ES2692185T3 - Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer (AD) - Google Patents

Abstract

Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer (AD) en el que los anticuerpos específicos de Aß en una muestra biológica de una persona que se sospecha presenta AD son detectados comprendiendo las etapas siguientes: - poner en contacto la muestra con agregados de Aß y permitir que los anticuerpos específicos de Aß se unan a los agregados de Aß, y - detectar los anticuerpos específicos de Aß unidos a los agregados de Aß mediante una técnica de detección de partículas individuales, preferentemente mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS); y en el que la cantidad de los anticuerpos específicos de Aß detectada se compara con la cantidad en una muestra de estado de AD conocido.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer (AD).

La presente invencion se refiere a procedimientos para detectar anticuerpos espedficos Ap en muestras biologicas, especialmente en relacion con y para el diagnostico de la enfermedad de Alzheimer (AD).

La AD constituye una alteracion compleja progresiva que implica la interaccion de cascadas patologicas, que incluyen la agregacion del p-amiloide y la formacion de placas cerebrales, la hiperfosforilacion de la protema tan con la formacion de maranas intraneuronales. Concomitante con la agregacion y la hiperfosforilacion de estas protemas cerebrales, procesos inflamatorios contribuyen a la perdida de la integridad sinaptica y a la neurodegeneracion progresiva.

La conversion del peptido p amiloide (Ap o A-beta) a partir de una forma soluble con una estructura principalmente alfa-helicoidal o secundaria enrollada al azar, a una forma agregada con una estructura secundaria en forma de laminas beta, que forma finalmente placas amiloideas en el cerebro, representa una de las primeras caractensticas de la patologfa AD. Varias formas de Ap, C-, asf como de los peptidos modificados o truncados N-terminalmente, contribuyen a la formacion de las placas Ap en el cerebro. Las tres variantes mayores C-terminales de Ap, incluyen los peptidos Ap1-40 (que estan formados por 40 aminoacidos (aa) con sal-40 como ultimo aa), Ap1-42 y Ap1-43. Ademas de estas formas importantes de peptidos truncados C-terminales, existen tambien otras formas truncadas que aparecen menos frecuentemente, principalmente Ap1-37, Ap1-38 y Ap1-39. Las variantes N-terminales de Ap consisten en Ap3-40/42/43 y Ap11-40/42/43. En todas estas formas truncadas N-terminales el acido glutamico mantiene la primera posicion. Este aa no es estable, pero experimenta mas bien un cambio para transformarse en el piroglutamato (pE), dando lugar a la formacion de App(E)3-4o/42 y App(E)11-40/42. Los residuos de pE se forman, bien espontanea o enzimaticamente, mediante enzimas conocidos como glutaminil ciclasas.

Hasta recientemente, el diagnostico de AD era uno puramente clmico, basado en la aparicion gradual de deficits cognitivos en, por lo menos, dos ambitos (por ejemplo, de comprension, y funcional), que afectan negativamente a la vida diaria del paciente, sin que se encontrara otra causa que los provoque (por ejemplo, vascular). La limitacion del diagnostico clmico de AD consistio en altas tasas de diagnostico equivocado (especificidad diagnostica del 80% por los expertos), y en el hecho de que el diagnostico se pudiera realizar solamente en un momento tardfo, cuando la enfermedad hada causado una perdida neuronal sustancial, que ha producido ya deficits funcionales.

Basandose en el conocimiento reunido durante las dos ultimas decadas, la forma de diagnosticar AD esta cambiando rapidamente. Un grupo de investigadores comandado por B. Dubois, Paris, fue el primero en integrar datos que se hadan puesto de manifiesto a partir de las investigaciones subyacentes a la patologfa AD, en el algoritmo diagnostico (Dubois et al., Lancet Neurol. 9 (2010): 1118-1127). Segun los autores, el diagnostico de AD se basa en un deficit cognitivo espedfico (una alteracion de la memoria episodica), que tiene que producirse combinada con un cambio en los biomarcadores espedficos de la enfermedad (atrofia hipocampica detectada mediante MRI estructural; tfpica de AD del lfquido cerebroespinal) A42 bajo, tan total alta, alta fosfotau); imagen amiloidea positiva; riesgo genetico definido). Recientemente, este algoritmo diagnostico conducido patofisiologicamente ha sido adoptado ampliamente por el grupo de trabajo NIH-NINCDS (McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 7 (2011): 263-269). Con propositos principalmente practicos, el grupo de trabajo NIH- NINCDS mantuvo el diagnostico del MCI (alteracion cognitiva leve del tipo AD como un estadio temprano de Ad.

El concepto de potenciacion del diagnostico clfnico de AD mediante biomarcadores, que reflejen la patologfa de la enfermedad, ha sido adoptado por un grupo de trabajo propiciado por el Instituto Nacional del Envejecimiento (NIA, NIH, USA) y la Asociacion Alzheimer, llevando esto a cabo, AD no constituye ya un diagnostico por exclusion, sino que empieza a ser ya uno positivo. El hecho de que NIA y AA no sigan completamente el algoritmo conducido (gobernado) por los biomarcadores, propuesto por Dubois y colaboradores, refleja las limitaciones de los biomarcadores habitualmente disponibles. El distintivo del lfquido cefalorraqrndeo (CSF) de AD, puede ponerse como ejemplo. El CSF de los pacientes de AD muestra un patron tfpico, principalmente la reduccion de Ap1-42 y la elevacion de la Tau total (tTau) y de la fosfoTau (pTau). El distintivo se encuentra en los pacientes aD, pero no detecta un cambio a lo largo del tiempo. De hecho, en una poblacion de pacientes con riesgo de AD (es decir, pacientes MCI), identifica aquellos que van a desarrollar los smtomas clfnicos. Ya en este estadio, el CSF muestra identico patron de expresion y cambio que en los pacientes con AD pleno. De este modo, mientras que no sea posible definir un intervalo normal para Ap1-42, tTau y pTau, no existe definicion de los momentos cruciales, es decir, del momento en un paciente dado cuando por ejemplo, la fisiologfa de Ap cambia de normal a patologica. Lo mismo es cierto para cualquiera de los biomarcadores habitualmente seguidos y que todavfa no se han validado. La razon principal para esto es que solo existen pocos estudios longitudinales que evaluan esta cuestion, a causa de que no es posible facilmente repetir CSF-, MRI, examenes de imaginena amiloide, a causa del riesgo que imponen a los pacientes y a los costes que con ellos se asocien.

De este modo, falta todavfa un biomarcador fiable que pueda aplicarse repetitivamente, con costes y riesgos bajos. Es verdad especialmente que todos los esfuerzos que se han llevado a cabo hasta la fecha para desarrollar biomarcadores AD basados en la sangre, fallaron (Hampel et al., Nat. Rev. Drug Discov. 9 (2010): 560-574). La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

disponibilidad de tales biomarcadores debera ser de la mayor importancia para el desarrollo de terapias modificadoras de enfermedades. Cuanto mas pronto se administren dichas terapias, mas grandes seran las posibilidades de suerte. Y, se pueden limitar dichos esfuerzos a los casos verdaderos de AD, con la ayuda de un biomarcador espedfico.

Asf hasta ahora, Ap (varias especies de Ap y estados de agregacion), se han evaluado en AD y MCI, el estadio predemencia de AD. Hallazgos recientes muestran que existe una actividad amiloidogenica de IgG e IgM contenidos en el plasma y en el lfquido cerebroespinal de los pacientes AD y en los controles sanos (O'Nuallain et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) Suppl.1: S37-S42; Marcello et al., J. Neural. Transm. 116 (2009): 913-920). Resultados obtenidos mediante ELISA, o ensayos de inmunoprecipitacion que evaluan IgG y/o IgM espedficos para varios de los estados de agregacion/formas de Ap, mostraron que los pacientes AD- y mCi mostraron niveles mas bajos de autoanticuerpos Ap sericos que los controles sanos. Aunque estos estudios mostraron una diferencia en la concentracion de autoanticuerpos, los procedimientos que se utilizaron adolecieron de la sensibilidad y especificidad que hubieran sido necesarias para utilizarlos como herramientas de diagnostico predictivo para identificar pacientes Ad o MCI con alta selectividad y especificidad. La mayona de los procedimientos utilizados hasta la fecha, se basan en la tecnologfa ELISA. Para aumentar la sensibilidad en estos ensayos, algunos utilizan marcaje radioactivo del peptido Ap1-42. El analisis ROC (receptor caractenstico operacional) de Brettschneider et al., (Brettschneider et al., Biol.. Psychiatry 57 (2005): 813-817), alcanzo una especificidad del 46,7% cuando la sensibilidad se fijo al 81,3%, utilizando un ensayo de inmunoprecipitacion con Ap1-42 marcada con cloramina T, para mediar la diferencia entre los controles sanos y los pacientes Ad. Al contrario que esto, Bayer et al. (WO 2010/128139 Al; Marcello et al., J Neural. Transm. 116 (2009): 913-920), utilizaron un procedimiento basado en ELISA, en el que la placa se revistio con un fragmento de piroglutamato-Ap. En este caso, la deteccion de los autoanticuerpos IgM anti Ap espedficos en los controles sanos y en los pacientes AD con anticuerpos anti-IgM-HRP mostro que la especificidad era del 60% cuando la sensibilidad se fijo en 80%. Hasta ahora, ninguno de estos procedimientos cumplio los criterios que los hubiera calificado como biomarcadores predictores (>80% especificidad) para AD.

No se conoce la razon para la reducida concentracion serica de los anticuerpos Ap espedficos en estos dos grupos de pacientes. Existen dos explicaciones generales y no mutuamente exclusivas: produccion reducida (pato- espedfica con respecto a la inmunosenescencia general), y redistribucion (los anticuerpos son atrapados en los depositos amiloides que se encuentran, por ejemplo, en el cerebro). El soporte para una funcion potencial de estos (auto) anticuerpos Ap espedficos proviene de estudios recientes que demuestran que productos sangumeos disponibles comercialmente, principalmente la fraccion IgG asociada extrafda del plasma derivado de donantes sanos, se ha mostrado que contiene anticuerpos espedficos para los peptidos Ap. Dos de dichos productos, las preparaciones de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) de dos compares diferentes, estan experimentando habitualmente ensayos clmicos para evaluar su potencial para interferir con o evitar la patologfa AD.

Otra cuestion no resuelta es si el nivel de anticuerpos Ap espedficos esta reducido en entidades patologicas con un componente Ap en su patofisiologfa, principalmente en la demencia parkinsoniana (PDD), demencia con cuerpos de Lewy (DLB), angiopatfa amiloide cerebral (CAA), trauma cefalico cronico (por ejemplo, boxeo). La investigacion del nivel de anticuerpos en estas enfermedades podna anadir a la comprension actual de los procesos que dan lugar a la reduccion de la concentracion serica de los anticuerpos espedficos Ap agregados en AD. La investigacion de los sueros de pacientes con estas enfermedades podna clarificar la cuestion de si los resultados de AD a partir de una inmunodeficiencia espedfica (en el caso de si los tttulos de anticuerpo Ap espedficos se reducen solo en AD, pero no en otras patologfas caracterizadas por la patologfa Ap), o si los niveles reducidos de los anticuerpos espedficos de Ap provienen de la redistribucion debida a la amplia patologfa Ap. En el primer caso, el ensayo debena consistir en un biomarcador altamente espedfico de la enfermedad, y, como resultado, debena ser de ayuda para diferenciar AD de las entidades patologicas anteriormente mencionadas. Asumiendo la segunda posibilidad, el ensayo podna calificar la identificacion de pacientes cuya enfermedad sea gobernada por la patologfa Ap.

En el documento WO 2010/128139, se dan a conocer biomarcadores y procedimientos para diagnosticar AD, especialmente, anticuerpos contra pGlu Ap. Funke et al. (Curr. Alz. Res., 6 (3) (2009): 285-289) considero si la deteccion de los agregados de Ap en los fluidos corporales constituye un procedimiento apropiado para el diagnostico temprano de AD. Maetzler et al. (J. Alz. Dis. 26 (1) (2011): 171-179) informo que los autoanticuerpos contra antfgenos amiloideos y derivados de la glia, aumentan en el suero y lfquido cerebroespinal de las demencias asociadas a los cuerpos de Lewy. Funke et al. (Rejuv. Res. 13 (2-3) (2010): 206-209) dio a conocer un sistema de deteccion de partfculas unitarias para los agregaros Ap. Fukumoto et al. (Faseb J., 1 (24) (2010): 2716-2726), dio a conocer que oligomeros p-amiloideos de alto peso molecular se elevan en el lfquido cefalorraqrndeo de pacientes AD. El documento WO 2011/106732 A1 se refiere a unos procedimientos de monitorizacion de inmunoterapia dirigida a Ap. El documento WO 2010/099199 A1 se refiere a unos procedimientos para detectar los complejos de Tau, variantes de Tau y amiloides que contienen moleculas, asf como autoanticuerpos para estos complejos o componentes de estos complejos, en muestras de lfquido fisiologico, siendo dichos complejos un marcador para trastornos que incluyen la enfermedad de Alzheimer. El documento NZ 560 689 A divulga un procedimiento para detectar autoanticuerpos que presentan especificidad para un epftopo de estructura oligomero beta A globular no difusible en una muestra procedente de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto la muestra con un oligomero beta A globular no difusible o un derivado reticulado o marcado del mismo, y detectar un complejo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

formado por el anticuerpo y el oligomero o derivado, indicando la presencia de un complejo la presencia de los autoanticuerpos.

Constituye un objeto de la presente invencion proporcionar medios para mejorar el diagnostico de AD, especialmente para detectar los estados iniciales de la enfermedad y para observar el desarrollo de ensayos clmicos para medicamentos que traten AD. Constituye otro objeto de la invencion, proporcionar herramientas... para la deteccion de anticuerpos anti-Ap en muestras biologicas, especialmente en las de pacientes humanos con AD, o en las de individuos humanos de los que se sospecha que presentan o estan en riesgo de desarrollar AD.

Por tanto, la presente invencion proporciona un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer (AD) en el que se detectan los anticuerpos espedficos de Ap en una muestra biologica de una persona que se sospecha presenta AD que comprende las etapas siguientes:

- poner en contacto la muestra con agregados de Ap y permitir que los anticuerpos Ap espedficos se unan a los agregados de Ap, y

- detectar los anticuerpos Ap espedficos unidos a los agregados de Ap mediante una tecnica de deteccion de partfculas individuales, preferentemente mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS);

y en el que la cantidad de anticuerpos espedficos de Ap detectada es comparada con la cantidad en una muestra de estado de AD conocido.

Con la presente invencion, se da a conocer un nuevo procedimiento para detectar autoanticuerpos espedficos de Ap, para utilizarse como una herramienta diagnostica, que ayuda extremadamente en el diagnostico de AD, monitorizando el desarrollo de esta. Este procedimiento se basa en la invencion de que no se utilizan justamente los peptidos Ap unicos como herramientas de captura para los anticuerpos espedficos de Ap sin que en vez de ello se emplean agrados Ap, detectandose un tanto complejos de agregados anticuerpos Ap utilizando una tecnica de deteccion de partfculas individuales y que la cantidad de dichos anticuerpos correlaciona con el desarrollo de AD. Cuanto menor es la cantidad que es detectada mediante el presente procedimiento, mayor es el avance del estado de la enfermedad con respecto a AD. Brevemente, los agregados de Ap (derivados de diferentes Ap truncados y versiones modificadas) se generan, por ejemplo, mediante incubacion nocturna. Subsiguientemente, los agregados de Ap se incluyen con muestras sericas derivadas, bien de donantes sanos (HD) o de pacientes AD, para permitir la union de estos anticuerpos (tanto IgG como IgM). Los anticuerpos unidos a los agregados de Ap pueden detectarse mediante cualquier procedimiento disponible para el experto en la tecnica, por ejemplo, utilizando un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo Ap espedfico unido a los agregados de Ap. Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (PE). Entonces, a continuacion los complejos inmunes que incluyen el anticuerpo Ap-espedfico unido a los agregados de Ap (y opcionalmente uno o mas agentes de deteccion, tales como anticuerpos secundarios), se miden utilizando una tecnica de deteccion de partfculas individuales tal como el analisis FACS (clasificacion de celulas activadas por fluorescencia) tambien conocido como citometna de flujo. Utilizado el procedimiento segun la presente invencion, pudo mostrarse que los pacientes AD contienen menos inmunoglobulinas Ap-espedficas que reaccionan respecto a los agregados de Ap (inmunoglobulinas libres Ap-espedficas) proporcionados segun la presente invencion, comparados con los individuos sanos. Ademas, utilizando el procedimiento segun la presente invencion pudo mostrarse que la reactividad de las inmunoglobulinas Ap- espedficas (con respecto a los agregados de Ap proporcionados segun la presente invencion) derivadas de los pacientes AD, pueden aumentarse mediante un procedimiento conocido como desenmascaramiento (eliminacion de antfgenos Ap unidos potencialmente a partir de los autoanticuerpos). Esto es en contraste a la reactividad de immunoglobulina Ap-espedficas de individuos sanos en los que tal aumento de reactividad con respecto a los agregados de Ap no puede detectarse despues del tratamiento de esos sueros de una forma especial. Por otra parte, la reactividad de los anticuerpos IgM despues de desenmascaramiento (disociacion de Ap ya unido en el suero), revelo un aumento del nivel de IgM en los pacientes AD. Adicionalmente, tambien se determino la diferencia entre los niveles de IgG con y sin desenmascaramiento (valores delta (A)). Este parametro tambien se elevo en pacientes AD, comparandolo con controles sanos que mostraban una ocupacion mas alta de los anticuerpos por Ap, de los anticuerpos en el estado patologico de la enfermedad. Ademas, con la presente invencion, se proporcionan datos que muestran que este procedimiento tiene una capacidad mucho mayor para detectar anticuerpos espedficos de Ap, y por tanto, posee un poder mucho mas alto para diagnosticar AD, comparado con los procedimientos publicados hasta ahora. Dados estos hechos, el procedimiento segun la presente invencion, cumple con los prerrequisitos teoricos de una herramienta para predecir el diagnostico, para identificar AD y para seguir la respuesta clmica al tratamiento de un paciente dado.

Esta invencion se desarrollo para el analisis de anticuerpos espedficos Ap en muestras humanas. Constituye, por tanto, una forma de realizacion preferida para detectar anticuerpos humanos espedficos de Ap, preferentemente anticuerpos IgG o IgM humanos, especialmente anticuerpos IgG humanos. Como ya se ha mencionado, la deteccion de anticuerpos Ap espedficos en el hombre se conoce en principio en la tecnica; sin embargo, no se ha podido comprobar su papel como posible biomarcador. Tal como se muestra con la presente invencion, esto se debio tambien a la insuficiencia analttica de los procedimientos de deteccion disponibles en la tecnica. Debido a la superioridad del procedimiento segun la presente invencion, se acepta la disponibilidad de estos anticuerpos en las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

muestras humanas como biomarcadores. Este procedimiento esta (dotado) espedficamente para detectar autoanticuerpos en muestras biologicas. De acuerdo con esto, en una forma de realizacion preferida de este procedimiento, los anticuerpos espedficos de Ap que van a detectarse y cuantificarse, son autoanticuerpos.

Contrariamente a los procedimientos de la tecnica anterior, este procedimiento utiliza agregados de Ap como sonda para unir los anticuerpos Ap espedficos a partir de las muestras. Aunque dichos agregados son conocidos en principio en la tecnica, no se constato que la utilizacion de dichos agregados en el analisis de anticuerpos espedficos de Ap, especialmente en muestras humanas, podna mejorar dichos procedimientos significativamente, tambien combinadamente con las tecnicas de deteccion de partfculas individuales, tales como FACS. Debido a la utilizacion de dichos agregados, la deteccion con tecnicas de deteccion de partfculas individuales (que constituyen tecnicas establecidas en varios distintos campos, y para diversas cuestiones), es posible para analizar anticuerpos espedficos de Ap en muestras humanas (tales como sangre), que son habitualmente muy complejas y diffciles de llevar a cabo.

Preferentemente, las dimensiones de los agregados que van a utilizarse segun la presente invencion, estan estandarizadas para uso analttico. Esto puede realizarse estableciendo ciertos parametros durante la produccion de los agregados. Dependiendo de las condiciones que se aplican durante la generacion de los agregados, el tamano de estos puede ajustarse. Los tamanos preferidos de los agregados de Ap segun la presente invencion, son de entre

50 nm a 15 pm, preferentemente de entre 100 nm a 10 pm, especialmente entre 200 nm y 5 pm (definidos por la longitud de los agregados (es decir, la extension mas larga).

Un procedimiento preferido para proporcionar agregados, apropiado para la presente invencion, incluye la etapa de incubacion de peptidos Ap-1-42, peptidos Ap-1-43, peptidos Ap-3-42 o Ap-p(E)-3-42 o menos preferentemente peptidos Ap que esten truncados en el extremo C, tal como el peptido Ap-1-40, a un pH de entre 2 y 9 durante por lo menos 20 minutos, preferentemente de 1 hora por lo menos, especialmente, por lo menos, de 4 horas. La duracion de incubacion es uno de los parametros para ajustar el tamano de los agregados: cuando mas duradera sea la incubacion, mayores son los agregados. Los tiempos tfpicos de incubacion son de entre 10 minutos a 24 horas. Tiempos de incubacion mas cortos dan lugar habitualmente a solo agregados muy cortos y a un escaso numero de estos; los agregados producidos con tiempos de incubacion significativamente mas largos a 48 horas, no se prefieren habitualmente en este procedimiento. Por supuesto, los agregados pueden tambien clasificarse y cribarse para conseguir el tamano deseado, si es necesario, por ejemplo, mediante centrifugacion fraccionada y tecnicas similares.

Segun este procedimiento, las muestras en las que los anticuerpos espedficos Ap van a detectarse y ponerse en contacto con los agregados de Ap para conseguir la union de los anticuerpos Ap espedficos posiblemente presentes y reactivos vis a vis de los Ap agregados en las muestras. La concentracion de los agregados de Ap tiene, por tanto, que ajustare para proporcionar bastantes posiciones de union para los anticuerpos. De acuerdo con esto, la concentracion de los agregados de Ap para la union de los anticuerpos en la muestra es preferentemente del orden comprendido entre 0,001 y 1 pM, preferentemente entre 0,01 y 0,1 pM. La concentracion optima depende tambien de la naturaleza de los anticuerpos que van a unirse, de la naturaleza de la muestra del tiempo planeado de contacto y del tamano de los agregados.

Este procedimiento tiene principalmente como objetivo la aplicacion en las muestras humanas. Se prefiere, pues, que la muestra biologica sea sangre humana o una muestra derivada de esta, preferentemente suero o plasma humano; lfquido cerebroespinal humano o linfa humana. Con tales fuentes de muestras, pueden tambien establecerse ensayos rutinarios y en serie (especialmente para las muestras derivadas de la sangre).

Los tiempos preferidos de contacto que permiten una union apropiada de los anticuerpos en la muestra a los agregados, son por lo menos de 10 minutos (por ejemplo, de 10 minutos a 48 h), preferentemente de 15 min a 24 horas, especialmente de 30 min a 2 h.

Preferentemente, se ponen en contacto los agregados de Ap con la muestra durante por lo menos 10 minutos, preferentemente desde 10 a 24 h, especialmente desde 20 minutos a 2 horas.

51 la muestra biologica no es pretratada espedficamente, los anticuerpos espedficos de Ap que poseen una capacidad de union a los agregados de Ap, se uniran durante el contacto con los agregados de Ap. Los anticuerpos espedficos Ap que estan enmascarados en la muestra (es decir, aquellos que ya estan unidos a un asociado de union (por ejemplo, una estructura que comprende Ap, o peptidos Ap endogenos), no seran detectados mediante el procedimiento segun la presente invencion (estando ausente dicha muestra espedfica pretratamiento). Mientras que la identificacion y cuantificacion de solo anticuerpos reactivos sera en muchos casos suficiente y deseada, pueden existir situaciones o cuestiones diagnosticas en las que la cantidad total de anticuerpos espedficos de Ap en la muestra podra detectarse (reactivos o no reactivos), o todos, el numero de anticuerpos espedficos de Ap reactivos, el numero de no reactivos enmascarados, y el numero total de anticuerpos A-espedficos.

Por tanto, segun una divulgacion, las muestras se desenmascaran, es decir, los anticuerpos espedficos de Ap son “liberados” desde cualquier union a asociados de union, que estan presentes en la muestra previa al contacto con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

los agregados de Ap, segun la presente invencion. Esto permite la deteccion de todos los anticuerpos espedficos de Ap que no se unen a un asociado de union en la muestra (anticuerpos “libres” o “reactivos”). Durante la presente invencion se determino que la cantidad de los anticuerpos espedficos de Ap reactivos, especialmente de IgG Ap- espedfico reactivo, constituyo un marcador clave para el diagnostico y desarrollo de AD. Este procedimiento es, tal como se ha establecido anteriormente, tambien apropiado para determinar la cantidad total de anticuerpos espedficos de Ap en una muestra, es decir, los anticuerpos libres (o “reactivos”), asf como aquellos antibioticos que ya estan unidos (por ejemplo, a las estructuras Ap) en la muestra. Esto puede ser de ayuda para establecer la diferencia (A) de anticuerpos reactivos con respecto a los no reactivos en una muestra, un parametro que es tambien de importancia significativa para el diagnostico de Ad. Mientras que dicha diferencia no se encuentra presente (o baja) en individuos “sanos” con respecto a AD, esta diferencia es crucial para la funcion de los marcadores en AD, con respecto tanto para IgG espedficos de Ap como para IgM espedficos de Ap. Para utilizar el IgM Ap-espedfico como parametro para el diagnostico de AD, se divulga una etapa de desenmascaramiento antes de llevar a cabo este procedimiento, y de este modo, la diferencia (A) de los anticuerpos reactivos con respecto a los no reactivos en la muestra, se definira y utilizara como parametro relevante.

El procedimiento segun la presente invencion utiliza una tecnica de deteccion de una partfcula individual. Dichas tecnicas permiten la identificacion y cuantificacion (“contaje”) del numero y cantidad de resultados de union “positiva” del anticuerpo Ap-espedfico a los agregados de Ap. Una forma de realizacion preferida de esta tecnologfa la constituye FACS, que es una tecnica establecida en este campo. Otros procedimientos de deteccion que van a utilizarse para detectar los anticuerpos que se unen a los agregados de Ap, son, por ejemplo, Luminex o la citometna de masas.

Segun la tecnologfa Luminex, la preparacion de la muestra puede llevarse a cabo tal como se describe en “Material y Metodos”. Siguiendo la preparacion de la muestra, los agregados de Ap reconocidos por los anticuerpos espedficos espedficos de Ap pueden detectarse mediante un anticuerpo secundario unido a microsferas tenidas fluorescentes, que pueden detectarse en sistemas multiplex de deteccion, por ejemplo, en un lector Luminex (Binder et al., Lupus15 (2005): 412-421.

Si la citometna de masas se utiliza como tecnica de deteccion de partfculas individuales, la preparacion de la muestra puede tambien llevarse a cabo tal como se describe en “Material y Metodo” de la seccion de Ejemplos que se muestra a continuacion. La preparacion de las muestras se lleva a cabo tal como se va a describir. Siguiendo esta preparacion, los agregados de Ap reconocidos por los Abs espedficos pueden detectarse mediante un anticuerpo secundario unido a isotopos estables de elementos de transicion, que pueden detectarse mediante espectrometna de masas. La muestra puede entonces rociarse mediante una bobina inductora rellena de plasma de argon, calentado a una temperatura de >5,500 K. La muestra se vaporiza e ioniza en sus constituyentes atomicos, cuantificandose el numero de anticuerpos marcados isotopicamente mediante espectrometna de masas de tiempo de vuelo (Janes et al., Nat. Biotechnol. 29 (2011): 602-604).

Alternativamente, tambien es posible aplicar tecnicas de deteccion de partfculas individuales donde un asociado de union (agregados Ap o anticuerpo/suero) son inmovilizados, pero la union se evalua mediante condiciones de flujo. Ejemplos son la tecnologfa Hybcell y la de Resonancia Plasmonica Superficial Utilizando la Tecnologfa Hybcell en la presente invencion, las muestras sericas pueden motearse sobre la superficie de Hybcell (un cilindro rotatorio), llevandose a cabo la incubacion con agregados de Ap directamente preincubados y marcados fluorescentemente, o, alternativamente, con un segundo anticuerpo monoclonal Ap-espedfico marcados fluorescentemente. Los anticuerpos que se unen a los agregados de Ap se detectan mediante un laser (Ronacher, Anagnostics Technical Note aNA-TN-005 (2010)). Si se utiliza la Resonancia Plasmonica de superficie en el procedimiento segun la presente invencion, puede aplicarse un programa de instalacion inverso: los agregados de Ap preincubados pueden inmovilizarse sobre la superficie de un chip. La union de los anticuerpos Ap espedficos del suero a los agregados de Ap en el chip, puede detectarse aumentando la masa en la superficie del chip, no siendo, por tanto, necesario marcar entonces, los asociados de union. Para aumentar la sensibilidad o determinar los subtipos IgG, es posible una inyeccion seriada de anti-IgG-AB (Cannon et al., Anal. Bochem. 328 (2004): 67-75). En vez de inmovilizar directamente los agregados de Ap a la superficie del chip, puede utilizarse un anticuerpo de captura. Para este programa de instalacion inversa, se inmoviliza sobre la superficie del chip, un anticuerpo Ap-espedfico, seguido por la inyeccion de agregados de Ap preincubados. Despues de la captacion de los agregados, el suero se inyecta, midiendose la reactividad por el aumento de la masa.

La deteccion de la union de anticuerpos espedficos de Ap a los agregados de Ap, segun la presente invencion, puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento conocido apropiado, por ejemplo la Espectroscopia de Fluorescencia (Missailidis et al., Methods in Molecular Biology 248 (2003): 431-441), para detectar los anticuerpos espedficos de Ap unidos a los agregados de Ap mediante un anticuerpo secundario (por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado anti-IgG o anti-IgM).

La deteccion de los autoanticuerpos unidos a los agregados puede tambien realizarse utilizando anticuerpos que se unan espedficamente a sustratos tales como la Protema A o la Protema G. Otra posibilidad es precipitar autoanticuerpos Ap-agregados espedficos utilizando los Ap-agregados, lavando el complejo y biotinilando los anticuerpos. Subsiguientemente, puede utilizarse entonces estreptavidina como reactivo en la segunda etapa.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La muestra de estado de AD conocido puede ser cualquier valor de muestra que permite clasificar la muestra que se evalua mediante el procedimiento segun la presente invencion. Puede ser una muestra ffsica, real, de una persona con estado de AD conocido (por ejemplo una persona sana, que no presenta AD o un paciente de AD, especialmente un paciente de AD con un estado de enfermedad conocido (por ejemplo determinado mediante un examen de estado Mini-Mental (MMSE)) o un valor comparativo, tal como una curva de calibracion. Una curva de calibracion preferida incluye las cantidades comparativas de los anticuerpos espedficos de Ap en el mismo tipo de muestra (por ejemplo una muestra sangumea) en una curva de calibracion de estado de AD, especialmente una curva de MMSE. En un sistema de ensayo estandarizado, las cantidades absolutas de anticuerpos espedficos de Ap segun la presente invencion pueden correlacionar con un estado de AD. Las cantidades decrecientes de los anticuerpos espedficos de Ap para un paciente dado en diferentes momentos indican la evolucion de la enfermedad.

Resulta asimismo posible definir determinados valores umbral de los anticuerpos espedficos de Ap en la muestra para un estado de enfermedad definido (por ejemplo “sano”, AD leve, AD avanzada, o segun la escala de MMSE). Los valores umbral, dependen por supuesto de la muestra y del sistema de deteccion preciso, pero pueden desarrollarse para cualquier manera estandarizada en la que se realiza la presente invencion. La concentracion de IgG espedfica de Ap en suero de personas sanas esta habitualmente entre 1000 y 5000 ng/ml mientras que la concentracion de IgG de los pacientes de AD es habitualmente muy inferior, por ejemplo, en el intervalo de 250 a 1500 ng/ml. La mayona de los pacientes de AD presentan menos de 1000 ng/ml. Por lo tanto, segun una divulgacion, la deteccion de una cantidad de anticuerpos espedficos de Ap en la muestra que es inferior a un nivel umbral resulta indicativa de AD, en la que el nivel umbral es 1500 ng/ml o inferior, preferentemente 1000 ng/ml o inferior, especialmente 750 ng/ml o inferior. Por otro lado, el aumento de esta concentracion de IgG en el desarrollo de un tratamiento de AD, especialmente el tratamiento de AD mediante inmunoterapia indica una inmunoterapia exitosa. Por ejemplo, si el nivel aumenta desde menos de 750 ng/ml a por encima de 1000 ng/ml o incluso por encima de 1500 ng/ml, esto indicana una inmunoterapia exitosa.

En una divulgacion adicional, la cantidad detectada de los anticuerpos espedficos de Ap correlaciona con un resultado de MMSE de la misma persona al mismo tiempo que la muestra es tomada de la persona.

El procedimiento segun la presente invencion resulta adecuado espedficamente para monitorizar a un paciente de AD dado con respecto al desarrollo de la enfermedad, especialmente para correlacionar los resultados de diagnostico segun la presente invencion con otras herramientas de diagnostico para determinar el estado de AD y/o para monitorizar la eficacia de las intervenciones terapeuticas. Por lo tanto, en una divulgacion el procedimiento es realizado por lo menos dos veces en las muestras de la misma persona tomadas en diferentes momentos. En una divulgacion adicional, las cantidades detectadas de los anticuerpos espedficos de Ap correlacionan con los resultados de MMSE de la misma persona en los mismos momentos en los que las muestras son tomadas de la persona. Para monitorizar el desarrollo de AD en un paciente dado, se divulga para realizar el procedimiento segun la presente invencion en intervalos regulares, por ejemplo por lo menos una vez cada seis meses, preferentemente por lo menos una vez cada tres meses, especialmente por lo menos una vez cada mes.

El presente procedimiento esta asf espedficamente adaptado para utilizarlo con relacion al diagnostico de AD de una manera monitorizada a lo largo del tiempo. Con la presente invencion, los autoanticuerpos espedficos de Ap en pacientes humanos se proporcionan como marcadores para la condicion de AD. La gente con un nivel “normal” de anticuerpos espedficos de Ap en su sangre “estan sanos” con respecto a AD. Si este nivel se modifica en un paciente con Ad o en individuos con un riesgo de desarrollo AD o son sospechosos de tener AD, tal nivel de modificacion se correlaciona con AD. Un nivel “modificado” puede consistir en una modificacion del numero absoluto de los anticuerpos espedficos de Ap o de una modificacion de la reactividad de la totalidad de los anticuerpos espedficos de Ap (por ejemplo, de un tipo dado de anticuerpos espedficos de Ap (IgG, IgM, etc.). Por ejemplo, el IgG Ap-espedfico reactivo disminuido, se correlaciona con, y constituye un marcador para AD. Por otra parte con IgM, cambios del nivel de IgM Ap-espedfico (no reactivo, es decir, unido o enmascarado, en la otra direccion, poseen una funcion marcadora con respecto a AD. Con este procedimiento, cuando el nivel “sano” de IgG reactivo Ap-espedfico se fija al 100% una disminucion significativa el IgG reactivo Ap-espedfico, por ejemplo, una disminucion del 70%) e inferior, del 50% e inferior, y del 30% e inferior, indica el desarrollo de AD. Por otra parte, cuando el nivel “sano” del IgM Ap-espedfico se fija al 100% un aumento del IgM total (reactivo + no reactivo) de por lo menos el 30%, por ejemplo, por lo menos del 50% por lo menos del 100%, en una muestra sangumea, indica el desarrollo de AD.

De acuerdo con esto, un campo preferido de utilizacion de la presente invencion, lo constituye el diagnostico de la enfermedad de Alzheimer (AD). Sin embargo, la presente invencion puede utilizarse para todas las patologfas conectadas a o relacionadas con Ap (“patologfas Ap”), especialmente a las patologfas en las que los depositos Ap se producen durante la enfermedad. Ejemplos de dichas patologfas Ap son la demencia de Parkinson (PDD), la Demencia con los Cuerpos de Lewy (DLB), la Angiopatfa Amiloide Cerebral (CAA), los Miositos de cuerpos de inclusion (IBM; especialmente la IBM esporadica), o el trauma cefalico cronico (por ejemplo, el boxeo).

Ya que esta invencion proporciona un marcador para AD e, incluso, para el desarrollo de AD, es posible utilizar este procedimiento para observar el desarrollo de la enfermedad y la realizacion de posibles procedimientos de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tratamiento, especialmente si el procedimiento de tratamiento permite establecer niveles “sanos” o “mas sanos” de anticuerpos espedficos de Ap, especialmente IgG o IgM.

Este procedimiento se utiliza, por tanto, preferentemente para la monitorizacion de los pacientes AD especialmente de los pacientes AD que son tratados con medicamentos para curar o mejorar AD. Este procedimiento puede aplicarse satisfactoriamente para observar pacientes en ensayos clmicos para vacunas AD (por ejemplo, con mimotopos AD segun WO 2004/062556 A, WO 2006/005707 A, WO 2009/149486 y WO 2009/149485; o con vacunas derivadas de Ap segun WO 99/27944 o medicamentos que hacen diana en Ap y modifican la patologfa.

El procedimiento segun la presente invencion puede utilizarse tambien para evaluar el riesgo de desarrollo de AD o para detectar las etapas tempranas de AD. Con la presente invencion se ha hecho posible, en principio, detectar cambios en el “acomodo” inmunologico de los pacientes, con respecto a los autoantibioticos espedficos de Ap en un punto significativamente temprano en el tiempo que en el los deficits cognitivos. Esto podna permitir una mejona significativa del diagnostico temprano de AD, con respecto a una parte mucho mas amplia de la poblacion, si se establece en un formato rutinario de ensayo. Esto hace que los pacientes puedan elegirse para regfmenes de tratamiento en un estadio temprano y/o estrategias de prevencion (o retraso) para AD, especialmente vacunaciones.

Segun otro aspecto, la presente invencion se refiere a la utilizacion de un kit que comprende

- agregados Ap, y

- un contenedor de muestras, especialmente para las muestras humanas (por ejemplo, sangre, suero, plasma) para poner en practica el procedimiento segun la presente invencion.

Preferentemente, el kit segun la presente invencion, puede contener ademas medios para detectar agregados de Ap que se unan a anticuerpos Ap espedficos preferentemente anticuerpos secundarios, especialmente anticuerpos secundarios marcados, por ejemplo, anticuerpos anti-IgG o anti-IgM. Otros componentes pueden ser muestras estandar, controles positivos y/o negativos, instrucciones para el uso, y medios apropiados de empaquetamiento (por ejemplo, recipientes estables, viales coloreados, etc.).

La presente invencion se ilustra ademas por los Ejemplos y las figuras acompanantes, sin que esten restringidos.

La Figura 1 muestra la determinacion del tamano de los agregados de Ap, utilizando el analisis FACS. Los agregados Tioflavina T positivos Ap1-42 pueden detectarse utilizando citometna de flujo y se muestran como una poblacion homogenica en el canal FL1-FITC A (escala-logantmica) - y FSC-A (escala log) en la transferencia por puntos (A). La distribucion del tamano (definida por la senal FCS-A) de los agregados de Ap se determino utilizando perlas disponibles comercialmente de tamano calibrado (1, 2, 4, 6, 10 y 15 pm), tal como se muestra en el histograma FSC-A (B).

La Figura 2 muestra la deteccion de la reactividad de los anticuerpos monoclonales respecto a los agregados de Ap, utilizando un ensayo basado en FACS. El anticuerpo 3A5 monoclonal Ap1-42 se une espedficamente a los agregados de Ap1-42 (A), pero no interacciona con los agregados de App(E)3-42 (C). Contrariamente, el anticuerpo D129 espedfico se une a App(E)3-42, pero no a los agregados de Ap1-42 (B+D). Se determino la reactividad utilizando un anticuerpo secundario marcado con anti-inmunoglobulina-PE en el canal FL2-PE. La intensidad fluorescefnica tal como se muestra en B y C, representa una tincion anterior, tal como se ve cuando los agregados se incuban con solo el anticuerpo secundario marcado con PE.

La Figura 3 muestra la comparacion de sensibilidad del ensayo para tres procedimientos distintos. (A) Los agregados de Ap1-42 se incubaron en una serie de diluciones de IVIG, determinandose la reactividad en el canal FL-2, utilizando la citometna de flujo. (B) titulacion de IVIG sobre placas ELISA Maxisorp, revestidas con Ap1-42 durante la noche con un pH de 9,2. (C) Deteccion sin marcadores de concentraciones diferentes de IVIG, interaccionando con, principalmente Ap1-42 inmovilizado y biotinilado, sobre chip-SA, utilizando resonancia superficial plasmonica (BiaCore). Por favor, tengase en cuenta que para comparacion, todos los resultados se dan en una senal anterior amplificada.

La Figura 4 muestra la determinacion de la reactividad del autoanticuerpo IgG Ap-espedfico, en las muestras de suero que se indican. Los sueros de control de los donantes sanos (de 30 a 50 anos de edad), o los sueros derivados de los pacientes AD, se sometieron al ensayo FACS descrito. La intensidad fluorescefnica de los agregados de Ap, se evaluo en el canal FL2-PE, y se expresa como Intensidad Fluorescefnica Media (MFI).

La figura 5 muestra un analisis de curva ROC. Se comparo la reactividad anti-Ap1-42 IgG espedfica de los sueros derivados de pacientes AD, con los sueros derivados de donadores sanos.

La Figura 6 muestra la correlacion de la reactividad de IgG con los parametros del examen del Estado MiniMental (MMSE), 24 pacientes de AD se examinaron en cuanto al estado MMSE, sometiendose los sueros de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

estos pacientes al ensayo FACS descrito, y se determino la FI Media. Se muestra una correlacion de los datos recogidos en los resultados y en las figuras previas.

La Figura 7 muestra un analisis de la curva ROC. Se comparo la reactividad anti-Ap3-42 espedfica de IgG de los sueros derivados de los pacientes AD, con los sueros derivados de donadores sanos.

La Figura 8 muestra un analisis de la curva ROC. Se comparo la reactividad anti-App(E)3-42 espedfica de IgG de los sueros derivados de los pacientes AD, con los sueros derivados de donadores sanos.

La Figura 9A muestra la determinacion de la reactividad del autoanticuerpo IgM Ap-espedfico en las indicadas muestras sericas. Los sueros de control de los donadores sanos, o de los sueros derivados de los pacientes AD, se sometieron al ensayo FACS descrito. La intensidad fluorescemica de los agregados de Ap se evaluo en el canal FL2-PE y se expresa como Intensidad Media de fluorescencia (MFI). La Figura 9B muestra un analisis de la curva ROC. Se comparo la reactividad IgM-espedfica anti-Ap1-42 de los sueros derivados de los pacientes AD, con los sueros derivados de donadores sanos.

La Figura 10 muestra la determinacion de la reactividad del autoanticuerpo IgM Ap-espedfico en las muestras sericas indicadas despues del desenmascaramiento del anticuerpo. Los sueros de control de los donadores sanos (HI) o los sueros derivados de los pacientes AD se sometieron al descrito procedimiento de desenmascaramiento, y al ensayo FACS subsiguiente. La intensidad fluorescemica de los agregados de Ap se evaluo en el canal FL2-PE, expresandose como la Intensidad Fluorescemica Media (MFI).

La Figura 11 muestra un analisis de la curva ROC. La reactividad anti-Ap1-42 IgM-espedfica de los sueros derivados de los pacientes AD con sueros derivados de donadores sanos, se comparo despues de desenmascaramiento del autoanticuerpo.

La Figura 12 muestra un analisis de la curva ROC. La reactividad anti-Ap1-42 IgG espedfica de los sueros derivados de los pacientes AD, y de los sueros derivados de los individuos sanos, se analizaron antes y despues de la disociacion antigenica. Los valores delta se utilizaron para calcular la curva ROC.

La figura 13 representa los valores de MFI absolutos que representan los anticuerpos IgG espedficos de agregados de Ap antes, durante y tras las vacunaciones en pacientes tratados con una vacuna de Affitope. Se representa la sensibilidad a Ap1-42 de los sueros derivados de pacientes inmunizados con (paciente A) y sin alumbre (paciente B). Se evalua la intensidad de fluorescencia de los agregados de Ap en un canal de FL2-PE y se expresan como MFI.

La figura 14 representa el analisis estadfstico de inmunosensibilidad contra los agregados de Ap-42 expresados en los valores de MFI medios de los pacientes inmunizados con vacuna de Affitope con y sin alumbre. Debido a un extremo en el grupo con adyuvante se realiza una prueba Mann-Whitney (distribucion no normal) (A). Tras la extraccion del extremo se proporciona una distribucion normal y se realiza una prueba t de Student (B) Ambas pruebas son significativas estadfsticamente (p<0,05).

Ejemplos

Materiales y Metodos

Deteccion de los anticuerpos espedficos de Ap que utilizan la resonancia plasmonica superficial (SPR-Biacore).

El sistema Biacore ofrece distintos chips que pueden utilizarse para la inmovilizacion. Para este experimento, se utilizo un chip revestido con estreptavidina (sa). Para evitar la union inespedfica del ligando, mediante las cadenas laterales, a la superficie del chip, se utilizaron peptidos ApC-terminalmente biotinilados (obtenidas de Anaspec). Ya que el complejo biotina-estreptavidina es extremadamente estable, es el mas apropiado para experimentos seriados extendidos. Para optimizar la robustez del chip, y por tanto, la reproductibilidad, se inmovilizo un maximo de unidades de respuesta (~1500RU) sobre celulas de flujo, mientras la celula 1 de flujo se dejo vada y se utilizo como referencia. Para evitar la union no espedfica sobre la superficie del chip, se utilizo biotina libre para saturar sitios libres de union SA sobre la totalidad de las cuatro celulas de flujo. Las muestras humanas se han diluido 1:10 a 1:100 en HBS pH 7,4), y se midio (diluida en HBS pH 7,4, tambien) una serie de diluciones de IVIG desde 1 mg/ml a 10 |jg/ml. La superficie del chip se regenero despues de cada inyeccion de la muestra con 10 mM glicina-HCl (pH 1,8). Todos los experimentos se realizaron a 25°C. Se utilizo un protocolo estandarizado para el comienzo de las inyecciones con etapa de asociacion de 200 segundos, seguida por una de disociacion de 600 segundos. El valor Rmax se define como el nivel de respuesta (medido en RU) al final de la inyeccion de la muestra. Para la evaluacion de la senal, los valores Rmax se determinaron utilizando el programa BIA-evaluacion integrado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Deteccion de los anticuerpos especificos de Ap utilizando ELISA.

Distintos peptidos Ap (obtenidos de rPeptide) se diluyeron en 100 mM NaHCO3 (pH 9,2) a una concentracion de 5 |jg/ml, revistiendose sobre placas Maxisorp de 96 pocillos por la noche. Para evitar la union inespedfica, las placas de union se bloquearon utilizando BSA al 1%/PBS a 37°C durante 1 hora. Se llevo a cabo ELISA con una dilucion en serie de muestras de seres humanos (que empezaba con una dilucion de 1:10), o anadiendo IVIG en concentraciones que oscilaban entre 1 mg/ml y 10 jg/ml, diluidas en tampon de union (PBS/0,1% BSA/0,1% Tween20), a 37°C durante 1 hora. Despues de etapas repetidas de lavado (3x) con PBS/0,1% Tween20, se anadio durante 1 hora a 37°C el anticuerpo de deteccion secundario Ig HRP (0,5 jg/ml) anti-humano. Las muestras se lavaron otra vez 3x, anadiendo durante 30 minutos ABTS (0,68 nM en 0,1 M acido dtrico pH 4,3) para el desarrollo del ensayo, antes de la medicion-OD sobre el lector de la placa (Programa Biotek-Gen5) a una longitud de Onda de 405 nm.

Deteccion de los anticuerpos especificos de Ap utilizando el analisis FACS

Antes del analisis los peptidos p-amiloides liofilizados se sometieron a un procedimiento de desagregacion. Con este proposito, especies Ap liofilizadas se disolvieron en NH4OH al 1% (pH11). Los peptidos Ap disueltos alfcuotamente se conservaron a -20°C. Para inducir la formacion de agregados, las distintas especies Ap se incubaron a una concentracion de 20 jM en una solucion acuosa (pH 5) a 37°C en una agitadora (a 350 rpm) durante la noche en un tubo Eppendorf. La formacion de los agregados de Ap pudo confirmarse mediante tincion con Tioflavina T (ThT) en FACS (FSC/FL1). Las especies Ap agregadas se diluyeron a 0,15 jM en medio esteril, se filtraron con BSA al 0,5% y se preincubaron durante 30 minutos en un volumen final de 95 jl, en una placa de 96 pocillos. 5 jl del plasma humano prediluido a Abs (en 0,5% BSA/PBS), se anadio a 95 jl de solucion Ap-agregados. La dilucion final de plasma oscilo entre 1:1.000 y 1:10.000. Para los anticuerpos monoclonales, se utilizaron concentraciones inferiores a 0,5 jg/ml. Despues de 45 o 60 minutos de incubaron a una temperatura ambiente (RT) en la agitadora (350 rpm), se anadieron a cada pocillo 200 jl de BSA/PBS al 0,5%, centrifugandose durante 5 minutos a 3.000 rpm (placa de 96 pocillos-centnfuga). Se elimino el sobrenadante, repitiendose una etapa de lavado otra vez con 200 jl de BSA/PBS al 0,5%. Despues del segundo lavado, se descarto el SN, volviendose a suspender el sedimento en 100 jl de BSA/PBS al 0,5%, que contema una dilucion 1:1.000 de anti-IgG (H+L)-PE secundario marcado, o una dilucion 1:500 de anticuerpo Fc5j anti-IgM (ambos Jackson Immuno Research). Las muestras se incubaron durante otros 45 o 60 minutos a RT en la agitadora (350 rpm), y realizandose la medicion en FACS Canto equipado con un muestreador de alta capacidad de procesamiento (HTS). Los agregados se... en FSC/SSC, midiendose y evaluandose en el canal FL2-PE, respectivamente, la intensidad fluorescemica media (MFI), y la reactividad de ThT a los agregados de Ap, en el canal FL1-FITC, utilizando el programa FACS Diva.

Desenmascaramiento

Para interrumpir la union de los autoanticuerpos especificos de Ap a Ap, tal como se encuentra presente en el suero del paciente y, por tanto, para evitar la deteccion de estos autoanticuerpos unidos a Ap, mediante procedimientos basados en los antfgenos (como ELISA o FACS), se prediluyeron los sueros en 10 mM de Glicina pH 2,6, con una dilucion de 1:16,7 durante 5 minutos.

Para interrumpir la union potencial de los antfgenos Ap a los sueros de autoanticuerpos, se prediluyeron en 10 mM Glicina pH 2,6 con una dilucion de 1:16,7 durante 5 minutos. 5 jl de suero acidificado se co-incubaron entonces con 3 jl de Ap1-42 (100 jg/ml) durante otros 5 minutos. Entonces, la mezcla se neutralizo anadiendo 92 jl de 0,5% BSA/PBS), incubandose durante 20 a 60 minutos. Las etapas de lavado e incubacion con el anticuerpo secundario, se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente para el suero no desenmascarado.

Resultados

Agregados Ap: oligomerizacion y formacion fibrilar

La formacion de agregados de Ap (incluyendo oligomeros Ap, fibrillas y agregados fibrilares), a partir de Ap monomerico, se ha investigado intensivamente bajo multiples condiciones, recientemente. Se encontro que la agregacion de peptidos Ap depende mucho de distintas condiciones que incluyen pH, temperatura, composicion del tampon, y concentracion proteica. La agregacion empieza con la formacion de p-horquillas a partir de monomeros, lo que conduce a oligomeros solubles. La transicion conformacional a laminas p, lleva entonces a la formacion de fibrillas y de agregados fibrilares, lo que puede precipitarse mediante centrifugacion. Hallazgos recientes han mostrado que los agregados de Ap40 y Ap42 producidos a pH 7,4, incluyen fibrillas con un filamento de 5 nm de anchura, con una ligera tendencia a asociarse lateralmente en haces (con filamentos de 15 a 25 nm de ancho). La longitud de dicha unica fibrilla es del orden de los sub-micrometros (50-100 nm), hasta 10-15 jm, tal como se determina mediante microscopia electronica de transmision. Una caractenstica de estas fibrillas Ap es que se intercalan espedficamente con un colorante fluorescente, la tioflavina T (ThT).

Segun la presente invencion, se generaron los agregados de Ap de distintas variantes Ap peptfdicas (Ap1-42, Ap-40 y App(E)3-40, que se intercalan con ThT. Estos agregados-Ap, pueden detectarse utilizando analisis FACS. Tal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

como se describe en MM, con este proposito, peptidos Ap solubles sin semillas, se incubaron durante 20 h a 37°C, a una concentracion de 20 pM. Tal como se muestra en la Figura 1A (cuadro superior), una poblacion homogenea clara de ThT positivas (medidas como senales positivas FL1 (FITC) a las que el ensayo FACS dio lugar segun la presente invencion, permite el analisis de los agregados de Ap generados in vitro. La distribucion del tamano de los agregados de Ap (definida mediante dispersion avanzada FSC-A, se analizo utilizando perlas de tamano calibrado del orden de 1 a 15 pm (Kit de Calibracion el Tamano mediante Citometna de Flujo (Cat.# F-13838) mediante sondas moleculares) (Figura 1 cuadro inferior). Utilizando este analisis, se mostro que el tamano de los agregados de Ap generados, era del orden, tal como se esperaba, del sub-micrometrico hasta 10 pm, en el que la mayona de los agregados generados es del orden de ~200 nm hasta 3 pm.

Reactividad de mAbs con los agregados de Ap

Para definir si los agregados de Ap permiten la union de los anticuerpos espedficos de Ap y determinar si dicha interaccion puede monitorizarse utilizando el ensayo basado en FACS que se describe en esta Memoria, se emprendio otro conjunto de experimentos. Para esto, se generaron los agregados de Ap1-42 asf como App(E)3-42, incubandose con anticuerpos monoclonales espedficos para Ap1-42, (3A5) o espedficos para App(E)3-42 (D129). Tal como se muestra en los histogramas de FACS, en la Figura 2, el anticuerpo monoclonal 3A5 se une exclusivamente a los agregados de Ap1-42 mientras que mAb D129 interacciona solo con la especie piroglutamizada Ap truncada N-terminalmente. Esto muestra que el ensayo basado en FACS descrito, permite la deteccion de anticuerpos espedficos de Ap de una manera espedfica.

Definiendo la sensibilidad de distintos procedimientos de deteccion para la union de Ap de los autoanticuerpos humanos, utilizando IVIG.

IVIG (inmunoglobulina intravenosa) es un producto sangumeo comercialmente disponible. Contiene el conjunto de la fraccion IgG extrafda del plasma derivado de donadores sanos (plasma humano de, por lo menos, 1.000 donantes). Se ha mostrado que las preparaciones de IVIG contienen anticuerpos que se encuentran de forma natural (autoanticuerpos) espedficos para los peptidos Ap.

La finalidad de este experimento fue definir y comparar los lfmites de deteccion de tres procedimientos independientes de deteccion (Biacore, ELISA y el ensayo basado en FACS) para la reactividad Ap de IVIG (IVIG Subcuvia, obtenido de Baxter, Austria). Ap1-42 se inmovilizo entonces, bien sobre la superficie del chip, o sobre las placas Maxisorp de microtitulacion para las mediciones de ELISA o de SPR, respectivamente. Alternativamente, los agregados de Ap1-42 se generaron para analisis FACS. Subsiguientemente se aplicaron distintas diluciones IVIG a los sistemas individuales, definiendose los valores Rmax en el caso de SPR, los valores OD en el caso de ELISA, o los valores MFI (intensidad fluorescemica) en el caso del ensayo FACS. Por razones comparativas, la senal para la proporcion de ruido, se evaluo para todas las concentraciones de IVIG, expresandose las senales como senales ampliadas del ruido de fondo (xBG) (Figura 3). En el caso de la medicion de SPR, ninguna de las concentraciones IVIG dio lugar a una senal superior al ruido de fondo (Figura 3C). Contrariamente a que el anticuerpo 3A5 de control diera lugar a una senal fuerte, indicando que Ap1-42 se habfa inmovilizado con exito en la superficie del chip, y que los peptidos Ap, en principio, pueden reconocerse sobre la superficie del chip mediante anticuerpos. Utilizando ELISA como procedimiento de deteccion, 1.000 pg/ml de IVIG dieron lugar a una senal clara sobre el ruido de fondo (7 veces BG), mientras que la senal inducida por 100 pg/ml de IVIG fue solo de 2 veces el ruido de fondo, 10 pg/ml de IVIG no dieron lugar a una senal mayor que el ruido de fondo (Figura 3B). Tal como se muestra en la IA, el ensayo basado en FACS proporciono senales que fueron mucho mas altas que las proporcionadas por los otros dos procedimientos de deteccion. No solo los 1.000 pg/ml (24 veces BG), o 100 pg/ml (11 veces BG), sino tambien 10 pg/ml (5 veces BG), y 1 pg/ml (casi 2 veces BG) de la dilucion de IVIG dieron lugar a una senal que se encontraba claramente por encima del ruido de fondo. Esto indica que el nuevo ensayo basado en FACS desarrollado recientemente para detectar autoanticuerpos espedficos de Ap, es, por lo menos, 100 veces mas sensible que los ensayos convencionales tales como ELISA o Biacore.

Definicion de anticuerpos amiloides anti-beta en la sangre humana derivados de donantes sanos y de pacientes AD.

a. Reactividad de IgG para AB1-42

Muestras sericas derivadas, bien de individuos sanos (n = 13, “30 a 50 anos de edad) o de pacientes AD (n = 48, ~ 70 anos de edad), se analizaron con respecto al contenido de anticuerpos espedficos de Ap encontrados naturalmente, utilizando agregados de Ap y analisis FACS tal como se ha descrito anteriormente. Tal como se muestra en la Figura 4, los anticuerpos que se encuentran de forma natural que son espedficos para los agregados de Ap. Se detectaron en todas las muestras ensayadas. Sin embargo la concentracion de dichos anticuerpos fue significativamente mas baja en las muestras sangumeas derivadas de los pacientes AD, cuando se compararon con las muestras sericas derivadas de individuos sanos.

Para definir la sensibilidad y especificidad del presente ensayo FACS, para identificar individuos que padecen AD, la reactividad de IgG para los agregados de Ap1-42 de los sueros indicados en la Figura 4, se repitieron 2 veces, habiendose sumarizado los resultados en las curvas ROC (Figura 5). Este analisis de la curva rOc mostro que la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

especificidad fue del 100% cuando la sensibilidad era del 81% y la sensibilidad era del 100% cuando la especificidad era del 77%, con un area bajo la curva (AUC) de 0,9679.

En un intento de definir una correlacion entre datos cognitivos e inmunologicos, la reactividad IgG medida para los agregados de Ap de los sueros de los pacientes AD (n=24), se correlaciono con indices del examen del estado MiniMental (MMSE) de los pacientes, cuando se llevo a cabo el muestreo del suero. Esta correlacion revelo que los pacientes con un rendimiento debil del ensayo, muestran una tendencia a una reactividad IgG reducida, tal como se muestra en la Figura 6. Esta disminucion de la reactividad IgG Ap-espedfica, refleja por tanto la progresion de AD.

En un intento para definir una correlacion entre datos inmunologicos y cognitivos, la reactividad IgG medida de los sueros de pacientes AD (n=24), se correlaciono con resultados del examen del estado Mini-Mental (MMSE) de los pacientes. Esta prueba se utiliza habitualmente para detectar la alteracion y demencia cognitiva, estimando la gravedad de dicha alteracion cognitiva, en un individuo y en un momento determinado. La correlacion de MFI con los parametros MMSE revelo que los pacientes con un rendimiento debil de la prueba, mostraron una tendencia a una reactividad IgG reducida tal como se muestra en la Figura 6.

b. Reactividad de IgG con respecto a AB3-42 y App(E)3-42

Ademas de definir la reactividad de las inmunoglobulinas que estan presentes habitualmente en los sueros de los pacientes AD y de los individuos sanos para los agregados de Ap1-42, la reactividad de estos sueros se definio tambien contra Ap3-42, asf como para App(E)3-42. Las curvas ROC a partir de estos analisis, se muestran en las Figuras 7 y 8. En el caso de Ap3-42 (Figura 7), el analisis de la curva rOc mostro que la especificidad fue del 92% cuando la sensibilidad era del 77%, con un area bajo la curva (AUC) de 0,859.

En el caso de App(E)3-42 (Figura 8), el analisis de la curva ROC mostro que la especificidad fue de 85%, cuando la sensibilidad era del 93%, con un area bajo la curva (AUC) de 0,928.

c. Reactividad de IgM para distintos agregados de Ap

En un conjunto de experimentos llevados a cabo a continuacion, de la reactividad IgM espedfica respecto a los agregados de Ap, esta reactividad se definio en muestras sericas derivadas, bien de individuos sanos, o de pacientes AD, utilizando identicos sueros que los anteriormente descritos. Como puede apreciarse en la Figura 9A, anticuerpos de isotipo IgM que se encuentran naturalmente, y que son espedficos para los agregados de Ap, se detectaron en todas las muestras que se ensayaron. Pero, a diferencia de la reactividad IgG, las muestras sericas derivadas de controles sanos no parecen tener una reactividad IgM superior a los agregados de Ap, que las muestras sericas derivadas de los pacientes AD. Por tanto, el analisis de la curva ROC no dio lugar a curvas que mostraron sensibilidad o especificidad (Figura 9B).

d. Reactividad de IgG e IgM respecto a los agregados de AB despues de desenmascaramiento.

En estudios previos, se ha mostrado que los autoanticuerpos espedficos de Ap, principalmente del isotipo IgM, pueden ocuparse con el antfgeno Ap para construir un complejo inmune que es estable y circula en la sangre humana (WO 2010/128139 A1; Marcello et al., 2009; Lindhagen-Persson et al., PLoS ONE 5 (2010): e13928). Para definir si los antfgenos Ap potencialmente unidos a los autoanticuerpos, pueden bloquear la reactividad de estos anticuerpos para los Ap-agregados generados in vitro, los sueros individuales se sometieron a un procedimiento de desenmascaramiento, tal como se describe en Material y Metodos. Utilizando un pH bajo, los complejos inmunes potenciales se rompen, dando lugar a la eliminacion de antfgenos Ap, a partir de dominios que se unen a anticuerpos (disociacion de antfgenos). De este modo, un procedimiento de desenmascaramiento podna dar lugar a senales mas intensas de autoanticuerpos en el ensayo basado en FACS, si los complejos inmunes estan en las muestras sericas. De forma interesante, tal como se muestra en la Figura 10, la reactividad IgM de los sueros del paciente AD aumento significativamente despues de desenmascaramiento, mientras que la reactividad de sueros de control sanos no cambio, comparada con los sueros no tratados (comparese Figura 9A). Esto representa un contraste con lo que se midio en caso de reactividad IgG para los agregados de Ap. Tal como se muestra en la Figura 4, los sueros derivados de los individuos sanos, mostraron, una superior reactividad IgG con respecto a los agregados de Ap, que los sueros derivados de los pacientes AD (en este caso, los sueros no se trataron con un pH bajo).

Los resultados de la Figura 11 que se muestran en la Figura 10, se han sumarizado en curvas ROC. Este analisis de la curva ROC, mostro que la especificidad fue del 84% cuando la sensibilidad fue del 78% con un area bajo la curva (AUC) de 0,822.

Para completar este conjunto de experimentos, se llevo tambien a cabo un experimento de desenmascaramiento, para detectar si tambien los autoanticuerpos del subtipo IgG podnan ser ocupados por antfgenos Ap. Con esta finalidad, todos los sueros se trataron otra vez con pH bajo, para romper complejos inmunes potenciales y subsiguientemente, se analizo la reactividad IgG de los sueros con respecto a los agregados-Ap. Como se muestra antes en el experimento de desenmascaramiento de IgM, tambien en este experimento de reactividad IgG con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

respecto a los agregados de Ap de los sueros derivados de los individuos sanos, no difirio entre los sueros no tratados y los desenmascarados. En contraste con esto, los sueros derivados de pacientes AD, mostraron otra vez un aumento significativo en la reactividad Ap, despues del procedimiento de desenmascaramiento. Se compararon las senales derivadas de la union de los autoanticuerpos IgG sericos, a los agregados de Ap (en este caso Ap1-42) antes y despues de la disociacion de los antigenos. La diferencia entre los valores MFI derivados de las distintas mediciones (no tratados respecto a desenmascarados), se definieron como la delta de disociacion (A). En la Figura 11, los valores A de los sueros derivados de los controles sanos, y los valores A de los sueros derivados de los pacientes AD, se sumarizan en una curva ROC. Como puede apreciarse, los vales A derivados de la reactividad IgG, pueden utilizarse tambien como parametro para identificar los pacientes AD. Este analisis de la curva ROC mostro que la especificidad fue del 85%, cuando la sensibilidad fue del 79% con un area bajo la curva (AUC) de 0,862.

Conclusiones

Basandose en estos resultados, puede establecerse que la sensibilidad mas acusada del ensayo de agregacion FACS segun la presente invencion, esta conectada directamente los distintos estados de agregacion de Ap1-42. Para el analisis BIAcore se utilizo un Ap1-40 biotinilado y recien disuelto para la inmovilizacion sobre un chip de estreptavidina. Este procedimiento favorece la union de Ap1-42 monomerico sobre la superficie del chip, porque el peptido se inmoviliza inmediatamente sin preincubacion, decelerando tambien la formacion de agregados de Biotina marcada. Tambien, el revestimiento de Ap1-42 a pH9 sobre las placas Maxisorp parece favorecer la forma monomerica de Ap, aunque el revestimiento de algunos agregados no puede excluirse. En este ensayo, las afinidades entre anticuerpos y el peptido Ap1-42 son responsables del lfmite de deteccion.

En contraste con estos dos procedimientos para el ensayo basado en FACS, segun la presente invencion, los agregados de Ap1-42 se indujeron y utilizaron espedficamente para la deteccion de anticuerpos para Ap presente en IVIG. Estas moleculas mas grandes ofrecen multiples sitios de union a los anticuerpos. El efecto resultante de avidez (la suma de multiples interacciones sinergicas antfgeno-anticuerpo), puede considerar la sensibilidad mas alta de este ensayo, conduciendo a la deteccion de anticuerpos poco afines dentro de la fraccion IVIG. La reactividad de IVIG para los agregados de Ap, puede explicarse tambien por la existencia de un epitopo que solo se encuentre presente en la forma agregado de Ap.

Los ejemplos muestran claramente la superioridad de este procedimiento con respecto a los procedimientos que estan disponibles habitualmente en el campo, especialmente con respecto a propiedades analfticas, tales como especificidad y selectividad.

Un estudio clmico con una vacuna de mimotopo segun los documentos EP 1 583 774 B1 y EP 1 679 319 B1.

Una vacuna de Affitope como se reivindica en los documentos EP 1 583 774 B1 y EP 1 679 319 que resulta apta para inducir unos anticuerpos que se dirigen espedficamente a los peptidos Ap se somete a ensayo en un estudio clmico que contiene dos brazos. Los pacientes de la cohorte uno son inmunizados con la vacuna de Affitope que contiene un adyuvante y los pacientes en la cohorte dos son inmunizados con la vacuna de Affitope que carece de un adyuvante como potenciador de la respuesta inmunitaria. En contraste con la vacuna sin adyuvante, en la que no puede esperarse un aumento de los anticuerpos IgG espedficos de Ap, la vacuna con adyuvante debena presentar la capacidad de inducir anticuerpos que se dirigen a Ap.

Para evaluar la capacidad del ensayo basado en FACS segun la presente invencion para monitorizar los anticuerpos IgG inducidos a lo largo del desarrollo del estudio clmico se someten a este ensayo los sueros derivados de los recipientes de vacuna. Se analizan un suero preinmunizacion (recogido antes del inicio del procedimiento de inmunizacion) y 3 sueros posinmunizacion derivados de cada paciente unico. Se realizan dos mediciones individuales por momento y paciente en almuotas diferentes de las muestras de suero. Un aumento de Abs IgG espedficos de agregados de Ap en pacientes individuales a lo largo del tiempo indicana que el ensayo de FACS puede aplicarse para monitorizar la eficacia de una intervencion inmunoterapeutica a lo largo del tiempo y ademas dichos resultados senan indicativos de una vacunacion exitosa tambien.

Aplicando el ensayo basado en FACS segun la presente invencion, se descubre que los sueros preinmunizacion de la totalidad de los participates del estudio ya contienen las IgG espedficas de agregado de Ap como se espera. Esto de acuerdo con publicaciones recientes que presentan que los lfquidos corporales tales como sangre (plasma/suero) y CSF contienen Ab IgM e IgG espedficos de agregado de Ap.

Los valores presentados en la figura 13 representan los valores medios de las dos mediciones a lo largo del tiempo. En esta figura se representan de manera ejemplificativa el desarrollo de una respuesta de anticuerpo IgG espedfica de Ap en un paciente que proviene de la cohorte uno (paciente A) y un paciente inmunizado con una vacuna que carece de adyuvante (cohorte dos - paciente B). Como puede apreciarse en la figura 13 las senales de MFI de los sueros inmunitarios 2 y 3 del paciente A son superiores significativamente a la senal de fluorescencia derivada del presuero, que indica las IgG espedficas de Ap aumentadas. En contraste con esto, los sueros inmunitarios

derivados del paciente B no dan como resultado unas senales de fluorescencia aumentadas. Estos resultados son representativos de los grupos respectivos.

Para definir el aumento de la reactividad a Ap1-42 en pacientes individuales se calcula la diferencia de los valores de 5 MFI medios de las dos mediciones independientes del ultimo suero inmunitario con relacion a los presueros respectivos. En la figura 14 puede apreciarse que el analisis de los sueros inmunitarios que utiliza el ensayo de FACS da como resultado una diferencia evidente entre ambos grupos. Los sueros inmunitarios de los pacientes inmunizados con una vacuna con adyuvante presentan de manera consistente un aumento de las IgG espedficas de AP.

10

Para evaluar la diferencia estadfstica entre los valores de FI medios de los pacientes que reciben la vacunacion con adyuvante o sin adyuvante se realizan dos ensayos diferentes. Cuando los datos de la totalidad de los pacientes se incluyes no existe una distribucion normal dada entre los dos grupos debido a un extremo en el grupo con adyuvante. Se realiza bajo esta precondicion una prueba de Mann-Whitney que da como resultado un valor de p de 15 0,0473 (figura 14). Para realizar un analisis estadfstico asimismo bajo unas condiciones de distribucion normales se

elimina la capa exterior del conjunto de datos y se calcula una prueba t de Student. Este analisis da como resultado asimismo un valor p significativo estadfstico de 0,0089 (figura 14).

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer (AD) en el que los anticuerpos espedficos de Ap en una muestra biologica de una persona que se sospecha presenta AD son detectados comprendiendo las etapas siguientes:

   - poner en contacto la muestra con agregados de Ap y permitir que los anticuerpos espedficos de Ap se unan a los agregados de Ap, y

   - detectar los anticuerpos espedficos de Ap unidos a los agregados de Ap mediante una tecnica de deteccion de partfculas individuales, preferentemente mediante la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS);

   y en el que la cantidad de los anticuerpos espedficos de Ap detectada se compara con la cantidad en una muestra de estado de AD conocido.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que los anticuerpos espedficos de Ap son anticuerpos humanos, preferentemente anticuerpos IgG o IgM humanos, especialmente anticuerpos IgG humanos.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que los anticuerpos espedficos de Ap son autoanticuerpos.
4. 4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que los agregados de Ap presentan un tamano de 50 nm a 15 pm, preferentemente de 100 nm a 10 pm, especialmente de 200 nm a 5 pm.
5. 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que los agregados de Ap se han preparado incubando los peptidos Ap-1-42, peptidos Ap-1-43, Ap-3-42, o peptidos Ap-p(E)3-42 a un pH de 2 a 9 durante por lo menos 20 minutos, preferentemente por lo menos 1 h, especialmente por lo menos 4 h.
6. 6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que los agregados de Ap estan presentes para poner en contacto la muestra con los agregados de Ap en una cantidad de 0,001 a 1 pM, preferentemente 0,01 a 0,1 pM.
7. 7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la muestra biologica es sangre humana o una muestra derivada de sangre humana, preferentemente suero humano o plasma humano; lfquido cefalorraqmdeo humano o linfa humana.
8. 8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que los agregados de Ap se ponen en contacto con la muestra durante por lo menos 10 minutos, preferentemente desde 10 minutos a 24 horas, especialmente desde 20 minutos a 2 horas.
9. 9. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra de un estado de AD conocido es una muestra de un paciente con AD o una muestra de una persona sana.
10. 10. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de un estado de AD conocido es una curva de calibracion de estado de AD, especialmente una curva de exploracion de estado Minimental (MMSE).
11. 11. Utilizacion de un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la monitorizacion de pacientes de AD, especialmente pacientes de AD que son tratados con medicamentos para curar o mejorar la AD.
12. 12. Utilizacion de un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para evaluar el riesgo de desarrollar AD o para detectar una AD de estadio temprano.
13. 13. Utilizacion de un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para el diagnostico de la demencia de Parkinson (PDD), demencia con cuerpos de Lewy (DLB), angiopatfa amiloide cerebral (CAA), miositis de cuerpos de inclusion (IBM), o traumatismo craneoencefalico cronico.
14. 14. Utilizacion de un kit que comprende:

    - unos agregados de Ap, y

    - un recipiente de muestras

    para llevar a cabo el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.