により、HIV感染の有無を診断することは
ほとんどできず、従って疾病の切迫した発症を確実に予
測することができない。よって、前述したような疾病の
前駆的症状の複合的な状態のために、患者がエイズを発
症するかどうかを次回までに決定することは、多くの場
合医師にとって困難である。
により、HIVウイルス自体の様々な抗原決定基を決定す
ることが可能となっている。その結果、患者の血液中の
HIVウイルスを検出できる抗体が調製される。しかし、
これらの試験により、HIV感染の有無を診断することは
ほとんどできず、従って疾病の切迫した発症を確実に予
測することができない。よって、前述したような疾病の
前駆的症状の複合的な状態のために、患者がエイズを発
症するかどうかを次回までに決定することは、多くの場
合医師にとって困難である。
【０００９】したがって、疾病の発病を確実に予測する
ための、信頼性が高く迅速な診断の道具が当技術分野に
おいて求められている。
ための、信頼性が高く迅速な診断の道具が当技術分野に
おいて求められている。
【００１０】ヒトの体における HIV感染の進行は一般的
に、2つの相互作用要因によって決定される。その2つの
要因は、感染の進行とともに現れる、感染した個人の免
疫系および侵入物に対する宿主の免疫反応を弱めるとい
う、HIV特有の性質である。
に、2つの相互作用要因によって決定される。その2つの
要因は、感染の進行とともに現れる、感染した個人の免
疫系および侵入物に対する宿主の免疫反応を弱めるとい
う、HIV特有の性質である。
【００１１】重篤な免疫不全の状態に陥る前には免疫系
はまだある程度はその役割を果たし、前述した様々な症
状が認められるずっと前に、感染した個人に検出されう
る特有の分子を産生する。従って、このような分子を病
気を決定するために利用することが考えられた。
はまだある程度はその役割を果たし、前述した様々な症
状が認められるずっと前に、感染した個人に検出されう
る特有の分子を産生する。従って、このような分子を病
気を決定するために利用することが考えられた。
【００１２】このような目的で現在使用されている分子
として、例えば、β-ミクログロブリンまたはネオプテ
リンがある。しかし、病気を決定するためのこれらの化
合物の利用は、これらが特にHIV感染に特異的ではない
という欠点と、複雑な方法で血液試料から調製されねば
ならないという欠点があり、これは診断方法の妨害とな
る。さらに、体液中のこれらの分子の増加は、他の免疫
系のパラメーター、およびウイルス学的アッセイ法によ
りすでに明確に示されたエイズの発病の段階を決定する
ことができるだけである。
として、例えば、β-ミクログロブリンまたはネオプテ
リンがある。しかし、病気を決定するためのこれらの化
合物の利用は、これらが特にHIV感染に特異的ではない
という欠点と、複雑な方法で血液試料から調製されねば
ならないという欠点があり、これは診断方法の妨害とな
る。さらに、体液中のこれらの分子の増加は、他の免疫
系のパラメーター、およびウイルス学的アッセイ法によ
りすでに明確に示されたエイズの発病の段階を決定する
ことができるだけである。
【００１３】従って、本発明の根底にある問題点は、病
気の初期発病段階、好ましくは前駆的エイズ症状の際
に、既にエイズの発病を予測するための新規の診断上の
道具を提供することである。
気の初期発病段階、好ましくは前駆的エイズ症状の際
に、既にエイズの発病を予測するための新規の診断上の
道具を提供することである。
【００１４】上述の問題点は、体液中で見いだされる、
特定の化合物である尿中トリプシン阻害剤を診断の道具
として用いて、該体液におけるその量を測定することに
より解決されている。
特定の化合物である尿中トリプシン阻害剤を診断の道具
として用いて、該体液におけるその量を測定することに
より解決されている。
【００１５】本発明に至る多くの実験を行う際に、健康
な人の尿中では通常約3μg/mlまでである尿中トリプシ
ン阻害剤（UTI）の量は、HIVに感染し、今まさに発病し
ようとしている患者においては著しく増加することが見
出された。
な人の尿中では通常約3μg/mlまでである尿中トリプシ
ン阻害剤（UTI）の量は、HIVに感染し、今まさに発病し
ようとしている患者においては著しく増加することが見
出された。
【００１６】従って、本発明によりエイズ発症の診断に
おけるUTI の利用が提供される。その診断では、エイズ
患者の血液または好ましくは尿でありうる体液試料にお
けるUTIの量を測定する。その量が、尿中に3μg/mlとい
う一定レベルを超えた場合には、これは、この患者が疾
病を発病すると考えられる信頼性のあるシグナルとみな
されうる。
おけるUTI の利用が提供される。その診断では、エイズ
患者の血液または好ましくは尿でありうる体液試料にお
けるUTIの量を測定する。その量が、尿中に3μg/mlとい
う一定レベルを超えた場合には、これは、この患者が疾
病を発病すると考えられる信頼性のあるシグナルとみな
されうる。
【００１７】体液のUTIの量は、ポリクローナル抗体も
しくはモノクローナル抗体、または血清を含む抗体であ
り得る抗体を用いるような、当技術分野において周知の
方法に従って測定されうる。UTI測定の別の方法には、
試料中の抗トリプシン活性または抗キモトリプシン活性
の測定が含まれる。
しくはモノクローナル抗体、または血清を含む抗体であ
り得る抗体を用いるような、当技術分野において周知の
方法に従って測定されうる。UTI測定の別の方法には、
試料中の抗トリプシン活性または抗キモトリプシン活性
の測定が含まれる。
【００１８】本発明はまた、体液試料中のUTIレベルの
測定を行うためのキットも提供し、アッセイ法を実行す
るためのすべての必要な成分、および緩衝液を提供す
る。
測定を行うためのキットも提供し、アッセイ法を実行す
るためのすべての必要な成分、および緩衝液を提供す
る。
【００１９】本発明に至る研究の間、免疫不全状態に羅
患した患者の体内における、多くのプロテイナーゼ阻害
剤の発現および癌の進行へのこれらの程度の依存性が調
べられた。血漿阻害剤の1つとしてインター-α-トリプ
シン阻害剤（ITI）があるが、このタンパク質の機能は
まだ完全には解明されていない。ITIは肝臓で生合成さ
れる分子量約240 kDaの糖タンパク質である。その血中
濃度は約450 μg/mlである。
患した患者の体内における、多くのプロテイナーゼ阻害
剤の発現および癌の進行へのこれらの程度の依存性が調
べられた。血漿阻害剤の1つとしてインター-α-トリプ
シン阻害剤（ITI）があるが、このタンパク質の機能は
まだ完全には解明されていない。ITIは肝臓で生合成さ
れる分子量約240 kDaの糖タンパク質である。その血中
濃度は約450 μg/mlである。
【００２０】免疫学的にITIに付着する低分子量の阻害
剤が見出された。この特異的阻害剤は、その酸安定性を
決定するジスルフィド結合を多く含む、ITIの軽鎖の断
片に相当する。この阻害剤がある病状において実際に血
中から尿に分泌されるという事実から、この分子を尿中
トリプシン阻害剤（UTI）と命名した。
剤が見出された。この特異的阻害剤は、その酸安定性を
決定するジスルフィド結合を多く含む、ITIの軽鎖の断
片に相当する。この阻害剤がある病状において実際に血
中から尿に分泌されるという事実から、この分子を尿中
トリプシン阻害剤（UTI）と命名した。
【００２１】UTIは分子量約 44 kDaの酸性糖タンパク質
である。主要な2本の糖鎖が、その質量の約30%を占め
る。炭化水素を除いたUTIの分子量は約 30 kDaである。
UTIは1本のポリペプチド鎖だけからなるが、三次元構造
的に見ると、2つのドメイン分子である。2つのドメイン
間には構造上の相同性が見い出され、また、ウシの器官
に存在する主要な膵臓プロテイナーゼ阻害剤（MPPI）と
も相同性を示す。これはまた、反応中心領域の中の、UT
Iトリプシン結合ドメインおよびそのキモトリプシン結
合ドメインに本質的に当てはまる。
である。主要な2本の糖鎖が、その質量の約30%を占め
る。炭化水素を除いたUTIの分子量は約 30 kDaである。
UTIは1本のポリペプチド鎖だけからなるが、三次元構造
的に見ると、2つのドメイン分子である。2つのドメイン
間には構造上の相同性が見い出され、また、ウシの器官
に存在する主要な膵臓プロテイナーゼ阻害剤（MPPI）と
も相同性を示す。これはまた、反応中心領域の中の、UT
Iトリプシン結合ドメインおよびそのキモトリプシン結
合ドメインに本質的に当てはまる。
【００２２】MPPIとの構造上の相同性により、UTIは
「クニン(Kunin)」型の阻害剤と相互に関連する。UTIの
両方のドメインがMPPIに相同的であるという事実によ
り、このポリペプチドは「バイクニン(Bi-Kunin)」とと
きどき呼ばれる。エラスターゼおよび好中球の顆粒球G
カテプシンを不活性化するUTIの性質は、それが抗炎症
効果を示しうるという仮説のもととなった。
「クニン(Kunin)」型の阻害剤と相互に関連する。UTIの
両方のドメインがMPPIに相同的であるという事実によ
り、このポリペプチドは「バイクニン(Bi-Kunin)」とと
きどき呼ばれる。エラスターゼおよび好中球の顆粒球G
カテプシンを不活性化するUTIの性質は、それが抗炎症
効果を示しうるという仮説のもととなった。
【００２３】一方、1974年にはすでにEDC-1（分子量＝2
7 kDa）と呼ばれる特殊なタンパク質が急性骨髄性白血
病に羅患した患者の尿から単離された。これまでに試験
された腫瘍学的な患者のほとんどにおいて、尿中のEDC-
1レベルが疾病の臨床的進行に対応していることが見出
された。臨床的な寛解の徴候が現れる前に、それは著し
く減少し、臨床的再発の前に増加した。
7 kDa）と呼ばれる特殊なタンパク質が急性骨髄性白血
病に羅患した患者の尿から単離された。これまでに試験
された腫瘍学的な患者のほとんどにおいて、尿中のEDC-
1レベルが疾病の臨床的進行に対応していることが見出
された。臨床的な寛解の徴候が現れる前に、それは著し
く減少し、臨床的再発の前に増加した。
【００２４】EDC-1のアミノ酸配列の分析により、そのN
末端配列は通常UTIのそれにほぼ一致しているが、C末端
配列はUTIと異なることが示された。EDC-1とUTIが、ITI
内の様々なペプチド結合の分解により現れるとしばしば
考えられた。
末端配列は通常UTIのそれにほぼ一致しているが、C末端
配列はUTIと異なることが示された。EDC-1とUTIが、ITI
内の様々なペプチド結合の分解により現れるとしばしば
考えられた。
【００２５】一方、腫瘍学的患者におけるEDC-1含量の
増加の潜在的な機構が提唱されている。腫瘍成長の第一
段階では、腫瘍関連のタンパク質分解活性が、宿主にお
けるα-1-プロテイナーゼ阻害剤形成の促進を誘導する
が、これはプロテイナーゼによって実質的に不活性化さ
れている。第二段階においてのみ、EDC-1が形成される
まで腫瘍関連のプロテイナーゼが血漿ITIを分解する。
その結果、EDC-1の血清中の濃度は上昇するが、ITIの濃
度は減少する。
増加の潜在的な機構が提唱されている。腫瘍成長の第一
段階では、腫瘍関連のタンパク質分解活性が、宿主にお
けるα-1-プロテイナーゼ阻害剤形成の促進を誘導する
が、これはプロテイナーゼによって実質的に不活性化さ
れている。第二段階においてのみ、EDC-1が形成される
まで腫瘍関連のプロテイナーゼが血漿ITIを分解する。
その結果、EDC-1の血清中の濃度は上昇するが、ITIの濃
度は減少する。
【００２６】たとえば胃、食道、又は大腸の癌など、種
々の癌に罹患した患者の尿および血清においてUTIのレ
ベルが上昇し、それが病気の進行と相関することが見出
された。化学療法の適用が成功した後に、UTIのレベル
が減少することが見出された。
々の癌に罹患した患者の尿および血清においてUTIのレ
ベルが上昇し、それが病気の進行と相関することが見出
された。化学療法の適用が成功した後に、UTIのレベル
が減少することが見出された。
【００２７】さらに、健康な腎臓において、近位の管上
皮細胞の細胞質内にUTIが見い出されることから、その
尿への分泌は、これらの細胞によることが示唆された。
UTIは糸球体、遠位の管または血管壁には見出されなか
った。さらに、間隙にはUTIは含まれなかったが、腫瘍
の周辺組織のUTIのレベルは健康な腎臓とちょうど同じ
レベルであった。従って、癌細胞はUTIを明らかに生成
していないことが示唆された。
皮細胞の細胞質内にUTIが見い出されることから、その
尿への分泌は、これらの細胞によることが示唆された。
UTIは糸球体、遠位の管または血管壁には見出されなか
った。さらに、間隙にはUTIは含まれなかったが、腫瘍
の周辺組織のUTIのレベルは健康な腎臓とちょうど同じ
レベルであった。従って、癌細胞はUTIを明らかに生成
していないことが示唆された。
【００２８】本発明により、血液または、より好ましく
は尿などの体液中のUTIレベルの増加は、現時点ではエ
イズ、またはより好ましくは前駆的エイズに関連する病
気の発達の発症を決定するために用いられうる。HIVウ
イルスが休眠していたり、エイズ関連症候群に罹患して
いないようなHIVに感染した患者においては、尿中のUTI
のレベルは通常の健康な人と同様に3μg/mlまでの正常
範囲である。しかし、症候群を形成する疾患が今にも発
症しようとしている場合は、体内の「通常の」細菌、ウ
イルスまたは腫瘍の出現をもはや阻止できない程度まで
患者の免疫系の働きが弱められているために、症候群に
より尿中のUTIのレベルが3μg/mlまでの正常レベルを超
えて顕著に現れ始める。
は尿などの体液中のUTIレベルの増加は、現時点ではエ
イズ、またはより好ましくは前駆的エイズに関連する病
気の発達の発症を決定するために用いられうる。HIVウ
イルスが休眠していたり、エイズ関連症候群に罹患して
いないようなHIVに感染した患者においては、尿中のUTI
のレベルは通常の健康な人と同様に3μg/mlまでの正常
範囲である。しかし、症候群を形成する疾患が今にも発
症しようとしている場合は、体内の「通常の」細菌、ウ
イルスまたは腫瘍の出現をもはや阻止できない程度まで
患者の免疫系の働きが弱められているために、症候群に
より尿中のUTIのレベルが3μg/mlまでの正常レベルを超
えて顕著に現れ始める。
【００２９】症候群に関係する病気の徴候が顕著になる
ずっと前から測定可能であるUTIレベルのこのような増
加は、エイズ進行の発病の指標とみなされ得る。このよ
うな知見によって、医師は患者に対し、各々の人が事実
上病気になったと考えられる前に、患者の適切な治療を
開始することができるようになると考えられる。
ずっと前から測定可能であるUTIレベルのこのような増
加は、エイズ進行の発病の指標とみなされ得る。このよ
うな知見によって、医師は患者に対し、各々の人が事実
上病気になったと考えられる前に、患者の適切な治療を
開始することができるようになると考えられる。
【００３０】さらに、抗HIV薬、あるいは例えばカンジ
ダなど患者が羅患する個々の疾病に対して特異的な薬剤
等のような薬物を用いて患者を治療する際に、UTIの量
を測定することで、エイズ患者における該薬剤の効果が
容易にモニターできる。その結果、例えばエイズ関連疾
患に羅患した患者にAZTまたはいわゆる「三重療法(trip
le therapy)」などの薬を投与した場合、患者におけるU
TIレベルを測定することにより疾病の減退の様子をモニ
ターしうる。
ダなど患者が羅患する個々の疾病に対して特異的な薬剤
等のような薬物を用いて患者を治療する際に、UTIの量
を測定することで、エイズ患者における該薬剤の効果が
容易にモニターできる。その結果、例えばエイズ関連疾
患に羅患した患者にAZTまたはいわゆる「三重療法(trip
le therapy)」などの薬を投与した場合、患者におけるU
TIレベルを測定することにより疾病の減退の様子をモニ
ターしうる。
【００３１】さらに、本発明はまた、疾病の発症に関し
てHIV感染患者をモニターする可能性により、エイズが
とにかく急に発病する前に該患者に投与される薬の量を
減らしうるという利点を持ち、そのような治療に伴う莫
大なコストを節約し、さらに同様にウイルスにおいて耐
性が産生される可能性も減少すると考えられる。
てHIV感染患者をモニターする可能性により、エイズが
とにかく急に発病する前に該患者に投与される薬の量を
減らしうるという利点を持ち、そのような治療に伴う莫
大なコストを節約し、さらに同様にウイルスにおいて耐
性が産生される可能性も減少すると考えられる。
【００３２】アッセイ法はまた、容易に入手可能な生物
材料、すなわち尿において行われうるので、アッセイ法
は容易に行われる。医者または採血をする医療技術者の
ような技術者を必要としない。
材料、すなわち尿において行われうるので、アッセイ法
は容易に行われる。医者または採血をする医療技術者の
ような技術者を必要としない。
【００３３】また本発明は、アッセイ法を行うためのキ
ットも提供する。キットは、例えばUTIに対するポリク
ローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、または抗血
清が固定化された単なる帯（strip）という形態であっ
てもよい。従って、生物試料を単に帯に接触させ、その
後、UTIに対する抗体を含む溶液を帯へ接触させて、UTI
分子とサンドイッチを形成させる。その後、サンドイッ
チは、例えば抗体の不変領域に対する抗体および色素や
西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカーが結合した
抗体を供するなど、従来の方法で視覚化されうる。
ットも提供する。キットは、例えばUTIに対するポリク
ローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、または抗血
清が固定化された単なる帯（strip）という形態であっ
てもよい。従って、生物試料を単に帯に接触させ、その
後、UTIに対する抗体を含む溶液を帯へ接触させて、UTI
分子とサンドイッチを形成させる。その後、サンドイッ
チは、例えば抗体の不変領域に対する抗体および色素や
西洋ワサビペルオキシダーゼなどのマーカーが結合した
抗体を供するなど、従来の方法で視覚化されうる。
【００３４】当業者が自身の知識に基づいて、ELISAや
その他のような個々の需要に従って、キットを設計する
ことが評価されると考えられる。従って、試料中のUTI
の量の正確な読みとりを提供するために、当事者は例え
ば光度計のような対応する装置の使用を考慮に入れると
考えられる。また、UTIに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を作成するための技術も十分に
通常の技術の範囲内であることが評価されると考えられ
る。
その他のような個々の需要に従って、キットを設計する
ことが評価されると考えられる。従って、試料中のUTI
の量の正確な読みとりを提供するために、当事者は例え
ば光度計のような対応する装置の使用を考慮に入れると
考えられる。また、UTIに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を作成するための技術も十分に
通常の技術の範囲内であることが評価されると考えられ
る。
【００３５】提供されたキットの種類に依存して、たと
えば特定のUTI含量を示す色素を用いて大まかに表示す
るために、羅患した人が十分に自宅でアッセイ法を行う
ことができる。さらに、 例えば研究室において、光度
計を用いてUTIのレベルもまた正確に測定されうる。
えば特定のUTI含量を示す色素を用いて大まかに表示す
るために、羅患した人が十分に自宅でアッセイ法を行う
ことができる。さらに、 例えば研究室において、光度
計を用いてUTIのレベルもまた正確に測定されうる。
【００３６】実施例 実施例1
抗体を用いたUTIの測定
UTIを検出するために、以下の方法が用いられた。UTIに
対する3種のモノクローナル抗体、M2、B6、P1 をそれ自
体は周知の方法で作製し、トリプシン結合ドメイン存在
下でこれらの結合能力を調べた。M2抗体が、このドメイ
ンに対する最も高い親和性を持つことを示した。mab M2
に基づいて、尿中のUTI濃度の競合的ELISAが計画されて
いる。
対する3種のモノクローナル抗体、M2、B6、P1 をそれ自
体は周知の方法で作製し、トリプシン結合ドメイン存在
下でこれらの結合能力を調べた。M2抗体が、このドメイ
ンに対する最も高い親和性を持つことを示した。mab M2
に基づいて、尿中のUTI濃度の競合的ELISAが計画されて
いる。
【００３７】疾患の様々な段階において、HIV感染の進
行状況を予測する際にそのUTI値を測定する目的でUTIを
検出するために用いられた方法は、以下のように示され
る。
行状況を予測する際にそのUTI値を測定する目的でUTIを
検出するために用いられた方法は、以下のように示され
る。
【００３８】結果 患者群
17人のHIV-1感染患者と30人の健康なボランティアを調
べた。4人の患者は臨床症状を示しておらず、8人の患者
は様々な日和見感染症を発症し、5人の患者はすでにエ
イズを発症していた。
べた。4人の患者は臨床症状を示しておらず、8人の患者
は様々な日和見感染症を発症し、5人の患者はすでにエ
イズを発症していた。
【００３９】材料および方法
尿中のUTI ELISA (UTIへのmab：分泌性のハイブリドー
マは、非分泌性のマウス骨髄腫細胞（クローンP3 O1)
とヒトのUTIで免疫化されたBALB/c マウスの脾臓細胞と
の融合に由来する）レベル、残存窒素濃度及びクレアチ
ニンの濃度、ならびに多くの免疫学的パラメーター（CD
4、CD8、CD16、B-リンパ球、HLA-DR）、p24の濃度が調
べられた。
マは、非分泌性のマウス骨髄腫細胞（クローンP3 O1)
とヒトのUTIで免疫化されたBALB/c マウスの脾臓細胞と
の融合に由来する）レベル、残存窒素濃度及びクレアチ
ニンの濃度、ならびに多くの免疫学的パラメーター（CD
4、CD8、CD16、B-リンパ球、HLA-DR）、p24の濃度が調
べられた。
【００４０】尿中タンパク質濃縮物の調製
1. 尿（好ましくは朝の分）を回収し、アセトンで処理
する（5 mlの尿に対し、+4 ℃に冷やしたアセトン10 m
l）。 2. 尿中タンパク質のアセトン沈澱物は+4 ℃で一ヶ月
間保存されうる。 3. タンパク質沈澱物を遠心分離する（1,000 g, 10
分）。 4. 濃縮し尿色素を除いた沈澱物を懸濁し、調製する
（沈殿物に2.5 mlの0.05M 緩衝液、pH 7.8を添加する。
沈澱はガラス棒ですり潰す）。 5. 不溶性の沈殿物を遠心分離する。 6. その後、得られた上清をUTIの測定のために用い
る。
する（5 mlの尿に対し、+4 ℃に冷やしたアセトン10 m
l）。 2. 尿中タンパク質のアセトン沈澱物は+4 ℃で一ヶ月
間保存されうる。 3. タンパク質沈澱物を遠心分離する（1,000 g, 10
分）。 4. 濃縮し尿色素を除いた沈澱物を懸濁し、調製する
（沈殿物に2.5 mlの0.05M 緩衝液、pH 7.8を添加する。
沈澱はガラス棒ですり潰す）。 5. 不溶性の沈殿物を遠心分離する。 6. その後、得られた上清をUTIの測定のために用い
る。
【００４１】ELISA試験
1. UTI溶液を、96ウェルプレートに4 ℃で一晩吸収さ
せる。 2. プレートを水で洗浄し、ノックアウトする。 3. 空いている結合部位を、アルブミンで充填する（各
々のウェルに、0.05 Mリン酸緩衝液 pH 7.4 による1%ア
ルブミン溶液を200μl添加し、1時間インキュベートす
る）。 4. プレートを水で洗浄し、ノックアウトする。 5. 以下より、プレートのウェル中への滴定をおこな
う：（a）尿中の試料（上記の6を参照）；（b）検量線
のための標準UTI溶液；および（c）UTI含量が既知であ
る対照試料。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた
UTIモノクローナル抗体の溶液を添加し1時間インキュベ
ートする。この反応で試料中のUTI及びプレートに吸着
したUTIと抗体が結合する。 6. プレートを緩衝液（0.1% アルブミンおよびTween-2
0を含む）で洗浄し、続いて水で洗浄し、ノックアウト
する。 7. 現像：基質（クエン酸緩衝液に溶解したオルトフェ
ニレンジアミン）を添加し、10分間インキュベートす
る。 8. 反応停止：10%硫酸を添加する。 9. ELISAリーダーを用いて、492 nmにおける吸光度を
測定する。 10. 既知のUTI量を用いて検量線を引く。検量線は、マ
イクロタイタープレートのウェル中における2倍希釈のU
TIを用いて検量線を作製する。検量線の直線部分は、実
用的な濃度範囲に及んでいなければならない（図1参
照）。 11. 各々由来の試料のUTIの濃度を測定する。
せる。 2. プレートを水で洗浄し、ノックアウトする。 3. 空いている結合部位を、アルブミンで充填する（各
々のウェルに、0.05 Mリン酸緩衝液 pH 7.4 による1%ア
ルブミン溶液を200μl添加し、1時間インキュベートす
る）。 4. プレートを水で洗浄し、ノックアウトする。 5. 以下より、プレートのウェル中への滴定をおこな
う：（a）尿中の試料（上記の6を参照）；（b）検量線
のための標準UTI溶液；および（c）UTI含量が既知であ
る対照試料。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた
UTIモノクローナル抗体の溶液を添加し1時間インキュベ
ートする。この反応で試料中のUTI及びプレートに吸着
したUTIと抗体が結合する。 6. プレートを緩衝液（0.1% アルブミンおよびTween-2
0を含む）で洗浄し、続いて水で洗浄し、ノックアウト
する。 7. 現像：基質（クエン酸緩衝液に溶解したオルトフェ
ニレンジアミン）を添加し、10分間インキュベートす
る。 8. 反応停止：10%硫酸を添加する。 9. ELISAリーダーを用いて、492 nmにおける吸光度を
測定する。 10. 既知のUTI量を用いて検量線を引く。検量線は、マ
イクロタイタープレートのウェル中における2倍希釈のU
TIを用いて検量線を作製する。検量線の直線部分は、実
用的な濃度範囲に及んでいなければならない（図1参
照）。 11. 各々由来の試料のUTIの濃度を測定する。
【００４２】血液中のUTI濃度を測定するために、以下
の装置を用ることができる： 1. 80チャンネル（chanel）ピペット、40 x 200μl； 2. 試験管用のエッペンドルフ（Eppendorf）遠沈機
（微量遠心機）； 3. 492 nmのフィルターを持つ、プレート用のELISAリ
ーダー； 4. 薬剤用のプレート； 5. 濃度に加えて、UTIの活性を測定するのに必要であ
ると考えられる、405 nmのフィルターを持つ光度計； 6. 洗浄装置。
の装置を用ることができる： 1. 80チャンネル（chanel）ピペット、40 x 200μl； 2. 試験管用のエッペンドルフ（Eppendorf）遠沈機
（微量遠心機）； 3. 492 nmのフィルターを持つ、プレート用のELISAリ
ーダー； 4. 薬剤用のプレート； 5. 濃度に加えて、UTIの活性を測定するのに必要であ
ると考えられる、405 nmのフィルターを持つ光度計； 6. 洗浄装置。
【００４３】実施例2
定量的なATAの測定
実施例1に記載されたように尿試料を得た。
【００４４】使用した試薬
1）トリプシン濃縮液
1 mgのトリプシンを0.1 M 塩化カルシウムを含む0.0025
M 塩酸1 mlに溶解させた。溶液は4℃で10日間まで保存
されうる。 2）実用的なトリプシン溶液 0.1 M 塩化カルシウムを含む0.0025 M 塩酸でトリプシ
ン濃縮液を50倍に希釈する。 3）pH 7.8 〜pH 8.0の 0.2 M トリス-HCl 。 4）BAPNA濃縮液（p-ニトロアリニド N-ベンゾイル-DL-
アルギニン） 脱水したDMSO 6 mlに11.4 mgのBAPNAを溶解させ、暗所
で保存する。 5）実用的なBAPNA溶液 BAPNA濃縮液を蒸留水で1：2の割合で希釈する。
M 塩酸1 mlに溶解させた。溶液は4℃で10日間まで保存
されうる。 2）実用的なトリプシン溶液 0.1 M 塩化カルシウムを含む0.0025 M 塩酸でトリプシ
ン濃縮液を50倍に希釈する。 3）pH 7.8 〜pH 8.0の 0.2 M トリス-HCl 。 4）BAPNA濃縮液（p-ニトロアリニド N-ベンゾイル-DL-
アルギニン） 脱水したDMSO 6 mlに11.4 mgのBAPNAを溶解させ、暗所
で保存する。 5）実用的なBAPNA溶液 BAPNA濃縮液を蒸留水で1：2の割合で希釈する。
【００４５】尿試料中のATAの測定
1）吸光度計のキュベットに実用的なトリプシン溶液40
μlと、2μlから80μlの試験試料を添加する。 2）全量が160μlになるようにpH 7.8からpH 8.0 の0.2
M トリス-HClを添加する。 3）溶液を混合し、37 ℃で5分間インキュベートする。 4）実用的なBAPNA溶液40μlを添加する。 5）溶液を混合し、吸光度計を用いて、405 nmまたは410
nmにおける初期吸光度（A1）をを測定する。 6）溶液を37 ℃で30分間インキュベートする。 7）溶液を混合し、吸光度計を用いて、405 nmまたは410
nmにおける最終吸光度（A2）を測定する。
μlと、2μlから80μlの試験試料を添加する。 2）全量が160μlになるようにpH 7.8からpH 8.0 の0.2
M トリス-HClを添加する。 3）溶液を混合し、37 ℃で5分間インキュベートする。 4）実用的なBAPNA溶液40μlを添加する。 5）溶液を混合し、吸光度計を用いて、405 nmまたは410
nmにおける初期吸光度（A1）をを測定する。 6）溶液を37 ℃で30分間インキュベートする。 7）溶液を混合し、吸光度計を用いて、405 nmまたは410
nmにおける最終吸光度（A2）を測定する。
【００４６】得られた結果の加工
ATA量は以下の計算式を用いて計算される：
ATA = ε(B2 - B1 - A2 + A1) / (t V)
式中、A1およびA2は、試料存在下での初期および最終の
吸光度を示している。B1およびB2は試料非存在下での初
期および最終の吸光度を示している。Vは添加した尿試
料の容量であり、tは反応時間、εは、用いられた波長
と溶液の全量に依存するような、表にまとめられている
p-ニトロアニリンの吸光係数である。
吸光度を示している。B1およびB2は試料非存在下での初
期および最終の吸光度を示している。Vは添加した尿試
料の容量であり、tは反応時間、εは、用いられた波長
と溶液の全量に依存するような、表にまとめられている
p-ニトロアニリンの吸光係数である。
【００４７】
0.4 (B2 - B1) < A2 - A1 < 0.6 (B2 - B1)
である場合、もっとも正確な結果が得られる。
［図面の簡単な説明］
【図１】 492 nmにおける吸光度の、UTIの濃度への依
存度を示した検量線である。
存度を示した検量線である。
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 33/543 501
G01N 33/577
Claims (9)
- 【請求項１】 体液中の尿中トリプシン阻害剤(UTI)の
量を測定することを含むエイズ発症の診断のためのUTI
の利用において、測定された体液中のUTI量の増加がAID
Sの発症を示すものであるUTIの利用。 - 【請求項２】 体液が尿または血液試料である、請求項
1記載の利用。 - 【請求項３】 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体または血清を含む抗体を用いてUTIの量を測定する、
請求項1または請求項2のいずれか一項記載の利用。 - 【請求項４】 抗トリプシン活性測定によってUTIの量
を測定する、請求項1または請求項2のいずれか一項記載
の利用。 - 【請求項５】 抗キモトリプシン活性測定によってUTI
の量を測定する、請求項1または請求項2のいずれか一項
記載の利用。 - 【請求項６】 抗体がマーカーで標識されている、請求
項3記載の利用。 - 【請求項７】 マーカーが、色素、蛍光、または放射性
マーカーである、請求項6記載の利用。 - 【請求項８】 抗体がELISAアッセイ法に用いられる、
請求項7記載の利用。 - 【請求項９】 抗HIV薬の投与前後において採取された
体液試料を体液とする請求項1記載のUTIの利用により、
抗HIV薬の効力を決定する方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19903034 | 1999-01-26 | ||
| DE19903034.0 | 1999-01-26 | ||
| DE19920704.6 | 1999-05-05 | ||
| DE19920704A DE19920704C1 (de) | 1999-01-26 | 1999-05-05 | Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitors gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS |
| PCT/EP2000/000522 WO2000045175A1 (en) | 1999-01-26 | 2000-01-24 | Urinary trypsin inhibitor to diagnose aids |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002535679A JP2002535679A (ja) | 2002-10-22 |
| JP3534703B2 true JP3534703B2 (ja) | 2004-06-07 |
Family
ID=26051490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000596376A Expired - Fee Related JP3534703B2 (ja) | 1999-01-26 | 2000-01-24 | エイズ診断のための尿中トリプシン阻害剤 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1147420B1 (ja) |
| JP (1) | JP3534703B2 (ja) |
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| AU (1) | AU770114B2 (ja) |
| CA (1) | CA2361000C (ja) |
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| JPH05304983A (ja) * | 1992-04-27 | 1993-11-19 | Nissin Food Prod Co Ltd | ヒト尿中蛋白質分解酵素阻害蛋白質の定量のための物質および定量方法 |
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1999
- 1999-05-05 DE DE19920704A patent/DE19920704C1/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-01-19 US US09/487,690 patent/US6242197B1/en not_active Expired - Fee Related
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