CN109929009B - Ccp肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CCP肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用。该CCP肽段具有NH2‑S3‑S1‑X‑S2‑S4‑COOH所示的结构，X为含瓜氨酸的抗原表位区、S1和S2为含瓜氨酸的抗原表位区的侧翼区，S1和S2中至多一个为带电氨基酸残基，S3和S4为用于连接成环从而形成该CCP肽段的氨基酸残基区域。该CCP肽段的侧翼区采用至多一个氨基酸为带电氨基酸的氨基酸构成，能够减少分子间作用力或避免形成抗原表位，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
Description
技术领域
本发明涉及医药检测领域，具体而言，涉及一种CCP肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
类风湿关节炎(rheumatoid arthtitis，RA)是一种病因不明的自身免疫性疾病，主要临床表现为对称性、慢性、进行性关节炎，关节滑膜出现慢性炎症，增生形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。类风湿关节炎多见于中年女性，在我国的患病率约为0.32％～0.36％。
近年来，随着对RA研究的深入，逐步发现RA患者血清中的抗核周因子(Antiperipheral Factor，APF)、抗角蛋白抗体(Antikeratin Antibody，AKA)以及抗丝集蛋白抗体(Antifilaggrin Antibody，AFA)对RA的诊断具有高度的特异性。研究者发现这些抗体识别的靶抗原在化学结构上具有一定的相关性，他们识别的抗原决定簇中都含有瓜氨酸残基，其中瓜氨酸是一种稀有氨基酸，来源于翻译后酶修饰的精氨酸残基。1998年Schellekens等证实瓜氨酸残基是RA患者血清识别底物的必须成分，如将瓜氨酸残基换成精氨酸残基则RA患者血清不能与之结合。最初使用的环瓜氨酸肽(CCP)抗原是来源于丝聚蛋白的含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段，其氨基酸序列(SEQ ID NO:18)为：SHQESTCitGRSRGRSGRSGS，然而研究发现用直链线性瓜氨酸肽段为底物，用ELISA法来检测抗环瓜氨酸肽抗体常会导致失败，原因是由于此肽段不能吸附于聚苯乙烯上。后来，为了提高瓜氨酸肽链的抗原活性，Schellekens将上述由19个氨基酸残基组成的一条瓜氨酸肽链中的两个丝氨酸替换成半胱氨酸，并使半胱氨酸环化形成β-转角结构相似的二硫键，而成为环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)，即为第一代CCP抗原。
研究者在随后的研究中发现虽然第一代CCP试剂具有较高的疾病诊断特异性，但是诊断敏感性不够，只在约40％的RA患者中出现。因抗环瓜氨酸肽抗体是一组针对含瓜氨酸表位的多种异质性抗体，而包被于固相载体的瓜氨酸抗原决定簇有限，没有包含所有的抗原决定簇表位，因此会导致一些漏检，从而阳性率较低。同时，研究发现RA患者的血清并不能识别游离的瓜氨酸，但能识别位于氨基酸序列里的瓜氨酸残基，而且根据瓜氨酸残基所处位置不同，RA患者血清与之反应的比例不同，说明瓜氨酸残基并不是决定其是否能与RA血清中抗体反应的唯一因素，瓜氨酸残基所处的周围氨基酸序列和结构特征也参与RA患者血清与含瓜氨酸序列的识别过程。基于上述序列而开发的第一代抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，除临床检测敏感性较低外，同时也在其他一些非RA患者血清中检出。
为了提高RA患者血清的检测敏感性，研究者们根据瓜氨酸与精氨酸结构特征，以及其侧翼氨基酸序列的组成，应用生物信息学相关软件预测其空间结构变化，对已知的瓜氨酸化抗原分析、分类，筛选出含有瓜氨酸的多肽文库。通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎患者血清比对，最终筛选出多条敏感性高的CCP多肽，由两类序列组成，一类是含有瓜氨酸甘氨酸基序的序列，一类是含有瓜氨酸非甘氨酸基序的序列，将多条不同的含Cit的多肽链联合，可以识别超过70％的类风湿关节炎血清，这就是后来的第二代CCP抗原。瓜氨酸甘氨酸基序是指CitG序列，瓜氨酸非甘氨酸基序是指CitnonG序列，其中，G为甘氨酸，nonG为除甘氨酸以外的氨基酸。采用第二代CCP序列而开发的检测试剂盒，其氨基酸序列选自HQKRGCitGWSRAA(SEQ ID NO:21)、HQRRVCitGWSRAA(SEQ ID NO:22)、HQRRTCitGGSRAA(SEQ ID NO:23)、HQRKWCitGASRAA(SEQ ID NO:24)、HQFRFCitGCitSRAA(SEQ ID NO:25)、HQKWRCitGRSCitAA(SEQ ID NO:26)、HQFRFCitGWSRAA(SEQ ID NO:27)、KPYTVCitKFMRRP(SEQ ID NO:28)、ARFQMCitHCitRLIR(SEQ ID NO:29)、YSFVWCitSHARPR(SEQ ID NO:30)、ARFQMRHCitRLIR(SEQ ID NO:31)及RNLRLCitRERNHA(SEQ ID NO:32)中至少两种及以上序列的组合，其序列形成环状结构。
第二代抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒，临床检测敏感性较大程度提高，但是使用多条氨基酸序列，引入更多的非必须抗原决定簇位点，因而特异性较第一代序列更差。而且随着抗环瓜氨酸肽抗体在临床上的广泛应用，大量国内外学者的研究结果也证实抗环瓜氨酸肽抗体出现在多种非RA疾病中，且具有一定的阳性检出率。吴晓宇等统计分析台州市中心医院门诊和住院患者中申请检测抗CCP抗体检测的患者13715例样本的结果分布情况，抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒采用目前权威厂家欧洲诊断试剂公司产品，其中在2716例确诊的RA患者中，抗环瓜氨酸肽抗体敏感性为64.10％，而在确诊的1909例非RA患者中抗环瓜氨酸肽抗体特异性为85.44％，抗环瓜氨酸肽抗体阳性结果除出现于RA患者中，在干燥综合征、银屑病关节炎、骨关节炎和系统性硬化症患者中的阳性率分别高达36.69％、25.00％、18.60％和18.60％。Gottenberg JE等发现抗环瓜氨酸肽抗体在干燥综合征患者中阳性率为7.5％(10/134)；Kakumanu等发现抗环瓜氨酸肽抗体在系统性红斑狼疮患者中阳性率为16.7％(55/329)，在肺结核患者中阳性率为36.7％(18/49)；毛桐俊等发现抗环瓜氨酸肽抗体在系统性红斑狼疮患者中阳性率为20.6％(29/141)，赵义等发现抗环瓜氨酸肽抗体在系统性红斑狼疮患者中阳性率为13.8％(19/138)；刘媛等发现抗环瓜氨酸肽抗体在原发性胆汁性肝硬化患者中阳性率为19.17％(23/120)。
因此，仍有必要对现有的CCP抗原进行改进。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种CCP肽段、包含其的抗原、试剂、试剂盒及应用，以解决现有技术中的CCP抗原在检测中检测特异性低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种CCP肽段，该CCP肽段CCP肽段具有式I所示的结构：
NH2-S3-S1-X-S2-S4-COOH……………式I；
其中，X为含瓜氨酸的抗原表位区，S1和S2为含瓜氨酸的抗原表位区的侧翼区，S1和S2中至多一个为带电氨基酸残基，S3和S4为用于连接成环从而形成CCP肽段的氨基酸残基区域。
进一步地，侧翼区的氨基酸残基为非极性的氨基酸残基，或非带电的氨基酸残基；优选地，侧翼区的氨基酸残基为甘氨酸残基和/或丙氨酸残基。
进一步地，S3的氨基酸残基区域与S4的氨基酸残基区域通过二硫键连接成环。
进一步地，含瓜氨酸的抗原表位区含有2n+1个氨基酸，优选瓜氨酸位于n+1的位置，其中n为≥0的自然数。
进一步地，式I结构中，S1-X-S2及S3和S4中参与成环的氨基酸的总个数为12～19个；优选地，S1或S2中含有0～9个氨基酸；优选地，S3或S4中含有2～4个氨基酸。
进一步地，CCP肽段选自如下氨基酸序列中的任意一个：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11：；SEQ ID NO:12：；SEQ ID NO:13：；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种CCP抗原，该CCP抗原包括一个或多个上述任一种CCP肽段。
进一步地，CCP抗原包括含瓜氨酸甘氨酸基序的CCP肽段与含瓜氨酸非甘氨酸基序的CCP肽段的组合。
根据本发明的第三个方面，提供了一种类风湿关节炎检测试剂，该试剂包括CCP抗原，CCP抗原为上述任一种抗原。
进一步地，CCP抗原以CCP抗原-载体蛋白偶联物、CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素的形式存在；优选地，CCP抗原-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白；更优选地，载体蛋白选自如下任意一种：牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛γ球蛋白及人γ球蛋白。
进一步地，CCP抗原-载体蛋白偶联物、CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素包被于固相载体上；优选地，固相载体为磁性微球；更优选地，磁性微球为表面带有修饰基团的磁性微球，修饰基团选自如下至少一种：环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基以及羟基。
根据本发明的第四个方面，提供了一种类风湿关节炎检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种试剂。
进一步地，试剂盒包括上述任一种试剂，试剂盒还包括发光标记物标记的二抗，优选发光标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、吖啶酯、辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶中的任一种。
根据本发明的第五个方面，提供了一个或多个上述任一种CCP肽段、或者上述任一种CCP抗原在制备用于诊断类风湿关节炎检测试剂或试剂盒中的用途。
根据本发明的第六个方面，提供了一种类风湿关节炎的检测方法，该检测方法包括：将至少一个上述任一种CCP肽段与患者的血清进行反应；或者上述任一种CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂中的CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的CCP抗原与患者的血清进行反应。
进一步地，采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的CCP抗原与患者的血清进行反应，反应在半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪中进行。
应用本发明的技术方案，本申请的CCP肽段中，含瓜氨酸的抗原表位区为含瓜氨酸的抗体识别关键区，而侧翼区采用至多一个氨基酸为带电氨基酸的氨基酸来构成，能够减少分子间作用力或避免形成抗原表位，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中出现抗环瓜氨酸肽抗体检出的概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
在某些优选的实施例中，本申请所提供的CCP肽段能够在保证临床检测敏感性的同时，降低背景和非特异性吸附，提高灵敏度和信噪比，进一步优化检测试剂的性能，同时，降低在非RA患者或正常人中的检出率，从而提高临床检测特异性。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
瓜氨酸(Citrulline，Cit)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)、CCP(环瓜氨酸肽)、Anti-CCP(抗环瓜氨酸抗体)、RA(类风湿性关节炎)、CLIA(化学发光免疫分析法)、BSA(牛血清白蛋白)、NaN3(叠氮钠)、ABEI[N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺]、HRP(HorseradishPeroxidase，辣根过氧化物酶)、吖啶酯(Acridinium Ester)、FITC(异硫氰酸荧光素)、DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)、ELISA(酶联免疫吸附试验法)、免疫荧光技术(ABS)、免疫层析体技术(ICA)牛血清白蛋白(BSA)，阳离子牛血清白蛋白(cBSA)，血蓝蛋白(KLH)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)
如背景技术所提到的，现有技术中用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂或试剂盒在检测中存在假阳性比较高的缺陷。为了改善这一现状，本申请中，发明人对现有的CCP抗原肽进行了深入研究。具体研究内容如下：
目前，抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒使用的抗原主要是合成的含瓜氨酸的多肽，一般序列长度为12～19个氨基酸。多肽序列太短，难以形成环状结构，序列太长又容易失去环状结构的构像优势，同时还容易引入其他非必须结合位点。从目前已发表的文献和公布的专利来看，RA患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体是一组针对含瓜氨酸表位的多种异质性抗体，分为两类，一类是识别含有瓜氨酸甘氨酸基序的抗原的抗体，另一类是识别含有瓜氨酸非甘氨酸基序的抗原的抗体。第一代序列为含有瓜氨酸甘氨酸基序的序列，如：HQCHQESTCitGRSRGRCGRSGS(SEQ ID NO:33)，第二代序列中选择含有瓜氨酸非甘氨酸基序的序列，如：KPYTVCitKFMRRP(SEQ ID NO:34)。
通常多肽表位一般由3～6个氨基酸残基构成，因而-2-1Cit+1+2几个位置的氨基酸默认是抗瓜氨酸肽抗体识别的关键位点，而CCP多肽上除瓜氨酸位点外的其他氨基酸序列可能存在抗原决定簇而被非抗瓜氨酸肽抗体识别。如第一代序列瓜氨酸左边的HQES及右边的SRGR残基序列，第二代序列中，瓜氨酸左边的KPYT及右边的MRRP残基序列，是抗瓜氨酸肽抗体的非识别位点，而有很大可能被其他自身抗体识别，从而造成假阳性的检测结果。这些侧翼区氨基酸残基具有较多侧链基团，且部分残基带电荷，部分残基具有较高极性，易与抗体的沟槽通过静电吸引、氢键以及较好的契合从而形成紧密的结合。从结构及属性来看，均是较为理想的抗原决定簇位点，容易被其他类的抗体所识别。
抗原与抗体的免疫反应具有高度特异性，抗体与抗原的免疫识别和结合是发生在抗体分子与抗原分子特定位置、特定片段之间的相互匹配和吻合的过程。抗体既可以识别由序列上相连接的一些氨基酸残基通过共价键所形成的线性表位结构，也可以识别由序列上不相连的氨基酸残基通过折叠所形成的空间结构的构像表位结构。抗原与抗体能够特异性的结合是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性及亲和力决定的，抗体分子N端可变区形成3nmX1.5nmX0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如契状嵌入。抗原和抗体的结合不会形成牢固的共价键，而是通过非共价键结合，这种弱的结合力主要包括电荷引力、范德华引力、氢键结合力和疏水作用力。电荷引力又称为库伦引力或静电引力，是抗原、抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力，这种引力和两电荷间的距离的平方成反比；范德华引力是由原子与原子、分子与分子互相接近时由于分子的极化作用而出现的一种引力，这种引力的能量小于静电引力；氢键结合力是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合，氢键结合力较范德华引力强；疏水作用力是指抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即消失，排斥了两者之间的水分子，促进抗原抗体的进一步相互吸引，使抗原抗体结合更为紧密，这种疏水结合对于抗原抗体的结合非常重要，提供的作用力最大，约占总结合力的50％。
上述分析可知，现有检测结果出现临床检测特异性较低的很大原因在于CCP多肽上除瓜氨酸位点外的其他氨基酸序列可能存在抗原决定簇而被血清中的其他抗体识别。因CCP多肽上除瓜氨酸位点外的其他氨基酸序列可能存在的抗原决定簇表位为线性表位，且CCP多肽约为19个AA左右的序列，除半胱氨酸形成的环状结构外无其他空间结构，因此，此类抗原决定簇在与抗体分子识别时氨基酸残基的侧链结构、电负性及其极性至关重要。
因而，现有的CCP抗原除含瓜氨酸部分可作为抗原决定簇外，多肽上的其他氨基酸序列也可能存在抗原决定簇而被识别，从而导致假阳性的检测结果。因此，通过一些方法降低甚至消除非RA患者血清与CCP抗原的非依赖瓜氨酸残基反应就显得格外重要和必要。也就是说，需要对现有的CCP抗原进行改进，以使CCP抗原中除含瓜氨酸部分的抗原决定簇能被特异性识别外，其他可能存在的抗原决定簇经过修饰或者改变而不被识别，进而在保证临床检测敏感性的同时，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA临床诊断中的特异性，减少假阳性结果，降低医生对患者错误诊断和错误治疗的风险。
要使CCP多肽序列中除含瓜氨酸部分的抗原决定簇能被特异性识别，而其他可能存在的抗原决定簇经过修饰或者改变后不被识别，根据抗原与抗体结合的关键是抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性，以及抗原分子与抗体分子之间的作用力，本申请从原理上提出了提高检测特异性的改进手段：将除抗环瓜氨酸肽抗体必须识别位点外的其他氨基酸序列，修饰或替换成残基侧链结构简单、非极性或不带电的氨基酸，来降低与非RA患者血清抗体识别的概率，从而降低非RA患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体的检出率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
而且，本申请进一步通过实验验证，经上述改进后的CCP抗原在进行检测时，试剂灵敏度和信噪比进一步改进，临床检测特异性大幅提高。本文中的“试剂灵敏度”“灵敏度”及“信噪比”均是从CCP抗原本身作为试剂使用时的性能，而“特异性”和“敏感性”是指该试剂应用于临床检测时的性能。
基于上述研究结果，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种CCP肽段，该具有式I所示的结构：
NH2-S3-S1-X-S2-S4-COOH……………式I；
其中，X为含瓜氨酸的抗原表位区，S1和S2为含瓜氨酸的抗原表位区的侧翼区，S1和S2中至多一个为带电氨基酸残基，S3和S4为用于连接成环从而形成该CCP肽段的氨基酸残基区域。
上述CCP肽段中，X为含瓜氨酸的抗原表位区，是抗体识别的关键区，而S1和S2形成的侧翼区，由至多一个为带电氨基酸的序列构成。本申请所改进的CCP肽段中S1和S2侧翼区的氨基酸性质能够减少分子间作用力或避免形成抗原表位，减少了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基形成抗原表位而被其他抗体识别的概率，进而降低非RA患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体的检出率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
在一些优选的实施例中，侧翼区所有的氨基酸残基为非带电氨基酸残基，或者侧翼区的氨基酸残基为非极性的氨基酸残基。非带电的氨基酸或者非极性的氨基酸均能减少分子间作用力或避免形成抗原表位，进而减少被其他抗体识别的概率，从而进一步提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。
上述属于非极性的氨基酸残基的定义标准与教科书上的定义标准一致。具体如下：组成蛋白质的20种基本氨基酸按照R基的性质：大小、酸碱性、极性(在生物pH约7.0下与水相互作用的倾向性)进行分类。根据R基性质的不同，20中基本氨基酸分为：
A.非极性脂肪族R基氨基酸：包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及甲硫氨酸。该组氨基酸是非极性的、疏水的氨基酸。
B.芳香族R基氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸。该组氨基酸是非极性的、疏水的氨基酸。
C.极性、不带电荷的R基氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺。该组氨基酸是亲水的，不带电荷的氨基酸。
D.带正电荷的(碱性)R基氨基酸：赖氨酸、精氨酸及组氨酸。该组氨基酸是亲水的，带正电荷的氨基酸。
E.带负电荷的(酸性)R基氨基酸：天冬氨酸及谷氨酸。该组氨基酸是亲水的，带负电荷的氨基酸。
在一些更优选的实施例中，侧翼区所有的氨基酸由甘氨酸和/或丙氨酸构成；进一步优选地，侧翼区所有的氨基酸由甘氨酸构成，这样形成的CCP肽段中被其他抗体识别的概率更低，因而抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性更好。
上述CCP肽段中，S3和S4为用于连接成环从而形成环状瓜氨酸肽段的氨基酸残基区域，因而只要S3和S4存在能够连接成环的氨基酸残基即可。在一种优选的实施例中，S3的氨基酸残基区域与S4氨基酸残基区域通过二硫键连接成环。即在S3中含有半胱氨酸，S4中含有半胱氨酸，两个半胱氨酸之间通过形成二硫键将线性肽段连接成环。
本申请的上述CCP肽段中，含瓜氨酸的抗体识别关键区，即X所代表的含瓜氨酸的抗原表位区，通常可以有3～7个氨基酸，具体长度可以是3个、4个、5个、6个或7个，实际应用中根据需要进行合理设定，只要不影响抗环瓜氨酸肽抗体识别即可。优选地，含瓜氨酸的抗原表位区有5个氨基酸，具有完整的抗原决定簇位点，基本能保证临床检测敏感性，同时，具有更优的临床检测特异性。其中Cit在其中的位置也无特殊限定，任意位置均可，比如可以是从N端至C端的第1位，也可以是第2位、第3位、第4位或者最后一位。更优选，Cit位于最中心的位置，在该位置上具有更优异的临床检测敏感性，同时提高了信噪比这一试剂性能。因此，在本申请一种优选的实施例中，含瓜氨酸的抗原表位区含有2n+1个氨基酸，优选瓜氨酸位于n+1的位置，其中n为≥0的自然数。
现有的含瓜氨酸的多肽的序列长度一般为12～19个氨基酸，由于多肽序列太短，难以形成环状结构，序列太长又容易失去环状结构的构像优势，同时还容易引入其他非必须结合位点。因而，在一种优选的实施例中，上述式I结构中，S1-X-S2及S3和S4中参与成环的氨基酸的总个数为12～19个。本申请中的CCP肽段也采用12～19个氨基酸，优选为14个氨基酸，有助于在保留现有CCP抗原的构象优势及较高的临床检测敏感性的基础上，进一步提高检测的特异性。
上述CCP肽段中，S1和S2的侧翼区为CCP抗体识别关键区之外的序列区，其修饰或改进减少了形成抗原表位的结构特征及被其他抗体识别的概率。其具体的氨基酸数量并无特殊限定，在一种优选的实施例中，S1或S2中含有0～9个氨基酸。当S1或S2中的氨基酸数目为0时，是指不含S1或S2侧翼区的情况。在本申请中优选S1和S2中的氨基酸数目不同时为零。在一种优选的实施例中，S1或S2中含有2～8个氨基酸。
本申请的上述CCP肽段中，S3和S4中的氨基酸除了使含瓜氨酸的抗原表位区、侧翼区形成环状构象外，使抗原表位也更突出，且使形成的环瓜氨酸肽结构更稳定。同时，S3或S4还可以提供使该CCP肽段与生物素等活性基团连接的接口。在一种优选的实施例中，S3或S4中含有2～4个氨基酸，这些氨基酸的存在可以用来作为接口连接生物素等活性基团。具体氨基酸的种类不影响检测的敏感性或特异性。在一种更优选的实施例中，上述S3的C端为半胱氨酸残基，S4的N端为半胱氨酸残基，两个半胱氨酸残基通过形成二硫键将上述式I中的S3-S1-X-S2-S4连接成环。
本申请上述改进的CCP肽段具有较低的被非CCP抗体识别的概率，因而，任何按照本申请的改进方法而得到的改进的CCP肽段均在本申请的保护范围内。在一种优选的实施例中，CCP肽段选自如下氨基酸序列中的一个：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17。
在第二种典型的实施方式中，本申请还提供了一种CCP抗原，该CCP抗原包括一个或多个上述任一种CCP肽段。由于本申请上述改进的CCP肽段，不仅具有现有CCP抗原较高的临床检测敏感性，而且具有较低的被非CCP抗体识别的概率，因而采用其中的一种或几种的组合形成的CCP抗原，在用于检测RA患者血清时，不仅具有较高的检测敏感性，而且具有较高的检测特异性。
由于CCP抗体的识别序列分为两类，一类是识别含有瓜氨酸甘氨酸基序序列的抗体，另一类是识别含有瓜氨酸非甘氨酸基序序列的抗体。因而同时含有这两类序列的CCP抗原，临床检测敏感性更高。因此，在一种优选实施例中，CCP抗原包括含瓜氨酸甘氨酸基序的CCP肽段与含有瓜氨酸非甘氨酸基序的CCP肽段的组合。
在第三种典型的实施方式中，本申请还提供了一种类风湿关节炎检测试剂，该试剂包括CCP抗原，CCP抗原为上述任一种抗原。本申请的CCP抗原在保持现有检测敏感性的前提下，具有更高的临床检测特异性，减少了假阳性造成错误诊断的风险。
本申请的上述CCP抗原在具有较高检测特异性的优势基础上，为进一步提高试剂灵敏度等性能，在一种优选实施例中，CCP抗原以CCP抗原-载体蛋白偶联物或CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素的形式存在；优选地，CCP抗原-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白；优选地，载体蛋白选自如下任意一种：牛血清白蛋白(BSA)、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、牛γ球蛋白及人γ球蛋白；更优选地，CCP抗原以CCP抗原-载体蛋白偶联物的形式存在，试剂灵敏度等性能进一步放大。
由于CCP多肽仅由20个左右AA组成，相对于微米级的磁性微球太小，包被CCP多肽的磁性微球在与血清中的抗环瓜氨酸肽抗体共孵育时可能会存在较大空间位阻，不太容易被抗体所识别，而当将其与载体蛋白偶联后，载体蛋白的存在会在一定程度上降低抗原抗体识别的空间位阻，带有抗原表位的CCP多肽更容易被抗体分子识别，从而保证试剂较高的灵敏度。
为了进一步提高上述CCP抗原利用的便利性或提高检测的自动化程度，在一种优选实施例中，CCP抗原-载体蛋白偶联物或CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素包被于固相载体上；优选地，固相载体为磁性微球，磁性微球可以为现有市售的任意一种磁性微球。更优选地，磁性微球为表面带有修饰基团的磁性微球，修饰基团选自如下至少一种：环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基以及羟基。带有上述修饰基团的磁性微球通过相应的修饰基团与活性基团反应，从而将CCP抗原-载体蛋白偶联物或CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素连接到磁性微球表面上。
在第四种典型的实施方式中，本申请还提供了一种类风湿关节炎检测试剂盒，该试剂盒包括上述任一种试剂。本申请的试剂盒因所含的CCP抗原具有较低的被血清中的非CCP抗体识别的概率，因而在保证临床检测敏感性的同时，提高抗CCP抗体试剂在RA临床诊断中的特异性，降低假阳性结果造成医生对患者做出错误诊断和错误治疗的风险。
相应地，当上述试剂盒包含包被于磁性微球上的CCP抗原时，优选该试剂盒还包括发光标记物标记的二抗，更优选发光标记物选自金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的任一种，更优选异鲁米诺衍生物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
在第五种典型的实施方式中，本申请还提供了一个或多个上述任一种CCP肽段在制备用于诊断类风湿关节炎检测试剂或试剂盒中的用途。
在本申请第六个典型的实施方式中，提供了一种类风湿关节炎的检测方法，该检测方法包括：将至少一个上述任一种CCP肽段与患者的血清进行反应；或者上述任一种CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂中的CCP抗原与患者的血清进行反应；或者采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的CCP抗原与患者的血清进行反应。该检测方法能显著提高临床检测特异性。
进一步地，采用上述任一种类风湿关节炎检测试剂盒中的CCP抗原与患者的血清进行反应，反应在半自动免疫分析仪或全自动免疫分析仪中进行，能提高检测的自动化程度。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实验一：提供了一种试剂盒，包括：
(1)组分A：包被磁性微球的CCP抗原-载体蛋白偶联物溶液，由CCP抗原与载体蛋白偶联而成，其中：
a)CCP抗原的结构序列为上述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12的CCP肽段的任一种(各CCP序列的抗原由上海科泰合成)。
b)载体蛋白：牛血清白蛋白(BSA)、阳离子牛血清白蛋白(cBSA)、血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、血清白蛋白HSA、牛γ球蛋白或人γ球蛋白。
c)磁性微球为以下任意一种磁性微球：表面带有环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基或羟基修饰的磁性微球。
其中，磁性微球的工作浓度为：1～10mg/ml，CCP抗原的工作浓度为50-100ng/ml，载体蛋白的浓度为10-40ng/mL；
(2)组分B：标志发光标志物的鼠抗人IgG二抗溶液，其中，发光标志物的工作浓度为10-30ng/ml，鼠抗人IgG二抗的工作浓度为100-300ng/ml。
发光标记物选自如下任一种：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
(3)校准品溶液：浓度15.826U/mL的低浓度校准品溶液和浓度281.215U/mL的高浓度校准品溶液。各组分均含有BSA和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％-0.5％，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。
实验二：用于检测Anti-CCP抗体的检测试剂盒的制备方法
步骤1：将CCP抗原与载体蛋白形成偶联物
1)将CCP抗原与交联剂在催化剂条件下进行反应，得到CCP抗原反应液；其中，交联剂包括但不限于戊二醛、BS(PEG)5、BS(PEG)8、PEG400、PEG800、丁二酸酐等，其用量为1eq至4eq；催化剂包括但不限于三乙胺、吡啶、氢氧化钾、碳酸钾，其用量为1eq至4eq。
2)向步骤1)的CCP抗原反应液中加入载体蛋白进行反应，经纯化，得到CCP抗原与载体蛋白形成的偶联物。其中，CCP抗原与载体蛋白的摩尔比为20:1-80:1。
步骤2：CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球悬浮液的制备
采用上述步骤2)获得的偶联物包被磁性微球(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产，80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000，浓度为100mg/ml，羟基数为95的纳米磁性微球)。具体步骤如下：
1)将磁珠置于醋酸缓冲液溶液中超声搅拌清洗，通过磁分离除去上层清液，重复三次此步骤，得到醋酸缓冲液悬浮磁珠；
2)采用磁珠连接CDC法(磁珠-CDC-抗原/抗体)，向醋酸缓冲液悬浮磁珠中加入CDC和CCP抗原-载体蛋白偶联物，置于恒温震荡水浴箱中反应，得到CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球反应液；其中磁性微球与CCP抗原-载体蛋白偶联物的比例为1mg：10μg至1mg：40μg；
3)将步骤2)得到的反应液通过磁分离除去上层清液，并加入磁珠清洗液搅拌清洗，重复此步骤清洗四次；其中磁珠清洗液为0.1M的pH7.4的PBS缓冲液，加入混匀后，称量0.5％(w/v)的BSA(Roche生产)，自溶混匀；
4)清洗完毕后，加入磁珠悬浮液进行悬浮，得到CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球悬浮液；其中磁珠悬浮液为0.1M的pH7.4的PBS缓冲液。
步骤3：鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物ABEI的制备
1)将鼠抗人IgG二抗碳酸缓冲液装入合适截留量的透析袋中置于透析液中进行透析，其中，透析液为碳酸缓冲液；
2)往步骤1)透析好的溶液中加入发光标记物进行反应；其中，温育的温度25-37℃，温育的时间：8-12h；
3)将步骤2)得到的反应液通过G-25凝胶柱进行纯化，收集出现峰值的溶液，得到鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液；
4)将步骤3)得到的鼠抗人IgG二抗标记的发光标记物溶液加入BSA保护液，待用。
实验三：一种用于检测Anti-CCP抗体的化学发光免疫学方法，包括以下步骤：
1)将待测样本溶液、高点校准品和低点校准品分别加入到不同反应杯孔中；
2)分别向步骤1)中加入上述制备的CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球，使与待测物质结合；
3)分别向步骤2)中加入发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗进行温育，使发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗与CCP抗原-载体蛋白偶联物包被的磁性微球和待测物质结合；其中，温育的温度25-37℃，温育的时间：10-20min。
4)磁分离，得到发光标记物标记的鼠抗人IgG二抗与CCP抗原包被的磁性微球和待测物质的结合物；
5)向步骤4)得到的结合物加入发光激发底物，检测光信号强度；其中发光激发底物包括但不限于NaOH和H2O2。
6)通过校准品修正后的工作曲线，根据样本检测光强度自动计算，得出待测样本的Anti-CCP抗体浓度。
实验四、实施例及对比例
1)待测样本：为通过临床诊断及其他商业试剂筛查已经确诊的RA患者血清、正常人血清、非RA患者血清。
2)待测样本的收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血3mL。分离血清，置于-20℃冰箱保存。
3)各实施例及对比例的设置：各实施例及对比例所使用的试剂盒中，除CCP抗原不同外，其余组分均相同(具体如表1)。检测方法也都相同，具体步骤同实验三。
表1：各实施例和对比例对应的CCP抗原序列
附：表1中黑体加粗的为含瓜氨酸的抗原表位区，其两边斜体加下划线的分别为S1和S2的侧翼区，两端的常规字体的为用于成环的氨基酸残基区域。
4)对各实施例及对比例的如下检测性能进行评估，检测结果分别见表2-1至表2-8、表3-1、表3-2、表4-1和表4-2。
a.特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)，临床特异性评估样本：健康体检样本、非RA样本(如：系统性红斑狼疮患者、干燥综合征患者、原发性胆汁性硬化患者或I型自身免疫性肝炎患者的血清)
b.敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)，临床敏感性评估样本：类风湿性关节炎患者的血清。
c.灵敏度(空白限)：重复测定零浓度校准品20次，记录20次测试的相对发光强度(RLU)。计算20次测试的相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，代入试剂盒工作曲线，对应的浓度值即空白限。
d.信噪比：测定正常阴性血清样本20次，计算平均相对发光强度(RLU)。
信噪比＝Cut-off值(RLU)/样本平均相对发光强度(RLU)。
下表2-1至表2-8为各实施例和对比例对应的诊断敏感性及特异性。
表2-1：
表2-2：
表2-3：
表2-4：
表2-5：
表2-6：
表2-7：
表2-8：
下表3-1和3-2为各实施例和对比例对应的灵敏度(空白限)检测结果。
表3-1：实施例1-12对应的灵敏度(空白限)
表3-2：实施例13-19和对比例1-4对应的灵敏度(空白限)
下表4-1和表4-2为各实施例和对比例对应的信噪比(空白限)检测结果。
表4-1：实施例1-12对应的检测信噪比(空白限)
表4-2：实施例13-19和对比例1-4对应的检测信噪比(空白限)
5)结果分析：
与对比例1相比，实施例1～7的含瓜氨酸的抗原表位区段含有3～7个氨基酸，从表2-1至表2-3及表2-7可知，实施例的临床检测敏感性与对比例相当或稍低(除实施例1、6和7因含瓜氨酸的抗原表位区含有与对比例1相同的3个和4个氨基酸，即形成抗原表位的氨基酸数目相对较少敏感性稍低外，实施例2～5的含瓜氨酸的抗原表位区含有与对比例1相同的5个和7个氨基酸，其敏感性与对比例1无明显区别)。考虑到最终的CCP抗原是由不同的多肽序列组合而成，因而对于单一序列可以接受少量样本的漏检，当含有不同位点的序列组合后，阳性率会叠加，临床检测敏感性会得到补偿。但在检测特异性方面，与对比例相比，上述实施例的特异性大幅度(12％～14％)提高，同时灵敏度和信噪比也大幅提高。
与对比例2相比，实施例8的CCP抗原的含瓜氨酸的抗原表位区含有与其相同的TVCitKF5个氨基酸，两者的敏感性相差不大(分别为57.62％和56.67％)，而特异性(由85.30％提升至98.33％)、灵敏度(由2.232提升至0.155)和信噪比(由2.66提示至20.16)均大幅提高。
类似地，与对比例3相比，实施例9的敏感性几乎不变，特异性、灵敏度和信噪比大幅提高。
与对比例4的组合肽段的CCP抗原相比，实施例18和19中的CCP抗原包括含瓜氨酸甘氨酸基序的CCP肽段与含瓜氨酸非甘氨酸基序的CCP肽段的组合，敏感性无明显变化，而特异性由84.67％提升至98％以上，灵敏度由2.752提升至0.228，信噪比由2.77提升至24以上，灵敏度和信噪比提升了近10倍。
在实施例内部，由实施例2～5可知，成环氨基酸的个数可以是12～19个，从含瓜氨酸的抗原表位区氨基酸数相等(均是5个)的实施例4与实施例2比较可见，成环氨基酸的个数为14个时，其检测的敏感性和信噪比相对更高。
由实施例4、6和7可知，氨基酸Cit可位于含瓜氨酸的抗原表位区的任意位置，包括最左端、最右端和正中心位置。当含瓜氨酸的抗原表位区的氨基酸数量相对较多，且Cit位于含瓜氨酸的抗原表位区的正中心位置时，环状结构使得抗原表位更加突出，更有利于抗体的识别，因而敏感性和信噪比也相对更高。
此外，由表2-1至表2-8中的敏感性结果可知，只要保留了含瓜氨酸的抗原表位区段5～7个氨基酸，其敏感性几乎能够保持整个肽段的全部活性，说明对应的CCP抗体的识别表位大部分位于包含了Cit的含瓜氨酸的抗原表位区的5～7个氨基酸区段。而S1和S2的侧翼区和S3和S4中的成环氨基酸残基对敏感性无明显影响。
由此可见，通过保留影响敏感性的含瓜氨酸的抗原表位区，对含瓜氨酸的抗原表位区以外的S1和S2的侧翼区进行改造，有助于提高肽段的特异性。而由表2-4至表2-8中实施例10～17的特异性结果可知：当侧翼区的氨基酸为甘氨酸时，临床检测的特异性优于其为非极性脂肪族氨基酸时的特异性，其次为侧链是芳香族的氨基酸，再次为极性不带电的氨基酸，最后为一个带电氨基酸。
由实施例18～19可知，因RA及其相关疾病的发病机理复杂，肽段的联合使用，可大大提高RA的诊断敏感性和特异性。
通过上述各对比例和各实施例的比较可知，当含瓜氨酸的抗原表位区为3～7个氨基酸组成的抗原决定簇时，其检测的敏感性与对比例相当。本申请的实施例通过对瓜氨酸位点两端的侧翼区的氨基酸位点进行改进修饰，使得CCP抗原能够在保持临床检测敏感性无明显改变的同时，大大降低背景和非特异性吸附，使试剂的灵敏度和信噪比提高接近10倍，进一步优化了试剂性能。同时，两端对抗原特异性非必须氨基酸位点的改进修饰，极大地降低了在非RA患者及正常健康人中的检出率，临床检测特异性从84％左右提高到99％左右。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过将除CCP必须识别位点外的其他氨基酸序列修饰或者替换成残基侧链结构简单、非极性或非带电的氨基酸来降低与非RA患者血清抗体识别的概率，从而在保持临床检测敏感性的同时，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA临床诊断中的特异性。本申请的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒及其在临床上的应用，降低非RA患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体的检出率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性，降低或避免因假阳性结果而导致医生对患者错误诊断和错误治疗的风险。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司
<120> CCP抗原肽、包含其的试剂、试剂盒及应用
<130> PN95253SZSW
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 24
His Gln Arg Lys Trp Xaa Gly Ala Ser Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(8)
<223> 位置6和8的Xaa均代表瓜氨酸
<400> 25
His Gln Phe Arg Phe Xaa Gly Xaa Ser Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(10)
<223> 位置6和10上的Xaa均代表瓜氨酸
<400> 26
His Gln Lys Trp Arg Xaa Gly Arg Ser Xaa Ala Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 27
His Gln Phe Arg Phe Xaa Gly Trp Ser Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 28
Lys Pro Tyr Thr Val Xaa Lys Phe Met Arg Arg Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(8)
<223> 位置6和8上的Xaa均代表瓜氨酸
<400> 29
Ala Arg Phe Gln Met Xaa His Xaa Arg Leu Ile Arg
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 30
Tyr Ser Phe Val Trp Xaa Ser His Ala Arg Pro Arg
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 31
Ala Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Arg Leu Ile Arg
1 5 10
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 32
Arg Asn Leu Arg Leu Xaa Arg Glu Arg Asn His Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 33
His Gln Cys His Gln Glu Ser Thr Xaa Gly Arg Ser Arg Gly Arg Cys
1 5 10 15
Gly Arg Ser Gly Ser
20
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa代表瓜氨酸
<400> 34
Lys Pro Tyr Thr Val Xaa Lys Phe Met Arg Arg Pro
1 5 10
Claims (17)
1.一种CCP肽段，其特征在于，所述CCP肽段具有式I所示的结构：
NH2-S3-S1-X- S2-S4-COOH……………式I；其中，
X为含瓜氨酸的抗原表位区，
S1和 S2为所述含瓜氨酸的抗原表位区的侧翼区，
S3和 S4为用于连接成环从而形成所述CCP肽段的氨基酸残基区域，
所述S3的氨基酸残基区域与所述S4的氨基酸残基区域通过二硫键连接成环，其中，所述S3的C端为半胱氨酸残基，S4的N端为半胱氨酸残基，两个所述半胱氨酸残基通过形成二硫键将所述式I中的S3-S1-X-S2-S4连接成环；
所述侧翼区的氨基酸残基为甘氨酸残基和/或丙氨酸残基，
所述式I结构中， S1-X-S2及S3和S4中参与成环的氨基酸的总个数为12~19个，
所述S1或S2分别含有2-8个氨基酸，所述S3或S4分别含有2~4个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述含瓜氨酸的抗原表位区含有2n+1个氨基酸，其中n为≥1的自然数。
3.根据权利要求2所述的CCP肽段，其特征在于，所述瓜氨酸位于n+1的位置。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CCP肽段，其特征在于，所述CCP肽段选自如下氨基酸序列中的任意一个：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17。
5.一种CCP抗原，其特征在于，所述CCP抗原包括一个或多个权利要求1至4中任一项所述的CCP肽段。
6.根据权利要求5所述的CCP抗原，其特征在于，所述CCP抗原包括含瓜氨酸甘氨酸基序的CCP肽段与含瓜氨酸非甘氨酸基序的CCP肽段的组合。
7.一种类风湿关节炎检测试剂，其特征在于，所述试剂包括CCP抗原，所述CCP抗原为权利要求5或6所述的抗原。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述CCP抗原以CCP抗原-载体蛋白偶联物、CCP抗原-生物素或CCP抗原-异硫氰荧光素的形式存在。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述CCP抗原-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为动物源性载体蛋白或人源性载体蛋白。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于，所述载体蛋白选自如下任意一种：牛血清白蛋白、阳离子牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛γ球蛋白及人γ球蛋白。
11.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述CCP抗原-载体蛋白偶联物、所述CCP抗原-生物素或所述CCP抗原-异硫氰荧光素包被于固相载体上。
12.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述固相载体为磁性微球。
13.根据权利要求12所述的试剂，其特征在于，所述磁性微球为表面带有修饰基团的磁性微球，所述修饰基团选自如下至少一种：环氧基、磺酰基、醛基、酰胺基、氨基、羧基、巯基以及羟基。
14.一种类风湿关节炎检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7至13中任一项所述的试剂。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求11至13中任一项所述的试剂，所述试剂盒还包括发光标记物标记的二抗。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述发光标记物选自金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、吖啶酯、辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶中的任一种。
17.权利要求1至4中任一项所述的任意一个或多个CCP肽段、或者权利要求5或6所述的CCP抗原在制备用于诊断类风湿关节炎检测试剂或试剂盒中的用途。
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