CN111944773B - 一种Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Jo‑1抗原偶联磁微粒，所述Jo‑1抗原偶联磁微粒中的磁微粒可通过酰胺键与Jo‑1抗原偶联；所述酰胺键由所述磁微粒经含有乙醇的2‑吗啉乙磺酸溶液活化后与所述Jo‑1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。通过提升Jo‑1抗原与磁微粒的偶联量，提升了对抗Jo‑1抗体的检出率和反应性，尤其是对弱阳性样本的反应性，使得应用本发明制备的Jo‑1抗原偶联磁微粒的试剂产品批间差异小、检测精密度高。

Description

一种Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测抗Jo-1抗体的Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品。

背景技术

肌炎是一种以骨骼肌受累、皮肤受累为主要表现的自身免疫性疾病，部分患者会出现心脏、肺、消化道、肾脏等重要器官受累，甚至出现呼吸、心脏衰竭。目前的研究表明肌炎患者血清中存在种类繁多的肌炎相关性自身抗体，肌炎诊断及治疗指南提及的抗体就包括：抗组氨酰t-RNA合成酶抗体(抗Jo-1抗体)、抗信号识别颗粒(SRP)抗体、抗多发性肌炎硬皮病(PM-Scl)抗体、抗组蛋白乙酰转移酶复合物解旋酶成分(Mi-2)抗体、抗X射线修复交叉互补蛋白6/抗X射线修复交叉互补蛋白5(Ku)抗体和抗DNA拓朴异构酶-1(SCl-70)抗体等。不同的肌炎相关性自身抗体阳性往往预示着不同的并发症(癌症、间质性肺病和关节炎等)，患者的致死致残率、治疗方法也有很大不同，现有技术中涉及几种甚至十几种的肌炎相关性自身抗体的多重检测方案已被提出，该多重检测方案中每种肌炎亚型的准确分类和判定十分必要。

抗Jo-1抗体是最常见的肌炎特异性自身抗体(肌炎的血清学标志物)，在肌炎患者中的阳性率约为20-30％。最新的荟萃分析显示抗Jo-1抗体阳性患者临床上常伴有肺间质纤维化、关节炎、雷诺现象和“技工手”等并发症，并存在较高概率的合并肺部感染、心脏损害；而肌痛、肌无力症状较轻，出现吞咽困难症状的几率较低。另外，中日友好医院与青海省人民医院风湿免疫科研究结果均显示肌炎患者血清中的抗Jo-1抗体滴度与疾病活动度之间存在相关性，抗Jo-1抗体滴度越高病情越重,累及的内脏损害发生率越高。由此可见，抗Jo-1抗体的准确检测对肌炎临床亚型诊断、相关并发症预测、治疗策略选择和预后判断起到重要作用。

目前抗Jo-1抗体检测技术已有报道，可大致分为两类：物理吸附Jo-1抗原的胶体金层析法、酶联免疫吸附法和基于磁微粒捕获包被Jo-1抗原的化学发光法，但是这些方法均存在不足之处。

一、物理吸附法

专利CN103185777 A公开了一种单人份抗Jo-1抗体酶联免疫检测试剂的制备方法，但是整个测试长达约1小时50分钟，检测时间较长，无法满足临床上对快速诊断的需求；使用物理吸附的方法结合抗原，容易出现假阳、灵敏度低；使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺为显色底物，信噪比较低；整个测试期间加注试剂种类过多，试剂加注操作较为繁琐。

专利CN 102621308 A公开了一种抗Jo-1抗体胶体金层析法检测试纸的制备方法，但是该方法使用胶体金物理吸附抗原、根据T线颜色人工判读，灵敏度低、灰区大；不同区域的硝酸纤维素膜孔径大小差异会导致测试结果变异系数较大、重复性差；需纯度极高的抗原(减少杂蛋白吸附造成的干扰)，蛋白原料成本较高。

二、基于磁微粒捕获包被Jo-1抗原的化学发光法

专利CN109085343 A使用链霉素亲和素磁微粒捕获生物素化的Jo-1抗原，搭配碱性磷酸酶标记的抗人IgG对血清中的抗Jo-1抗体进行检测。为了保持Jo-1抗原的天然构象以提高检出率，该专利在Jo-1抗原中添加了tRNA用来与Jo-1形成复合物。但是生物素-链霉素亲和素系统稳定性较差、背景高，存在一定的假阳，临床应用存在不足；tRNA在体外液相环境下极易被降解，从而失去调整Jo-1抗原的作用，造成检测试剂稳定性差。

专利CN106706896 A使用羧基磁珠偶联抗Jo-1抗体IgG单克隆抗体，配合吖啶酯标记的抗人IgG对血清中的Jo-1抗体进行检测。但是人体内的抗Jo-1抗体是多克隆抗体，加之不同患者之间的个体差异，抗Jo-1抗体IgG单克隆抗体对不同病人、同一病人体内存在的亚型众多的抗Jo-1抗体难以全面的识别，因此该方法存在大量的漏检；该专利使用抗体间接捕获Jo-1抗原，抗原部分表位被占用，因此会造成试剂对部分患者样本漏检；间接结合Jo-1抗原，试剂稳定性差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种Jo-1抗原偶联磁微粒。

本发明的第二目的在于提供一种Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法。

本发明的第三目的在于提供上述Jo-1抗原偶联磁微粒或其制备方法的应用。

本发明的第四目的在于提供一种包括上述Jo-1抗原偶联磁微粒或其制备方法制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒的产品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种Jo-1抗原偶联磁微粒，包括磁微粒以及通过酰胺键与所述磁微粒偶联的Jo-1抗原；所述酰胺键由所述磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与所述Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。

进一步地，所述Jo-1抗原包括第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原，所述第一Jo-1抗原为天然Jo-1抗原，所述第二Jo-1抗原为重组Jo-1抗原，第一Jo-1抗原的氨基酸序列与第二Jo-1抗原的氨基酸序列相同。

进一步地，所述含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中乙醇浓度为10～20％v/v,优选为15％v/v。

上述Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，将磁微粒加入到含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中活化；向活化后的磁微粒溶液中加入可通过酰胺键与磁微粒偶联的Jo-1抗原，制得Jo-1抗原偶联磁微粒；所述酰胺键由所述磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与所述Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。

进一步地，加入的所述Jo-1抗原与所述磁微粒的比例为0.6～1ng/个，优选为0.8ng/个。

进一步地，加入的所述Jo-1抗原包括第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原，所述第一Jo-1抗原为天然Jo-1抗原，所述第二Jo-1抗原为重组Jo-1抗原，第一Jo-1抗原序列与第二Jo-1抗原氨基酸序列相同，加入的所述Jo-1抗原中所述第一Jo-1抗原与所述第二Jo-1抗原的质量比为(0.6ng：0.2ng)～(0.4ng：0.4ng)，优选为(0.5ng：0.3ng)。

进一步地，活化后的磁微粒在偶联缓冲液中通过酰胺键与加入的Jo-1抗原偶联，所述偶联缓冲液中含有可打断所述Jo-1抗原中的二硫键利于Jo-1抗原表位暴露的DTT。

进一步地，所述偶联缓冲液中DTT的浓度为0.2～1mM，优选为0.5mM。

进一步地，加入的所述含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中乙醇浓度为10～20％v/v,优选为15％v/v。

进一步地，一种Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，包括：

(1)取所述磁微粒，分离，用pH 6.0含15％乙醇的100mM 2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤，重悬；

(2)向重悬后的磁微粒中加入NHS至溶液中NHS浓度为5mg/mL，再向溶液中加入EDC至EDC的浓度为3.33mg/mL，在室温下震荡；

(3)采用100mM，pH 5.1醋酸盐缓冲溶液洗涤，重悬；

(4)按0.5ng/个磁微粒的量加入所述第一Jo-1抗原，混匀，后再按0.3ng/个磁微粒的量加入所述第二Jo-1抗原，混匀，再加入DTT至DTT浓度为0.5mM，震荡；

(5)采用pH 7.4含0.5％tween-20的磷酸盐缓冲溶液洗涤；

(6)采用含1％牛血清白蛋白的封闭液洗涤，震荡；

(7)采用含1％牛血清白蛋白洗涤，制备得到所述Jo-1抗原偶联磁微粒。

上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法制备地Jo-1抗原偶联磁微粒在检测抗Jo-1抗体中的应用。

一种用于肌炎的非活体诊断的产品，其上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供一种用于检测抗Jo-1抗体的Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品，一种Jo-1抗原偶联磁微粒，抗原偶联磁微粒中的磁微粒可通过酰胺键与Jo-1抗原偶联，酰胺键由磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。通过提升Jo-1抗原与磁微粒的偶联量，提升了对抗Jo-1抗体的检出率和反应性，尤其是对弱阳性样本的反应性，使得应用本发明制备的Jo-1抗原偶联磁微粒的试剂产品批间差异小、检测精密度较高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明中所述磁微粒包括但不限于磁片、磁珠、磁颗粒等可作为载体的并在其上可直接或间接与蛋白或多肽连接的物体。

本发明中所述抗Jo-1抗体指可以与Jo-1蛋白或多肽产生“抗原-抗体”特异性结合的蛋白、多肽或其他物质，也可称为Jo-1抗体。

本发明中所述Jo-1抗原指可以与抗Jo-1抗体产生“抗原-抗体”特异性结构的蛋白或多肽。

本发明中所述2-吗啉乙磺酸溶液是指将2-吗啉乙磺酸溶入超纯水中制备得到的溶液，可简写为MES；NHS指N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺溶入超纯水中制备得到的溶液；EDC指碳二亚胺或碳二亚胺溶入超纯水中制备得到的溶液；DTT指二硫苏糖醇或二硫苏糖醇溶入超纯水中制备得到的溶液。

本发明中所述比值，可以理解为比值内两数值中的其中一个化为1时的相同比值，例如6：2、3：1、0.6：0.2所表达数值均相同。

本发明提供一种Jo-1抗原偶联磁微粒，Jo-1抗原偶联磁微粒中的磁微粒可通过酰胺键与Jo-1抗原偶联；酰胺键由所述磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。

活化原理为EDC与磁微粒反应形成高活性的O-酰基异(O-acylisourea)，而水溶液中用NHS稳定该中间体。因溶剂化作用，溶液中的乙醇参与了稳定O-酰基异脲的反应过程，并形成了相应的O-酰基异脲中间体-乙醇复合物；该O-酰基异脲中间体-乙醇复合物有利于Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代，进而形成稳定的酰胺键。EDC可与磁微粒上的羧基反应形成高活性的O-酰基异(O-acylisourea)，也可与其他能形成O-酰基异(O-acylisourea)的在磁微粒上的非羧基基团反应。

Jo-1抗原包括第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原，第一Jo-1抗原为取自小牛胸腺，纯度大于90％的天然Jo-1抗原，其序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

MADRAALEDLVRVQGERVRGLKQQKASAEQIEEEVAKLLKLKAQLGPDEGKPKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIISCFKRHGAEVIDTPVFELKETLTGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGQFDPMLPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVPDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIADKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQPPARAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKVRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLISELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEETGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVASREEVDVRREDLVEEIKRRTSQPLCIC

第二Jo-1抗原是使用人Jo-1蛋白mRNA序列，参照专利申请201910788378.5中所述的抗原制备方法通过E.coli表达系统进行原核表达制备出的纯度大于90％的重组Jo-1抗原，其序列与SEQ ID NO.1相同。

在分子进化树中，Jo-1蛋白是种非常保守的蛋白，因此人和牛的Jo-1蛋白一级结构差别较小。本次试验中使用的重组表达Jo-1是使用人Jo-1蛋白mRNA序列，并通过E.coli表达系统进行原核表达；所以重组表达Jo-1蛋白缺少真核细胞特有的翻译后折叠、修饰过程，蛋白的二级、三级结构与天然的Jo-1抗原相比相对简单，缺乏部分构象型表位，但是重组表达Jo-1结构较为“松散”，抗原的线性表位暴露更加充分，有利于识别线性表位的抗体结合，所以重组Jo-1抗原偶联磁微粒后反应性较高但存在漏检；本发明所使用的天然Jo-1抗原是取自小牛胸腺中，蛋白高级结构更接近Jo-1在人体内的自然状态，所以构象型表位齐全，但是蛋白本身折叠、卷曲较多，线性表位暴露不充分、柔韧度较低，不利于抗体的识别与结合，所以天然Jo-1抗原检出率高，但反应性较低。本发明通过将天然Jo-1抗原、重组Jo-1抗原同时偶联在同一磁微粒上，将天然Jo-1抗原的高反应性与重组Jo-1抗原的高检出率结合，产生了预料不到的有益效果。

含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中乙醇浓度为10～20％v/v,可选但不限为10％v/v、12.5％v/v、15％v/v、17.5％v/v、20％v/v，或两数值之间的数值，优选为15％v/v。

本发明还保护了一种Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法：将磁微粒加入到含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中活化；向活化后的磁微粒溶液中加入可通过酰胺键与磁微粒偶联的Jo-1抗原，制得Jo-1抗原偶联磁微粒；酰胺键由磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成。本制备方法具有上述Jo-1抗原偶联磁微粒的全部有益效果。

加入的Jo-1抗原与磁微粒的比例为0.6～1ng/个，可选但不限为0.6ng/个、0.65ng/个、0.7ng/个、0.75ng/个、0.8ng/个、0.85ng/个、0.9ng/个、0.95ng/个、1.0ng/个，或两数值之间的数值，优选为0.8ng/个，其中，作为示例，0.8ng/个表示每个磁微粒对应质量为0.8ng的Jo-1抗原。

加入的Jo-1抗原用量过低时，磁微粒上偶联的Jo-1抗原数量较低，对抗Jo-1抗体的结合不足，导致反应性较低；Jo-1抗原用量过高时，磁微粒表面偶联Jo-1抗原数量过多，Jo-1抗原之间过于“拥挤”，空间位阻较大，妨碍Jo-1抗原与抗Jo-1抗体通过“诱导-契合”作用进行结合，导致反应性较低。

加入的Jo-1抗原中第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原的质量比为(0.6：0.2)～(0.4：0.4)ng/ng，可选但不限为(0.6ng：0.2ng)、(0.55ng：0.25ng)、(0.5ng：0.3ng)、(0.45ng：0.35ng)、(0.4ng：0.4ng)，或两数值之间的数值，优选为(0.5ng：0.3ng)。

活化后的磁微粒在偶联缓冲液中通过酰胺键与加入的Jo-1抗原偶联；偶联缓冲液中含有可打断Jo-1抗原中的二硫键利于Jo-1抗原表位暴露的二硫苏糖醇(DTT)。

DTT可打断Jo-1抗原中的二硫键，使抗原结构更加“松散”，抗原表位暴露更加充分，有利于Jo-1抗原识别血清中的抗Jo-1抗体。

偶联缓冲液中DTT的浓度为0.2～1mM，可选但不限为0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM，或两数值之间的数值，优选为0.5mM。

一种Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法：

(1)取磁微粒，分离，用pH 6.0含15％乙醇的100mM 2-吗啉乙磺酸(简称MES)缓冲液洗涤，重悬；

(2)向重悬后的磁微粒中加入N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)至溶液中NHS浓度为5mg/mL，再向溶液中加入碳二亚胺(简称EDC)至EDC的浓度为3.33mg/mL的，在室温下震荡；

(3)采用100mM，pH 5.1醋酸盐缓冲溶液洗涤，重悬

(4)按0.5ng/个磁微粒的量加入所述第一Jo-1抗原，混匀后再按0.3ng/个磁微粒的量加入所述第二Jo-1抗原，混匀，再加入DTT至浓度为0.5mM，震荡；

(5)采用pH 7.4含0.5％tween-20的磷酸盐缓冲溶液洗涤；

(6)采用含1％牛血清白蛋白的封闭液洗涤，震荡；

(7)采用含1％牛血清白蛋白洗涤，制备得到Jo-1抗原偶联磁微粒。

醋酸盐缓冲溶液可选pH为4.5～5.5，可选但不限为4.5、4.7、4.9、5.1、5.3、5.5，或两数值之间的数值，优选为5.1。

醋酸盐缓冲溶液可选浓度为50mM～100mM，可选但不限为50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，或两数值之间的数值，优选为100mM。

本发明还保护了一种上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒在检测抗Jo-1抗体中的应用，其具有上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法全部技术特征和有益效果。

本发明还保护了一种包括上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒用于肌炎的非活体诊断的产品，其具有上述Jo-1抗原偶联磁微粒或Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法全部技术特征和有益效果。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

藻红蛋白标记的抗人IgG抗体：抗人IgG抗体来源于鼠；

血清样本：由合作医院提供。

试剂：2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二硫苏糖醇(DTT)、三羟甲基氨基甲烷、硼酸、硼砂、十二水和磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸、醋酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、柠檬酸-磷酸氢二钠、2-(二乙醇氨基)乙磺酸钠、3-(N-吗啉基)丙磺酸、Tween-20、牛血清白蛋白和其它试剂应达到分析纯；

仪器：恒温混匀仪、磁力架、恒温振荡器、磁力板，判读仪。

磁微粒：Applied BioCode公司的数码液相芯片(Digital Liquid Chip)，其具有超顺磁性、且由生物兼容的高分子聚合物组成(Barcoded Magnetic Beads，BMB)。BMB表面共价交联有丰富的羧基。

试验例1、羧化磁微粒偶联天然Jo-1抗原

(1)取50000个磁微粒，磁分离去上清，用100mM MES缓冲液(pH 6.0)洗涤2遍，再采用152uL 100mM MES缓冲液(pH 6.0)重悬；

(2)MES缓冲液加入28uL新鲜配制的NHS(50mg/mL)至缓冲液内NHS浓度为5mg/mL，涡旋混匀，再向MES缓冲液中加入20uL新鲜配制的EDC(50mg/mL)至EDC浓度为3.33mg/mL，在室温下震荡50min(转速1500rpm/min)；

(3)采用200uL 100mM MES缓冲液(pH 5.0)洗涤2遍，再用200uL100 mM MES缓冲液(pH 5.0)重悬；

(4)按0.4ng/个磁微粒的用量加入天然Jo-1抗原，在室温下震荡2.5h(转速1500rpm/min)；

(5)采用含0.5％tween-20的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗涤1遍；

(6)采用封闭液(含1％牛血清白蛋白)洗涤2遍，加入500uL封闭液，在室温下震荡1h(转速1500rpm/min)；

(7)采用PBS-T(含1％牛血清白蛋白)洗涤，得到Jo-1抗原偶联磁微粒。

测试方法

(1)取50uLJo-1抗原偶联磁微粒(含50个磁微粒)于透明材质的96孔板，加入50uL采用PBST(含1％牛血清白蛋白)预稀释50倍的血清样本，于37℃条件下振荡15分钟；

(2)采用磁力板吸附Jo-1抗原偶联磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；

(3)加入50uL 0.5ug/mL藻红蛋白标记的抗人IgG抗体，于37℃条件下振荡15分钟；

(4)采用磁力板吸附Jo-1抗原偶联磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；

(5)采用PBST悬浮并采用判读仪读取荧光信号值。

对2组抗Jo-1强阳性患者血清样本、3组抗Jo-1阳性患者血清样本、2组抗Jo-1阴性患者血清、7组随机样本血清进行检测，结果如表1所示。

表1

本试验在经典的MES偶联体系中使用羧基磁微粒共价偶联Jo-1抗原，结果显示阴性样本MFI(Median Fluorescence Intensity)值极低，背景干净；强阳样本的MFI值可达到10000左右，阳性样本、弱阳性样本有一定的反应性，但均不高，总体信噪比只有602.05。此次试验结果表明磁微粒共价偶联Jo-1抗原对血清中抗Jo-1抗体进行检测的方法可行，但总体信噪比并不高，仍需对整个Jo-1抗原偶联磁微粒的偶联体系进行调整优化、增加反应性。

实施例1、羧化磁微粒活化缓冲液筛选

与试验例1中偶联方法相比，本实施例第(1)步中分别采用100mM MES(pH 6.0)、含5％乙醇的100mM MES(pH 6.0)、含10％乙醇的100mM MES(pH 6.0)、含15％乙醇的100mMMES(pH 6.0)、含20％乙醇的100mM MES(pH 6.0)、含25％乙醇的100mM MES(pH 6.0)为活化缓冲液，其余过程均相同，并考察其对2组抗Jo-1强阳性患者血清样本、1组抗Jo-1阳性患者血清样本、2组抗Jo-1弱阳性患者血清、3组Jo-1弱阳性患者血清样本的反应性，结果如表2所示。

表2

测试结果表明，使用含10-20％乙醇的100mM MES(pH 6.0)活化缓冲液包被磁微粒对抗Jo-1抗体弱阳、阳性、强阳性样本的反应性有明显的提升，同时背景干净。根据样本反应性提升情况，活化缓冲液优选含15％乙醇的100mM MES(pH 6.0)。

对比例1、髓过氧化物酶抗原、蛋白酶3抗原采用含15％乙醇的100mM MES(pH 6.0)活化缓冲液包被

与实施例1相比，本对比例中第(1)步活化缓冲液分别采用含15％乙醇的100mMMES(pH 6.0)或100mM MES(pH 6.0)，并将第(4)步中加入的Jo-1抗原改为髓过氧化物酶抗原或蛋白酶3抗原。其余过程均相同，并考察其对2组抗Jo-1抗体强阳性患者血清样本、2组抗Jo-1抗体阳性患者血清样本、2组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、2组Jo-1抗体阴性患者血清样本的反应性，结果如表3所示。

表3

测试结果表明，与100mM MES活化缓冲液相比，含15％乙醇的100mM MES活化缓冲液对髓过氧化物酶抗原、蛋白酶3抗原偶联磁微粒的反应性并没有明显的提升效果。交联剂EDC/NHS活化原理为EDC与磁微粒上的羧基反应形成高活性的O-酰基异脲(O-acylisourea)，而水溶液中用NHS稳定该中间体。推测因溶剂化作用，溶液中的乙醇参与了稳定O-酰基异脲的反应过程，并形成了相应的中间体-乙醇复合物；该中间体-乙醇复合物有利于Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代，进而形成稳定的酰胺键；不同抗原的溶液中的三维构象相差较大，这种中间体-乙醇复合物并不一定适合其他蛋白抗原的偶联，推测是乙醇溶剂化、Jo-1抗原特定结构下的作用。15％乙醇的100mM MES活化缓冲液并不适用于其他抗原的偶联，对磁微粒与Jo-1抗原的偶联有一定的专属性，并且利于Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代，进而形成稳定的酰胺键，提升Jo-1抗原与磁微粒的偶联量。

实施例2、考察天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原反应性及检出率

与试验例1相比，本实施例中偶联方法第(1)步中活化缓冲液采用含15％乙醇的100mM MES缓冲溶液(pH 5.0)，偶联方法第(4)步中抗原采用天然Jo-1抗原或重组Jo-1抗原，考察其对34份抗Jo-1抗体阳性患者血清、6份抗Jo-1抗体阴性患者血清的反应性，其余过程均与试验例1相同，测试结果如表4所示。

表4

34份抗Jo-1阳性患者血清测试结果表明重组Jo-1抗原和天然Jo-1抗原各有其独特的优缺点：重组Jo-1抗原反应性较高但是存在漏检问题，检出率较低；天然Jo-1抗原检出率较高但是反应性低；另外，两种抗原的背景均很低。在分子进化树中，Jo-1蛋白是种非常保守的蛋白，因此人和牛的天然Jo-1蛋白一级结构差别较小。本次试验中使用的重组表达Jo-1是使用人Jo-1蛋白mRNA序列，并通过E.coli表达系统进行原核表达；所以重组表达的Jo-1蛋白缺少真核细胞特有的翻译后折叠、修饰过程，蛋白的二级、三级结构与天然Jo-1抗原相比相对简单，缺乏部分构象型表位，但是重组表达Jo-1结构较为“松散”，重组Jo-1抗原的线性表位暴露更加充分，有利于识别线性表位的抗体结合，所以重组Jo-1抗原偶联磁微粒后对抗Jo-1抗体的反应性较高但存在漏检，检出率低；本发明所使用的天然提取Jo-1蛋白是取自小牛胸腺中，蛋白高级结构更接近Jo-1在人体内的自然状态，所以构象型表位齐全，但是蛋白本身折叠、卷曲较多，线性表位暴露不充分、柔韧度较低，不利于抗体的识别与结合，所以天然Jo-1抗原偶联磁微粒对抗Jo-1抗体的检出率高，但反应性较低。综合检出率和反应性，考虑使用天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原同时偶联在同一磁微粒上，用于同时提升对抗Jo-1抗体的检出率和反应性。

实施例3、初步考察天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原混合偶联的检出情况

与实施例2相比，本实施例中，偶联方法第(4)步混合偶联0.4ng/个磁微粒的天然Jo-1抗原和0.4ng/个磁微粒的重组Jo-1抗原，考察其对2组抗Jo-1抗体强阳性患者血清样本、7组抗Jo-1抗体阳性患者血清样本、4组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、3组抗Jo-1抗体阴性患者血清的反应性，并采用实施例2中的偶联方法作为对照，其余过程均相同，测试结果如表5所示。

表5

测试结果表明，天然Jo-1抗原与重组Jo-1抗原混合偶联磁微粒可对抗Jo-1抗体阳性病人血清样本有较强的反应性，并且对重组表达Jo-1漏检样本可以有效的检出；同时，阴性样本极低。天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原具有高度相似的一级结构，伯胺数量和分布位置相似，因此与活化后的羧基磁微粒反应的能力相差不大，可以进行混合偶联。另外，一个磁微粒可以同时偶联重组Jo-1抗原和天然Jo-1抗原，所以可以集合天然Jo-1抗原与重组Jo-1抗原的优点，即提升对抗Jo-1抗体阳性样本的反应性和检出率。优选重组Jo-1抗原和天然Jo-1抗原混合偶联磁微粒检测抗Jo-1抗体。

实施例4、筛选偶联缓冲溶液

与实施例3相比，本实施例中偶联方法第(3)步中的偶联缓冲液分别采用硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0)、磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)、2-吗啉乙磺酸缓冲溶液(pH 5.0)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(pH 8.0)、醋酸盐缓冲溶液(pH 5.1)、碳酸盐缓冲溶液(pH 9.6)、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 3.0)、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH7.0)、2-(二乙醇氨基)乙磺酸缓冲溶液(pH 7.2)、咪唑缓冲溶液(pH 7.0)和3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲溶液(pH7.4)，偶联方法第(4)步采用混合偶联0.4ng/个磁微粒的天然Jo-1抗原和0.4ng/个磁微粒的重组Jo-1抗原；并对2组抗Jo-1抗体强阳性患者血清、2组抗Jo-1抗体阳性患者血清、1组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、3组抗Jo-1抗体阴性患者血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表6所示。

表6

测试结果表明，偶联缓冲溶液为醋酸盐缓冲溶液(pH 5.1)时，对抗Jo-1抗体的反应性最优。推测Jo-1抗原在不同的缓冲溶液中具有不同的三维构象，不同的构象下抗原表位暴露情况不同，因此偶联缓冲液种类对Jo-1抗原的反应性一定的影响，醋酸盐缓冲液对本实施例中所用的磁微粒偶联Jo-1抗原方法具有专一性。偶联缓冲溶液优选pH 5.1的醋酸盐缓冲溶液。

实施例5、偶联缓冲溶液pH筛选

与实施例4相比，本实施例中偶联方法第(3)步中分别采用pH为4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的醋酸盐偶联缓冲溶液进行偶联；并对2组抗Jo-1强阳性患者血清、2组抗Jo-1抗体阳性患者血清、1组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、3组抗Jo-1抗体阴性患者血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表7所示。

表7

测试结果表明，偶联缓冲溶液为醋酸盐缓冲溶液pH为4.55.5时对抗Jo-1抗体的反应性较佳，偶联缓冲溶液为醋酸盐缓冲溶液pH为pH 5.1时，混合偶联天然提取和重组表达Jo-1的磁微粒反应性最优。偶联缓冲溶液优选pH 5.1的醋酸盐缓冲溶液。

实施例6、偶联缓冲溶液浓度筛选

相比实施例5，本实施例中偶联方法第(3)步中分别采用浓度为20mM、50mM、100mM、250mM或500mM的醋酸盐偶联缓冲液(pH 5.1)，并对1组抗Jo-1强阳性患者血清、1组抗Jo-1阳性患者血清、10组抗Jo-1弱阳性患者血清、2组抗Jo-1阴性患者血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表8所示。

表8

测试结果表明，当偶联缓冲溶液浓度为50mM～100mM时，对样本中的抗Jo-1抗体的反应性较优。考虑到对弱阳样本反应性及溶液的缓冲容量的影响，偶联缓冲液浓度优选100mM。

实施例7、天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原混合偶联总量筛选

相比于实施例6，本实施例中，偶联方法第(3)步偶联缓冲溶液采用100mM醋酸盐缓冲溶液(pH 5.1),偶联方法第(4)步天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原用量分别采用0.05ng+0.05ng/个磁微粒、0.1ng+0.1ng/个磁微粒、0.2ng+0.2ng/个磁微粒、0.3ng+0.3ng/个磁微粒、0.4ng+0.4ng/个磁微粒、0.5ng+0.5ng/个磁微粒或0.6ng+0.6ng/个磁微粒。并对2组抗Jo-1抗体强阳性患者血清、1组抗Jo-1抗体阳性患者血清、3组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、2组抗Jo-1抗体阴性患者血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表9所示。

表9

测试结果表明，当天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原使用量均为0.4ng/个磁微粒(Jo-1抗原总量为0.8ng/个磁微粒)进行混合偶联时，对抗Jo-1抗体强、中、弱阳性样本的反应性最高；两种抗原用量各高于或低于0.4ng/个磁微粒时，反应性均降低。由此可见，本申请所使用的羧化磁微粒对Jo-1抗原最适载量为0.8ng/个，Jo-1抗原使用量低于0.8ng/个磁微粒时，磁微粒表面偶联抗原数量不够，导致反应性不高；Jo-1抗原使用量高于0.8ng/个磁微粒时，磁微粒表面偶联抗原数量过多，Jo-1蛋白分子之间过于“拥挤”，空间位阻较大，妨碍抗原与抗体通过“诱导-契合”进行结合，反应性较低。Jo-1抗原使用量为0.6-1ng/个磁微粒时反应性较好，Jo-1抗原与磁微粒的使用量优选0.8ng/个磁微粒。

实施例8、天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原混合偶联比例筛选

相比于实施例7，本实施例在保证Jo-1抗原使用总量为0.8ng/个磁微粒条件下，偶联方法第(4)步天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原用量分别采用0.8ng+0ng/个磁微粒、0.7ng+0.1ng/个磁微粒、0.6ng+0.2ng/个磁微粒、0.5ng+0.3ng/个磁微粒、0.4ng+0.4ng/个磁微粒、0.3ng+0.5ng/个磁微粒、0.2ng+0.6ng/个磁微粒、0.1ng+0.7ng/个磁微粒和0ng+0.8ng/个磁微粒。并对2组抗Jo-1抗体强阳性患者血清、10组抗Jo-1抗体阳性患者血清、12组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、3组抗Jo-1抗体阴性患者血清考察其反应性，结果如表10所示。

表10

测试结果表明，在总量为0.8ng/个磁微粒条件下，将天然Jo-1抗原和重组Jo-1抗原混合偶联可以有效地兼顾对抗Jo-1抗体的检出率和反应性，在天然Jo-1抗原0.5ng/个磁微粒、重组Jo-1抗原0.3ng/个磁微粒的条件下，12组弱阳样本中6组MFI值最高；考虑到弱阳样本的反应性，天然Jo-1抗原与重组Jo-1抗原偶联浓度可选取(0.6ng：0.2ng)～(0.4ng：0.4ng)，优选取(0.5ng：0.3ng)。天然Jo-1抗原、重组Jo-1抗原、磁微粒之间的用量优选为(0.5ng：0.3ng)/个磁微粒。

实施例9、抗原偶联调节剂筛选

相比于实施例8，本实施例中，偶联方法第(4)步天然Jo-1抗原采用0.5ng/个磁微粒、重组Jo-1抗原用量采用0.3ng/个磁微粒，并在偶联缓冲液中加入1mM DTT、1mM KI、0.9％NaCl、1mM柠檬酸钠、1％甘油或0.05％tween-20；另外选用实施例9中筛选出的偶联方法作为对照。并对4组抗Jo-1阳性抗体患者血清、4组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、2组随机样本血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表11所示。

表11

上表中：I表示天然Jo-1抗原0.5ng/个磁微粒+重组Jo-1抗原0.3ng/个磁微粒。

测试结果表明，偶联时加入DTT对Jo-1抗原进行还原处理可使对大部分样本的抗Jo-1抗体的反应性提高。推测DTT可打断Jo-1抗原中的二硫键，使Jo-1抗原结构更加“松散”，Jo-1抗原表位暴露更加充分，有利于Jo-1抗原对血清中抗Jo-1抗体的识别。磁微粒与Jo-1抗原偶联时优选加入一定量的DTT。

实施例10、DTT加入浓度筛选

相比于实施例9，本实施例中偶联方法第(4)步天然Jo-1抗原采用0.5ng/个磁微粒、重组Jo-1抗原用量采用0.3ng/个磁微粒，并分别在偶联缓冲液中加入DTT至偶联缓冲液中DTT浓度为0、0.2、0.5、1、2或4mM，并对1组抗Jo-1抗体阳性患者血清、5组抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、2组抗Jo-1抗体阴性患者血清考察其反应性，其余过程均相同，结果如表12所示。

表12

测试结果表明，当DTT使用浓度为0.2～1mM时，Jo-1抗原偶联磁珠对抗Jo-1抗体的反应性较优。根据阳性样本、弱阳性样本MFI数据，蛋白还原剂DTT用量优选0.5mM。

实施例11、羧化磁微粒混合偶联天然提取Jo-1和重组Jo-1抗原性能考察

Jo-1抗原偶联磁微粒制备过程：

(1)取50000个磁微粒(1000人份)，磁分离去上清，用含15％乙醇的100mM MES缓冲液(pH 6.0)洗涤2遍，再采用152uL含15％乙醇的100mM MES缓冲液(pH 6.0)重悬；

(2)加入28uL新鲜配制的NHS(50mg/mL)，涡旋混匀，再加入20uL新鲜配制的EDC(50mg/mL)，在室温下震荡50min(1500rpm/min)；

(3)采用200uL醋酸盐缓冲溶液(100mM，pH 5.1)洗涤2遍，再用200uL醋酸盐缓冲溶液(100mM，pH 5.1)重悬；

(4)按0.5ng/个磁微粒的用量加入天然提取Jo-1，摇匀后再按0.3ng/个磁微粒的用量加入重组表达的Jo-1，摇匀后再加入0.5mM DTT，在室温下震荡2.5h(1500rpm/min)；

(5)采用含0.5％tween-20的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)洗涤1遍；

(6)采用封闭液(含1％牛血清白蛋白)洗涤2遍，加入500uL封闭液，在室温下震荡1h(1500rpm/min)；

(7)采用PBS-T(含1％牛血清白蛋白)洗涤，得到Jo-1抗原偶联磁微粒。

性能测试：

对抗Jo-1抗体强阳性患者血清、抗Jo-1抗体阳性患者血清、抗Jo-1抗体弱阳性患者血清、抗Jo-1抗体阴性患者血清中的抗Jo-1抗体进行检测，结果如表13-15所示。

(1)反应性考察

表13

本实验测试了90份样本(15例抗Jo-1抗体强阳样本、15例抗Jo-1抗体阳性样本、15例抗Jo-1抗体弱阳样本和45例抗Jo-1抗体阴性样本)，结果如表13所示。可以看出抗Jo-1抗体阴性样本背景信号极低，均为个位数；抗Jo-1抗体弱阳性样本有较强的荧光信号，与抗Jo-1抗体阴性样本差异较为明显；抗Jo-1抗体阳性样本和抗Jo-1抗体强阳性样本信号值极强且呈递增趋势。

(2)精密度考察

表14

本实验分别选取1例抗Jo-1抗体强阳性样本、1例抗Jo-1抗体阳性样本、1例抗Jo-1抗体弱阳性样本，均重复测定抗Jo-1抗体10次，结果如表14所示。不同滴度阳性样本测试结果的变异系数均在4％以内，测试重复性较优。

(3)加速稳定性考察

表15

本实验将同批次Jo-1抗原偶联磁微粒冻干后分别放在4℃存放7天、37℃加速7天，对3例抗Jo-1抗体阳性样本、2例抗Jo-1抗体弱阳性样本、1例抗Jo-1抗体阴性样本，检测抗Jo-1抗体反应性，结果如表15所示。

Jo-1抗原偶联磁微粒在37℃加速7天后，对抗Jo-1抗体阳性、抗Jo-1抗体弱阳性样本的反应性略有下降，但仍可检出。总的来说，加速稳定性合格。采用本发明所述制备出的Jo-1抗原偶联磁微粒能够显著区分阴阳性样本，对不同滴度的样本区分度明显且背景干净；精密度较优，稳定性良好；表明本发明所述Jo-1抗原偶联磁微粒制备方法总体效果较优。

对比例2、对比欧蒙的免疫印迹法试剂，考察本发明试剂对弱阳样本的精密度

选取两批次欧蒙医学诊断有限公司免疫印迹法试剂(ANA-3/827-65、ANA-3/299-7)，按照说明书对同一份抗Jo-1抗体弱阳样本(2000017)进行检测免疫印迹法结果：第一次结果显示血清中抗Jo-1抗体为阴性，第二次结果显示血清中抗Jo-1抗体为弱阳性。

同时，使用包括实施例11制备出的Jo-1抗原偶联磁微粒的两批次试剂产品参照试验例1中的测试方法，对抗Jo-1抗体弱阳样本(2000017)检测，结果如表16所示。

表16

本发明两批次试剂产品结果均显示样本为弱阳性，批间差异较小，精密度较高。本发明通过改进磁微粒偶联缓冲液、混合反应性较高的重组Jo-1抗原、优化Jo-1偶联缓冲液和对Jo-1进行还原变性处理这四种方法，极大的提高了Jo-1抗原偶联磁微粒对抗Jo-1抗体的反应性，尤其是对抗Jo-1抗体弱阳性样本的反应性，使得本发明试剂产品批间差异小、检测精密度较高。

本发明通过加入15％乙醇改进磁微粒与Jo-1抗原的偶联量；以天然Jo-1抗原0.5ng/个磁微粒：重组Jo-1抗原0.3ng/个磁微粒的比例将天然Jo-1抗原、重组Jo-1抗原与磁微粒偶联；以pH 5.1、100mM醋酸盐缓冲溶液作为优化后的Jo-1抗原与磁微粒偶联的缓冲液体系和使用0.5mM的DTT对Jo-1抗原进行二硫键打开的还原变性处理这四种方法的协同作用制备出的Jo-1抗原偶联磁微粒，提升了Jo-1抗原与磁微粒的偶联量，极大的提升了对抗Jo-1抗体的检出率和反应性，尤其是对抗Jo-1抗体弱阳性样本的反应性，使得应用本发明制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒的试剂产品批间差异小、检测精密度较高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海丽珠试剂股份有限公司

<120> 一种Jo-1抗原偶联磁微粒及其制备方法、应用和产品

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Asp Arg Ala Ala Leu Glu Asp Leu Val Arg Val Gln Gly Glu

1 5 10 15

Arg Val Arg Gly Leu Lys Gln Gln Lys Ala Ser Ala Glu Gln Ile Glu

20 25 30

Glu Glu Val Ala Lys Leu Leu Lys Leu Lys Ala Gln Leu Gly Pro Asp

35 40 45

Glu Gly Lys Pro Lys Phe Val Leu Lys Thr Pro Lys Gly Thr Arg Asp

50 55 60

Tyr Ser Pro Arg Gln Met Ala Val Arg Glu Lys Val Phe Asp Val Ile

65 70 75 80

Ile Ser Cys Phe Lys Arg His Gly Ala Glu Val Ile Asp Thr Pro Val

85 90 95

Phe Glu Leu Lys Glu Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Gly Glu Asp Ser Lys

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Leu Lys Asp Gln Gly Gly Glu Leu Leu Ser Leu Arg

115 120 125

Tyr Asp Leu Thr Val Pro Phe Ala Arg Tyr Leu Ala Met Asn Lys Leu

130 135 140

Thr Asn Ile Lys Arg Tyr His Ile Ala Lys Val Tyr Arg Arg Asp Asn

145 150 155 160

Pro Ala Met Thr Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Phe Tyr Gln Cys Asp Phe

165 170 175

Asp Ile Ala Gly Gln Phe Asp Pro Met Leu Pro Asp Ala Glu Cys Leu

180 185 190

Lys Ile Met Cys Glu Ile Leu Ser Ser Leu Gln Ile Gly Asp Phe Leu

195 200 205

Val Lys Val Asn Asp Arg Arg Ile Leu Asp Gly Met Phe Ala Ile Cys

210 215 220

Gly Val Pro Asp Ser Lys Phe Arg Thr Ile Cys Ser Ser Val Asp Lys

225 230 235 240

Leu Asp Lys Val Ser Trp Glu Glu Val Lys Asn Glu Met Val Gly Glu

245 250 255

Lys Gly Leu Ala Pro Glu Val Ala Asp Arg Ile Gly Asp Tyr Val Gln

260 265 270

Gln His Gly Gly Val Ser Leu Val Glu Gln Leu Leu Gln Asp Pro Lys

275 280 285

Leu Ser Gln Asn Lys Gln Ala Leu Glu Gly Leu Gly Asp Leu Lys Leu

290 295 300

Leu Phe Glu Tyr Leu Thr Leu Phe Gly Ile Ala Asp Lys Ile Ser Phe

305 310 315 320

Asp Leu Ser Leu Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Ile Tyr

325 330 335

Glu Ala Val Leu Leu Gln Pro Pro Ala Arg Ala Gly Glu Glu Pro Leu

340 345 350

Gly Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Gly Arg Tyr Asp Gly Leu Val Gly

355 360 365

Met Phe Asp Pro Lys Gly Arg Lys Val Pro Cys Val Gly Leu Ser Ile

370 375 380

Gly Val Glu Arg Ile Phe Ser Ile Val Glu Gln Arg Leu Glu Ala Leu

385 390 395 400

Glu Glu Lys Val Arg Thr Thr Glu Thr Gln Val Leu Val Ala Ser Ala

405 410 415

Gln Lys Lys Leu Leu Glu Glu Arg Leu Lys Leu Ile Ser Glu Leu Trp

420 425 430

Asp Ala Gly Ile Lys Ala Glu Leu Leu Tyr Lys Lys Asn Pro Lys Leu

435 440 445

Leu Asn Gln Leu Gln Tyr Cys Glu Glu Thr Gly Ile Pro Leu Val Ala

450 455 460

Ile Ile Gly Glu Gln Glu Leu Lys Asp Gly Val Ile Lys Leu Arg Ser

465 470 475 480

Val Ala Ser Arg Glu Glu Val Asp Val Arg Arg Glu Asp Leu Val Glu

485 490 495

Glu Ile Lys Arg Arg Thr Ser Gln Pro Leu Cys Ile Cys

500 505

Claims (11)

1.一种Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，包括：

将磁微粒加入到含有10%~20%v/v乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中活化；

向活化后的磁微粒溶液中加入可通过酰胺键与所述磁微粒偶联的Jo-1抗原，制得Jo-1抗原偶联磁微粒；

所述酰胺键由所述磁微粒经含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液活化后与所述Jo-1抗原上的伯胺进行亲电取代形成；

加入的所述Jo-1抗原为第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原，所述第一Jo-1抗原为天然Jo-1抗原，所述第二Jo-1抗原为重组Jo-1抗原，第一Jo-1抗原与第二Jo-1抗原的氨基酸序列相同，如SEQ ID No.1所示，加入的所述第一Jo-1抗原与所述第二Jo-1抗原的质量比为（0.6ng：0.2ng）~（0.4 ng：0.4 ng）。

2.根据权利要求1所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，加入的所述Jo-1抗原与所述磁微粒的比例为0.6~1ng/个。

3.根据权利要求2所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，加入的所述Jo-1抗原与所述磁微粒的比例为0.8 ng/个。

4.根据权利要求1所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，所述第一Jo-1抗原与所述第二Jo-1抗原的质量比为0.5 ng：0.3 ng。

5.根据权利要求1所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，活化后的磁微粒在偶联缓冲液中通过酰胺键与加入的Jo-1抗原偶联，所述偶联缓冲液中含有可打断所述Jo-1抗原中的二硫键利于Jo-1抗原表位暴露的DTT。

6.根据权利要求5所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液中DTT的浓度为0.2~1 mM。

7.根据权利要求6所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液中DTT的浓度为0.5 mM。

8.根据权利要求1所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，加入的所述含有乙醇的2-吗啉乙磺酸溶液中乙醇浓度为15%v/v。

9.根据权利要求1至8任一项所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，包括：

（1）取所述磁微粒，分离，用pH 6.0含15%v/v乙醇的100 mM 2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤，重悬；

（2）向重悬后的磁微粒中加入NHS至溶液中NHS浓度为5mg/mL，再向溶液中加入EDC至EDC的浓度为3.33 mg/mL，在室温下震荡；

（3）采用100 mM，pH 5.1醋酸盐缓冲溶液洗涤，重悬；

（4）按0.5 ng/个磁微粒的量加入第一Jo-1抗原，混匀，后再按0.3 ng/个磁微粒的量加入第二Jo-1抗原，混匀，再加入DTT 至DTT浓度为 0.5 mM，震荡；

（5）采用pH 7.4 含0.5% tween-20的磷酸盐缓冲溶液洗涤；

（6）采用含1%牛血清白蛋白的封闭液洗涤，震荡；

（7）采用含1%牛血清白蛋白洗涤，制备得到所述Jo-1抗原偶联磁微粒。

10.权利要求1至9任一项所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法制备的Jo-1抗原偶联磁微粒在制备检测抗Jo-1抗体产品中的应用。

11.一种用于肌炎的非活体诊断的产品，其特征在于，包括权利要求1至9任一项所述的Jo-1抗原偶联磁微粒的制备方法制备得到的Jo-1抗原偶联磁微粒。