CN102477081B - 一种新型多肽在干燥综合征诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一条新型多肽用于干燥综合征的诊断。这种多肽抗原的IgG型抗体，在干燥综合征的诊断中具有很高的敏感性和特异性。

Description

一种新型多肽在干燥综合征诊断中的应用

技术领域：

本发明涉及免疫学诊断领域，具体而言，本发明涉及一种新型多肽(SSP)的制备方法和及其在干燥综合征诊断中的应用。

背景技术：

干燥综合征(

Syndrome，SS)是一种以侵及泪腺和唾液腺等外分泌腺为特征的全身性自身免疫疾病。该病最常见的临床表现为眼干、口干，并可累及肺、肾脏、淋巴系统、血管及肝脏等器官。此病无明显的地区分布差异，可发生于任何年龄，以40-60岁，特别是绝经后的女性居多，男女之比为1∶9。在我国的患病率为0.77％，在老年人群中的患病率高达4％，全国有近1000万患者。干燥综合征可分为原发性干燥综合征(Primary Sjogren’s syndrome)和继发性干燥综合征(Secondary Sjogren’s syndrome)两类。该病单独发生时，称为原发性干燥综合征；与其它诊断明确的自身免疫性疾病如类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等合并存在时，称为继发性干燥综合征。

近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性进展。目前在临床诊断主要依据临床症状和唇腺活检及腮腺造影等有创检查明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时机。虽然诊断标准中包括血清抗SSA(Ro)抗体、抗SSB(La)抗体和抗核抗体(ANA)检测，但它们均特异性和敏感性低，不能作为理想的诊断指标。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的血清学检测方法，对干燥综合征的早期诊断及治疗具有重要意义。

大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其发病机制尚不明确，难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位(epitope)是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽(mimotope)作为诊断工具有以下几个优势：1)可以提高诊断的灵敏度和特异性，避免了生物大分子易产生的非特异性结合[Deroo Set al(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4：75-115]；2)扩大疾病诊断的范围，对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂类抗原，以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断，也可以获得与天然抗原表位一致的结果[Bruce G(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94：1955 1960；Jinaping Q et al(1999)Hyridoma 18(1)：103-109]；3)多肽制备、应用的成本低、易于质控。因此，自身抗原表位肽或其模拟肽[Meloen RH et al(2000)J Mol Recognit 13：352-359]的获得是制备自身抗体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术，仅需要以患者血清样本为靶标，而无需天然的自身抗原信息，可以实现快速和简便筛选，并且成本低、结果可信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是，通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的多个抗原表位肽，它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通常由多个抗原表位组成，其中有一些在免疫反应中起着主要作用，被称为“免疫显性基团”，针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种“单克隆抗体”组成。以SS患者血清样品为靶标，通过噬菌体肽库筛选，获得SS特异性的抗原表位肽，是获得新型诊断试剂的基础。

基于以上研究及目前的现状，申请人进行了多方面的研究及探索，通过下述实验策略获得了SS特异性的抗原表位肽。具体而言，申请人从10例SS患者血清中制备和纯化得到IgG，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其中的一个表位肽，命名为SSP，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合，而不与健康人血清反应。

至此，申请人能够特异性与SS患者血清中IgG结合的抗原表位肽，由此完成了本发明。

发明内容

具体地，本发明提供了：

1.一种干燥综合征特异性的抗原表位，其具有下述的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)：

YNATGPSPVSQW

2.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1所述的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

4.权利要求3的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，其可作为组合物的一种组分。

6.权利要求5的组合物，其特征在于，还可以包含药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的抗原表位在干燥综合征诊断的用途。

8.权利要求2所述的核苷酸序列在干燥综合征诊断的用途。

附图说明

图1：表示阳性噬菌体克隆的竞争ELISA结果。

图2：表示合成肽SSP与SS患者血清样品、健康人血清样品的结合。

具体实施方式

为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。

实施例

1、噬菌体展示肽库筛选SS特异性的抗体结合肽

Ph.D.-12肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2.7×10⁹，滴度为1.5×10¹³/μl.。Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库使用说明书。每轮筛选以SS患者血清中的总IgG包被(每孔10μg)，每孔投入1×10¹¹噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与总IgG抗体的特异性结合通过ELISA测定。总IgG抗体(每孔10μg)包被96孔板(Nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的抗体，3％BSA 37℃封闭1小时。每孔投入1×10⁹噬菌体37℃孵育2小时。洗涤液(PBS-0.05％Tween 20)洗板5次，共3分钟。HRP标记的抗M13单抗(1∶1000稀释，Amersham Biosciences公司)37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。由图1可知，这12个克隆均为阳性克隆。

2、rEfb抗原表位的获得及其活性验证

对挑取的20个噬菌体克隆进行测序，获得了7条阳性克隆的展示肽序列(见表1)。通过比对这些结合肽序列，申请人发现(见图2，3)。申请人据此合成了该肽段，其具体的氨基酸序列为：YNATGPSPVSQW(SEQ ID NO：1)，命名为SSP。

3、SSP与SS患者血清IgG结合检测

合成肽SSP(每孔0.5μg)包被96孔板(Nunc公司)4℃过夜。倾去不结合的肽，3％BSA 37℃封闭1小时。SS患者或健康人血清样品1∶400稀释，加入不同孔中，37℃孵育1小时。洗涤液(PBS-0.05％Tween 20)洗板5次，共3分钟。1∶1000稀释的HRP标记的羊抗人IgG 37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图2。

表1  噬菌体展示肽序列测定结果

综上可知，本申请的干燥综合征特异性的抗原表位肽，能够特异的与患者血清中的IgG结合，本申请提供了如式(I)所示的抗原表位。

Claims (4)

1.一种干燥综合征特异性的抗原表位，其氨基酸序列如下所示：YNATGPSPVSQW。

2.一种核苷酸序列，其特征在于编码权利要求1所述的氨基酸序列。

3.一种组合物，其特征在于，其将权利要求1所述的抗原表位作为组合物的一种组分。

4.权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。

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