CN102477079A - 一种新型多肽在系统性红斑狼疮诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一条新型多肽用于系统性红斑狼疮的诊断。这种多肽抗原的IgG型抗体，在系统性红斑狼疮的诊断中具有很高的敏感性和特异性。

Description

一种新型多肽在系统性红斑狼疮诊断中的应用

技术领域：

本发明涉及免疫学诊断领域，具体而言，本发明涉及一种新型多肽(SLEP)的制备方法和及其在系统性红斑狼疮诊断中的应用。 

背景技术：

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以自身抗体产生和免疫复合物形成为特征的自身免疫性疾病，临床表现为全身症状及多系统多器官受累的症状。我国SLE的发病率为70.1/10万，并且有逐年上升的趋势。SLE的早期诊断、早期治疗是改善预后的关键。然而我国自身免疫性疾病诊断水平较低，并且诊断试剂主要依赖进口，造成诊断费用昂贵，增加了国家和患者的医疗成本，也不利于向基层医院普及。因此，建立稳定、快捷、适合推广的检测方法，是目前亟待解决的问题。 

SLE临床诊断标准中包括自身抗体如抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(ds-DNA抗体)和抗Sm抗体检测，但由于特异性和灵敏度的不高，还不是理想的血清学检测指标。如果能够建立SLE特异的“自身抗体谱”检测方法，同时检测多种特异性抗体，提高检出率及准确性，将为SLE的诊断、分类、疗效观察和预后判断提供了可靠的依据，具有重要的临床意义。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的血清学检测方法，对系统性红斑狼疮的早期诊断及治疗具有重要意义。 

大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其发病机制尚不明确，难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位(epitope)是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽(mimotope)作为诊断工具有以下几个优势：1)可以提高 诊断的灵敏度和特异性，避免了生物大分子易产生的非特异性结合[Deroo Set al(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4：75-115]；2)扩大疾病诊断的范围，对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂类抗原，以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断，也可以获得与天然抗原表位一致的结果[Bruce G(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：1955 1960；Jinaping Q et al(1999)Hyridoma 18(1)：103-109]；3)多肽制备、应用的成本低、易于质控。因此，自身抗原表位肽或其模拟肽[Meloen RH et al(2000)J Mol Recognit 13：352-359]的获得是制备自身抗体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术，仅需要以患者血清样本为靶标，而无需天然的自身抗原信息，可以实现快速和简便筛选，并且成本低、结果可信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是，通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的多个抗原表位肽，它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通常由多个抗原表位组成，其中有一些在免疫反应中起着主要作用，被称为“免疫显性基团”，针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种“单克隆抗体”组成。以SLE患者血清样品为靶标，通过噬菌体肽库筛选，获得SLE特异性的抗原表位肽，是获得新型诊断试剂的基础。 

基于以上研究及目前的现状，申请人进行了多方面的研究及探索，通过下述实验策略获得了SLE特异性的抗原表位肽。具体而言，申请人从10例SLE患者血清中制备和纯化得到IgG，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其中的一个表位肽，命名为SLEP，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合，而不与健康人血清反应。 

至此，申请人能够特异性与SLE患者血清中IgG结合的抗原表位肽，由此完成了本发明。 

发明内容

具体地，本发明提供了： 

1.一种系统性红斑狼疮特异性的抗原表位，其具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：KSPGTPSPVSQW。 

2.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1所述的氨基酸序列。 

3.权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。 

4.权利要求3的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。 

5.权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。 

6.权利要求5的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。 

7.权利要求1所述的抗原表位在系统性红斑狼疮诊断的用途。 

8.权利要求2所述的核苷酸序列在系统性红斑狼疮诊断的用途。 

附图说明

图1：表示阳性噬菌体克隆的竞争ELISA结果。 

图2：表示合成肽SLEP与SLE患者血清样品、健康人血清样品的结合。 

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。 

实施例 

1、噬菌体展示肽库筛选SLE特异性的抗体结合肽 

Ph.D.-12肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2.7×10⁹，滴度为1.5×10¹³/μl.。Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示 肽库使用说明书。每轮筛选以SLE患者血清中的总IgG包被(每孔10μg)，每孔投入1×10¹¹噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与总IgG抗体的特异性结合通过ELISA测定。总IgG抗体(每孔10μg)包被96孔板(Nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的抗体，3％BSA 37℃封闭1小时。每孔投入1×10⁹噬菌体37℃孵育2小时。洗涤液(PBS-0.05％Tween 20)洗板5次，共3分钟。HRP标记的抗M13单抗(1∶1000稀释，Amersham Biosciences公司)37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。由图1可知，这12个克隆均为阳性克隆。 

2、rEfb抗原表位的获得及其活性验证 

对挑取的20个噬菌体克隆进行测序，获得了7条阳性克隆的展示肽序列(见表1)。通过比对这些结合肽序列，申请人发现(见图2)。申请人据此合成了该肽段，其具体的氨基酸序列为：KSPGTPSPVSQW(SEQ ID NO：1)，命名为SLEP。 

3、SLEP与SLE患者血清IgG结合检测 

合成肽SLEP(每孔0.5μg)包被96孔板(Nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的肽，3％BSA 37℃封闭1小时。SLE患者或健康人血清样品1∶400稀释，加入不同孔中，37℃孵育1小时。洗涤液(PBS-0.05％Tween 20)洗板5次，共3分钟。1∶1000稀释的HRP标记的羊抗人IgG 37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图2。 

表1  噬菌体展示肽序列测定结果 

综上可知，本申请的系统性红斑狼疮特异性的抗原表位肽，能够特异的与患者血清中的IgG结合，本申请提供了如式(I)所示的抗原表位。 

Claims (8)

1.一种系统性红斑狼疮特异性的抗原表位，其具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：KSPGTPSPVSQW。

2.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1所述的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

4.权利要求3的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

6.权利要求5的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的抗原表位在系统性红斑狼疮诊断的用途。

8.权利要求2所述的核苷酸序列在系统性红斑狼疮诊断的用途。