CN102816210B - 一种继发性干燥综合征抗原表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于免疫学诊断技术领域的一种继发性干燥综合征抗原表位及其应用。该抗原表位为多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。该抗原表位多肽，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合，而不与健康人血清反应。该抗原表位多肽可制备诊断继发性干燥综合征的药物。

Description

一种继发性干燥综合征抗原表位及其应用

技术领域

本发明属于免疫学诊断技术领域，具体涉及一种继发性干燥综合征抗原表位及其应用。

背景技术

干燥综合征是一种主要累及外分泌腺的系统性自身免疫性疾病，临床上以口眼干燥，腮腺肿大为主要表现。干燥综合征可单独发生，也继发于其他自身免疫性疾病，如类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA），系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）等。有报道证明继发性干燥综合征（sSS）与原发性干燥综合征(pSS)不同，二者有不同的临床、血清学和遗传学特征, 但目前为止，继发性干燥综合征的发生机制仍然未明。

由于sSS患者病程中往往出现器官受累，如弥漫性间质性肺病，肾小管酸中毒，肌炎等，而这些并发症使得sSS死亡率大大增加，所以sSS的早期诊治至关重要。但目前sSS仍然缺乏理想的血清标记物，我们仍不清楚sSS与pSS的抗体谱是否相同。虽然自身抗体如抗SSA、SSB以及a-胞衬蛋白抗体已用于sSS的临床诊断，但这些标记物均缺乏较好的特异性和敏感性，并且部分患者血清中缺乏抗SSA、SSB抗体。

大量自身抗体的出现是自身免疫性疾病的重要特征之一，但由于其发病机制尚不明确，难以直接利用自身抗原检测抗体。抗原表位（epitope）是抗原分子中识别、结合抗体的基础，因此是检测抗体的实际有效组分。以抗原表位肽或其模拟肽（mimotope）作为诊断工具有以下几个优势：1）可以提高诊断的灵敏度和特异性，避免了生物大分子易产生的非特异性结合（Deroo S et al (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4: 75 – 115）；2）扩大疾病诊断的范围，对于研究较少或难以体外应用的自身抗原如核酸抗原、多糖抗原、脂类抗原，以模拟肽作为天然抗原的替代物进行诊断，也可以获得与天然抗原表位一致的结果（Bruce G （1997） ProcNatl Acad Sci USA 94：1955 – 1960； Jinaping Q etal (1999) Hyridoma 18(1)：103 – 109）；3）多肽制备、应用的成本低、易于质控。因此，自身抗原表位肽或其模拟肽（MeloenRH et al (2000) J Mol Recognit 13: 352 - 359 ）的获得是制备自身抗体的多肽检测试剂的基础。基于噬菌体肽库技术的抗原表位确定技术，仅需要以患者血清样本为靶标，而无需天然的自身抗原信息，可以实现快速和简便筛选，并且成本低、结果可信度高。噬菌体肽库技术的另一个突出特点是，通过筛选可以同时获得某一疾病特异性的多个抗原表位肽，它们可能代表了天然抗原的主要免疫显性基团。天然生物大分子抗原通常由多个抗原表位组成，其中有一些在免疫反应中起着主要作用，被称为“免疫显性基团”，针对完整抗原的抗体主要是针对这些表位的多种“单克隆抗体”组成。以sSS患者血清样品为靶标，通过噬菌体肽库筛选，获得sSS特异性的抗原表位肽，是获得新型诊断试剂的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种继发性干燥综合征的抗原表位。

本发明的目的还在于提供上述抗原表位的核苷酸序列。

本发明的目的还在于提供一种检测继发性干燥综合征的试剂盒。

本发明的目的还在于提供继发性干燥综合征的抗原表位在制备诊断继发性干燥综合征的药物中的用途。

发明人从10例sSS患者血清中制备和纯化得到IgG，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性噬菌体克隆展示肽序列。化学合成其中的一个表位肽，命名为sSSP, 通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与患者血清中的IgG结合，而不与健康人血清反应。

一种继发性干燥综合征的抗原表位，该抗原表位为多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。

编码上述继发性干燥综合征的抗原表位的核苷酸序列。

一种检测继发性干燥综合征的试剂盒，该试剂盒包括：权利要求1所述多肽，权利要求1所述多肽的抗体，固相酶标板，牛血清白蛋白，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，四甲基联苯胺。

所述继发性干燥综合征的抗原表位在制备诊断继发性干燥综合征的药物中的用途。

本发明的有益效果：本发明获得的继发性干燥综合征的抗原表位多肽，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，表明其能特异的与sSS患者血清中的IgG结合，而不与RA、SLE、pSS患者及健康人血清反应。

附图说明

图1为阳性噬菌体克隆的ELISA结果。

图2为sSSP与患者血清样品、健康人血清样品的结合。

图3 为RAP抗体检测的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分（J.萨姆布鲁克 E.F.弗里奇等，科学出版社）或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1  sSS患者血清总IgG制备和纯化

取适量Protein A树脂悬液（GE公司产品），装入层析柱，用10倍柱体积的PBS缓冲液洗涤平衡层析柱。将继发性干燥综合征患者血清高速离心后，加入1/10体积10×PBS缓冲液混合，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。加入6倍柱体积0.1 M甘氨酸（pH 3.0）洗脱，收集穿出液，以1/10体积的1M Tris-HCl（pH 9.0）中和。将得到抗体对PBS透析，定量抗体浓度后加入50%甘油，分装并保存在-20℃。

实施例2   噬菌体展示肽库筛选sSS特异性的抗体结合肽

Ph.D.-12 肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2.7×10⁹, 滴度为1.5×10¹³/μl.。Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库试剂盒使用说明书。每轮筛选以sSS患者血清中的总IgG包被（每孔10 μg），每孔投入1×10¹¹噬菌体。噬菌体富集程度通过“投入/产出比”计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与总IgG抗体的特异性结合通过ELISA测定。总IgG抗体（每孔10 μg）包被96孔板（Nunc公司）4 ℃过夜。倾去不结合的抗体，3% BSA 37℃封闭1小时。每孔投入1×10⁹噬菌体37℃孵育2小时。洗涤液（PBS-0.05% Tween 20）洗板5次，共3分钟。HRP标记的抗M13单抗(1:1000稀释，Amersham Biosciences公司) 37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以TMB (Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。由图1可知，这14个克隆均为阳性克隆。序列测定结果表明，这些序列具有良好的一致性，其中一条序列出现频率高、保守性好。申请人据此合成了该肽段，其具体的氨基酸序列为：FKSGTGPQQYSY（SEQ ID NO：1）,命名为sSSP。

实施例3  sSSP与sSS患者血清IgG结合检测

合成肽sSSP（每孔0.5 μg）包被96孔板（Nunc公司）4 ℃过夜。倾去不结合的肽，3% BSA 37℃封闭1小时。sSS患者或健康人血清样品1:400稀释，加入不同孔中， 37℃孵育1小时。洗涤液（PBS-0.05%Tween 20）洗板5次，共3分钟。1:1000稀释的HRP标记的羊抗人IgG37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以四甲基联苯胺（TMB，Sigma）为底物检测结合的抗M13单抗，450 nm检测光吸收。

结果见图2，sSS患者血清中sSSP抗体水平明显高于RA、SLE、pSS患者及健康人，利用One-way ANOVA方法进行统计学分析，结果显示二者具有显著性差异（P<0.001）。

实施例4  sSSP抗体检测的灵敏度及特异性测定

将化学合成的sSSP多肽与SulfoLink偶联树脂偶联，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS缓冲液洗涤平衡层析柱。将继发性干燥综合征患者血清高速离心后，加入1/10体积10×PBS缓冲液混合，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。加入6倍柱体积0.1 M甘氨酸（pH 3.0）洗脱，收集穿出液，以1/10体积的1M Tris-HCl（pH 9.0）中和。将得到抗体对PBS透析，定量抗体浓度后加入50%甘油，分装并保存在-20℃。合成肽sSSP（每孔0.5 μg）包被96孔板（Nunc公司）4 ℃过夜。倾去不结合的肽，3% BSA 37℃封闭1小时。以亲和纯化的sSSP抗体作为标准品，系列稀释浓度分别为0，10，25，50，100 μg/ml，加入不同孔中，37℃孵育1小时。洗涤液（PBS-0.05% Tween 20）洗板5次，共3分钟。1:1000稀释的HRP标记的羊抗人IgG 37℃孵育1小时。洗涤方法同上，以四甲基联苯胺(TMB，Sigma)为底物检测结合，450 nm检测光吸收，绘制出标准曲线。同时，将sSS、RA、SLE、pSS患者或健康人血清样品1:100稀释，也加入已包被的孔内，方法同上。将检测结果利用标准曲线计算出不同样品中sSSP抗体含量，并利用SPSS16软件绘制ROC曲线。

结果见图3，sSSP抗体的检测具有高特异性（96.0%）和高敏感性（90.0%）。RA-SS 与RA患者相比，sSSP抗体检测的敏感性及特异性分别是90%和96%,见图3 A； RA-SS 与pSS患者相比，sSSP抗体检测的敏感性及特异性分别是92.5% 和96.36%，见图3 B；SLE-SS 与SLE患者相比，sSSP抗体检测的敏感性及特异性分别是100%和91.7%，见图3C；SLE-SS 与pSS患者相比，sSSP抗体检测的敏感性及特异性分别是100%和91.7%，见图3 C。因此，sSSP抗体可以作为sSS患者的一个检测指标。

实施例5  检测继发性干燥综合征的试剂盒设计

检测继发性干燥综合征的试剂盒，该试剂盒包括：sSSP多肽1.0 mg，sSSP抗体1.0 mg，阴性对照血清100 μl，阳性对照血清100 μl，96孔固相酶标板10板，牛血清白蛋白10.0 mg，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG 100 μl，显色液100 ml（含四甲基联苯胺），终止液50ml。

 应用上述试剂盒的操作步骤如下：

[1]sSSP多肽（每孔0.5 μg）包被96孔板（Nunc公司），4 ℃过夜；

[2]3% BSA 37℃封闭1小时；

[3]sSSP抗体作为标准品进行系列稀释，浓度分别为0，10，25，50，100 μg/ml；阴性对照血清、阳性对照血清及待测血清1:100稀释，加入不同孔中； 37℃孵育1小时；

[4]洗涤液（PBS-0.05% Tween 20）洗板5次，共3分钟；

[5]羊抗人IgG1:1000稀释，37℃孵育1小时；

[6]重复步骤[4]；

[7]每孔加入显色液100μl，室温避光反应20分钟；

[8]每孔加入终止液50μl，室温静置5分钟；

[9]酶联仪检测450nm吸收值；

[10]绘制标准曲线，计算出每个待测样品的sSSP抗体含量，结果高于阴性对照三倍判定为阳性。

Claims (1)

1.氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示的抗原表位在制备诊断继发性干燥综合征的药物中的用途。