WO2007007792A1

WO2007007792A1 - 抗体の検出法及び検出キット

Info

Publication number: WO2007007792A1
Application number: PCT/JP2006/313871
Authority: WO
Inventors: Yuji Yamada
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2005-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2007-01-18

Abstract

　生物学的試料中の抗体と、抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテインLとの複合体を形成させ、形成した複合体を検出することにより、精度や感度が改良された抗体を検出する方法を提供する。

Description

明細書

抗体の検出法及び検出キット

技術分野

[0001] 本発明は、生物学的試料中の抗体の検出法及び検出キット、並びに、その検出法による抗体の検出に基づく疾患の検出法及び検出キットに関する。

背景技術

[0002] 生体は、ウィルス、細菌等に感染すると、自己防衛手段としてそれら病原体に対する抗体を産生し、病原体を抗体と結合させることにより排除する。このとき産生される抗体は侵入した病原体等の異物を排除する機能をもつ重要なタンパク質である。抗体は、免疫担当細胞の一種、 B細胞力産生されるが、 B細胞の一部は免疫記憶細胞として残る。生体が、再度、同じ抗原をもつ病原体に感染すると、 B細胞はクローナルに増殖し、多量の抗体を産生して速やかに病原体を排除する。

[0003] しかし、生体外の病原体ではなく生体自身の細胞や組織を攻撃する抗体ができてしまう場合がある。このような抗体を自己抗体と呼ぶが、詳細な産生機構は不明である。自己抗体の産生機構は、自己の持つ抗原と反応する抗体を産生する B細胞を排除する機構が正常に機能しないといった異常が抗体産生機構に生じること、ェピトープが非常に似通っている外来異物により長時間にわたり刺激を繰り返されること、抗原が大量にかつ長期にわたり生体内に存在すること、抗原自身が翻訳後修飾をされたりまたは凝集体を形成したりすることなどによりェピトープと認識されてしまうこと、などが複合的に作用しながら確立していく可能性がある。

[0004] 自己の持つ抗原がェピトープとなっている自己抗体が原因となって惹起される疾患は、自己免疫疾患として知られており、主な代表的な自己免疫疾患として、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、シエーダレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、ギラン，バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血等が挙げられる。これらは、自己抗体によって細胞や臓器が障害を受けて発病する。関節リウマチでは免疫グロブリンの一種である IgGに存在する Fc部位に結合する自己抗体 (リウマチ因子)が産生され、関節の滑膜細胞を攻撃し、関節の痛みや変形を起こすことが知られている。全身性エリテマトーデスは、自己の細胞の核に存在する DN Aや RNAに対して、自己抗体が産生され体中の細胞に対して攻撃をする疾患であり、症状としては、皮膚の紅斑や、腎臓の障害などがある。その他、シエーダレン症候群（涙やだ液の分泌異常)、全身性硬化症 (皮膚硬化)、多発性筋炎 (筋肉の炎症)、ギラン .バレー症候群 (末梢神経の炎症）、特発性血小板減少性紫斑病 (血小板減少）、自己免疫溶血性貧血 (赤血球の溶血)などがあるが、抗原はそれぞれ異なり、症状も多種多様に渡る。

[0005] 以上のように自己抗体は、細胞の核成分に対する抗核抗体、リウマチ因子、抗甲状腺抗体、抗内因子抗体、抗赤血球抗体、抗血小板抗体、抗平滑筋抗体等、多種多様にわたる。

[0006] 一方、痴呆症の一種であるアルツハイマー病は、脳表面に老人斑が形成されることが大きな特徴であり、この老人班の構成成分を分析した結果、ベータアミロイドが沈着していることが知られている。ベータアミロイドは、前駆アミロイドタンパク質 (APP)から、 N-末端のベータ部位を切断するベータセクレターゼ作用と、細胞膜内に存在する APPの C-末端を切断するガンマーセクレターゼ作用により産生されることが知られて、る。これらの酵素作用によって様々な分子種のベータアミロイドが産生されるが、それらの中でも特に神経細胞毒性があるベータアミロイドはベータアミロイド (1-42)であることが知られている。

[0007] 老人班の周囲には、活性ィ匕されたミクログリアが認められ、免疫機構が働いていることが示されており、何らかの排除機構が働いていることが示唆されている。健常人では、その排除機構が正常に作用し、慢性的'持続的な被爆を許さないが、アルッノ、ィマー病では、その分解系が破綻をきたし、その結果として、各種サイト力イン系が作用すると同時に、自己抗体の産生が惹起され、脳内の炎症が昂進し、病態の形成に関与している可能性がある。

[0008] 最近になって、合成ベータアミロイドペプチド、ベータアミロイド抗体や、ベクターによるベータアミロイド遺伝子等の体内投与により、老人班が消失し、記憶テストが改善する等の成績が発表されていることからも、免疫機構がベータアミロイドの排除に積極的に作用して、ることが確認されて、る。 [0009] このように、ベータアミロイドは、アルツハイマー病発症又はその病態に深く関与していることが示唆されており、ベータアミロイドの産生、繊維化の抑制等は治療法のタ一ゲットになっている。

[0010] 一方、アルツハイマー病の診断マーカーの研究もなされており、その有力候補の一つとしてベータアミロイドがある。ベータアミロイドは、脳に沈着するば力りでなぐ脳脊髄液や血中にも見出されており、おそらぐ脳関門を通過して脳脊髄液へ移行していると思われる。脳脊髄液中のベータアミロイド（ 1-42)濃度はアルッノ、イマ一病において、低下して、ることが報告されて、る〔非特許文献 1〜4〕。

[0011] また、家族性アルツハイマー病患者血漿中に存在するベータアミロイド（1-42)は増カロしているという報告、及び、孤発性アルツハイマー病患者の血漿中ベータアミロイド (1-40)又はベータアミロイド（1-42)濃度は増加して、ると!/、う報告がある一方、ほとんど健常人群と同等という報告もあり、血中に存在するベータアミロイドの量は定かではないのが現状である。これら定量値が異なる理由としては、測定対象となる臨床検体、測定に使用している抗体の種類や性質、測定法、測定法の感度、検量線に用いるベータアミロイド（1-42)の調製法の違い等が挙げることができる。さらに、臨床検体が血漿や血清である場合、ベータアミロイド分子と相互作用する血漿や血清中の干渉物質の存在が知られており、これらの物質をあら力じめ除去するか分離する必要がある〔非特許文献 5〕。しかしながら、アルツハイマー病患者群と健常人群との比較にお、て、ベータアミロイド（1-42)の C末端部分を認識する抗体を用いる診断は知られているが（特許文献 1)、アルツハイマー病患者の血清診断マーカーの研究開発は非常に重要である。

非特干文献 1 : Tamaoka A, Sawamura N, Fukushima T. et al. J. Neurol, bci.1997; 1 48:41-45

非特許文献 2 :Andreasen N, Hesse C, Davidsson P, et al. Arch.Neurol.l999;56:673 -680

非特許文献 3 : Galasko D, Chang L, Motter R, et al. Arch. Neurol. 1998;55:937-945 非特許文献 4 : Motter R, Vigo- Pelfrey C, Kholodenko D, et al. Ann Neurol 1995; 38 :643-648 非特許文献 5 : Sheuner D, Eckman C, Jensen M, et al. Nat Med. 1996;2:864-870 特許文献 1： WO2006/046644A1

発明の開示

[0012] 本発明の課題は、精度や感度が改良された生物学的試料中の抗体を検出する方法を提供することである。

[0013] 本発明者は、自己抗体の検出又は測定法を鋭意研究した結果、プロテイン Lを用いることにより、 IgG、 IgM、 IgE、 IgD及び IgAが測定でき（特に、それぞれが同時に測定でき)、偽陽性が低ぐ S/N比が高くなることを見出し、本発明を完成させた。本発明においては、以下のものが提供される。

[0014] (1)抗体を検出する方法であって、生物学的試料中の抗体と、当該抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとの複合体を形成させ、形成した複合体を検出することを含む前記方法。

(2) 生物学的試料が血清又は血漿である、（1)記載の方法。

(3) 抗体が、ヒト免疫グロブリンの Fc、又は、ベータアミロイドに対する自己抗体である（1)又は（2)記載の方法。

(4) (1)又は（2)に記載の方法に用いるための、抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとを含む、抗体の検出キット。

(5) 抗体が免疫学的に結合する物質が、ヒト免疫グロブリンの Fc、又は、ベータァミロイドである (4)記載のキット。

(6) (1)又は（2)に記載の方法で抗体を検出することにより、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出することを特徴とする、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出する方法。

(7) 自己抗体がリウマチ因子であり、疾患カ^ゥマチである（6)記載の方法。

(8) 自己抗体がベータアミロイドに対する自己抗体であり、疾患がアルッノヽイマ一病である（6)記載の方法。

(9) (6)に記載の方法に用いるための、抗体が免疫学的に結合する物質と、プロティン Lとを含む、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患の検出キット。

(10) 抗体が免疫学的に結合する物質がヒト免疫グロブリンの Fcであり、疾患が関節リウマチである（9)記載のキット。

(11) 抗体が免疫学的に結合する物質がベータアミロイドであり、疾患がアルッハイマ一病である（9)記載のキット。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]関節リウマチ患者群 (RA)および健常人群 (Healthy C)〖こおける、 TIA法によるリウマチ因子測定結果の分布（p〈0.001、 Mann-Whitney U-test)

[図 2]関節リウマチ患者群 (RA)および健常人群 (Healthy C)〖こおける、プロテイン L(pro tein L)を用いて測定した Fcに対する自己抗体の分布（p〈0.001、 Mann-Whitney U-te st)

[図 3]関節リウマチ患者群 (RA)および健常人群 (Healthy C)における、抗ヒト κ特異的抗体 (anti-kappa)を用いて測定した Fcに対する自己抗体の分布（p〈0.001、 Mann-Wh ltney U-test)

[図 4]アルッノ、イマ一病患者群 (AD)および健常人群 (Healthy C)における、プロテイン Lを用いて測定したベータアミロイド (1-42)に対する自己抗体 (anti betal-42)の分布（ p=0.013、 p<0.05、 Unpaired t- test)

[図 5]アルッノ、イマ一病患者群 (AD)および健常人群 (Healthy C)における、プロテイン Lを用いて測定したベータアミロイド (1-16)に対する自己抗体 (anti betal-16)の分布（ p=0.000985、 p〈0.01、 Unpaired t-test)

[図 6]健常人群のベータアミロイド (1-42) (横軸）とベータアミロイド (1-16)に対する自己抗体の相関関係

[図 7]アルツハイマー病患者群のベータアミロイド (卜 42) (横軸）とベータアミロイド (1-1 6)に対する自己抗体の相関関係

発明を実施するための最良の形態

[0016] < 1 >本発明の抗体検出法

本発明の抗体検出法は、生物学的試料中の抗体と、当該抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとの複合体を形成させ、形成した複合体を検出することを特徴とする。

本明細書における、抗体の検出には、定量的な検出、すなわち、測定も包含される [0017] 生物学的試料とは、血液、血清、血漿、髄液、腹水と!/、つた体液又はその画分であり、医療機関等において通常採取されるものであれば特に限定されるものではない力被験者からの血清などの血液に由来するものが特に好適である。

[0018] 抗体は、特に限定されないが、ヒト免疫グロブリン、又は、ベータアミロイドに対する自己抗体が例として挙げられる。抗体が免疫学的に結合する物質は、検出対象の抗体に応じて適宜選択される。例えば、ヒト免疫グロブリンの場合には、ヒト免疫グロプリンの Fc、ベータアミロイドに対する自己抗体の場合には、例えばベータアミロイド (1-4 2₎やベータアミロイド ₍₁_₁₆₎が例として挙げられる。

[0019] プロテイン Lは、バクテリアの一種である Peptostreptococcus magnus由来の、分子量 35,800をもつ免疫グロブリン結合タンパク質であり、組換えタンパク質として入手可能である。プロテイン Lは、様々な免疫グロブリンの抗原結合部位とは相互作用を示さないが、 κ軽鎖を介して結合することができるという特徴を持つ。プロテイン Lは、免疫グロブリンに対して 4個の結合ドメインを有している〔Beckingham J.A, Bottonley SP, Hinton R, Sutton B.J, uore MG. Interaction between a single immunoglobulin— bind ing domain of protei L from Peptpstreptococcsu magnus and a human kappa light ch ain. Biochem. J. 1999;340: 193-199〕。プロテイン Lは、ヒトにおいては、殆どの免疫グロブリン、 IgGOgG , IgG , IgG , IgG ), IgM, IgD, IgE, IgA, IgA , IgAと強い結合能を

1 2 3 4 1 2

もつことが知られている。また、ヒトの scFvや Fabとも結合する。しかし、結合できないタィプも存在する。例えば、ヒトの V κ I、 V κ III、 V κ IVの κ鎖サブタイプと結合するが、

V κ IIとは結合できない。

[0020] 本発明に用いるプロテイン Lは、 κ軽鎖を介して免疫グロブリンに結合することができる限り、修飾や改変を受けていてもよい。

[0021] 生物学的試料中の抗体と、当該抗体が免疫学的に結合する物質 (抗原)と、プロテイン Lとの複合体の形成、及び、形成した複合体の検出は、抗体とプロテイン Lとの結合を利用する他は、通常のサンドイッチ方式による免疫学的測定方法と同様に行うことがでさる。

[0022] このような免疫学的測定法の例としては、ェンザィムィムノアッセィ (EIA) (特に ELIS A)、ラジオィムノアッセィ (RIA)、免疫沈降法、ラテックス凝集法、ウェスタンプロット、ドッドプロット、ィムノクロマト、電気化学発光法、化学発光法等の公知の方法が挙げられる。

[0023] 具体的には、固相に固定ィ匕された抗原に被検試料中の抗体を反応させ、さらに酵素等で標識したプロテイン Lを反応させ、固相に捕獲された標識プロテイン Lの量を検出することにより被検試料中の抗体の濃度を測定することができる。また、逆にプロティン Lを固相に固定化し、標識した抗原を反応させ、固相に捕獲された標識抗原の量を検出してもよい。プロテイン L又は抗原の標識は、通常に用いられる方法で行うことがでさる。

[0024] 標識としては、通常のサンドイッチ法に使用されるものが挙げられ、例えば、放射性物質、ラテックス、蛍光物質、化学発光物質、金属コロイド粒子、酵素などが挙げられる。本発明の抗体検出キットにおいては、標識は酵素であることが好ましい。標識とプ口ティン L又は抗原との結合は、通常の方法に従って行うことができる。

[0025] 免疫学的測定方法には、標識の検出方法によって、放射性物質標識物を用いる方法、蛍光標識物を用いる方法、電気化学発光を用いる方法、酵素を用いる方法などがあり、標識に対応した方法により測定する。本発明の抗体検出法において特に限定されるものではな、が、安全で簡便なことから酵素免疫測定法 (ELISA)であることが好ましい。

[0026] ELISAにおいては、その測定方式として様々な方法が知られている力特に簡便で定量性が高、方法としてペルォキシダーゼを標識酵素として用いたサンドイッチ方式を用いることが好ましい。具体的には、抗原をマイクロプレートの底面などの固相に吸着させる。次に、固相への自然吸着を低減するためにミルクカゼインなどのブロッキングタンパク質を吸着させる。そこへあらかじめ濃度の明らかな標準抗体溶液と被験生物学的試料を加えて一定時間静置する。試料中の抗体を固相上の抗原に結合させた後にマイクロプレートを洗浄し、ペルォキシダーゼなどの酵素で標識したプロテイン Lを適当な濃度で加える。一定時間静置して固相上の抗原と抗体と標識プロテイン L の三者の複合体を固相上に形成させる。その後に固相を洗浄して、過酸ィ匕水素と AB TS等の発色基質の混合溶液を添加し標識酵素による発色を得る。酵素反応を、阻害剤を添加して停止させた後に、その発色の吸光度をプレートリーダー等の機器により測定する。被験液の吸光度と標準品の吸光度を検量線等を用いて比較することにより精度良く被験液中の抗体量を知ることができる。

[0027] < 2 >本発明の抗体検出キット

本発明の抗体検出キットは、本発明の抗体検出法に用いるためのキットであり、抗体が免疫学的に結合する物質 (抗原)と、プロテイン Lとを含むことを特徴とする。抗原及びプロテイン Lは、本発明の抗体検出法に関して記載した通りである。

[0028] 本発明の抗体検出キットにおいては、抗原及びプロテイン Lの一方が固相に固定され、及び、もう一方が酵素により標識されていることが好ましい。

[0029] 固相としては、通常のサンドイッチ法に使用されるものが挙げられ、形状や材質は特に限定されない。具体的には、マイクロプレート、ビーズなどが挙げられる。抗原又はプロテイン Lの固相への固定は、通常の方法に従って行うことができる。

[0030] 標識としては、通常のサンドイッチ法に使用されるものが挙げられ、例えば、放射性物質、ラテックス、蛍光物質、化学発光物質、金属コロイド粒子、酵素などが挙げられる。本発明の抗体検出キットにおいては、標識は酵素であることが好ましい。標識とプ口ティン L又は抗原との結合は、ダルタルアルデヒド法、マレイミド法等の通常の方法に従って行うことができる。（"ENZYME IMMUNOASSAY" (edited by EIJI ISHIKAWA, TADASHI KAWAI, KIYOSHI MIYAI, IGAKU- SHIN Tokyo -New York, 1981)

[0031] 本発明の抗体検出キットにおける抗原又はプロテイン Lは溶液とされたものでも、凍結乾燥されたものであってもょ、。

[0032] 本発明の抗体検出キットは、抗原及びプロテイン Lの他に、免疫学的測定法で通常に使用される試薬を含んでいてもよい。この様な試薬としては、標準抗体液、基質溶液、検体希釈液、洗浄液などが挙げられる。

[0033] < 3 >本発明の疾患検出方法

抗体は、自己免疫疾患の原因となったり、他の疾患の指標 (マーカー）となったりすることが知られている。従って、本発明の抗体検出法で抗体を検出することにより、自己免疫疾患や自己抗体が指標となる疾患を検出することができる。

[0034] 従って、本発明は、本発明の抗体検出法により、生体試料中の抗体の量を測定し、その測定値に基づ、て自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出することを含む、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患の検出方法も提供する。

[0035] 抗体の測定値に基づ!/、て自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出する方法としては、健常人の平均値を超える測定値が得られた場合に、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患である（あるいは自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患である可能性が高い）と判定する方法が挙げられる。判定においては、健常人における値のばらつきを考慮して、統計的に有意に大きい場合に自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患であるとしてもよい。また、カットオフ値を標準偏差などに基づいて定め（例えば、平均値 + 1標準偏差)、カットオフ値との比較により判定してちよい。

[0036] 検出対象の抗体は、検出対象の疾患に応じて適宜選択される。自己免疫疾患の例としては、リウマチ、好ましくは関節リウマチが挙げられ、リウマチの場合の自己抗体の例としてはリウマチ因子が挙げられる。自己抗体が指標となる疾患としては、ァルツハイマー病が挙げられ、アルツハイマー病の場合の自己抗体の例としてはべ一タアミロイドに対する自己抗体が挙げられる。

[0037] 本発明の抗体検出法により、ベータアミロイドに対する自己抗体を検出すると、アルッハイマー病の患者は、極めて高い陽性率で高い血中自己抗体濃度を示す。健常人ではほとんど高値を示す例はなぐアルッノ、イマ一病患者群ではほとんどにお！/、て血中濃度の上昇を検出し、従って本疾患の診断において本発明の抗体検出法は有効である。

[0038] このような自己抗体と疾患の関連性は、以下のように推測される力本発明はこの推測に拘束されるものではな、。アルツハイマー病患者脳の特徴的病理学的所見であるベータアミロイドのような毒性が強い物質が産生され、凝集、繊維化、沈着等を通して、生体内に長期間に渡り貯留した場合、おそらぐ免疫的な排除機構が働いていること、その結果として、おそらく自己免疫疾患と同じような機構を経てベータアミロイドに対する自己抗体が産生されている可能性が想定される。ベータアミロイドが微量ではあるが、持続的に産生され、速やかに代謝されにくい生体内環境であれば、ベータアミロイドに対する自己抗体が産生される可能性がある。また、ベータアミロイド産生が微量であること、体液中成分との結合があること、一部代謝されてしまうこと等がベータアミロイドの測定を困難にして、る可能性がある。このように抗原自体の測定が困難である諸課題がある場合、それらに対する自己抗体を測定することは、意味がある。なぜならば、生体は微量な抗原に対しても特異抗体を大量に産生する、言わば、抗原特異的な増幅機構であるからである。

[0039] < 4 >本発明の疾患検出キット

本発明の疾患検出キットは、本発明の疾患検出法に用いるためのキットであり、抗体が免疫学的に結合する物質 (抗原)と、プロテイン Lとを含むことを特徴とする。

[0040] キットの構成は、抗体が免疫学的に結合する物質 (抗原）が、検出しょうとする自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患に対応したものである他は、本発明の抗体検出キットに関して記載した通りである。

[0041] 本発明の実施例を以下に示す力本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例 1

[0042] 〔関節リウマチ患者血清および健常人血清を用いた自己抗体測定〕

関節リウマチ患者血清 39例、健常人血清 47例を用いて、自己抗体の測定を実施した。ヒト免疫グロブリン IgG力も調製した Fcを 50 mMトリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4)にて 5 μ g/mLに希釈し、ポリスチレン製 96穴 ELISA用マイクロプレートに、一穴当り、 100 L ずつ分注し、 4°Cにて、 16時間、静置して、コーティング処理を施した。次いで、 50 m Mトリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4)にて、ミニラボウォッシャーを用いて 3回洗浄後、 0.5%ゥシアルブミン（シグマ）（50 mMトリス-塩酸緩衝液、 pH 7.4)を 250 μ Lずつ分注し、 4°C にて、 16時間、静置して、ブロッキング処理を施し、実験に使用した。

[0043] 次に、 0.5%ゥシアルブミン、 1/10量のブロックエース（第一化学薬品）を含む 50 mM トリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4) (検体希釈液)を用いて血清を 201倍に希釈し、 100 /z Lをゥエルに分注し、室温にて 1時間、反応させた。次いで、 0.05%トリトン X— 100、 0.15 M NaClを含む 50 mMトリス-塩酸緩衝液、 pH 7.4 (洗浄液）にて、ミニラボウォッシャーを用いて 3回洗浄後、検体希釈液を用ヽてペルォキシダーゼ標識プロテイン L (ピアス）を 2500倍、ペルォキシダーゼ標識抗ヒト κ特異的抗体 (ャギ）を 5000倍にて希釈し、それぞれ 100 Lずつゥエルに分注し、室温にて 1時間、反応させた。次いで、洗净液にて、ミニラボウォッシャーを用いて 3回洗净し、発色基質 (3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン， TMB,シグマ）を 100 Lずつ、ゥエルに分注し、 10分から 30分反応させた後、 1N塩酸 100 Lをゥエルに分注し、発色反応を停止させた。反応停止後、波長 45 0 nm (副波長 650 nm)の吸光度を測定した。陽性率は、健常人の平均吸光度 + 3SD を用いて算定した。

[0044] また、リウマチ因子は、汎用されている測定法の一つである免疫比濁法 (TIA)によつて柳』定した。

[0045] 図 1は、免疫比濁法 (TIA)を用いて、関節リウマチ患者血清に存在する自己抗体（リウマチ因子）を測定した結果を示す。図の縦軸の値は、検体個々の定量値の分布、横軸の RAは関節リウマチ患者血清、 Healthy Cは健常人血清を示す。

[0046] 関節リウマチ患者群の平均定量値は 104.6、健常人群の平均定量値は 5.8であり、関節リウマチ患者群では有意に高値を示した（p〈0.001、 Mann-Whitney U-test)。また、関節リウマチ患者群と健常人群の平均定量値との比 (S/N比）は、約 18であった。

[0047] カットオフ値 18を用いてそれぞれの陽性率を算定すると 18以上を示した例は、関節リウマチ患者群では、 39例中 29例 (74.4%)、健常人群では、 47例中 4例 (8.5%)であり、関節リウマチ患者群で有意に高い陽性率を示した (表 1) (p=1.6525 X 10^-9, pく 0.01、 Yates chi test)。

[0048] 図 2は、プロテイン Lを用いて、関節リウマチ患者血清に存在する Fcに対する自己抗体 (リウマチ因子）を測定した結果を示す。図の縦軸の値は、検体個々の吸光度 (4 50nm-650nm)の分布、横軸の RAは関節リウマチ患者血清、 Healthy Cは健常人血清を示す。

[0049] 関節リウマチ患者群の平均吸光度は 1.415、健常人群の平均吸光度は 0.112であり、関節リウマチ患者群では有意に高値を示した（p〈0.001、 Mann-Whitney U-test)。また、関節リウマチ患者群と健常人群の平均吸光度との S/N比は 12.6であった。

[0050] 健常人群の平均吸光度 +3標準偏差力算定したカットオフ値は 0.45であり、 0.45以上を示した例は、関節リウマチ患者群では、 39例中 28例 (71.8%)、健常人群では、 47 例中 2例 (4.3%)であり、関節リウマチ患者群で有意に高い陽性率を示した (表 2) (p=l . 4338 X 10— ^U, p〈0.01、 Fisher's test)。 TIAと比較すると、関節リウマチの検出率は、ほぼ同等であつたが、健常人の偽陽性率は、低い傾向が見られた。

[0051] また、抗ヒト κ鎖特異的抗体を用いた結果を図 3に示した。関節リウマチ患者群の平均吸光度は 1.051 ,健常人群の平均吸光度は 0.217であり、また、関節リウマチ患者群と健常人群の平均吸光度との S/N比は 4.8であった。関節リウマチ群では健常人群と比較して有意に高い吸光度を示した（p〈0.001、 Mann-Whitney U-test)。

[0052] 健常人群の平均吸光度 +3標準偏差力算定したカットオフは 0.71であり、 0.71以上を示した例は、関節リウマチ患者群では、 39例中 23例 (59.1%)、健常人群では、 47例中、陽性例はな《0%)、関節リウマチ患者群で有意に高い陽性率を示した (表 3) (p= 7.998 X 10— n, p〈0.01、 Fisher's test)。

[0053] プロテイン Lを用いた本発明の測定法は、関節リウマチに顕著に見出されるリウマチ因子の特異的測定法である TIAとほぼ同等の性能を持つが、健常人群での偽陽性率が低い傾向があること、また、抗ヒト κ鎖抗体を用いた ELISAと比較した場合、抗ヒト _K鎖抗体と同様の結合部位を持つと考えられる抗体を用いる測定法よりも、高い S /Ν比を持つことが確認され、自己抗体のスクリーニング法としてより有効な手段であることが分力ゝる。

[0054] [表 1]

表 1. ΤΙΑ法による自己抗体 (リウマチ因子)の、関節リウマチ患者群および健常人群における陽性頻度

[0055] [表 2]

表 2. プロテイン Lを用いて測定した Fcに対する自己抗体（リゥマチ因子) の、関節リウマチ患者群および健常人群における陽性頻度

[0056] [表 3] 表 3. 抗ヒト κ特異的抗体を用いて測定した Fcに対する自己抗体（リウマチ因子)の、関節リウマチ患者群および健常人群における陽性頻度

実施例 2

[0057] 〔アルツハイマー病患者血清および健常人血清を用いた自己抗体測定〕

プロテイン Lを用いた抗体測定系を用いて、アルツハイマー病患者血清 (29例）および健常人血清 (41例）中の自己抗体の測定を実施した。合成ベータアミロイドぺプチド（1-42) (ペプチド研究所)又は合成ベータアミロイドペプチド（1-16) (ペプチド研究所)を 50 mMトリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4)〖こて 5 g/mUこ希釈し、ポリスチレン製 96 穴 ELISA用マイクロプレートに、一穴当り、 100 /z Lずつ分注し、 4°Cにて、 16時間、静置して、コーティング処理を施した。次いで、 50 mMトリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4)にて、ミニラボウォッシャーを用いて 3回洗浄後、 0.5%ゥシアルブミン（シグマ）（50 mMトリス- 塩酸緩衝液、 pH 7.4)を 250 Lずつ分注し、 4°Cにて、 16時間、静置して、ブロッキング処理を施し、実験に使用した。

[0058] 次に、 0.5%%ゥシアルブミン、 1/10量のブロックエース（第一化学）、プロテア一ゼ' インヒビター'カクテル (シグマ）を含む ⁵0 mMトリス-塩酸緩衝液 (pH 7.4) (検体希釈液）を用いて血清を 101倍に希釈し、 100 Lをゥエルに分注し、室温にて 1時間、反応させた。反応後、 0.05%トリトン X— 100、 0.15 M NaClを含む 50 mMトリス-塩酸緩衝液、 pH 7.4 (洗浄液）にて、プレート洗浄機を用いて 3回洗浄し、次いで、検体希釈液を用いてペルォキシダーゼ標識プロテイン L (ピアス）を 500倍希釈し、それぞれ 100 μ Lずつゥエルに分注し、室温にて 1時間、反応させた。反応後、洗浄液にて、ミニラボウォッシャーを用いて 3回洗浄し、次いで、発色基質（ΤΜΒ,シグマ）を 100 Lずつ、ゥエルに分注し、 10分から 30分反応させた後、 1N塩酸 100 Lをゥエルに分注し、発色反応を停止させた。反応停止後、波長 450nm (副波長 650nm)の吸光度を測定した。陽性率は、健常人の平均吸光度 + 1SDを用いて算定した。

[0059] 図 4は、プロテイン Lを用いて、アルツハイマー病患者血清に存在するベータアミ口イド（1-42)に対する自己抗体を測定した結果を示す。図 4の縦軸の値は、検体個々の吸光度 (450nm-650nm)の分布、横軸の ADはアルツハイマー病患者血清、 Healthy Cは健常人血清を示す。アルツハイマー病患者群の平均吸光度は 0.721、健常人群の平均吸光度は 0.451であり、アルッノ、イマ一病患者群では有意に高値を示した (p= 0.013、 pく 0.05、 Unpaired t-test)。健常人群の平均吸光度 +1標準偏差から算定したカットオフ値は 0.76であり、 0.76以上を示した例は、アルツハイマー病患者群では、 29 例中 12例、健常人群では、 41例中 5例であり、アルツハイマー病患者群で有意に高い陽性率を示した（表 4) (p=0.01167, p<0.05, Yates Chi test)。

[0060] 次に、プロテイン Lを用いて、アルツハイマー病患者血清に存在するベータアミロイド（1-16)に対する自己抗体を測定した結果を示す。図 5の縦軸の値は、検体個々の吸光度 (450nm-650nm)の分布、横軸の ADはアルツハイマー病患者血清、 Healthy C は健常人血清を示す。アルツハイマー病患者群の平均吸光度 0.81、健常人群の平均吸光度は 0.405であり、アルッノ、イマ一病患者群では有意に高値を示した (p=0.00 0985、 pく 0.001、 Unpaired t-test)。健常人群の平均吸光度 +1標準偏差から算定したカットオフ値は 0.67であり、 0.67以上を示した例は、アルツハイマー病患者群では、 29 例中 13例、健常人群では、 41例中 5例であり、アルツハイマー病患者群で有意に高い陽性率を示した（表 5) (p=0.00512, p〈0.01、 Yates Chi test)。

[0061] 以上、示したように、ベータアミロイド（1-42)に対する自己抗体とベータアミロイド（1 -16)に対する自己抗体は、アルツハイマー病患者血清群で有意に高ぐ血清診断マ一力一として有用であることがわ力つた。また、ベータアミロイド（1-42)に対する自己抗体とベータアミロイド（1-16)に対する自己抗体の陽性率は、両者とも同等であった。また、図 6及び図 7に示すように、ベータアミロイド（1-42)に対する自己抗体とベータアミロイド（1-16)に対するそれぞれの自己抗体の相関係数は、健常人群で 0.666 (p =2.0199 X 10— ⁶、 p〈0.01、 parametric) (図 6)、アルツハイマー病患者群で、 0.747 (p=3.1 96 X 10— ⁶、 p〈0.01、 parametric)と有意に相関する力 (図 7)、分散していることから、ァルツハイマー病患者血清と健常人血清に存在する自己抗体は、認識するェピトープは違っている可能性がある。

[0062] [表 4] プロテイン Lを用いて測定したベータアミロイド (1-42)に対する自己抗体の、ァルツハイマー患者群およぴ健常人群における陽性群頻度

[0063] [表 5]

表 5. プロテイン Lを用いて測定したベータアミロイド（1-16) に対する自己抗体の、ァルツハイマー患者群および健常人群における陽性群頻度

産業上の利用可能性

[0064] 本発明の検出法によれば、一層正確で高感度の検出が可能になる。また、従来法と同程度の感度で十分な用途であれば、従来法よりも操作を簡単にすることができる。これらの効果により、生物学的試料、例えば血液等の簡単に採取できる体液を用いて簡便な検出が可能になる。

Claims

請求の範囲

[I] 抗体を検出する方法であって、生物学的試料中の抗体と、当該抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとの複合体を形成させ、形成した複合体を検出することを含む前記方法。

[2] 生物学的試料が、血清又は血漿である、請求項 1記載の方法。

[3] 抗体が、ヒト免疫グロブリンの Fc、又は、ベータアミロイドに対する自己抗体である請求項 1又は 2記載の方法。

[4] 請求項 1又は 2に記載の方法に用いるための、抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとを含む、抗体の検出キット。

[5] 抗体が免疫学的に結合する物質が、ヒト免疫グロブリンの Fc、又は、ベータアミロイドである請求項 4記載のキット。

[6] 請求項 1又は 2に記載の方法で抗体を検出することにより、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出することを特徴とする、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患を検出する方法。

[7] 自己抗体がリウマチ因子であり、疾患カ^ゥマチである請求項 6記載の方法。

[8] 自己抗体がベータアミロイドに対する自己抗体であり、疾患がアルッノ、イマ一病である請求項 6記載の方法。

[9] 請求項 6に記載の方法に用いるための、抗体が免疫学的に結合する物質と、プロテイン Lとを含む、自己免疫疾患又は自己抗体が指標となる疾患の検出キット。

[10] 抗体が免疫学的に結合する物質がヒト免疫グロブリンの Fcであり、疾患が関節リウマチである請求項 9記載のキット。

[I I] 抗体が免疫学的に結合する物質がベータアミロイドであり、疾患がアルッノヽイマ一病である請求項 9記載のキット。