CN103833859B - 新型Smith嵌合肽抗原及其在实验诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型Smith嵌合肽抗原及其在实验诊断中的应用，该抗原为含多个抗原表位的Sm嵌合肽，由SmD-1、SmD-2、SmB-1三种合成肽组成，将Sm嵌合肽抗原包被在固相载体上，可用于抗Sm抗体的检测。该检测方法包括间接ELISA法，即将Sm嵌合肽抗原包被在酶标板上，制成间接酶联免疫检测试剂盒。本发明制备过程简单，其检测系统性红斑狼疮血清中抗Sm抗体的敏感性及特异性高，重复性好，操作简便，并可定性或定量，可广泛应用于临床常规检测及科学研究，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于临床免疫及医学实验诊断领域，具体涉及一种包含多个Smith（Sm）蛋白抗原优势表位的合成嵌合肽（chimeric synthetic peptide）及其应用于检测系统性红斑狼疮血清中抗Sm抗体的酶联免疫试剂盒。
背景技术
系统性红斑狼疮（SLE）是影响人群最广泛、最严重的自身免疫病之一，能引发全身多器官炎症病变。该病发展潜伏，病程迁延反复并不断加重，临床表现复杂多样，极易与其它疾病尤其是类似的自身免疫性疾病混淆。 早期发现，准确诊断和及时治疗对提高SLE病人的预后，降低死亡率具有决定性意义。目前诊断SLE是基于综合临床表现及实验检查的美国风湿病学会（ACR）的分类标准（TAN, E. M., COHEN, A. S., FRIES, J. F., MASI, A. T., MCSHANE, D. J., ROTHFIELD, N. F., SCHALLER, J. G., TALAL, N. & WINCHESTER, R. J. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis rheumatism, 1982,25, 1271-7.），临床医生上在判断该标准规定的11项指标时受主观因素影响较大，诊断准确性差，经常出现误诊或漏诊。而由于缺乏高度敏感性或特异性的原因，当前尚无理想的实验室检测指标（AHEARN, J. M., LIU, C. C., KAO, A. H. & MANZI, S. Biomarkers for systemic lupus erythematosus. Transl Res, 2012,159, 326-42.）。
Sm 抗原-抗体系统是1966年 由Tan and Kunkel 在一位女性SLE患者上发现的第一个非组蛋白核蛋白抗原系统（TAN, E. M. & KUNKEL, H. G. Characteristics of a soluble nuclear antigen precipitating with sera of patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Immunology, 1966, 96, 464-71.）。Sm系统中的主要蛋白质抗原为B、B'、D1，D2，D3、E，F，G蛋白， 这些蛋白质与富含鸟苷的小核RNAs(snRNAs)形成复合物SnRNP,是剪接小体(spliceosome)的重要组成部分，参与细胞核内mRNA 的加工（ZIEVE, G. W. & KHUSIAL, P. R. The anti-Sm immune response in autoimmunity and cell biology. Autoimmunity Reviews, 2003,2, 235-40.）。在SLE病人血清中，上述的各类Sm蛋白都有可能与相应抗Sm抗体的亚型发生免疫反应，其中又以SmB和SmD 蛋白为主，因其含有Sm系统中多个抗原决定簇（ROKEACH, L. A. & HOCH, S. O. B-cell epitopes of Sm autoantigens. Mol Biol Rep, 1992, 16, 165-74.）。
抗Sm抗体（IgG）是SLE 的标记性抗体， 是SLE 诊断的最佳实验指标之一。其对该病的诊断高特异性（≈95%）备受医生推崇，但较低的敏感性（10-30%）极大地限制了其应用价值（MIGLIORINI, P., BALDINI, C., ROCCHI, V. & BOMBARDIERI, S. Anti-Sm and anti-RNP antibodies. Autoimmunity, 2005,38, 47-54.）。半个世纪以来，大量的学者以不同的技术从不同方向尝试提高其敏感性，均未能取得较大突破。至今为止，国际上检测Sm 抗体的商业化试剂盒不论以化学提取的天然抗原（extracted native antigen），基因重组的多肽（recombinant polypeptides） 或合成肽抗原(synthetic peptide)作为检测底物，其对SLE的诊断价值均较低。临床评价实验表明，这些试剂盒的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线）下方的区域面积（AUC）都在0.70以下，而且经常与混合结缔组织病血清中常见的抗RNP抗体产生交叉反应（MAHLER, M., STINTON, L. M. & FRITZLER, M. J. Improved serum differentiation between systemic lupus erythematosus and mixed connective tissue disease by use of an SmD3 peptide-based immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol, 2005,2, 107-13.）。
用于检测抗Sm 抗体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组多肽抗原和合成肽抗原三大类，天然抗原及重组多肽抗原的优点是其包含多个抗原决定簇，可能被多种抗体亚型所识别。但它们有不少缺点：1.在粗提或纯化的过程中蛋白易发生变性，操作技术难度较大，批间重复性差，价格昂贵；2. 由于蛋白或多肽二级空间结构的影响，其所包含的一些抗原决定簇无法暴露于蛋白分子表面而被抗体所结合；3. 由于所含的非抗原决定簇的氨基酸含量较多，可能与其他非特异抗体结合导致诊断特异性的下降。合成肽抗原是根据特定蛋白抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列而人工合成的多肽片段。合成肽抗原结构简单，与抗体亲和力强，特异性也高，而且制备简单，重复性好，价格低廉，质量稳定，可标准化，近年来获得广泛应用。但合成肽一般只含有一个抗原决定簇，只能检测有限的抗体亚型，加上其分子量小，往往难于直接吸附于固相载体如酶标板（ELISA板）上，这些都将造成检测敏感性的不足。
我们在筛查以合成肽序列代表的Sm蛋白抗原表位的实验中，发现了SLE 病人血清识别三个优势抗原表位（SmD-1， SmD-2， SmB-1），而且不同SLE 病人血清对这些优势抗原表位的识别存在明显差异。如有些SLE患者的血清只识别SmD-1肽，部分血清只识别SmB-1肽, 而有些SLE血清则能同时识别多种抗原决定簇（SmD-1， SmD-2， SmB-1）。 这样，如果与当前的部分商业化试剂盒一样，只采用任何一条含单一优势抗原表位的合成肽，必将漏检相当一部分Sm抗体亚型，导致敏感性的不足。而同时包被以上三条合成肽于ELISA板，由于短肽之间相互竞争有限的包被位点，技术上存在困难。
发明内容
本发明的目的在于设计一种对SLE高度特异并含有多种抗原表位的Sm嵌合肽，将其应用于制备检测抗Sm抗体的酶联免疫试剂盒，以提高检测抗Sm抗体的敏感性，从而改善SLE的实验诊断水平。
本发明的技术方案如下：
一种Sm嵌合肽抗原，其特征在于：该抗原为多抗原表位的Sm嵌合肽，由SmD-1、SmD-2、SmB-1三种合成肽组成，其氨基酸序列如下：
MKLVRFLMKLSHETVTIE GVDVSMNTHLKAVKMT PPMGIPPGRGTPMG。
其中，所述的SmD-1、SmD-2、SmB-1合成肽的氨基酸序列如下：
SmD-1 MKLVRFLMKLSHETVTIE；
SmD-2 GVDVSMNTHLKAVKMT；
SmB-1 PPMGIPPGRGTPMG。
其中，Sm合成肽段来源于Sm蛋白，Sm合成肽由FMOC固相合成方法自动或人工合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。
Sm嵌合肽抗原在抗体检测中的应用，其特征在于：将Sm嵌合肽抗原包被在固相载体上，用于抗Sm抗体的检测。
其中，所述的固相载体包括聚乙烯微孔板、纤维素膜或微球。
所述的抗Sm抗体的检测方法包括间接ELISA法，具体为：将Sm嵌合肽抗原包被在酶标板上，制成间接酶联免疫检测试剂盒，其组成如下：
（1）包被Sm嵌合肽抗原的ELISA 板；
（2）辣根过氧化物酶HRP标记的抗人IgG 抗体；
（3）TMB 底物显色液；
（4）1M硫酸反应终止液；
（5）磷酸盐-Tween 20 洗涤液（PBST）；
（6）标本稀释液：含1%的小牛血清白蛋白的PBST；
（7）Sm抗体校准品；
（8）阴性及阳性对照血清。
进一步的，所述的包被Sm嵌合肽抗原的ELISA 板的制备过程为：
（1）将Sm嵌合肽抗原用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释至20μg／ml，每ELISA板孔加100ul，4℃过夜；
（2）次日用PBST洗涤2次；
（3）每孔加入100ul含1%的牛血清白蛋白的封闭液，放置37℃孵育2小时封闭ELISA板，后用PBST洗涤3次，拍干；
（4）该ELISA 板可立即用于检测抗Sm抗体或密封防潮避光保存于4℃。
本发明的优点：
1.本发明原创性地设计的Sm嵌合肽抗原，包含了来源于Sm蛋白，能被SLE血清特异识别的多个优势抗原表位。这种新型的抗原具有如下的优点：（1）它既利用了线性合成肽抗原易与抗体结合的特点，也克服了只含单一表位的短肽抗原无法检测多种抗Sm抗体亚型的缺点；（2）由于嵌合肽抗原含有的氨基酸数量较含单一抗原表位的短肽多，所以分子量较大，易于包被于固相载体如普通ELISA板上；（3）嵌合肽抗原还能避免多条短肽同时包被于ELISA板而产生的位点竞争现象；（4）与化学提纯的天然抗原和重组多肽抗原相比，该嵌合肽具有制备简单，重复性好，价格低廉，质量稳定等特点，而且不含与待检抗体无关的氨基酸序列，有助于避免与其他抗体的交叉反应。
2.以纯化的Sm嵌合肽为检测抗原的酶联免疫（ELISA）试剂盒能够在保证高特异性（93%）的前提下，突破性地将其对SLE血清的检测敏感性提高到71%，远远领先于目前国际上同类Sm抗体检测试剂盒30%以下的敏感性，在诊断价值上明显优于其他的商业化试剂盒。本发明的ELISA试剂盒制备过程简单，其检测抗Sm抗体的准确性高，重复性好，操作简便，并可定性或定量，可广泛应用于临床常规检测及科学研究，具有很好的应用价值。
附图说明
图 1 含多种抗原表位的Sm嵌合肽(Chimeric Sm)与含单一抗原表位的三种Sm 合成肽(SmD-1,SmD-2,SmB-1)在检测SLE 血清中抗Sm抗体敏感性的比较。
图2 本发明的Sm抗体检测试剂盒在检测系统性红斑狼疮（SLE）患者及其对照组血清的表现。以24Au/ml为阳性界值（图中虚线），本发明的试剂盒对SLE 的诊断敏感性为71%, 特异性93%。受检者包括SLE 170例，疾病对照组153例：其中含类风湿性关节炎(RA) 21例，混合结缔组织病(MCTD) 11例，干燥综合征（SS）10例，银屑病（Psoriasis）10 例，硬皮病(Scleroderma)13例，其它疾病（other diseases）88例，以及健康对照（Healthy）43例。
图3 本发明的Sm抗体ELISA检测试剂盒(Chimeric Sm peptide ELISA)与一种商业化试剂盒(QuantaLite anti-Sm ELISA)的受试者工作特征曲线（ROC曲线）对比。 AUC: ROC曲线下方区域面积；SLE：系统性红斑狼疮；Controls：疾病及健康对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明不仅限于此。
实施例1
1. Sm合成肽序列及合成
首先应用SLE患者血清筛选出三个针对SLE高度特异，来源于SmD 和SmB 蛋白的优势抗原表位(SmD-1, SmD-2和 SmB-1合成肽)，然后设计出一条包含上述三个抗原表位的Sm嵌合肽，由多肽生化公司合成并纯化。
以下肽段来源于Sm蛋白， 由FMOC固相合成方法自动或人工合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90%以上。
（1）含单一抗原表位的Sm合成肽氨基酸序列
SmD-1 MKLVRFLMKLSHETVTIE；
SmD-2 GVDVSMNTHLKAVKMT；
SmB-1 PPMGIPPGRGTPMG。
（2）含多抗原表位的Sm嵌合肽氨基酸序列
MKLVRFLMKLSHETVTIEGVDVSMNTHLKAVKMTPPMGIPPGRGTPMG
2.包被Sm嵌合肽抗原于ELISA 板
以纯化的嵌合肽抗原包被ELISA板，发展出一种间接酶联免疫（ELISA）试剂盒，用于检测SLE病人血清中的抗Sm IgG抗体。
将Sm嵌合肽抗原用用碳酸盐包被缓冲液（PH 9.6）稀释至20μg／ml，每ELISA板孔加100ul，4℃过夜。次日用磷酸盐TWEEN 20缓冲液（PBST）洗涤2次。然后每孔加入100ul含1%的牛血清白蛋白的封闭液（PBST），放置37℃孵育2小时封闭ELISA板，后用PBST洗涤3次，拍干，该ELISA 板可立即用于检测抗Sm抗体或密封防潮避光保存于4℃。
3. 间接法ELISA 检测抗Sm抗体 （1） 加样： 将1:100稀释的患者血清(含待检抗体) 100ul 加入上述已包被Sm嵌合肽抗原的ELISA反应孔中, 同时做空白（样本稀释液）、Sm抗体校准品，阴性对照(健康人血清)及阳性对照（Sm抗体阳性的SLE患者血清）。然后将ELISA板置37℃孵育1小时后, PBST洗涤3次。
（2） 添加酶标二抗：于反应孔中，加入HRP酶标记的第二抗体(羊抗人IgG抗体) 100ul，37℃孵育45 分钟，PBST 洗涤3次。 （3）加底物液显色：于各反应孔中加入TMB显色液100ul ，室温避光孵育30分钟。 （4）终止反应：于各反应孔中加入1M硫酸100ul, 混匀10秒。
（5）结果检测及判定：在ELISA检测仪上，选择主波长450nm，副波长620nm读取光密度（OD）值，并以空白对照孔调零。
4. 结果判定
样本结果= (样本孔OD /校准孔OD) ×参考值 (30 Au/ml))。
阳性临界值为24Au/ml（从ROC曲线上选择），样本结果高于或等于阳性界值为抗Sm 抗体阳性，反之为阴性。
实施例2
以含多抗原表位的Sm嵌合肽（chimeric Sm peptide）与含单一抗原表位的SmD-1，SmD-2，SmB-1短肽分别包被ELISA板，同时检测50例SLE 血清。如图1所示，以ELISA 光密度（OD） 0.2作为阳性的界值， Sm嵌合肽对检测SLE 血清中的抗Sm抗体的敏感性达70% 以上，远优于SmD-2（19%），SmB-1（29%）和 SmD-1 （31%）。
本实验说明含有多抗原表位的Sm嵌合肽较含单一抗原表位的Sm短肽对检测Sm抗体具有更高的敏感性。
实施例3
对本发明的ELISA试剂盒进行临床验证，分别检测了170例SLE病人，153例疾病对照：其中包括类风湿性关节炎(RA) 21例，混合结缔组织(MCTD) 病 11例，干燥综合征（SS）10例，银屑病（Psoriasis）10 例，硬皮病(Scleroderma)13例，其它疾病88例，以及健康对照43例。
结果见图2。以24AU/ml作为阳性的界值（图中虚线），本发明的试剂盒对SLE患者的检测敏感性达到71%，特异性达93%。而同时检测上述血清的商业化试剂盒（Quantalite anti-Sm ELISA），按照其说明书提供的阳性界值计算，敏感性只有28%，特异性分别为94%。说明本发明的ELISA试剂盒在维持高特异性的同时，敏感性较Quantalite anti-Sm ELISA有极显著的提高。
采用ROC曲线作为诊断价值对比的标准，见图3。本发明的试剂盒在ROC曲线下方区域面积（AUC）达到0.93 (95%可信区间：0.90-0.95)，显著优于商业化试剂盒(QuantaLite anti-Sm ELISA)的0.69 （95%可信区间：0.61-0.76）。而文献报道显示，该商业化试剂盒与目前国际上其它抗Sm 抗体检测试剂盒具有很接近的诊断价值（MAHLER, M., STINTON, L. M. & FRITZLER, M. J. Improved serum differentiation between systemic lupus erythematosus and mixed connective tissue disease by use of an SmD3 peptide-based immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol, 2005,12, 107-13.）。可见本发明的ELISA试剂盒的诊断价值完全优于当前国际上其它的商业化试剂盒，具有很好的临床应用价值，将大大地提高SLE的实验诊断水平。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈仁奋
<120> 新型Smith嵌合肽抗原及其在实验诊断中的应用
<130> 2014
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Leu Val Arg Phe Leu Met Lys Leu Ser His Glu Thr Val Thr
1 5 10 15
Ile Glu Gly Val Asp Val Ser Met Asn Thr His Leu Lys Ala Val Lys
20 25 30
Met Thr Pro Pro Met Gly Ile Pro Pro Gly Arg Gly Thr Pro Met Gly
35 40 45
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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Ile Glu
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gly Val Asp Val Ser Met Asn Thr His Leu Lys Ala Val Lys Met Thr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Pro Pro Met Gly Ile Pro Pro Gly Arg Gly Thr Pro Met Gly
1 5 10
Claims (3)
1. 一种Smith（Sm）嵌合肽抗原，其特征在于：该抗原为含多个抗原表位的Sm 嵌合肽，由SmD-1、SmD-2、SmB-1 三种合成肽组成，所述的嵌合肽抗原的氨基酸序列如下：
MKLVRFLMKLSHETVTIEGVDVSMNTHLKAVKMTPPMGIPPGRGTPMG。
2. 如权利要求1 所述的Sm 嵌合肽抗原，其特征在于：所述的SmD-1、SmD-2、SmB-1 合成肽的氨基酸序列如下：
SmD-1 MKLVRFLMKLSHETVTIE ；
SmD-2 GVDVSMNTHLKAVKMT ；
SmB-1 PPMGIPPGRGTPMG。
3. 如权利要求1或2 所述的Sm 嵌合肽抗原，其特征在于：Sm 合成肽段来源于Sm 蛋白，Sm 合成肽由FMOC 固相合成方法自动或人工合成，经HPLC 分析和纯化，抗原纯度达到90% 以上。
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