CN115166230A - 一种树状化合物用于提高磁微粒偶联蛋白效率的方法 - Google Patents

一种树状化合物用于提高磁微粒偶联蛋白效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，包括以下步骤：(1)树状化合物与蛋白混合反应，得蛋白‑树状化合物偶联物；(2)蛋白‑树状化合物偶联物与磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。本发明通过树状化合物作为载体，使标记蛋白通过化学键连接到磁微粒表面。与传统的磁微粒包被方法相比，本发明一方面可通过化学连接作用，减少因物理吸附而结合到磁微粒表面的蛋白数量；另一方面，树状化合物表面的官能团数量巨大，能结合更多的蛋白，在磁微粒偶联的过程中，起到级联放大的效果，大大的提高灵敏度。

Description

一种树状化合物用于提高磁微粒偶联蛋白效率的方法
技术领域
本发明涉及磁微粒化学发光免疫分析方法，具体地涉及一种树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法。
背景技术
目前，磁微粒化学发光平台方法已经广泛应用于体外诊断、食品安全等领域，该方法主要以磁微粒为固相载体，偶联蛋白或者核酸分子等对待检物进行检测。
常见的磁微粒表面多为羧基或者氨基官能团，其与蛋白的偶联工艺也多为碳二亚胺活化法以及戊二醛法，但是由于磁珠表面修饰分子的特性，仍有超过30％的蛋白分子是通过疏水作用和静电作用吸附于磁微粒表面。
通过物理吸附的蛋白-磁微粒复合物在液体保存液中不稳定，蛋白质极易从磁微粒表面脱落，造成检测信号值的降低，在产品方面会影响产品的稳定性，造成检测结果不准确。
针对这样的情况，很多厂家往往通过偶联后洗脱的方式，去除非化学偶联的蛋白质或者核酸分子，但是相应地，磁珠表面偶联的蛋白质减少，检测发光信号值降低，同时也降低了检测灵敏度。
也有其他的方法对磁微粒表面进行修饰改性，如磁微粒表面包裹SiO2，在对其进行修饰，可以减少物理吸附；还有通过PEG修饰表面微球，也能降低其表面吸附等。但是，这种比较专业的方式，对于体外诊断厂家而言，一方面操作过程比较复杂，体外诊断生产厂家，更侧重于应用，而缺少磁微粒表面修饰改性的人才，并且大部分厂家不愿意投入更多的财力研究这项课题；另一方面，市场上批量生产这些微球的厂家较少，并且磁微粒属于体外诊断厂家的核心原材料，厂家也不会轻易更改原料供应商。
因此，一种既能减少物理吸附，又不降低检测灵敏度的磁微粒蛋白或者核酸偶联工艺，亟待开发与应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，以树状化合物作为载体，使标记蛋白通过化学键连接到磁微粒表面，既能减少物理吸附，又不降低检测灵敏度。
本发明通过以下技术方案实现：一种树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，包括以下步骤：
(1)树状化合物与蛋白混合反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
本发明通过树状化合物作为载体，将抗原或抗体偶联到磁微粒表面。树状化合物是一类具有树枝状结构的大分子，一般由内核、分支单元和表面为羧基或氨基的官能团三部分组成。通过树状化合物作为载体，一方面，可通过化学连接作用，减少因物理吸附而结合到磁微粒表面的蛋白数量；另一方面，树状化合物表面的官能团数量巨大，能结合更多的蛋白，在磁微粒偶联的过程中，起到级联放大的效果，大大的提高灵敏度。
本发明所述树状化合物即树枝状聚酰胺胺(PAMAM)表面具有氨基官能团或羧基官能团，即分为氨基树状化合物或羧基树状化合物。其中，本发明中使用不同迭代数的PAMAM，氨基树状化合物包括CYD-120A(C142H288N58O28)、CYD-130A(C302H608N122O60)、CYD-140A(C622H1248N250O124)、CYD-150A(C1262H2528N506O252)，羧基树状化合物包括CYD-120C(C206H352N58O76)、CYD-130C(C430H736N122O156)、CYD-140C(C878H1504N250O316)。
不同类型的树状化合物，在本发明中的具体操作是有所区别的，具体地，羧基树状化合物在与蛋白偶联反应前，需经过交联剂处理；氨基树状化合物则可以直接与蛋白偶联反应。
1.羧基树状化合物
(1)取羧基树状化合物溶液与交联剂混合，震荡反应20-40分钟，然后与蛋白混合反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
作为一个实施例，所述羧基树状化合物溶液由羧基树状化合物与MES缓冲液配制，羧基树状化合物浓度为1mg/mL；所述交联剂采用pH 5.0,0.1M MES缓冲液溶解至浓度为10-70mg/mL，再与羧基树状化合物溶液混合，其中羧基树状化合物终浓度为1-10mg/mL。
所述交联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
本发明步骤(1)中，偶联蛋白与树状化合物的最终摩尔比为5:1-20:1。
2.氨基树状化合物
(1)将蛋白加入氨基树状化合物溶液，随后加入戊二醛，室温静置反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与经交联剂处理的磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
步骤(1)中，戊二醛、蛋白及氨基树状化合物摩尔比为3-10:3-8:1。
所述氨基树状化合物溶液由氨基树状化合物与MES缓冲液配制，氨基树状化合物浓度为1mg/mL。
步骤(2)中，所述交联剂采用pH 5.0,0.1M MES缓冲液溶解至浓度为10-70mg/mL，再与磁微粒混合，其中磁微粒终浓度为1-10mg/mL，室温震荡反应，之后用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清，MES缓冲液重悬磁微粒。
所述交联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
本发明中所述的蛋白包括抗体或抗原等。
本发明所述的封闭剂为含有封闭蛋白的缓冲液，所述的封闭蛋白可以是BSA、Casein、脱脂奶粉等。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明方法方便有效，通过树状化合物作为载体，使标记蛋白通过化学键连接到磁微粒表面。与传统的磁微粒包被方法相比，本发明一方面可通过化学连接作用，减少因物理吸附而结合到磁微粒表面的蛋白数量；另一方面，树状化合物表面的官能团数量巨大，能结合更多的蛋白，在磁微粒偶联的过程中，起到级联放大的效果，大大的提高灵敏度。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例一羧基表面官能团树状化合物偶联PCT抗体
1.树状化合物的稀释：用0.1M的MES(pH5.5)将树状化合物稀释至1mg/mL。
2.树状化合物的处理：用0.1M的MES(pH5.5)将EDC和NHS制备成50mg/mL的溶液。随后，加入稀释后的树状化合物溶液中，使其终浓度为1-10mg/mL，震荡反应30分钟。
3.树状化合物与蛋白的偶联：在处理后的树状化合物中加入PCT包被抗体，使PCT包被抗体与树状化合物按照最终摩尔比10:1的比例混合，室温震荡反应30分钟，得PCT包被抗体-树状化合物偶联物。
4.氨基微球的清洗：取200ul表面氨基的磁微粒放在玻璃瓶中，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2ml 0.02M PBS(pH 8.0)，重悬磁微粒，重复以上操作3次。
5.偶联后的树状化合物与磁微粒的结合：取PCT包被抗体-树状化合物偶联物加入到清洗后的磁微粒中，室温震荡反应2小时。PCT包被抗体-树状化合物偶联物的加入量按照PCT包被抗体的量计算，最终PCT包被抗体的量为0.5mg/mL。
6.反应结束后，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2ml 0.02MPBS(pH 8.0)，重悬磁微粒，重复以上操作3次。清洗后，加入1％BSA和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液(pH 8.0)，2～8℃保存。
实施例二氨基表面官能团树状化合物偶联PCT抗体
1.树状化合物的稀释：将树状化合物用0.02M PBS(pH 8.0)缓冲液稀释至1mg/mL。
2.树状化合物与抗原或抗体的偶联：将PCT包被抗体加入稀释后的树状化合物中，使PCT包被抗体与树状化合物按照最终摩尔比10:1的比例混合。随后加入戊二醛，使戊二醛的终浓度为0.2％。室温静置反应2小时，得PCT包被抗体-树状化合物偶联物。
3.磁微粒的预处理：取200ul表面含羧基的磁微粒放在玻璃瓶中，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2ml 0.02M PBS(pH 8.0)，重悬磁微粒，重复以上操作3次。将EDC和NHS分别溶解在0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中，浓度呈50mg/ml，然后各取1ml加入到磁微粒中；室温轻轻震荡反应30分钟。用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清；再加入2ml0.1M MES(pH 5.0)缓冲液，重悬磁微粒，重复以上操作2次。
4.PCT包被抗体-树状化合物偶联物与处理过的磁微粒的结合：将PCT包被抗体-树状化合物偶联物和处理过的磁微粒按照一定比例混合(PCT包被抗体-树状化合物偶联物与羧基磁微粒上羧基含量摩尔比为2-5:1)，室温震荡反应2小时。PCT包被抗体-树状化合物偶联物的加入量按照PCT包被抗体的量计算，最终PCT包被抗体的量为0.5mg/mL。
5.反应结束后，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2ml 0.02MPBS(pH 8.0)，重悬磁微粒，重复以上操作3次。清洗后，加入1％BSA和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液(pH 8.0)，2～8℃保存。
对比例PCT抗体偶联磁微粒
1.磁微粒的洗涤与活化：取200ul表面含羧基的磁微粒放在玻璃瓶中，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2ml 0.02M PBS(pH 8.0)，重复以上操作3次。将EDC和NHS分别溶解在0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中，浓度呈10～70mg/ml，然后各取1ml加入到磁微粒中；室温轻轻震荡反应30～60分钟；用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清；再加入2ml0.1M MES(pH 5.0)缓冲液，重悬磁微粒，重复以上操作2次。
2.PCT抗体的偶联：取PCT抗体加入到活化后的磁微粒中，PCT抗体的量为0.5mg，再加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液，至终体积1ml；室温轻轻震荡反应30分钟；用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清，用2ml 0.02M PBS(pH 8.0)洗涤3次；加入20ml含1％BSA和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液(pH 8.0)，2-8℃保存。
免疫检测方面，通过替换国外某厂家磁微粒化学发光试剂盒(双抗体夹心法)中磁微粒组分，使用科斯迈SMART 500S进行上机检测。免疫检测灵敏度结果如下表所示：
表1实施例及对比例的检测灵敏度对比
编号 S0 S1 S2 S3 QB1 QB2 QB3
样本浓度 0ng/mL 0.02ng/mL 0.05ng/mL 0.1ng/mL 0.8ng/mL 4.7ng/mL 8.2ng/mL
实施例一 0 0.03 0.05 0.09 0.81 4.76 8.28
实施例二 0 0.02 0.04 0.11 0.78 4.69 8.31
对比例 0 0 0.8 0.13 0.88 4.73 8.16
表2实施例一37℃热稳定性结果
编号 S0 S1 S2 S3 QB1 QB2 QB3
样本浓度 0ng/mL 0.02ng/mL 0.05ng/mL 0.1ng/mL 0.8ng/mL 4.7ng/mL 8.2ng/mL
3天 0 0.03 0.05 0.10 0.83 4.76 8.22
7天 0 0.02 0.04 0.11 0.81 4.62 8.19
10天 0 0.02 0.05 0.12 0.85 4.61 8.21
14天 0 0.02 0.05 0.09 0.79 4.62 8.16
21天 0 0.03 0.06 0.11 0.77 4.61 8.11
28天 0 0.02 0.04 0.08 0.73 4.60 8.02
表3实施例二37℃热稳定性结果
Figure BDA0003722233060000051
Figure BDA0003722233060000061
表4对比例37℃热稳定性结果
编号 S0 S1 S2 S3 QB1 QB2 QB3
样本浓度 0ng/mL 0.02ng/mL 0.05ng/mL 0.1ng/mL 0.8ng/mL 4.7ng/mL 8.2ng/mL
3天 0 0 0.05 0.13 0.85 4.81 8.21
7天 0 0 0.06 0.10 0.79 4.68 8.19
10天 0 0 0.05 0.11 0.77 4.66 7.91
14天 0 0 0.04 0.09 0.72 4.53 7.86
21天 0 0 0.03 0.08 0.69 4.17 7.11
28天 0 0 0.02 0.06 0.61 3.85 6.06
由表1的结果可见，本发明的实施例一和实施例二树状化合物作为载体，使标记蛋白通过化学键连接到磁微粒表面，其检测限值可达到0.02ng/mL，而且结果偏差小，准确度高。对比例的检出限在0.1ng/mL，而且在样本浓度0.8ng/mL时，还出现较大的偏差，在样本浓度低于0.1ng/mL时，检测结果会出现较大误差，导致检测结果不准确。
表2-4的结果显示，本发明的实施例一和实施例二制备的样本稳定性高，28天后蛋白未出现有明显脱落情况，对检测发光信号值影响低。而对比例28天后蛋白出现明显脱落，且随着样本浓度增高，蛋白脱落越明显。
综上，本发明通过树状化合物作为载体偶联的磁微粒，其灵敏度和稳定性均有较大的提升。本发明的操作易于实现，适合大规模推广。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)树状化合物与蛋白混合反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
2.根据权利要求1所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述树状化合物为氨基树状化合物或羧基树状化合物。
3.根据权利要求1所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述树状化合物为羧基树状化合物，其操作步骤如下：
(1)取羧基树状化合物溶液与交联剂混合，震荡反应20-40分钟，然后与蛋白混合反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
4.根据权利要求3所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述羧基树状化合物溶液由羧基树状化合物与MES缓冲液配制，所述羧基树状化合物浓度为1mg/mL；所述交联剂采用pH 5.0,0.1M MES缓冲液溶解至浓度为10-70mg/mL，再与羧基树状化合物溶液混合，其中羧基树状化合物终浓度为1-10mg/mL。
5.根据权利要求4所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述交联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
6.根据权利要求3所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述蛋白与树状化合物的最终摩尔比为5:1-20:1。
7.根据权利要求1所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述树状化合物为氨基树状化合物，其操作步骤如下：
(1)将戊二醛和蛋白混合，随后加入氨基树状化合物溶液，室温静置反应，得蛋白-树状化合物偶联物；
(2)蛋白-树状化合物偶联物与经交联剂处理的磁微粒混合反应，反应结束后用磁铁将磁微粒吸附在底部，出去上清，加缓冲液重悬，之后加封闭剂封闭，即得。
8.根据权利要求4所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述步骤(1)中，戊二醛、蛋白及氨基树状化合物摩尔比为3-10:3-8:1；所述氨基树状化合物溶液由氨基树状化合物与MES缓冲液配制，氨基树状化合物浓度为1mg/mL。
9.根据权利要求8所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，步骤(2)中，所述交联剂采用pH 5.0,0.1M MES缓冲液溶解至浓度为10-70mg/mL，再与磁微粒混合，其中磁微粒终浓度为1-10mg/mL，室温震荡反应，之后用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清，MES缓冲液重悬磁微粒。
10.根据权利要求4所述的树状化合物用于提高磁微粒包被效率的方法，其特征是，所述交联剂包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
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