JP2013083644A - 血液内アミロイドβ抗体に特異的に結合する新規なAβ22(pE)−42ペプチドを有効成分として含む痴呆症診断用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明では、アミロイドβ抗体に結合する特定配列のペプチドを探索し、Aβ22(pE)−42ペプチドが、正常なヒトに比べてアルツハイマー病患者の血清のアミロイドβ抗体に対する免疫反応性が高いことを確認したので、前記Aβ22(pE)−42ペプチドは、痴呆症診断用キットの有効成分として使用可能であり、初期診断が難しい痴呆症の診断に有用に用いることができる。
【選択図】図1
Description
(1)対象由来血液を、配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドが付着した固体基板上に処理した後、洗浄する工程、及び
(2)前記基板上でのアミロイドβ抗体の付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法を提供する。
(1)対象由来血液を固体基板上に処理した後、洗浄する工程、
(2)前記基板上に配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドを処理した後、洗浄する工程、及び
(3)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドの付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法を提供する。
本発明2は、前記ペプチドが、アミロイドβ抗体に結合することを特徴とする、本発明1の痴呆症診断用キットである。
本発明3は、前記痴呆症が、軽度認知障害(mild cognitive impairment,MCI)、アルツハイマー病及び脳アミロイド血管症からなる群から選択されることを特徴とする、本発明1の痴呆症診断用キットである。
本発明4は、前記ペプチドが、発色酵素、発色物質または蛍光分子に結合することを特徴とする、本発明1の痴呆症診断用キットである。
本発明5は、前記発色酵素が、HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)または塩基性脱リン酸化酵素(アルカリホスファターゼ)であることを特徴とする、本発明4の痴呆症診断用キットである。
本発明6は、前記発色物質が、コロイドゴールド(colloid gold)であることを特徴とする、本発明4の痴呆症診断用キットである。
本発明7は、前記蛍光分子が、ポリL−リジン−フルオレセインイソチオシアネート(poly L−lysine−flourescein isothiocynate,FITC)、ローダミン−B−イソチオシアネート(rhodamine−B−isothiocyanate,RITC)またはCy2、Cy3及びCy5からなる群から選択されることを特徴とする、本発明4の痴呆症診断用キットである。
本発明8は、前記キットが、
(1)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドがコーティングされた反応体、
(2)基質との反応によって発色を示す標識体が結合された2次抗体結合体、及び
(3)前記標識体と発色反応する発色基質溶液
を含むことを特徴とする、本発明1の痴呆症診断用キットである。
本発明9は、前記2次抗体結合体の標識体が、HRP、塩基性脱リン酸化酵素、コロイドゴールド、蛍光物質及び色素からなる群から選択されることを特徴とする、本発明8の痴呆症診断用キットである。
本発明10は、前記発色基質が、TMB(3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン)、ABTS[2,2'−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)]及びOPD(o−フェニレンジアミン)からなる群から選択されることを特徴とする、本発明8の痴呆症診断用キットである。
本発明11は、
(1)対象由来血液を、配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドが付着した固体基板上に処理した後、洗浄する工程、及び
(2)前記基板上でのアミロイドβ抗体の付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法である。
本発明12は、
(1)対象由来血液を固体基板上に処理した後、洗浄する工程、
(2)前記基板上に配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドを処理した後、洗浄する工程、及び
(3)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドの付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法である。
(1)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドがコーティングされた反応体、
(2)基質との反応によって発色を示す標識体が結合された2次抗体結合体、及び
(3)前記標識体と発色反応する発色基質溶液
を含むことを特徴とする痴呆症診断用キットであり得る。
(1)対象由来血液を配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドが付着した固体基板上に処理した後、洗浄する工程、及び
(2)前記基板上でのアミロイドβ抗体の付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含むことができる。
(1)対象由来血液を固体基板に処理した後、洗浄する工程、
(2)前記基板上に配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドを処理した後、洗浄する工程、及び
(3)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドの付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含むことができる。
正常なヒト(48人)、軽度認知障害(MCI)(49人)、ほぼ確実なアルツハイマー病(11人)及び深刻なアルツハイマー病(62人)の血漿を分離緩衝溶液(dissociation buffer)(TBS buffer,1.5%BSA,0.2M glycine−acetate,pH2.5)に1:500に希釈した後、20分間常温に放置しておいた。Amicon Ultra−0.5ml 10K Ultracel(Millipore,lreland)フィルターに希釈した血漿を入れて常温で8000gで20分間遠心分離した。新しいAmicon tubeにフィルターを裏返して移した後、1000gで2分間遠心分離し、1Mトリスバッファー(pH9.0)を用いてpH7.0に調節した。
TBS−グリセロール緩衝溶液(30%グリセロール、pH7.4)に6X His−抗体(abcam,UK)を1μg/ml濃度に希釈してタンパク質チップ(proteogen,韓国)上に1μlずつローディング(loading)した後、4℃でひと晩または37℃で3時間放置した。3M紙(3M paper)を用いてチップ上の6X His−抗体を除去した後、洗浄溶液(washing buffer)(TBS buffer,0.1%ツイーン20)で10分ずつ3回弱く洗浄した。蒸留水でチップに残っている洗浄溶液を10分間弱く振りながら洗い出して、1,500rpmで3分間遠心分離して残っている液体を除去した。遮断溶液(Blocking buffer)(TBS buffer,0.1%ツイーン20、3%BSA)を入れて、常温で1時間弱く振りながら処理した後、前記と同一な方法で洗浄して遠心分離して上澄み液を除去した。チップ上にAβ22(pE)−42ペプチド:pyrEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号1)(Peptide 2.0 Inc,www.peptide2.com)(TBS−glycerol buffer,3%BSA)を1μlずつローディングした後、37℃で1時間放置し、液体を除去した。前記<実施例1>で分離した抗体を抗体希釈緩衝溶液(TBS−glycerol buffer,3%BSA)に 1:4の割合で希釈してチップ上に1μlずつローディングした後、37℃で1時間放置した。1時間後に液体を除去し、チップ上に2次抗体(Anti−human IgG,cy5)を抗体希釈緩衝剤に1:5000の割合で希釈して1μlずつローディングした後、37℃で30分間放置した。30分後に液体を除去し、チップスキャナを用いて結果を確認した。
Claims (12)
- 配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドを有効成分として含む、痴呆症診断用キット。
- 前記ペプチドが、アミロイドβ抗体に結合することを特徴とする、請求項1に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記痴呆症が、軽度認知障害(mild cognitive impairment,MCI)、アルツハイマー病及び脳アミロイド血管症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記ペプチドが、発色酵素、発色物質または蛍光分子に結合することを特徴とする、請求項1に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記発色酵素が、HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)または塩基性脱リン酸化酵素(アルカリホスファターゼ)であることを特徴とする、請求項4に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記発色物質が、コロイドゴールド(colloid gold)であることを特徴とする、請求項4に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記蛍光分子が、ポリL−リジン−フルオレセインイソチオシアネート(poly L−lysine−flourescein isothiocynate,FITC)、ローダミン−B−イソチオシアネート(rhodamine−B−isothiocyanate,RITC)またはCy2、Cy3及びCy5からなる群から選択されることを特徴とする、請求項4に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記キットが、
(1)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドがコーティングされた反応体、
(2)基質との反応によって発色を示す標識体が結合された2次抗体結合体、及び
(3)前記標識体と発色反応する発色基質溶液
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の痴呆症診断用キット。 - 前記2次抗体結合体の標識体が、HRP、塩基性脱リン酸化酵素、コロイドゴールド、蛍光物質及び色素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の痴呆症診断用キット。
- 前記発色基質が、TMB(3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン)、ABTS[2,2'−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)]及びOPD(o−フェニレンジアミン)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載の痴呆症診断用キット。
- (1)対象由来血液を、配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドが付着した固体基板上に処理した後、洗浄する工程、及び
(2)前記基板上でのアミロイドβ抗体の付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法。 - (1)対象由来血液を固体基板上に処理した後、洗浄する工程、
(2)前記基板上に配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドを処理した後、洗浄する工程、及び
(3)配列番号1で表されるAβ22(pE)−42ペプチドの付着程度が、正常なヒトに比べて増加した対象を、痴呆症に罹患している、または罹患する危険がある個体であると判定する工程
を含む、痴呆症診断の情報を提供するためのアミロイドβ抗体検出方法。
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