KR20140069346A

KR20140069346A - 알츠하이머병 （ａｄ）을 진단하는 방법

Info

Publication number: KR20140069346A
Application number: KR1020147012156A
Authority: KR
Inventors: 귄터 슈타플러; 안드레아스 마이르호퍼; 아힘 슈네베르거; 마르티나 루테로바; 발터 슈미트; 프랑크 마트너
Original assignee: 아피리스 아게
Priority date: 2011-10-04
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-06-09
Also published as: BR112014008089A2; CY1115624T1; US9625459B2; AU2012320766B2; DK2579042T3; US20140234877A1; SG11201400229XA; AU2012320766A1; EP2764367B1; SMT201400145B; RU2014117671A; HK1178601A1; US20140242727A1; RS53496B1; EP2764367A1; MX2014003983A; PT2579042E; SI2579042T1; HRP20140937T1; PL2764367T3

Abstract

본 발명은 알츠하이머병 (AD)에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플을 Aβ-응집물 또는 Aβ-응집물 유사 표면을 갖는 입자와 접촉시키고 Aβ-특이적 항체가 Aβ-응집물에 결합되게 하는 단계, 및
단일 입자 검출 기법 바람직하게는, 형광 활성 세포 선별법 (FACS)에 의해 Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체를 검출하는 단계를 포함하여, AD에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플에서 Aβ-특이적 항체를 검출하고;
검출된 Aβ-특이적 항체의 양을 공지된 AD 상태의 샘플중의 양과 비교하여,
알츠하이머병 (AD)를 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병 （ＡＤ）을 진단하는 방법 {METHOD FOR DIAGNOSING ALZHEIMER'S DISEASE (AD)}

본 발명은 특히, 알츠하이머병 (AD)과 관련하여 생물학적 샘플에서 Aβ-특이적 항체를 검출하는 방법 및 알츠하이머병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

AD는 뇌에서 아밀로이드-β 응집 및 플라크 형성, tau 단백질의 과인산화와 신경내 탱글 (intraneuronal tangles)을 포함하는, 상호작용하는 병리학적 연쇄반응을 수반하는 복합적인 진행성 장애이다. 이러한 뇌 단백질의 과인산화 및 응집에 수반되는, 염증 과정은 시냅스 통합성의 손실 및 진행성 신경퇴행에 기여한다.

최종적으로 뇌에서 아밀로이드 플라크를 형성하는, 아밀로이드 β 펩티드 (Aβ 또는 A-베타)의 주로 알파-나선형 또는 랜덤 코일 이차 구조물을 갖는 가용성 형태로부터의 베타-시트 이차 구조물을 갖는 응집된 형태로의 전환은 AD 병리학의 첫 번째 특징 중 하나를 나타낸다. 여러 형태의 Aβ, C- 및 N-말단 절두되거나 개질된 펩티드는 뇌에서 Aβ 플라크 형성에 기여한다. Aβ의 3개의 주요 C-말단 변이체는 펩티드 Aβ1-40 (마지막 아미노산 (aa)으로서 Val-40을 갖는 40개 아미노산으로 구성됨), Aβ1-42, 및 Aβ1-43을 포함한다. 3개의 주요 형태의 C-말단 절두된 펩티드 이외에, 또한 덜 빈번하게 나타나는 다른 절두된 형태, 즉, Aβ1-37, Aβ1-38, 및 Aβ1-39가 존재한다. Aβ의 N-말단 변이체는 Aβ3-40/42/43 및 Aβ11-40/42/43로 구성된다. 모든 이러한 N-말단 절두된 형태에서, 글루탐산은 제 1 위치를 유지한다. 이러한 aa은 안정하지 않으나, 피로글루타메이트 (pE)를 구축하도록 변화되어 Aβp (E)3-40/42 및 Aβp (E)11-40/42의 형성을 유도한다. pE 잔기는 자연적으로 또는 글루타밀 시클라아제로서 공지된 효소에 의해 효소적으로 형성된다.

최근까지, AD의 진단은 또 다른 식별가능한 원인 (예를 들어, 혈관) 없이 환자의 일상에 부정적인 영향을 끼치는, 적어도 2개의 영역 (예를 들어, 인지, 기능)에서 인지 결함의 점진적 발생에 기초한 순수한 임상적 진단이었다. AD의 임상적 진단의 한계는, 높은 비율의 오진 (전문가에 의한 80%의 진단 특이도) 및 질환이 기능적 결함을 초래하는 실질적인 신경 손실을 초래한 경우의 단지 늦은 시점에서 진단이 이루어질 수 있다는 점이다.

최근 이십년에 걸쳐 수집된 지식에 근거하여, AD를 진단하는 방식이 빠르게 변화되고 있다. 비. 두보이스 (B. Dubois) (Paris)가 이끈 연구팀은, 처음으로 조사에 의해 AD의 기초적인 병리학으로 드러난 데이타를 진단학적 알고리즘으로 통합시키고자 하였다 (Dubois et al., Lancet Neurol.9 (2010): 1118-1127). 저자에 따르면, AD의 진단은 질환-특이적 바이오마커 (구조적 MRI에 의해 평가된 경우 해마 위축; AD-전형적인 뇌척수액 시그내처 (signature) (낮은 A42, 높은 총 tau, 높은 포스포Tau); 파지티브 아밀로이드 이미징; 규정된 유전적 위험)의 변화와 함께 발생하는 특이적 인지 결함 (일화적 기억의 변화)에 기초한다. 최근에는, 이러한 병리생리학 유래된 진단 알고리즘은 NIH-NINCDS 연구팀에 의해 크게 이용되었다 (McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 7 (2011): 263-269). 주로 실제적인 목적으로, NIH NINCDS 연구팀은 AD-타입의 MCI (경도인지장애)의 진단을 AD의 초기 단계로서 유지하였다.

질환의 병리학을 반영하는 바이오마커에 의해 AD의 임상적 진단을 향상시키는 개념이 국립 노화 연구소 (the National Institute of Aging) (NIA, NIH, USA) 및 알츠하이머 협회 (the Alzheimer Association)에 의해 임명된 연구팀에 의해 이용되었다. 이렇게 함으로써, AD는 더 이상 진단에서 배제되는 것이 아니라, 확실한 것이 되기 시작한다. NIA 및 AA가 두오비스 및 그 동료들에 의해 제안된 바이오마커-주도의 알고리즘을 완전하게 따르지 않는다는 점은 현재 이용가능한 바이오마커의 한계를 반영한다. AD 뇌척수액 (CSF) 시그내처가 한 예로서 논의될 수 있다. AD 환자의 CSF는 전형적인 패턴 즉, Aβ1-42의 감소 및 총 Tau (tTau)와 포스포Tau (pTau)의 증가를 나타낸다. 시그내처는 AD 환자에 존재하나, 시간에 따른 변화는 검출하지 못한다. 실제로, AD에 대한 위험 환자 군집 (즉, MCI 환자)에서, 이는 임상적 증상이 전개되는 쪽으로 이동하는 환자를 식별한다. 이러한 단계에서는 이미, CSF는 완전히 진행된 AD 환자에서와 동일한 발현 패턴 및 변화량을 보여준다. 따라서, Aβ1-42, tTau 및 pTau에 대한 정상적인 범위를 규정하는 것이 불가능하며, 터닝 포인트 즉, 해당 환자의 예를 들어, 정상으로부터 병리적 상태로 Aβ 생리 변화되는 때의 시점에 대한 규정이 없다. 현재 후속되는 아직 확증되지 않은 임의의 바이오마커에 대해서도 매우 동일하게 적용된다. 이에 대한 주요 원인은, 환자에 노출될 경우의 위험성 및/또는 이와 관련된 비용으로 인해 CSF-, MRI-, 아밀로이드-이미징 실험을 쉽게 반복할 수 있는 것이 아니기 때문에, 이러한 문제를 평가하는 단지 소수개의 추적 연구 (longitudinal study)만 존재한다는 점이다.

이와 같이, 각각 낮은 위험도 및 비용으로 적용될 수 있는 신뢰할만한 바이오마커가 여전히 결여되어 있다. 이는, 혈액-기반 AD 바이오마커를 개발하기 위해 지금까지 행한 모든 노력이 실패했기 때문에 특히 그러하다 (Hampel et al., Nat. Rev. Drug Discov. 9 (2010): 560-574). 이러한 바이오마커의 유용성은 질환-완화 치료법의 개발에 있어서 가장 중요할 것이다. 이러한 치료법이 더욱 일찍 수행될 수록, 성공 가능성은 더욱 크다. 또한, 이러한 노력을 특이적 바이오마커의 도움으로 확인된 진짜 AD 경우로 제한할 수 있다.

지금까지, Aβ(시험한 다양한 Aβ 종 및 응집 상태)는 AD 및 AD의 치매전 상태인 MCI에서 평가되었다. 최근의 발견은, AD 환자 및 건강한 대조군의 혈장 및 뇌척수액에 함유된 IgG 및 IgM의 항-아밀로이드 형성-활성이 있음을 보여준다 (O'Nuallain et al., J. Clin. Immunol.30 (2010) Suppl.1: S37-S42; Marcello et al., J Neural. Transm.116 (2009): 913-920). 다양한 Aβ 형태/응집 상태에 대해 특이적인 IgG 및/또는 IgM을 평가하는 ELISA 또는 면역침강 검정에 의해 수득된 결과는, AD- 및 MCI 환자가 건강한 대조군 보다 더 낮은 수준의 혈청 Aβ 자가-항체를 나타냄을 보여준다. 이러한 연구가 자가-항체 농도에서 차이를 나타낸다 하더라도, 이용된 방법에는, 높은 선택성 및 특이성을 갖는 AD- 또는 MCI 환자를 식별하기 위한 예측적 진단 도구로서 이들을 이용하는데 필요한 민감성 및 특이성이 결여되어 있다. 지금까지 이용된 대부분의 방법은 ELISA 기법을 기반으로 한다. 이러한 검정에서 민감성을 증가시키기 위해, 일부 접근방법은 Aβ1-42 펩티드의 방사성 라벨링을 사용한다. 브레츠슈나이더 (Brettschneider) 등 (Brettschneider et al., Biol. Psychiatry 57 (2005): 813-817)의 ROC (수신자 조작 특성) 분석은, 건강한 대조군과 AD 환자 사이의 차이를 측정하기 위해 클로르아민 T 라벨링된 Aβ1-42로의 면역침강 검정을 이용하여 민감도가 81.3%로 지정될 때 46.7%의 특이도에 도달하였다. 대조적으로, 바이어 (Bayer) 등 (WO 2010/128139 A1; Marcello et al., J Neural. Transm.116 (2009): 913-920)은 피로글루타메이트-Aβ 단편이 플레이트상에 코팅되는 ELISA 기반 방법을 이용하였다. 이러한 경우에, 항-IgM-HRP 항체를 갖는 AD 환자 및 건강한 대조군에서 항-Aβ 특이적 IgM-자가항체의 검출은, 민감도가 80%로 지정된 경우 특이도가 60%인 것으로 나타내었다. 지금까지, 이러한 방법들 어느 것도 AD에 대한 예측적 바이오마커 (>80% 특이도)로서 이들을 적합하게 할 기준을 충족시키지 못하였다.

환자의 이러한 두 그룹에서 Aβ-특이적 항체의 감소된 혈청 농도에 대한 원인은 공지되어 있지 않다. 2개의 일반적이고 상호 비배타적인 설명이 존재한다: 감소된 생성 (질환-특이적 대 일반적인 면역노화) 및 재분배 (항체가 예를 들어, 뇌에 존재하는 아밀로이드 침착물에 포획됨). 상업적으로 이용가능한 혈액 생성물, 즉 건강한 도너로부터 유래된 혈장으로부터 추출된 풀링된 IgG 분획물이 Aβ펩티드에 대해 특이적인 항체를 함유하는 것으로 밝혀졌음을 입증하는 최근 연구로부터, 이러한 Aβ-특이적 (자가)항체의 잠재적 기능이 뒷받침된다. 2개의 이러한 생성물 즉, 두개의 상이한 회사의 정맥내 면역글로불린 (IVIG) 제조물이 AD 병리학을 간섭하거나 예방하는 이들의 잠재성을 평가하기 위해 현재 임상 시험중에 있다.

또 다른 해결되지 않은 의문은, Aβ-특이적 항체의 수준이 이들의 병리생리학 즉, 파킨슨병성 치매 (PDD), 루이소체 치매 (DLB), 대뇌 아밀로이드 맥관병증 (CAA), 만성 두부외상 (예를 들어, 복싱)에서 Aβ 성분을 갖는 질환 실체에서 감소되는지의 여부이다. 이러한 질환에서 Aβ-응집성-특이적 항체 수준의 조사는 AD에서 Aβ-응집물-특이적 항체의 혈청 농도의 감소를 초래하는 과정에 대한 현재 이해도에 더하여질 수 있다. 이들 질환을 갖는 환자의 혈청 조사는, AD가 특이적 면역결핍으로부터 초래되는지 (Aβ-특이적 항체 역가가 단지 AD에서만 감소되며 Aβ 병리학을 특징으로 하는 다른 질환에서는 감소되지 않은 경우) 또는 Aβ-특이적 항체의 감소된 수준은 광범위한 Aβ 병리학으로 인한 재분배로부터 초래되는 지의 여부에 대한 의문을 명확하게 할 수 있다. 전자의 경우, 시험은 고도로 질환-특이적 바이오마커일 것이며, 그 결과, 상기 언급된 질환 실체로부터의 AD 구별을 도울 것이다. 두번째 시나리오인 것으로 가정하면, 시험은 Aβ 병리학에 의해 초래된 질환을 갖는 환자를 식별하기에 적합할 수 있다.

WO 2010/128139 A1에는, AD를 진단하기 위한 바이오마커 및 방법이 기재되어 있으며, 특히 pGlu Aβ에 대한 항체가 기술되어 있다. 펀케 (Funke) 등 (Curr. Alz. Res., 6 (3) (2009): 285-289)은 체액중의 Aβ 응집물 검출이 AD의 초기 진단에 적합한 방법인지의 여부를 논의하였다. 매츨러 (Maetzler) 등 (J. Alz. Dis. 26 (1) (2011): 171-179)은 아밀로이드 및 신경교-유래된 항원에 대한 자가항체가 루이체-관련 치매의 혈청 및 뇌척수액중에서 증가함을 보고하였다. 펀케 등 (Rejuv. Res. 13 (2-3) (2010): 206-209)은 Aβ 응집물에 대한 단일-입자 검출 시스템을 기술하였다. 푸쿠모토 (Fukumoto) 등 (Faseb J., 1 (24) (2010): 2716-2726)은 고분자량 β-아밀로이드 올리고머가 AD 환자의 뇌척수액중에서 증가됨을 기록하였다.

본 발명의 목적은 AD의 진단법을 개선하기 위한 수단 특히, 상기 질환의 초기 단계를 추적하기 위한 수단 및 AD의 치료용 약물에 대한 임상 시험의 개발을 관찰하기 위한 수단을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 생물학적 샘플 특히, 인간 AD 환자 또는 AD에 걸린 것으로 의심되거나 AD에 걸릴 위험이 있는 인간 개체의 샘플에서 항-Aβ 항체를 검출하기 위한 신뢰할만한 도구를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은

- AD에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플을 Aβ-응집물 또는 Aβ-응집물 유사 표면을 갖는 입자와 접촉시키고 Aβ-특이적 항체가 Aβ-응집물에 결합되게 하는 단계, 및

- 단일 입자 검출 기법 바람직하게는, 형광 활성 세포 선별법 (FACS)에 의해 Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체를 검출하는 단계를 포함하여, AD에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플에서 Aβ-특이적 항체를 검출하고;

검출된 Aβ-특이적 항체의 양을 공지된 AD 상태의 샘플중의 양과 비교하여;

알츠하이머병 (AD)를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, AD를 진단하고 AD의 발병을 모니터링하는데 있어서 대단히 유용한 진단 도구로서 이용하기 위한 Aβ-특이적 자가-항체를 검출하는 신규한 방법을 밝혀냈다. 본 방법은 단지 단일 Aβ 펩티드가 Aβ-특이적 항체에 대한 포획 도구로서 사용되는 것이 아니라, 대신에 Aβ-응집물이 사용되며, 이렇게 하여 생성된 항체-Aβ-응집물 복합물이 단일 입자 검출 기법을 이용하여 검출되며, 이러한 항체의 양은 AD의 발병과 관련된다는 본 발명에 기초한다. 본 방법에 의해 검출되는 양이 적을 수록, AD에 대한 질환 상태는 더욱 진행된 것이다. 간단하게는, Aβ-응집물 (다양한 Aβ 절두되고 개질된 버젼으로부터 유래된)은 예를 들어, 밤새 인큐베이션에 의해 생성된다. 후속하여, Aβ-응집물은 건강한 도너 (HD) 또는 AD 환자로부터 유래된 혈청 샘플과 인큐베이션되어 존재하는 항체 (IgG 및 IgM 둘 모두)의 결합을 허용한다. Aβ 응집물에 결합된 항체는 예를 들어, Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체를 인식하는 라벨링된 2차 항체를 사용함으로써 당업자에게 이용가능한 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 피코에리트린 (PE)-라벨링된 2차 항체가 사용될 수 있다. 그 후, Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체 (및 임의적으로, 하나 이상의 검출 작용제 예컨대, 2차 항체)를 포함하는 면역 복합물이 단일 입자 검출 기법 예컨대, FACS (형광 활성 세포 선별법)- 또한, 유동세포 계측법으로서 공지된 분석법을 이용하여 측정된다. 본 발명에 따른 방법을 이용하여, AD 환자가 본 발명에 따라 제공된 Aβ-응집물에 대해 반응성인 Aβ-특이적 면역글로불린 (자유 Aβ-특이적 면역글로불린)을 건강한 피검체와 비교하여 덜 함유하는 것으로 밝혀질 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 방법을 이용하여, AD 환자로부터 유래된 Aβ-특이적 면역글로불린 (본 발명에 따라 제공된 Aβ-응집물에 대한)의 반응성이 데마스킹 (demasking) (자가항체로부터 잠재적으로 결합된 Aβ-항원의 제거)으로서 공지된 공정에 의해 증가될 수 있음이 밝혀질 수 있다. 이는, Aβ-응집물에 대한 반응성의 이러한 증가는 이러한 혈청을 특별한 방식으로 처리한 후에도 검출될 수 없는 겅간한 피검체로부터의 Aβ-특이적 면역글로불린의 반응성과는 대조적이다. 다른 한편으로, 데마스킹 (= 혈청에서 이미 결합된 Aβ의 분리) 후 IgM-항체의 반응성은 AD 환자에서 증가된 수준의 IgM을 나타내었다. 추가적으로, 또한 데마스킹 처리 및 비처리의 IgG 수준의 차이를 측정하였다 (델타 (Δ) 값). 이러한 변수는 또한 건강한 대조군과 비교하여 AD 환자에서 증가되었으며, 이는 질환의 병리학 상태의 항체에서 Aβ에 의한 더욱 높은 항체 점유를 나타낸다. 게다가, 본 발명에 있어서, 본 방법이 Aβ-특이적 항체를 검출하는데 훨씬 더 큰 능력을 가지며, 따라서 지금까지 공개된 방법과 비교하여 AD를 진단하는데 훨씬 더 큰 파워을 가진다는 것을 보여주는 데이타가 제공된다. 이러한 점을 고려해 볼 때, 본 발명에 따른 방법은 AD를 식별하고 치료에 대한 해당 환자의 임상적 반응을 추적하는 예측 진단 도구의 이론적 전제조건을 충족시킨다.

본 발명은 인간 샘플에서 Aβ-특이적 항체의 분석을 위해 개발되었다. 따라서, 바람직한 구체예는 인간 Aβ-특이적 항체, 바람직하게는, 인간 IgG 또는 IgM 항체 특히, 인간 IgG 항체를 검출하는 것이다. 이미 언급된 바와 같이, 인간에서 Aβ-특이적 항체의 검출은 당해 분야에서 원칙적으로 공지되어 있다; 그러나, 가능한 바이오마커로서의 역할은 입증되지 않았다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, 이는 또한, 당해 분야에서 이용가능한 검출 방법의 분석적 결함으로 인한 것이었다. 본 발명에 따른 방법의 우월성으로 인해, 바이오마커로서의 인간 샘플중의 이러한 항체를 이용가능하게 할 수 있다. 따라서, 본 방법은 생물학적 샘플에서 자가항체를 검출하는데 특히 적합하다. 따라서, 본 방법의 바람직한 구체예에서, 검출되고 정량화될 자가항체는 Aβ-특이적 항체이다.

종래 기술의 방법과 대조적으로, 본 방법은 샘플로부터의 Aβ-특이적 항체와 결합하기 위한 프로브로서 Aβ-응집물을 사용한다. 이러한 응집물은 원칙적으로 당해분야에 공지되어 있으나, 특히 인간 샘플중의 Aβ-특이적 항체의 분석에서 이러한 응집물을 사용하여, 또한, 단일 입자 검출 기법 예컨대, FACS와 함께 이러한 방법을 현저하게 개선시킬 수 있음을 인지하지 못하였다. 이러한 응집물의 사용으로 인해, 단일 입자 검출 기법 (이는 여러 다양한 분야 및 다양한 문제에서 확립된 기법임)으로의 검출로, 일반적으로 조작하기에 매우 복잡하고 어려운 인간 샘플 (예컨대, 혈액)에서 Aβ-특이적 항체를 분석하는 것이 가능하다.

바람직하게는, 본 발명에 따라 사용될 응집물의 크기는 분석적 용도를 위해 표준화된다. 이는 응집물의 생성 동안 특정 변수를 확립함으로써 수행될 수 있다. 응집물의 생성 동안 적용된 조건에 따라, 응집물의 크기가 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 Aβ-응집물의 바람직한 크기는 50nm 내지 15μm, 바람직하게는, 100nm 내지 10μm, 특히, 200nm 내지 5μm이다 (응집물의 길이 (즉, 가장 긴 길이)에 의해 규정됨).

본 발명에 적합한 응집물을 제공하는 바람직한 방법은 pH 2 내지 9에서 20분 이상, 바람직하게는, 1시간 이상, 특히 4시간 이상 동안 Aβ-1-42 펩티드, Aβ-1-43 펩티드, Aβ-3-42 또는 Aβ-p(E)3-42 펩티드 또는 덜 바람직하게는, C-말단에서 절두된 Aβ-펩티드 예컨대, Aβ-1-40 펩티드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 인큐베이션 기간은 응집물의 크기를 조절하기 위한 변수중 하나이다: 인큐베이션을 길게 하면, 응집물이 더 커진다. 전형적인 인큐베이션 시간은 10분 내지 24시간이다. 더 짧은 인큐베이션 시간은 일반적으로, 단지 매우 짧은 응집물 및 적은 수의 응집물을 유도한다; 48시간을 초과하는 현저하게 더 긴 인큐베이션 시간으로 생성된 응집물은 일반적으로 본 방법에 바람직하지 않다. 물론, 응집물은 또한, 필요에 따라, 예를 들어, 분별 원심분리 및 유사한 기법에 의해 분류되고 "체질"되어 소정의 크기에 도달할 수 있다.

본 방법에 있어서, 검출하고자 하는 Aβ-특이적 항체를 Aβ 응집물과 접촉시켜 어쩌면 샘플중에 존재할 (및 Aβ-응집물에 대한 반응성) Aβ-특이적 항체의 결합을 달성한다. 따라서, Aβ-응집물의 농도는 항체에 대한 충분한 결합 지점을 제공하기 위해 조절되어야 한다. 따라서, 샘플중의 항체와 결합하기 위한 Aβ-응집물의 농도는 바람직하게는, 0.001 내지 1μM, 바람직하게는, 0.01 내지 0.1μM의 범위이다. 최적의 농도는 또한, 결합되는 항체의 특성, 샘플의 특성, 계획된 접촉 시간 및 응집물의 크기에 좌우된다.

본 방법은 인간 샘플에 적용하는 것을 주로 목적으로 한다. 따라서, 생물학적 샘플이 인간 혈액 또는 인간 혈액으로부터 유래된 샘플 바람직하게는, 인간 혈청 또는 인간 혈장; 인간 뇌척수액 또는 인간 림프액인 것이 바람직하다. 이러한 샘플 공급원으로, 또한 일련의 일정한 시험이 확립될 수 있다 (특히, 혈액으로부터 유래된 샘플에 있어서).

샘플중의 항체가 응집물로 적절하게 결합되게 하는 바람직한 접촉 시간은 10분 이상 (예를 들어, 10분 내지 48시간), 바람직하게는, 15분 내지 24시간, 특히 30분 내지 2시간이다.

생물학적 샘플이 특정하게 전-처리되지 않은 경우, Aβ 응집물에 대한 결합 능력을 갖는 Aβ-특이적 항체는 접촉 동안 Aβ-응집물과 결합할 것이다. 샘플중의 마스킹된 Aβ-특이적 항체 (즉, 결합 파트너에 이미 결합된 그러한 항체 (예를 들어, Aβ 포함 구조물 또는 내인성 Aβ 펩티드))는 본 발명에 따른 방법에 의해 검출되지 않을 것이다 (이러한 특정 샘플 전-처리의 부재시). 대부분의 경우 반응성 항체만의 식별 및 정량화가 충분하고 바람직하지만, 샘플중의 Aβ-특이적 항체의 총 양을 검출해야 하거나 (반응성 및 비반응성), 또는 반응성 Aβ-특이적 항체의 수, 비반응성 ("마스킹된") Aβ-특이적 항체의 수 및 Aβ-특이적 항체의 총 수를 모두 검출해야 하는 상황 또는 진단적 문제가 있을 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 샘플은 데마스킹되고, 즉 Aβ-특이적 항체는 본 발명에 따른 Aβ 응집물과 접촉되기 전에 샘플중에 존재하는 결합 파트너로의 임의의 결합으로부터 "자유롭게"된다. 이는 샘플중의 결합 파트너에 결합되지 않은 이러한 항체 ("자유" 또는 "반응성" 항체)의 검출 뿐만 아니라, 샘플중의 모든 Aβ-특이적 항체의 검출을 허용한다. 본 발명의 과정에서, 반응성 Aβ-특이적 항체 특히, 반응성 Aβ-특이적 IgG의 양이 AD의 진단 및 발병에 대한 주요 마커인 것으로 결정되었다. 상기 언급된 바와 같이, 본 방법은 또한, 샘플중의 Aβ-특이적 항체 즉, 샘플중의 자유 (또는 "반응성") 항체 및 (예를 들어, Aβ 구조물에) 이미 결합된 이러한 항체의 전체 양을 측정하는데 적합하다. 이는 AD 진단에 또한, 매우 중요한 변수인 샘플중의 반응성 항체 대 비반응성 항체의 차이 (Δ)를 확립하는데 도움이 될 수 있다. Aβ-특이적 IgG 및 Aβ-특이적 IgM 둘 모두와 관련하여, AD에 대한 "건강한 상태"의 인간에서는 이러한 차이가 존재하지 않는 반면 (또는 낮은 반면), AD에서 이러한 차이는 중대한 마커 기능을 갖는다. AD 진단에 대한 변수로서 Aβ-특이적 IgM을 이용하기 위해, 본 방법을 수행하기 전의 데마스킹 단계가 특히 우선시되며, 따라서 샘플중의 반응성 항체 대 비반응성 항체의 차이 (Δ)가 규정될 것이며 관련 변수로서 이용될 것이다.

본 발명에 따른 방법은 단일 입자 검출 기법을 적용한다. 이러한 기법에 의해 Aβ-응집물로의 Aβ-특이적 항체의 "파지티브" 결합 결과의 수와 양을 확인하고 정량화 ("계수")할 수 있다. 본 기법의 바람직한 구체예는 본 분야에서 확립된 기법인 FACS이다. Aβ-응집물에 결합된 항체를 검출하는데 사용되는 다른 검출 방법은 예를 들어, 루미넥스 (Luminex) 또는 질량 세포계측법이다.

루미넥스 기법에 있어서, 샘플 제조는 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 샘플 제조 후, 특정 Aβ-특이적 항체에 의해 인지된 Aβ-응집물은, 멀티플렉스 검출 시스템 예를 들어, 루미넥스 판독기로 검출될 수 있는 형광-염색된 마이크로스피어에 결합된 2차 항체에 의해 검출될 수 있다 (Binder et al., Lupus 15 (2005):412-421).

질량 세포계측법이 단일 입자 검출 기법으로서 이용되는 경우, 샘플 제조는 또한 하기 실시예 부분의 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 샘플 제조는 기술된 바와 같이 수행된다. 샘플 제조 후, 특이적 Ab에 의해 인지된 Aβ-응집물은, 원자 질량 분광분석법에 의해 검출될 수 있는 전이 원소의 안정한 동위원소에 결합된 2차 항체에 의해 검출될 수 있다. 그 후, 샘플은 >5,500K의 온도로 가열된 아르곤 플라즈마 충전된 유도 코일을 통해 분무될 수 있다. 샘플은 증발되고, 이의 원자 성분으로 이온화되며, 동위원소-태깅된 항체의 수는 비행시간 (time-of-flight) 질량 분광분석법에 의해 정량화된다 (Janes et al., Nat. Biotechnol. 29 (2011): 602-604).

대안적으로, 단일 입자 검출 기법을 적용하는 것이 또한 가능하며, 여기서 하나의 결합 파트너 (Aβ-응집물 또는 항체/혈청)가 고정되나, 결합은 유동 조건하에서 측정된다. 예로는 하이브셀테크놀로지 (Hybcelltechnology) 및 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance) 기법이 있다. 본 발명에서 하이브셀테크놀로지를 이용하여, 혈청 샘플은 하이브셀 (Hybcell) (회전 실린더)의 표면상에 스팟팅될 수 있으며, 인큐베이션은 직접적으로 형광-라벨링된 사전인큐베이션된 Aβ-응집물 또는 대안적으로, 형광-라벨링된 모노클로날 Aβ-특이적 2차 항체를 이용하여 수행될 수 있다. Aβ-응집물에 결합된 항체는 레이저에 의해 검출된다 (Ronacher, Anagnostics Technical Note ANA-TN-005 (2010)). 표면 플라스몬 공명이 본 발명에 따른 방법에 이용되는 경우, 역방향 셋업이 적용될 수 있다: 사전인큐베이션된 Aβ-응집물이 칩 표면상에 고정될 수 있다. 혈청으로부터의 Aβ-특이적 항체의 칩상의 Aβ-응집물로의 결합은 칩 표면상의 질량 증가에 의해 검출될 수 있으며, 따라서, 결합 파트너를 라벨링시킬 필요가 없다. 민감성을 증가시키거나 IgG-서브타입을 확인하기 위해, 항-IgG-AB의 일련의 주입이 가능하다 (Cannon et al., Anal. Biochem. 328 (2004): 67-75). Aβ-응집물을 칩 표면에 직접적으로 고정시키는 대신에, 포획 항체가 이용될 수 있다. 이러한 셋업에 있어서, Aβ-특이적 항체가 칩 표면상에 고정된 후, 사전인큐베이션된 Aβ-응집물이 주입된다. 응집물의 포획 후, 혈청이 주입되고, 질량 증가에 의해 반응성이 측정된다.

본 발명에 따른 Aβ-응집물로의 Aβ-특이적 항체의 결합 검출은, 2차 항체 (예를 들어, 라벨링된 2차 항-IgG-항체 또는 항-IgM-항체)에 의해 Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체를 검출하기 위한 공지된 임의의 적합한 방법 예를 들어, 형광 분광법 (Fluorescence Spectroscopy) (Missailidis et al., Methods in Molecular Biology 248 (2003): 431-441)에 의해 수행될 수 있다.

응집물에 결합된 자가항체의 검출은 또한, 프로테인 A (Protein A) 또는 프로테인 G (Protein G)와 같은 기질 특이적 결합 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 가능성은 Aβ-응집물을 사용하여 Aβ-응집물 특이적 자가항체를 침전시키고, 복합물을 세척하고, 항체를 바이오티닐화시키는 것이다. 그 후, 스트렙타비딘이 제 2 단계 시약로서 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, Aβ-응집물 유사 표면을 갖는 입자는 이들의 표면상에 Aβ-응집물이 고정된 비드 특히, 자성 비드이다.

공지된 AD 상태의 샘플은 본 발명에 따른 방법에 의해 평가되는 샘플의 분류를 허용하는 임의의 샘플 값일 수 있다. 이는 공지된 AD-상태의 인간 (예를 들어, AD에 걸리지 않은 건강한 인간 또는 AD 환자, 특히 (예를 들어, 간이정신상태검사 (Mini-Mental State examination) (MMSE)에 의해 측정된) 공지된 질환 상태의 AD 환자)의 실제적인 물리적 샘플 또는 비교 값 예컨대, 교정 곡선일 수 있다. 바람직한 교정 곡선은 AD 상태 교정 곡선 특히, MMSE 곡선에서 동일한 유형의 샘플 (예를 들어, 혈액 샘플)중의 Aβ-특이적 항체의 비교 양을 포함한다. 표준화된 검정 시스템에서, 본 발명에 따라 검출된 Aβ-특이적 항체의 절대량은 AD 상태와 상관관계에 있을 수 있다. 상이한 시점에서 해당 환자에 대한 Aβ-특이적 항체의 양의 감소는 질환의 진행을 나타낸다.

규정된 질환 상태 (예를 들어, "건강함", 경도 AD, 진행된 AD, 또는 MMSE 등급에 따라)에 대해 샘플중의 Aβ-특이적 항체의 특정 역치값을 규정하는 것이 또한 가능하다. 물론 역치값은 샘플 및 정확한 검출 시스템에 좌우되나, 본 발명이 수행되는 임의의 표준화된 방법에 대해 개발될 수 있다. 건강한 인간의 혈청중의 Aβ-특이적 IgG 농도는 일반적으로 1000 내지 5000ng/ml인 반면, AD 환자의 IgG 농도는 일반적으로 훨씬 더 낮으며 예를 들어, 250 내지 1500 ng/ml의 범위이다. AD 환자 대부분은 1000ng/ml 미만이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 샘플중의 역치 수준 보다 더 낮은 Aβ-특이적 항체의 양의 검출은 AD를 나타내며, 여기서 역치 수준은 1500 ng/ml 또는 그 미만, 바람직하게는, 1000 ng/ml 또는 그 미만, 특히, 750 ng/ml 또는 그 미만이다. 다른 한편으로, AD 치료 과정 특히, 면역요법에 의한 AD 치료 과정에서 이러한 IgG 농도의 증가는 성공적인 면역요법임을 나타낸다. 예를 들어, 수준이 750 ng/ml 미만으로부터 1000 ng/ml 초과 또는 심지어 1500 ng/ml 초과로 증가하는 경우, 이는 성공적인 면역요법임을 나타낼 것이다.

바람직하게는, Aβ-특이적 항태의 검출된 양은, 샘플이 인간으로부터 취해진 시간과 동일한 시간에서 동일한 인간의 MMSE 결과와 상관관계에 있다.

본 발명에 따른 방법은 AD의 발병과 관련하여 해당 AD 환자를 모니터링하는데, 특히 본 발명에 따른 진단 결과를 AD 상태를 측정하기 위한 다른 진단 도구와 연관시키고/거나 치료학적 개입의 효율성을 모니터링하는데 특히 효과적이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 상이한 시간에 취해진 동일한 인간의 샘플에 대해 2회 이상 수행된다. 바람직하게는, Aβ-특이적 항체의 검출된 양은, 샘플이 인간으로부터 취해진 시간과 동일한 시간에서 동일한 인간의 MMSE 결과와 상관관계에 있다. 해당 환자에서 AD 발병을 모니터링하기 위해, 일정한 간격 예를 들어, 각 6개월에 1회 이상, 바람직하게는, 각 3개월에 1회 이상, 특히, 각 1개월에 1회 이상으로 본 발명에 따른 방법을 수행하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 방법은 시간에 따른 모니터링 방식으로 AD 진단과 관련하여 이용하는데 특히 적합하다. 본 발명에 있어서, 인간 환자에서 Aβ-특이적 자가항체는 AD 상태에 대한 마커로서 제공된다. 인간의 혈액중 Aβ-특이적 항체가 "정상" 수준인 인간은 AD와 관련하여 "건강"하다. 이러한 수준이 AD 환자 또는 AD가 발병할 위험이 있거나 AD에 걸린 것으로 의심되는 피검체에서 변화되는 경우, 이러한 변화 수준은 AD와 관련이 있다. "변화된" 수준은 Aβ-특이적 항체의 절대수의 변화 또는 Aβ-특이적 항체 (예를 들어, Aβ-특이적 항체의 해당 부류 (IgG, IgM, 등))의 전체의 반응성의 변화일 수 있다. 예를 들어, 감소된 반응성 Aβ-특이적 IgG는 AD와 관련이 있으며, AD에 대한 마커이다. 다른 한편으로, IgM에 있어서, 다른 방향으로의 (비-반응성; 즉, 결합되거나 마스킹된) Aβ-특이적 IgM 수준의 변화는 AD에 대한 마커 기능을 갖는다. 본 방법에 있어서, 반응성 Aβ-특이적 IgG의 "건강한" 수준을 100%로 설정한 경우, 반응성 Aβ-특이적 IgG의 현저한 감소 예를 들어, 70% 및 그 미만, 50% 및 그 미만, 또는 30% 및 그 미만으로의 감소는 AD의 발병을 나타낸다. 다른 한편으로, Aβ-특이적 IgM의 "건강한" 수준을 100%로 설정한 경우, 혈액 샘플중의 30% 이상, 예를 들어, 50% 이상 또는 100% 이상의 전체 IgM (반응성 + 비반응성)의 증가는 AD의 발병을 나타낸다.

따라서, 본 발명을 이용하기에 바람직한 분야는 알츠하이머병 (AD)의 진단이다. 그러나, 본 발명은 Aβ ("Aβ 병리학")에 연관되거나 관련된 모든 병리학 특히, Aβ 침착물이 질환의 과정중에 발생하는 병리학에 이용가능하다. 이러한 Aβ 병리학에 대한 예는 파킨슨병성 치매 (PDD), 루이소체 치매 (DLB), 대뇌 아밀로이드 맥관병증 (CAA), 포함체 근육염 (IBM; 특히, 산발적 IBM (sIBM)), 또는 만성 두부외상 (예를 들어, 복싱)이다.

본 발명이 AD 및 심지어 AD의 발병에 대한 마커를 제공하기 때문에, 질환의 발병 및 가능한 치료 방법의 성능을 관찰하는데, 특히, 치료 방법이 "건강"하거나 "더욱 건강한" 수준의 Aβ-특이적 항체, 특히 IgG 또는 IgM을 확립할 수 있는지의 여부를 관찰하는데 본 방법을 이용하는 것이 가능하다.

따라서, 본 방법은 바람직하게는, AD 환자 특히, AD 치료용 또는 개선용 약제로 치료하고 있는 AD 환자를 모니터링하는데 이용된다. 본 방법은 AD 백신 (예를 들어, WO 2004/062556 A, WO2006/005707 A, WO2009/149486 A 및 WO 2009/149485 A에 따른 AD 미모토프; 또는 WO 99/27944 A에 따른 Aβ-유래된 백신을 이용) 또는 Aβ-타겟팅 질환-완화 약물에 대한 임상 시험에서 환자를 관찰하는데 성공적으로 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 또한, AD 발병 위험을 평가하거나 초기 단계 AD를 검출하는데 이용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 인지 장애의 시점 보다 현저하게 더 빠른 시점에서 Aβ-특이적 자가항체에 대해 환자의 면역학적 셋업의 변화를 검출하는 것이 원칙적으로 가능하게 된다. 이는 일정한 시험 포맷이 확립되는 경우, 군집의 더 큰 부분에 있어서 AD의 조기 진단의 현저한 개선을 허용할 수 있다. 이는 환자들을 AD에 대한 초기 상태 치료 요법 및/또는 예방 (또는 지연) 전략 특히, 백신접종에 적격이 되게 할 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 하기를 포함하는 키트에 관한 것이다:

- Aβ-응집물, 및

- 특히, 인간 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장)에 대한 샘플 컨테이너.

바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 Aβ-특이적 항체 바람직하게는, 2차 항체, 특히 라벨링된 2차 항체 예를 들어, 항-IgG-항체 또는 항-IgM-항체에 결합되는 Aβ-응집물을 검출하기 위한 수단을 추가로 함유할 수 있다. 추가의 성분은 표준 샘플, 파지티브 및/또는 네거티브 대조군, 사용 설명서 및 적합한 패키징 수단 (예를 들어, 안정한 박스, 색 유리병, 등)일 수 있다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명될 것이나, 이로 제한되지는 않는다.
도 1은 FACS-분석을 이용한 Aβ-응집물의 크기 측정을 보여준다. 티오플라빈 T 파지티브 Aβ1-42 응집물은 유동세포 계측법을 이용하여 검출될 수 있으며, FL1-FITC A (로그-스케일 (log-scale))- 및 FSC-A (로그-스케일) 채널에서 균일한 군집으로서 도트 블롯으로 묘사된다 (A). Aβ-응집물의 크기 분포 (FCS-A 시그널에 의해 규정됨)는 FSC-A-히스토그램에 도시된 바와 같이 상업적으로 이용가능한 교정된 크기 비드 (1, 2, 4, 6, 10, 및 15 ㎛)를 사용하여 측정된다 (B).
도 2는 FACS-기반 검정을 이용한, Aβ-응집물에 대한 모노클로날 항체 반응성의 검출을 도시한다. Aβ1-42 모노클로날 항체 3A5는 특히 Aβ1-42 응집물에 특이적으로 결합하나 (A), Aβp(E)3-42 응집물과 상호작용하지 않는다 (C). 반대로, Aβp(E)3-42 특이적 항체 D129는 Aβp(E)3-42에 결합하나, Aβ1-42 응집물에는 결합하지 않는다 (B+D). 반응성은 FL2-PE-채널에서 항 면역글로불린-PE-라벨링된 2차 항체를 사용하여 측정하였다. B 및 C에서 도시된 바와 같은 형광 강도는, 응집물이 단독의 PE-라벨링된 2차 항체와 인큐베이션되는 경우 관찰되는 바와 같은 배경 염색을 나타낸다.
도 3은 3개의 상이한 방법에 대한 검정 민감도의 비교를 나타낸다. (A) Aβ1-42 응집물을 IVIG의 일련의 희석물과 인큐베이션하고, 반응성을 유동세포 계측법을 이용하여 FL-2 채널에서 측정하였다. (B) 밤새 pH 9.2에서 Aβ1-42로 코팅된 Maxisorp ELISA 플레이트상의 IVIG 적정. (C) 표면 플라스몬 공명을 이용하여 SA-Chip상에 고정화된 주로 바이오티닐화된 Aβ1-42와 상호작용하는 다양한 농도의 IVIG의 라벨 프리 검출 (BiaCore). 비교를 위해 모든 결과는 폴드-백그라운드 시그널 (fold-background signal)로 제공됨에 주목하라.
도 4는 지시된 혈청 샘플중의 Aβ-특이적 IgG 자가-항체 반응성의 측정을 나타낸다. 건강한 도너 (30세 내지 50세)로부터의 대조군 혈청 또는 AD-환자로부터 유래된 혈청을 기술된 FACS 검정으로 처리하였다. Aβ-응집물의 형광 강도를 FL2-PE 채널에서 평가하고, 중간 형광 강도 (MFI)로 나타내었다.
도 5는 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 도너로부터 유래된 혈청으로부터의 IgG 특이적 항-Aβ1-42 반응성을 비교하였다.
도 6은 IgG 반응성과 간이정신상태검사 (MMSE) 스코어의 상관관계를 보여준다. 24명의 AD-환자를 MMSE 상태에 대해 실험하고, 이들 환자의 혈청을 기술된 FACS 검정으로 처리하여, 중간 FI를 측정하였다. 수집된 데이타의 상관관계는 결과 및 종전 도면에 나타내었다.
도 7은 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 도너로부터 유래된 혈청으로부터의 IgG 특이적 항-Aβ3-42 반응성을 비교하였다.
도 8은 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 도너로부터 유래된 혈청으로부터의 IgG 특이적 항-Aβp(E)3-42 반응성을 비교하였다.
도 9A는 지시된 혈청 샘플중의 Aβ-특이적 IgM 자가-항체 반응성의 측정을 나타낸다. 건강한 도너로부터의 대조군 혈청, 또는 AD-환자로부터 유래된 혈청을 기술된 FACS 검정으로 처리하였다. Aβ-응집물의 형광 강도는 FL2-PE 채널에서 평가하고, 중간 형광 강도 (Median Fluorescence Intensity) (MFI)로서 나타내었다. 도 9B는 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 도너로부터 유래된 혈청의 IgM 특이적 항-Aβ1-42 반응성을 비교하였다.
도 10은 항체 데마스킹 후 지시된 혈청 샘플중에서 Aβ-특이적 IgM 자가-항체 반응성의 측정을 나타낸다. 건강한 도너 (HI)로부터의 대조군 혈청 또는 AD-환자로부터 유래된 혈청을 기술된 데마스킹 공정에 따라 처리하고, 그 후, FACS 검정을 수행하였다. Aβ-응집물의 형광 강도를 FL2-PE 채널에서 평가하고, 중간 형광 강도 (MFI)로서 나타내었다.
도 11은 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 도너로부터 유래된 혈청의 IgM 특이적 항-Aβ1-42 반응성을 자가-항체 데마스킹 후 비교하였다.
도 12는 ROC 곡선 분석을 나타낸다. AD 환자로부터 유래된 혈청과 건강한 개체로부터 유래된 혈청의 IgG 특이적 항-Aβ1-42 반응성을 항원 분리 전 및 후에 분석하였다. 델타 값을 ROC 곡선 계산에 이용하였다.
도 13은 AFFITOPE-백신으로 처리된 환자에서 백신접종 전, 접종 동안 및 접종 후 Aβ-응집물-특이적 IgG 항체를 나타내는 절대 MFI 값을 보여준다. 알룸 (ALUM) 존재 (환자 A) 및 알룸 부재 (환자 B)의 면역화된 환자로부터 유래된 혈청의 Aβ1-42-반응성이 도시된다. Aβ-응집물의 형광 강도는 FL2-PE 채널에서 평가하고, MFI로서 나타낸다.
도 14는 알룸 존재 및 부재의 AFFITOPE-백신으로 면역화된 환자로부터의 중간 MFI 값으로 나타낸 Aβ1-42-응집물에 대한 면역반응성의 통계분석을 보여준다. 애주번트 그룹에서 극단적인 하나로 인해, 만-휘트니-테스트 (Mann-Whitney-test)를 수행하였다 (비정상적 분포) (A). 극단적인 것을 제거한 후, 정상적인 분포가 이루어졌으며, 스튜던트 t-테스트를 수행하였다 (B). 두 시험 모두는 통계학적으로 유의하였다 (p<0.05).

실시예;

재료 및 방법

표면 플라스몬 공명 (SPR-BIAcore)을 이용한 Aβ-특이적 항체의 검출

바이아코어 시스템 (Biacore system)은 고정화에 사용될 수 있는 다양한 칩을 제공한다. 본 실험을 위해, 스트렙타비딘 (SA) 코팅된 칩을 사용하였다. 측쇄를 통한 칩 표면으로의 리간드의 비특이적 결합을 방지하기 위해, C-말단의 바이오티닐화된 Aβ-펩티드 (Anaspec로부터 구매)를 사용하였다. 바이오틴-스트렙타비딘 복합물이 극도로 안정적이기 때문에, 연장된 일련의 실험에 대해 가장 적합하다. 칩의 견고성을 최적화시키고 따라서 재현성을 최적화시키기 위해, 최대 반응 유닛 (~1500RU)을 유동 세포상에 고정시킨 반면, 유동 세포 1은 비게 놔두어 참조로서 이용하였다. 칩 표면상으로의 비특이적 결합을 피하기 위해, 자유 바이오틴을 사용하여 모든 4개의 유동 세포상에서 자유 SA 결합 부위를 포화시켰다. 인간 샘플 (pH 7.4 HBS에서 1:10 내지 1:100으로 희석됨) 및 1 mg/ml 내지 10 ㎍/ml 범위의 IVIG의 일련의 희석물을 측정하였다 (마찬가지로 pH 7.4 HBS에서 희석됨). 칩 표면을 10mM 글리신-HCl (pH 1.8)로 각 샘플 주입 후 재생시켰다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. 200초의 결합 페이스로 시작하여 600초의 분해 페이스로 이어지는 표준화된 프로토콜이 주입에 이용되었다. R_max 값은 샘플 주입 말기에서의 반응 수준 (RU로 측정됨)으로서 규정된다. 시그널 평가에 있어서, R_max 값은 통합된 BIA-평가 소프트웨어를 사용하여 측정되었다.

ELISA를 사용한 Aβ-특이적 항체의 검출

다양한 Aβ-펩티드 (rPeptide로부터 구입)를 5㎍/ml의 농도에서 100mM NaHCO₃ (pH 9.2)로 희석하고, Maxisorp 96-웰 플레이트상으로 밤새 코팅시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해, 37℃에서 1시간 동안 1% BSA/PBS를 사용하여 플레이트를 차단하였다. ELISA를 인간 혈청 샘플의 일련의 희석물 (1:10의 희석으로 시작함)로 수행하거나 결합 완충제 (PBS/0.1% BSA/0.1% Tween 20)중에 희석된 1mg/ml로부터 10㎍/ml 범위의 농도로 IVIG를 37℃에서 1시간 동안 첨가하여 수행하였다. PBS/0.1% Tween20으로의 반복된 세척 단계 (3x) 후에, 2차-인간 Ig HRP (0.5㎍/ml) 검출-항체를 1시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 샘플을 다시 3x 세척하고, ABTS (O.1M 시트르산 pH 4.3중의 0.68mM)를 검정 디벨로프먼트 (assay development)을 위해 30분 동안 첨가한 후, 405nm 파장에서 플레이트 리더 (Biotek - Gen5 Program) 상에서 OD-측정하였다.

FACS 분석을 이용한 Aβ-특이적 항체의 검출

분석 전에, 동결건조된 β-아밀로이드 펩티드를 탈응집 과정으로 처리하였다. 이러한 목적을 위해, 동결건조된 Aβ 종을 1% NH₄OH (pH 11)중에 용해시켰다. 그 후, 용해된 Aβ 펩티드를 분취하여 -20℃에서 저장하였다. 응집물 형성을 유도하기 위해, 다양한 Aβ-종을 쉐이커 (350rpm)상에서 37℃하에 수용액 (pH 5)중의 20μM 농도로 에펜도르프 튜브중에서 밤새 인큐베이션하였다. Aβ-응집물의 형성은 FACS (FSC/FL1)중의 티오플라빈 T (ThT) 염색에 의해 확인될 수 있었다. 응집된 Aβ 종을 멸균 여과된 0.5% BSA중에 0.15μM으로 희석하고, 96-웰 플레이트상에서 95㎕의 최종 용적으로 30분 동안 사전-인큐베이션하였다. 5 ㎕의 사전-희석된 인간 혈장 또는 Ab (0.5% BSA/PBS 중)를 95㎕의 Aβ-응집물-용액에 첨가하였다. 혈장의 최종 희석은 1:1000 내지 1:10,000 범위이다. 모노클로날 항체에 있어서, 0.5㎍/ml 미만의 농도를 이용하였다. 쉐이커 (350rpm)상에서 실온 (RT)하에 45 또는 60분 동안 인큐베이션한 후, 200㎕의 0.5% BSA/PBS를 모든 웰에 첨가하고, 3000 rpm (96-웰 플레이트-원심분리)에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세척 단계를 200㎕의 0.5% BSA/PBS로 다시 반복하였다. 제 2 세척 후, SN을 버리고, 펠렛을 라벨링된 2차 항-IgG (H+L)-PE의 1:1000 희석물 또는 항-IgM, Fc5μ 항체의 1:500 희석물 (둘 모두 Jackson Immuno Research)을 함유하는 100㎕ 0.5% BSA/PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 쉐이커 (350rpm)상에서 RT하에 또 다시 45 또는 60분 동안 인큐베이션하고, 고-처리량 샘플러 (HTS)가 장착된 FACS Canto상에서 측정하였다. 응집물을 FSC/SSC에서 게이팅하고, 각각의 평균 중간 형광 강도 (MFI)를 측정하고, FL2-PE 채널에서 평가하고, ThT의 Aβ-응집물에 대한 반응성을, FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 FL1-FITC 채널에서 측정하고 평가하였다.

데마스킹

환자 혈청중에 존재하는 것으로 여겨지는 Aβ로의 Aβ 특이적 자가-항체의 결합을 파괴하고, 따라서 항원-기반 방법 (예컨대, ELISA 또는 FACS)에 의해 이러한 Aβ 결합된 자가-항체의 검출을 방지하기 위해, 혈청을 5분 동안 1:16.7의 희석비로 10mM 글리신 pH2.6중에 사전-희석하였다.

자가-항체로의 Aβ 항원의 잠재적 결합을 파괴하기 위해, 혈청을 5분 동안 1:16.7의 희석비로 10mM 글리신 pH2.6에서 사전-희석하였다. 그 후, 5㎕의 산성화된 혈청을 또 다른 5분 동안 3㎕의 Aβ1-42 (100㎍/ml)와 공동-인큐베이션하였다. 그 후, 92㎕의 0.5%BSA/PBS을 첨가하여 혼합물을 중화시키고, 20 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계 및 2차 항체와의 인큐베이션을, 비-데마스킹된 혈청에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.

결과

Aβ-응집물: 올리고머화 및 피브릴 형성

모노머 Aβ로부터의 Aβ-응집물 (Aβ 올리고머, 피브릴 및 피브릴 응집물 포함)의 형성을 최근 수년간 다양한 조건하에서 집중적으로 조사하였다. Aβ 펩티드의 응집이 pH, 온도, 완충제 조성물 및 단백질 농도를 포함하는 다양한 조건에 매우 크게 의존적임을 발견하였다. 응집은 모노머로부터의 β-헤어핀의 형성으로 시작되어 가용성 올리고머로 유도된다. 그 후, 평행하는 β-시트로의 형태 변이는 피브릴 및 피브릴 응집물의 형성을 유도하며, 이들은 원심분리에 의해 침전될 수 있다. 최근의 발견은, pH 7.4에서 생성된 Aβ40 및 Aβ42 응집물이 다발 (15 내지 25nm 폭의 필라멘트로)로 비스듬히 결합되는 경향이 약간 있는 5nm 폭 필라멘트를 지닌 피브릴을 포함함을 보여주었다. 이러한 단일 피브릴의 길이는 투과형 전자 현미경으로 측정하는 경우 서브-마이크로미터 (50-100nm) 내지 10-15㎛ 범위에 있다. 이러한 Aβ 피브릴의 한 특징은 이들이 형광 염료 티오플라빈 T (ThT) 사이에 특이적으로 삽입된다는 점이다.

본 발명에 있어서, ThT 사이에 삽입된 다양한 Aβ 펩티드 변이체 (Aβ1-42, Aβ3-40, 및 Aβp-(E)3-40)의 Aβ 응집물이 생성되었다. 이러한 Aβ 응집물은 FACS-분석을 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 목적을 위해 MM에 기술된 바와 같이, 시드 비함유의 가용성 Aβ 펩티드를 20μM의 농도로 37℃하에 20시간 동안 인큐베이션하였다. 도 1A (상위 패널)의 ThT 파지티브의 분명한 균질의 군집 (FL1 (FITC) 파지티브 시그널로서 측정됨)으로 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라 개발된 FACS 검정은 시험관내 생성된 Aβ 응집물의 분석을 허용한다. Aβ 응집물의 크기 분포 (전방 스캐터 FSC-A에 의해 규정됨)는 1 내지 15㎛ 범위의 교정된 크기 비드를 사용하여 분석되었다 (분자 프로브 (Molecular probes)의 유동세포 계측 크기 교정 키트 (Flow Cytometry Size Calibration Kit (Cat.# F-13838)) (도 1의 하위 패널). 이러한 분석을 이용하여, 생성된 Aβ 응집물의 크기가 서브-마이크로미터 범위 내지 10㎛의 예상된 바와 같은 범위이며, 생성된 응집물의 대부분이 ~200nm 내지 3㎛ 범위인 것으로 나타났다.

mAb와 Aβ-응집물의 반응성

Aβ-응집물이 Aβ-특이적 항체의 결합을 허용하는지의 여부를 규정하고 이러한 상호작용이 본원에 기술된 FACS-기반 검정을 사용하여 모니터링될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 또 다른 세트의 실험을 수행하였다. 이러한 목적으로, Aβ1-42 및 Aβp(E)3-42 응집물을 생성하였으며, Aβ1-42 (3A5)에 특이적인 또는 Aβp(E)3-42 (D129)에 특이적인 모노클로날 항체와 인큐베이션하였다. 도 2의 FACS 히스토그램에 도시된 바와 같이, 모노클로날 항체 3A5는 배타적으로 Aβ1-42 응집물에 결합하는 반면, mAb D129는 단지 N-말단 절두된 피로글루타메이트화된 Aβ 종과 상호작용한다. 이는 기술된 FACS-기반 분석이 특정 방식으로 Aβ 특이적 항체의 검출을 허용함을 보여준다.

IVIG를 사용한 인간 자가-항체의 Aβ 결합에 대한 다양한 검출 방법의 민감성 규정

IVIG (정맥내 면역글로불린)은 시중에서 입수가능한 혈액 생성물이다. 이는 건강한 도너로부터 유래된 혈장 (적어도 1000 도너로부터의 인간 혈장)으로부터 추출된 풀링된 IgG 분획물을 함유한다. 이는 IVIG 제조물이 Aβ-펩티드에 특이적인 자연 발생 항체 (자가-항체)를 함유함을 보여준다.

본 실험의 목적은 IVIG (IVIG-Subcuvia, Baxter (Austria)로부터 구입)의 Aβ-반응성에 대한 3개의 독립된 검출 방법 (Biacore, ELISA 및 FACS-기반 분석)의 검출 한계를 규정하고 비교하는 것이다. 따라서, Aβ1-42를 각각 SPR 또는 ELISA 측정을 위해 칩 표면상에 또는 Maxisorp 미세적정 플레이트상에 고정시켰다. 대안적으로, Aβ1-42 응집물을 FACS 분석을 위해 생성시켰다. 그 후, 다양한 IVIG 희석물을 개별 시스템에 적용하고, SPR의 경우에 R_max 값, ELISA의 경우에 OD 값 또는 FACS 검정의 경우에 형광 강도 (MFI 값)를 규정하였다. 비교 근거에 있어서, 시그널 대 노이즈 비를 모든 IVIG 농도에 대해 평가하고, 시그널을 폴드-백그라운드 시그널 (xBG)로서 나타내었다 (도 3). SPR 측정의 경우, IVIG 농도 어느 것도 백그라운드를 넘는 시그널을 제공하지 못하였다 (도 3C). 이와 대조적으로, 대조군 항체 3A5는 강한 시그널을 제공하였으며, 이는 Aβ1-42가 칩 표면에 성공적으로 고정화되고, Aβ-펩티드가 대체적으로 항체에 의해 칩 표면상에서 인지될 수 있음을 나타낸다. 검출 방법으로서 ELISA를 사용하는 경우, 1000㎍/ml IVIG는 백그라운드 q보다 높은 분명한 시그널을 제공하는 반면 (BG의 7배), 100㎍/ml IVIG에 의해 유도된 시그널은 단지 백그라운드의 2배이다. 10㎍/ml IVIG는 백그라운드보다 큰 시그널을 유도하지 못하였다 (도 3B). 도 3A에 묘사된 바와 같이, FACS-기반 검정은 다른 2개의 검출 방법에 의해 전달된 시그널 보다 훨씬 더 높은 시그널을 제공하였다. 1000㎍/ml (BG의 24배), 또는 100㎍/ml (BG의 11배) 뿐만 아니라 10㎍/ml (BG의 5배), 및 1㎍/ml (BG의 거의 2배)의 IVIG 희석물도 백그라운드를 분명히 넘어서는 시그널을 유도하였다. 이는 Aβ-특이적 자가-항체를 검출하기 위해 새로 개발된 FACS-기반 검정이 ELISA 또는 Biacore와 같은 통상적인 검정법 보다 적어도 100배 더 민감하다는 것을 나타낸다.

건강한 도너 및 AD 환자로부터 유래된 인간 혈액중의 항-베타 아밀로이드 항체의 규정

a. IgG의 Aβ1-42에 대한 반응성

건강한 개체 (n=13, ~30세 내지 50세) 또는 AD 환자 (n=48, ~ 70세)로부터 유래된 혈청 샘플을 상기 기술된 바와 같은 Aβ-응집물 및 FACS 분석을 이용하여 자연 발생 Aβ-특이적 항체 함량에 대해 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, Aβ-응집물에 특이적인 자연 발생 항체는 모든 시험된 샘플에서 검출되었다. 그러나, 이러한 항체의 농도는 건강한 피검체로부터 유래된 혈청 샘플과 비교할 경우, AD 환자로부터 유래된 혈액 샘플중에서 현저히 낮았다.

AD에 걸린 인간을 식별하기 위해 본 FACS 검정의 민감성 및 특이성을 규정하기 위해서, 도 4에 나타낸 혈청의 Aβ1-42 응집물에 대한 IgG 반응성을 2회 반복하여 측정하고, 결과는 ROC 곡선에 요약하였다 (도 5). 이러한 ROC 곡선 분석은, 민감도가 81%인 경우, 특이도는 100%이며, 특이도가 77%인, 민감도는 100%임을 나타냈으며, 곡선하면적 (AUC)는 0.9679이다.

인지와 면역 데이타 사이의 상관관계를 규정하기 위한 시도에 있어서, AD 환자 혈청 (n=24)의 Aβ-응집물에 대한 측정된 IgG 반응성은 혈청 샘플링 때에 환자의 간이정신상태검사 (MMSE)로부터의 스코어와 상관관계에 있다. 이러한 상관관계는, 약한 시험 수행능을 갖는 환자가 도 6에 묘사된 바와 같이 IgG 반응성이 감소되는 경향을 나타내는 것으로 드러났다. 따라서, Aβ 특이적 IgG 반응성의 이러한 감소는 AD의 진행을 반영한다.

인지와 면역 데이타 사이의 상관관계를 규정하기 위한 시도에 있어서, AD 환자 혈청 (n=24)의 측정된 IgG 반응성은 간이정신상태검사 (MMSE)로부터의 결과와 상관관계에 있다. 이러한 시험은 인지 장애 및 치매를 스크리닝하는데 보통 이용되며, 주어진 시점에서 개체의 인지 장애의 중증도를 평가한다. MFI와 MMSE 스코어의 상관관계는, 약한 시험 수행능을 갖는 환자가 도 6에 묘사된 바와 같이 IgG 반응성이 감소되는 경향을 나타내는 것으로 드러났다.

b. IgG의 Aβ3-42 및 Aβp(E)3-42에 대한 반응성

AD 환자 및 건강한 피검체의 혈청중의 자연 발생 면역글로불린의 Aβ1-42 응집물에 대한 반응성을 규정하는 것 이외에, Aβ3-42 및 Aβp(E)3-42에 대한 이러한 혈청의 반응성 또한, 규정되었다. 이러한 분석으로부터 유래된 ROC 곡선은 도 7 및 도 8에 도시되어 있다. Aβ3-42의 경우 (도 7), ROC 곡선 분석은 민감도가 77%인 경우 특이도는 92%임을 나타내며, 곡선하면적 (AUC)는 0.859이다.

Aβp(E)3-42의 경우 (도 8), ROC 곡선 분석은 민감도가 93%인 경우 특이도가 85%임을 나타내며, 곡선하면적 (AUC)는 0.928이다.

c. IgM의 다양한 Aβ-응집물에 대한 반응성

다음 세트의 실험에서, Aβ-응집물 특이적 IgM 반응성을, 상기 기술된 바와 같은 동일한 혈청을 사용하여 건강한 개체 또는 AD 환자로부터 유래된 혈청 샘플에서 규정하였다. 도 9A에서 확인할 수 있는 바와 같이, Aβ-응집물에 특이적인 IgM 아이소타입의 자연 발생 항체가 시험한 모든 샘플에서 검출되었다. 그러나, IgG 반응성과는 대조적으로, 건강한 대조군으로부터 유래된 혈청 샘플은 AD 환자로부터 유래된 혈청 샘플보다 Aβ-응집물에 대해 더 높은 IgM 반응성을 갖는 것으로 나타나지 않았다. 따라서, ROC 곡선 분석은 민감성 또는 특이성을 나타내는 곡선을 유도하지 못하였다 (도 9B).

d. 데마스킹 후 IgG 및 IgM의 Aβ-응집물에 대한 반응성

종전 연구에서, 주로 IgM 아이소타입의 Aβ-특이적 자가-항체는 Aβ 항원으로 점유되어 면역 복합물을 구축할 수 있으며, 이는 인간 혈액중에서 안정적이며 순환되는 것으로 나타났다 (WO 2010/128139 A1; Marcello et al., 2009; Lindhagen-Persson et al., PLoS ONE 5 (2010): e13928). 자가-항체에 잠재적으로 결합된 Aβ 항원이 시험관내 생성된 Aβ-응집물에 대한 이들 항체의 반응성을 차단할 수 있는지의 여부를 규정하기 위해, 개별적 혈청을 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 데마스킹 공정으로 처리하였다. 낮은 pH로 잠재적인 면역 복합물을 파괴하여 항체 결합 도메인으로부터 Aβ 항원의 제거를 유도하였다 (항원 분리). 이와 같이, 데마스킹 공정은, 면역 복합물이 혈청 샘플중에 존재하는 경우 FACS 기반 분석시 더 높은 자가-항체 시그널을 유도할 수 있다. 흥미롭게도, 도 10에 묘사된 바와 같이, AD 환자 혈청의 IgM 반응성은 데마스킹 후 현저하게 증가한 반면, 건강한 대조군 혈청의 반응성은 비처리된 혈청과 비교하여 변화되지 않았다 (도 9A 비교). 이는 Aβ-응집물에 대한 IgG 반응성의 경우 측정된 것과 대조적이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 건강한 개체로부터 유래된 혈청은 AD 환자로부터 유래된 혈청 보다 Aβ-응집물에 대한 더 높은 IgG 반응성을 나타낸다 (이러한 경우, 혈청은 낮은 pH로 처리되지 않음).

도 11에서, 도 10에 묘사된 결과를 ROC 곡선으로 요약하였다. 이러한 ROC 곡선 분석은, 민감도가 78%인 경우 특이도가 84%임을 나타냈으며, 곡선하면적 (AUC)는 0.822이다.

이러한 일련의 실험을 완료하기 위해, 데마스킹 실험을 또한 수행하여, IgG 서브타입의 자가-항체가 또한 Aβ 항원에 의해 점유될 수 있는지의 여부를 밝혀냈다. 이러한 목적으로, 모든 혈청을 낮은 pH로 다시 처리하여 잠재적인 면역 복합물을 파괴하고, 후속하여 Aβ-응집물에 대한 혈청의 IgG 반응성을 분석하였다. IgM 데마스킹 실험에서 전에 밝혀진 바와 같이, 본 실험에서도 또한, 건강한 개체로부터 유래된 혈청의 Aβ-응집물에 대한 IgG 반응성은 비처리된 혈청과 데마스킹된 혈청 사이에 차이가 없었다. 이와 대조적으로, AD 환자로부터 유래된 혈청은 데마스킹 과정 후 Aβ-반응성에 있어서 현저한 증가를 다시 나타내었다. 항원 분리 전 및 후의 Aβ-응집물 (이경우, Aβ1-42)에 대한 혈청 IgG 자가-항체의 결합으로부터 유래된 시그널을 비교하였다. 상이한 측정치 (비처리된 측정치 대 데마스킹된 측정치)로부터 유래된 MFI 값 사이의 차이는 분리 델타 (Δ)로서 규정되었다. 도 11에서, 건강한 대조군으로부터 유래된 혈청의 Δ 값과 AD 환자로부터 유래된 혈청의 Δ 값을 ROC 곡선에 요약하였다. 확인할 수 있는 바와 같이, IgG 반응성으로부터 유래된 Δ 값은 AD 환자를 식별하기 위한 변수와 마찬가지로 이용될 수 있다. 이러한 ROC 곡선 분석은, 민감도가 79%인 경우 특이도는 85%임을 나타내며, 곡선하면적 (AUC)는 0.862이다.

결론

이러한 결과에 근거하여, 본 발명에 따른 FACS-응집-검정의 더 높은 민감성은 Aβ1-42의 다양한 응집 상태와 직접적으로 관련된다고 말할 수 있다. BIAcore 분석에 있어서, 새로 용해되고 바이오티닐화된 Aβ1-40을 스트렙타비딘 칩상으로의 고정화에 사용하였다. 이러한 방법은, 펩티드가 사전인큐베이션 없이 즉시 고정화되고, 또한 바이오틴-태그가 응집물의 형성을 감속시키기 때문에, 칩 표면상으로의 모노머 Aβ1-42의 결합을 촉진한다. 또한, Maxisorp 플레이트상의 pH9에서의 Aβ1-42의 코팅은 Aβ의 모노머 형태를 촉진하는 것으로 보이나, 일부 응집물의 코팅이 배제될 수는 없다. 이러한 검정에서, 항체와 Aβ1-42 펩티드 사이의 친화도로 인해 검출에는 한계가 있다.

본 발명에 따른 FACS-기반 검정에 대한 이러한 두 방법과 대조적으로, Aβ1-42 응집물은 IVIG에 존재하는 Aβ에 특이적인 항체를 특이적으로 유도하고, 이들의 검출에 이용되었다. 이러한 더 큰 분자는 다수의 항체 결합 부위를 제공한다. 유도된 결합활성 효과 (다중의 상승작용성 낮은 아핀 (affine) 항체-항원 상호작용의 합)는 이러한 검정의 더 높은 민감성에 대한 이유일 수 있으며, IVIG 분획물내의 낮은-아핀 항체의 검출을 유도함으로써 설명될 수 있다. IVIG의 Aβ-응집물에 대한 반응성은 또한, Aβ의 응집된 형태상에 단독으로 존재하는 에피토프의 존재에 의해 설명될 수 있다.

실시예는 특히, 분석적 특성 예컨대, 특이성 및 선택성에 대한 분야에서 현재 이용가능한 방법과 비교하여 본 발명의 탁월성을 분명히 보여준다.

EP 1 583 774 B1 및 EP 1 679 319 B1에 따른 미모토프 백신으로의 임상 연구

Aβ-펩티드를 특이적으로 타겟팅하는 항체를 유도할 수 있는 EP 1 583 774 B1 및 EP 1 679 319 B1에 청구된 바와 같은 AFFITOPE-백신을 2개의 아암을 함유하는 임상 연구에서 시험하였다. 코호트 1의 환자에 애주번트를 함유하는 AFFITOPE-백신을 면역접종하고, 코호트 2의 환자에 면역 반응 인핸서로서의 애주번트가 결여된 AFFITOPE-백신을 면역접종하였다. Aβ-특이적 IgG 항체의 증가가 예측될 수 없는 애주번트 비함유 백신과 대조적으로, 애주번트 백신은 Aβ를 타겟팅하는 항체를 유도할 수 있는 능력을 지닌다.

임상 연구 과정에 걸쳐 유도된 IgG 항체를 모니터링하기 위해 본 발명에 따른 FACS-기반 검정의 능력을 평가하기 위해, 백신 수여체로부터 유래된 혈청을 본 검정으로 처리하였다. 각 1인 환자로부터 유래된 하나의 면역접종전 혈청 (면역접종 과정을 시작하기 전에 수집됨) 및 3개의 면역접종후 혈청을 분석하였다. 시점 및 환자 당, 2개의 개별적 측정을 혈청 샘플의 상이한 분취물로 수행하였다. 시간에 따른 개별 환자에서 Aβ 응집물-특이적 IgG Ab의 증가는, FACS 검정이 시간에 따른 면역요법 간섭의 효율성을 모니터링하기 위해 적용될 수 있음을 나타낼 것이며, 게다가, 이러한 결과는 또한, 성공적인 백신접종에 대한 지표가 될 것이다.

본 발명에 따른 FACS-기반 검정을 적용함으로써, 모든 연구 참가자의 면역접종전 혈청이 예측된 바와 같이 이미 Aβ 응집물-특이적 IgG를 함유한 것으로 밝혀졌다. 이는 체액 예컨대, 혈액 (혈장/혈청) 및 CSF가 Aβ 응집물 특이적 IgM 및 IgG Ab를 함유함을 보여주는 최근 공개 문헌과 일치된다.

도 13에 도시된 값은 시간에 따른 2개의 측정치의 평균 값을 나타낸다. 본 도면에는, 예시적으로, 코호트 1로부터 유래된 환자 (환자 A) 및 애주번트 부재 백신으로 면역접종된 환자 (코호트 2 - 환자 B)에서 Aβ-특이적 IgG 항체 반응의 발생이 묘사되어 있다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 환자 A로부터의 면역 혈청 2 및 3의 MFI 시그널은 전-혈청으로부터 유래된 형광 시그널보다 현저하게 높았으며, 이는 증가된 Aβ-특이적 IgG를 나타낸다. 이와 대조적으로, 환자 B로부터 유래된 면역 혈청은 증가된 형광 시그널을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 각 그룹에 대해 대표적인 것이다.

개별 환자에서 Aβ1-42-반응성의 증가를 규정하기 위해, 마지막 면역 혈청 내지 각 전-혈청의 2개의 독립적 측정치의 평균-MFI-값의 차를 계산하였다. 도 14에서, FACS 검정을 이용한 면역 혈청의 분석은 두 그룹 사이의 분명한 차이를 유도하였음을 알 수 있다. 애주번트 함유 백신으로 면역접종한 환자로부터의 면역 혈청은 Aβ-특이적 IgG의 증가를 일관되게 나타낸다.

애주번트 함유 또는 애주번트 비함유 백신 접종된 환자의 평균 FI-값 사이의 통계적 차이를 평가하기 위해, 2개의 상이한 시험을 수행하였다. 모든 환자의 데이타가 포함되는 경우, 애주번트 그룹에서의 극단적인 하나의 값으로 인해 두 그룹간에 주어진 보통의 분포가 존재하지 않았다. 이러한 전제 조건하에, 만-휘트니-테스트를 수행하였으며, 이는 0.0473의 p-값을 유도하였다 (도 14). 또한, 정상적인 분포 조건하의 통계적 분석을 수행하기 위해, 데이타 세트로부터 아웃-레이어를 제거하고, 스튜던트 t-테스트를 계산하였다. 이러한 분석은 또한, 통계학적으로 유의한 0.0089의 p-값을 유도하였다 (도 14).

Claims

알츠하이머병 (AD)에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플을 Aβ-응집물 또는 Aβ-응집물 유사 표면을 갖는 입자와 접촉시키고 Aβ-특이적 항체가 Aβ-응집물에 결합되게 하는 단계, 및
단일 입자 검출 기법 바람직하게는, 형광 활성 세포 선별법 (FACS)에 의해 Aβ-응집물에 결합된 Aβ-특이적 항체를 검출하는 단계를 포함하여, AD에 걸린 것으로 의심되는 인간의 생물학적 샘플에서 Aβ-특이적 항체를 검출하고;
검출된 Aβ-특이적 항체의 양을 공지된 AD 상태의 샘플중의 양과 비교하여;
알츠하이머병 (AD)를 진단하는 방법.
제 1항에 있어서, Aβ-특이적 항체가 인간 항체, 바람직하게는, 인간 IgG 또는 IgM 항체, 특히, 인간 IgG 항체임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, Aβ-특이적 항체가 자가항체임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-응집물의 크기가 50nm 내지 15㎛, 바람직하게는, 100nm 내지 10㎛, 특히, 200nm 내지 5㎛임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-응집물이 Aβ-1-42 펩티드, Aβ-1-43 펩티드, Aβ-3-42, 또는 Aβ-p(E)3-42 펩티드를 pH 2 내지 9에서 20분 이상, 바람직하게는, 1시간 이상, 특히 4시간 이상 동안 인큐베이션함으로써 제조됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-응집물이, 샘플과 접촉하기 위해 0.001 내지 1μM, 바람직하게는, 0.01 내지 0.1μM의 양으로 존재함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간 혈액 또는 인간 혈액으로부터 유래된 샘플, 바람직하게는, 인간 혈청 또는 인간 혈장; 인간 뇌척수액 또는 인간 림프액임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-응집물이 10분 이상, 바람직하게는, 10분 내지 24시간, 특히 20분 내지 2시간 동안 샘플과 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 데마스킹 단계 (demasking step)가 특히, IgM 항체가 검출되는 경우, 샘플을 Aβ-응집물과 접촉시키기 전에 샘플중의 Aβ-특이적 항체에 대해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-응집물 유사 표면을 갖는 입자가 이들의 표면상에 Aβ-응집물이 고정된 비드 특히, 자성 비드임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 공지된 AD 상태의 샘플이 AD 환자의 샘플 또는 건강한 인간의 샘플인 방법.
제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 공지된 AD 상태의 샘플이 AD 상태 교정 곡선 특히, 간이정신상태검사 (Mini-Mental State examination (MMSE)) 곡선인 방법.
제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 샘플중의 Aβ-특이적 항체의 양이 역치 수준 보다 낮게 검출되는 것이 AD를 나타내며, 역치 수준은 1500ng/ml 또는 그 미만, 바람직하게는, 1000ng/ml 또는 그 미만, 특히 750ng/ml 또는 그 미만인 방법.
제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, Aβ-특이적 항체의 검출된 양이, 샘플이 인간으로부터 취해진 시간과 동일한 시간에서 동일한 인간의 MMSE 결과와 상관관계에 있는 방법.
제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 다양한 시간에 취해진 동일한 인간의 샘플에서 2회 이상 수행되며, 바람직하게는, Aβ-특이적 항체의 검출된 양이, 샘플이 인간으로부터 취해진 시간과 동일한 시간에서 동일한 인간의 MMSE 결과와 상관관계에 있는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 방법이 각 6개월마다 1회 이상, 바람직하게는, 각 3개월 마다 1회 이상, 특히 각 1개월마다 1회 이상으로 수행되는 방법.
AD 환자, 특히 AD를 치료하거나 개선하기 위해 약제로 치료중인 AD 환자를 모니터링하기 위한 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
AD의 발병 위험성을 평가하거나 조기 단계 AD를 검출하기 위한 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
파킨슨병성 치매 (Parkinson's dementia)(PDD), 루이소체 치매 (Dementia with Lewy Bodies)(DLB), 대뇌 아밀로이드 맥관병증 (Cerebral Amyloid Angiopathy)(CAA), 포함체 근육염 (Inclusion body myositis)(IBM), 또는 만성 두부외상 (chronic head trauma)을 진단하기 위한 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
Aβ-응집물, 및
샘플 컨테이너를 포함하는, 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트.