CN110596374A - 一种磁微粒与抗原偶联的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种磁微粒与抗原偶联的方法，包括(1)抗原的前处理；(2)磁微粒的前处理；(3)磁微粒的活化；(4)偶联抗原；(5)偶联产物的洗涤；(6)偶联产物的储存。采用本发明的方法可防止磁微粒与抗原偶联时出现团聚现象，大大提高了磁微粒与抗原的偶联效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种磁微粒与抗原偶联的方法。
背景技术
磁微粒具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能性官能团、稳定性与分散性良好等特点。磁微粒的表面修饰有官能团，在合适缓冲溶液条件下，该官能团与抗原分子发生偶联，即完成了抗原分子的固定化。后续在外磁场的控制下，通过免疫反应、洗涤、测定等步骤，可以快速地测得目标分子的浓度或含量。
目前磁微粒上修饰的官能团主要有甲苯磺酰基、羧基、氨基和羟基等，鉴于抗原分子与磁微粒偶联时的反应效率和磁微粒修饰官能团的工艺成熟度，修饰羧基官能团的磁微粒应用较多。然而抗原分子结构复杂，分子量较小，现有技术中某些抗原分子在与磁微粒偶联的过程中容易导致磁微粒之间发生团聚，进而影响到磁微粒和抗原的偶联，降低了偶联效率，进而影响了试剂盒的检测性能。因此针对上述问题，有必要建立一种磁微粒与抗原偶联的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种磁微粒与抗原偶联的方法，该方法可以防止磁微粒与抗原偶联时磁微粒之间发生团聚，提高磁微粒与抗原的偶联效率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种磁微粒与抗原偶联的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)抗原的前处理：取抗原溶液，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释，再加入Triton-X100混匀，备用；
(2)磁微粒的前处理：取磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后加入2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下混匀；
(3)磁微粒的活化：向步骤(2)中加入新配制的碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下混匀，控制活化时间，得到活化后的磁微粒混悬液；
(4)偶联抗原：取步骤(3)中活化后的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液，加入步骤(1)中备用的抗原溶液，室温下混匀，得到偶联有抗原的磁微粒溶液；
(5)偶联产物的洗涤：取步骤(4)中偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入洗涤液，室温下混匀；
(6)偶联产物的储存：取步骤(5)中经过洗涤液处理后偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入储存液，室温下混匀，2-8℃储存。
作为一种改进的技术方案，所述的抗原为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。
作为一种改进的技术方案，步骤(1)中所述Triton-X100的加入量为所述抗原溶液的0.1％-5.0％v/v，混匀温度为20-37℃，混匀时间为10-40min。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中所述磁微粒混悬液中的磁微粒为表面带有羧基的磁微粒，所述磁微粒的粒径为0.1-5um。
作为一种改进的技术方案，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中，所述2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为10-100mmoL/L，pH为4-6。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中所述碳二亚胺溶液的浓度为5-10mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为5-10mg/mL，且活化时加入的所述碳二亚胺溶液与所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的摩尔比为0.5-2。
作为一种改进的技术方案，步骤(4)中磁微粒混悬液和抗原溶液混匀的反应溶液中磁微粒和抗原的质量比为100:1-10:1，偶联时间为1-4h，温度为20-37℃。
作为一种改进的技术方案，步骤(5)中所述洗涤液为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液。
作为一种改进的技术方案，步骤(6)中所述储存液由BSA、酪蛋白和甘氨酸中与pH为7.4-8的Tris缓冲液配置而成，其中所述储存液中的BSA、酪蛋白、甘氨酸的质量浓度分别为0.01％-0.05％。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明通过在预偶联的抗原溶液中加入Triton-X100，增大了抗原分子在溶液中的分散性，减小抗原之间的自交联，降低偶联过程中磁微粒的聚集团聚，同时在与磁微粒偶联的过程中，Triton-X100也防止抗原分子在磁微粒表面形成层积效应，提高偶联效率，进一步提高了试剂盒的检测性能。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种磁微粒偶联弓形虫IgM抗原分子(Tox-IgM Ag)的方法，包括以下步骤：
(1)抗原的前处理：取1mg的弓形虫IgM抗原，用pH为4.5，浓度为10mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释到100uL，得到的抗原溶液中再加入抗原溶液体积浓度为2％的Triton-X100，37℃混匀30min备用；
(2)磁微粒的前处理：取1mL 10mg/mL的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后加入1mL的pH为4.5、浓度为10mmoL/L2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下涡旋10s后磁分离去除上清液，再加入1mL的pH为4.5、浓度为10mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下混匀；
(3)磁微粒的活化：向步骤(2)的磁微粒混悬液中加入100uL浓度为10mg/mL新配制的碳二亚胺和100uL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下混匀30min，得到活化的磁微粒混悬液；
(4)偶联抗原：取步骤(3)中活化后的磁微粒混悬液，经磁分离去除上清液，加入1mL的pH为4.5、浓度为10mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液2-吗啉乙磺酸缓冲液，混匀后加入100uL Triton-X100处理的弓形虫IgM抗原，室温下混匀3h，得到偶联有抗原的磁微粒溶液；
(5)偶联产物的洗涤：取步骤(4)中偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入1mL洗涤液(为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液)，磁分离去除上清液后加入1mL洗涤液(为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液)，室温下混匀30min；
(6)偶联产物的储存：取步骤(5)中经过洗涤液处理后偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入1mL储存液(由BSA、酪蛋白和甘氨酸中与pH为7.4-8的Tris缓冲液配置而成，其中储存液中的BSA、酪蛋白、甘氨酸的质量浓度分别为0.01％、0.03％和0.02％。)，磁分离上清液后加入1mL储存液，室温下混匀，2-8℃储存。
为了证明本发明偶联方法所得的偶联有抗原的磁微粒具有较高的偶联效果，将本发明方法中偶联有抗原的磁微粒作为试剂盒组分，进行测试。同时还建立了对比例，对比例中的试剂盒组分与本发明相同，唯一的不同在于偶联有抗原的磁微粒在偶联时抗原的前处理没有加入Triton-X100。
具体检测方法：50uL磁微粒偶联试剂+50uL弓形虫IgM抗体标准品(S0-S5的浓度分别为0AU/mL,2AU/mL,20AU/mL,100AU/mL,200AU/mL,2000AU/mL)+50uL酶标试剂(吖啶酯标记)，37℃温育30min，洗液(0.1M且pH8的含质量浓度0.1％BSA的Tris)洗3次+100uL预激发液(含1.32％w/v过氧化氢酸性溶液，购自雅培贸易(上海)有限公司)测试，测试结果如表1所示：
表1
通过表1实验结果可以发现，同一浓度点，当偶联有抗原的磁微粒在抗原前处理时加入Triton-X100与未加入Triton-X100相比较，抗原前处理时加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒没有团聚现象，而抗原前处理时未加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒出现团聚现象；并且抗原前处理时加入Triton-X100后与磁微粒偶联得到的磁微粒偶联试剂，将作为试剂盒组分在相同操作下测定的数值更高，说明抗原和磁微粒偶联效率更高。
实施例2
一种磁微粒偶联丙肝抗原分子(HCV Ag)的方法，具体包括以下步骤：
(1)抗原的前处理：取0.5mg的丙肝抗原，用pH为5.5，浓度为100mmoL/L2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释到100uL，得到的抗原溶液中再加入抗原溶液体积浓度为1％的Triton-X100，37℃混匀30min备用；
(2)磁微粒的前处理：取0.5mL 10mg/mL的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后加入1mL pH为5.5，浓度为100mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下涡旋10s后磁分离去除上清液，再加入1mL pH为5.5，浓度为100mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下混匀；
(3)磁微粒的活化：向步骤(2)的磁微粒混悬液中加入50uL 10mg/mL新配制的碳二亚胺和50uL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下混匀30min，得到活化后的磁微粒混悬液；
(4)偶联抗原：取步骤(3)中活化的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液，加入1mL pH为5.5，浓度为100mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，混匀后加入100uL步骤(1)中备用的抗原溶液，室温下混匀3h，得到偶联有抗原的磁微粒溶液；
(5)偶联产物的洗涤：取步骤(4)中偶联有抗原的磁微粒溶液，经过磁分离去除上清液后，加入1mL洗涤液(为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液)，磁分离去除上清液后加入1mL洗涤液，室温下混匀30min；
(6)偶联产物的储存：取步骤(5)中经洗涤液洗涤后的偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入1mL储存液(由BSA、酪蛋白和甘氨酸中与pH为7.4-8的Tris缓冲液配置而成，其中储存液中的BSA、酪蛋白、甘氨酸的质量浓度分别为0.02％、0.02％和0.02％。)，磁分离上清液后加入1mL储存液，室温下混匀，2-8℃储存。
为了证明本发明偶联方法所得的偶联有抗原的磁微粒具有较高的偶联效果，将本发明方法中偶联有抗原的磁微粒作为试剂盒组分，进行测试。同时还建立了对比例，对比例中的试剂盒组分与本发明相同，唯一的不同在于偶联有抗原的磁微粒在偶联时抗原的前处理没有加入Triton-X100。
具体检测方法：50uL磁微粒偶联试剂+50uL丙肝抗体标准品(S0-S5的浓度依次为：0,2,8,40,120,240AU/mL)+50uL酶标试剂(吖啶酯标记)，37℃温育30min，0.1M且pH8的含质量浓度0.1％BSA的Tris洗液洗3次+100uL预激发液(含1.32％w/v过氧化氢酸性溶液，购自雅培贸易(上海)有限公司)测试，测试结果如表2所示：
表2
通过表2实验结果可以发现，同一浓度点，当偶联有抗原的磁微粒在抗原前处理时加入Triton-X100与未加入Triton-X100相比较，抗原前处理时加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒没有团聚现象，而抗原前处理时未加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒出现团聚现象；并且抗原前处理时加入Triton-X100后与磁微粒偶联得到的磁微粒偶联试剂，将作为试剂盒组分在相同操作下测定的数值更高，说明抗原和磁微粒偶联效率更高。
实施例3
一种磁微粒偶联梅毒抗原分子(TP Ag)的方法，包括以下步骤：
(1)抗原的前处理：取0.5mg的梅毒抗原，用pH为5.0，浓度为50mmoL/L2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释到100uL，得到的抗原溶液中再加入抗原溶液体积浓度为0.5％的Triton-X100，37℃混匀30min备用；
(2)磁微粒的前处理：取0.5mL 20mg/mL的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后加入1mL pH为5.0，浓度为50mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下涡旋10s后磁分离上清液，再加入1mL pH为5.0，浓度为50mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下混匀；
(3)磁微粒的活化：向步骤(2)中加入100uL 10mg/mL新配制的碳二亚胺和100uL10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下混匀30min，得到活化的磁微粒混悬液；
(4)偶联抗原：取步骤(3)中活化的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液，加入1mL pH为5.0，浓度为50mmoL/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液，混匀后加入100uL步骤(1)中备用的抗原溶液，室温下混匀3h，得到偶联有抗原的磁微粒溶液；
(5)偶联产物的洗涤：取步骤(4)中偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入1mL洗涤液(为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液)，磁分离上清液后加入1mL洗涤液，室温下混匀30min；
(6)偶联产物的储存：取步骤(5)中经过洗涤液处理的偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入1mL储存液(由BSA、酪蛋白和甘氨酸中与pH为7.4-8的Tris缓冲液配置而成，其中储存液中的BSA、酪蛋白、甘氨酸的质量浓度分别为0.02％、0.02％和0.02％。)，磁分离上清液后加入1mL储存液，室温下混匀，2-8℃储存。
为了证明本发明偶联方法所得的偶联有抗原的磁微粒具有较高的偶联效果，将本发明方法中偶联有抗原的磁微粒作为试剂盒组分，进行测试。同时还建立了对比例，对比例中的试剂盒组分与本发明相同，唯一的不同在于偶联有抗原的磁微粒在偶联时抗原的前处理没有加入Triton-X100。
具体检测方法：50uL磁微粒偶联试剂+50uL梅毒抗体标准品(浓度依次为：0,10,50,200,1000,3000AU/mL)+50uL酶标试剂(吖啶酯标记)，37℃温育30min，0.1M且pH8的含质量浓度0.1％BSA的Tris洗液洗3次+100uL预激发液(含1.32％w/v过氧化氢酸性溶液，购自雅培贸易(上海)有限公司)测试，测试结果如表3所示：
表3
通过表3实验结果可以发现，同一浓度点，当偶联有抗原的磁微粒在抗原前处理时加入Triton-X100与未加入Triton-X100相比较，抗原前处理时加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒没有团聚现象，而抗原前处理时未加入Triton-X100，当抗原与磁微粒偶联时通过肉眼观察磁微粒出现团聚现象；并且抗原前处理时加入Triton-X100后与磁微粒偶联得到的磁微粒偶联试剂，将作为试剂盒组分在相同操作下测定的数值更高，说明抗原和磁微粒偶联效率更高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)抗原的前处理：取抗原溶液，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释，再加入Triton-X100混匀，备用；
(2)磁微粒的前处理：取磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后加入2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温下混匀；
(3)磁微粒的活化：向步骤(2)中加入新配制的碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下混匀，控制活化时间，得到活化后的磁微粒混悬液；
(4)偶联抗原：取步骤(3)中活化后的磁微粒混悬液，磁分离去除上清液后，加入2-吗啉乙磺酸缓冲液，加入步骤(1)中备用的抗原溶液，室温下混匀，得到偶联有抗原的磁微粒溶液；
(5)偶联产物的洗涤：取步骤(4)中偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入洗涤液，室温下混匀；
(6)偶联产物的储存：取步骤(5)中经过洗涤液处理后偶联有抗原的磁微粒溶液，磁分离去除上清液后，加入储存液，室温下混匀，2-8℃储存。
2.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：所述的抗原为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。
3.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(1)中所述Triton-X100的加入量为所述抗原溶液的0.1％-5.0％v/v，混匀温度为20-37℃，混匀时间为10-40min。
4.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(2)中所述磁微粒混悬液中的磁微粒为表面带有羧基的磁微粒，所述磁微粒的粒径为0.1-5um。
5.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中，所述2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为10-100mmoL/L，pH为4-6。
6.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(3)中所述碳二亚胺溶液的浓度为5-10mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为5-10mg/mL，且活化时加入的所述碳二亚胺溶液与所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的摩尔比为0.5-2。
7.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(4)中磁微粒混悬液和抗原溶液混匀的反应溶液中磁微粒和抗原的质量比为100:1-10:1，偶联时间为1-4h，温度为20-37℃。
8.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(5)中所述洗涤液为0.1M，pH为8含有0.1％v/v吐温-20的Tris溶液。
9.根据权利要求1所述的一种磁微粒与抗原偶联的方法，其特征在于：步骤(6)中所述储存液由BSA、酪蛋白和甘氨酸中与pH为7.4-8的Tris缓冲液配置而成，其中所述储存液中的BSA、酪蛋白、甘氨酸的质量浓度分别为0.01％-0.05％。
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