CN112592473B - 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用 - Google Patents

一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112592473B
CN112592473B CN202011216660.5A CN202011216660A CN112592473B CN 112592473 B CN112592473 B CN 112592473B CN 202011216660 A CN202011216660 A CN 202011216660A CN 112592473 B CN112592473 B CN 112592473B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
enrofloxacin
antibody
enr
coupling
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011216660.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112592473A (zh
Inventor
隋建新
韩香凝
王略丰
曹立民
林洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean University of China
Original Assignee
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean University of China filed Critical Ocean University of China
Priority to CN202011216660.5A priority Critical patent/CN112592473B/zh
Publication of CN112592473A publication Critical patent/CN112592473A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112592473B publication Critical patent/CN112592473B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C08G73/0213—Preparatory process
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及分离纯化及检测技术领域，公开了一种支化聚乙烯亚胺‑恩诺沙星的合成方法及其应用，本发明利用支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基量，通过EDC/NHS反应，将恩诺沙星连接到支化聚乙烯亚胺上，可根据不同偶联比该复合物分别应用于特异性抗体纯化以及作为包被抗原用于ELISA检测中。本发明方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度可提高10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。

Description

一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及分离纯化及检测技术领域，尤其涉及一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用。
背景技术
小分子危害物，例如农兽药残留等，是目前影响食品安全的重要因素，引起了广泛的关注和重视。欧盟和中国等很多国家，针对目前小分子药物的应用现状制订了更为严格的限量标准，甚至很多危害物质要求不能检出。因此，亟需建立快速、简单、高通量、低成本的筛查食品中农兽药残留等危害物质的检测技术。
目前，ELISA免疫检测具有操作简单、灵敏度高、选择性强等特点，被广泛应用于农药和兽药残留的高通量分析和筛查。但是，ELISA检测中存在的多种问题，显著制约了其发展。尤其是多克隆抗体，在检测过程中，出现的假阳性，假阴性，高效价无竞争的情况，及检测灵敏度低等情况，是制约其发展的关键因素。而影响检测灵敏度的两大关键因素为抗体的质量以及ELISA的包被抗原有无非特异性结合。
在多克隆抗体中，特异性抗体的比例仅在10%-20%之间，其余大量的非特异性抗体严重影响检测的灵敏度。而能否排除非特异性抗体的影响成为检测成功的关键。
在目前的ELISA检测中，主流的包被抗原依然是采用BSA或者OVA作为载体，连接小分子物质，制备包被抗原，在偶联过程中，由于蛋白在DMF中易变性，偶联效率较低，最终产物得率较低，同时偶联比难以控制，且高纯度蛋白载体价格较为昂贵，其对于蛋白载体来讲，抗体对于载体蛋白的非特异性结合，是引起ELISA检测结果不稳定，灵敏度低，竞争有效价无有效竞争的关键原因。
此外，在抗体纯化的过程中，由于特异性抗体属于痕量水平，很难从复杂的血清基质中获得，现有的大多数纯化抗体的方法只能区分抗体成分和非抗体成分，无法区分非特异性抗体和特异性抗体。
因此，亟需开发一种新型的载体材料，具有性质稳定，价格低廉，容易合成加工，可以用于纯化抗体和免疫检测中，获得高质量抗体，同时提高检测灵敏度及准确率，对于小分子危害物的检测至关重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用，本发明方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好；且偶联比可控，可通过调整小分子恩诺沙星的偶联比分情况用于特异性抗体纯化以及替代蛋白作为ELISA检测的包被抗原ELISA检测中。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度提高了10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星。
作为优选，所述合成方法包括以下步骤：
1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在NaOH水溶液和DMF的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星。
2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应。
3）透析：将步骤2）所得偶联产物在水中透析处理以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。
本发明合成方法的原理是利用支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基量，通过EDC/NHS反应，将小分子恩诺沙星连接到支化聚乙烯亚胺分子上。支化聚乙烯亚胺是一种富含氨基的大分子材料，其来源广泛，价格便宜，易于购买，且易溶于水，化学性质稳定，且在有机溶剂合成的过程中，PEI能够保持性质的稳定，不易变性，其合成的ENR-PEI依然具有很稳定的性质，同时有助于增加不易溶于水药物的水溶性。本发明合成方法过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零。
此外，支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基数目使得偶联反应很容易进行，且容易通过控制ENR的添加量控制偶联比，以分别满足特异性性抗体纯化和ELISA反应的需求。
作为优选，步骤1）中：NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%，NaOH水溶液的和DMF体积比为1:（3-5）。
作为优选，步骤1）中：恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL。
作为优选，步骤1）中：活化反应条件为：在15-25℃下，摇床80-110 r/min振荡20-30h。
作为优选，步骤2）中：所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为4-6mg/mL。
作为优选，步骤2）中：偶联反应条件为1-6℃，反应时间10-15 h。
作为优选，步骤2）中：透析条件为：1-6℃，2-4天。
第二方面，本发明提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为45-55）在特异性抗体纯化中的用途：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI连接到溴化氢活化的琼脂糖凝胶上，制备抗体纯化柱，对多克隆抗体进行纯化，获得特异性抗体。
在极高的偶联比情况下，ENR-PEI可作为纯化特异性抗体的配基，可有效提高痕量抗体的结合效率，去除非特异性抗体，获得高纯度的特异性抗体。（注：实时实例中纯化抗体的竞争IC50值可直接证明，非特异性抗体被去除，保留了高纯度特异性抗体。
如本申请背景技术部分所述，在现有技术的抗体纯化过程中，由于特异性抗体属于痕量水平，很难从复杂的血清基质中获得，现有的大多数纯化抗体的方法只能区分抗体成分和非抗体成分，无法区分非特异性抗体和特异性抗体。本发明ENR-PEI可有效分离特异性抗体和特异性抗体，其原因在于本发明采用抗原亲和纯化的原理，为获得高纯度的特异性抗体，高密度的抗原是必须的，因为复杂基质中的特异性抗体是极其痕量的，PEI上丰富的游离氨基为高密度抗原的偶联创造了条件。
而当利用此复合物作为包被抗原时，相对于蛋白包被原来讲，蛋白的结构更为复杂，且蛋白之间存在的复杂相互作用导致的抗体和载体蛋白产生非特异性结合，引起假阳性的结果，严重影响免疫检测，而超支化聚乙烯亚胺是一种简单的线性结构，使得抗原容易暴露，且该材料没有免疫原性，抗体不会与载体产生非特异性结合，因此非特异性抗体不会影响检测（如图3）。
作为优选，上述用途包括如下步骤：
a）将溴化氢活化的琼脂糖凝胶在HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A将ENR-PEI与溴化氢活化的琼脂糖凝胶偶联，未结合的ENR-PEI 通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱。
b）血清采用偶联缓冲液B稀释，加到柱床，并用洗杂液A和洗杂液B洗涤杂蛋白，用Gly-HCl洗脱特异性抗体。
作为优选，步骤a）中：所述溴化氢活化的琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）。
作为优选，步骤a）中：偶联反应条件为：室温，10-20 r/min，4-8 h。
作为优选，步骤a）中：所述HCl溶液的浓度为0.8-1.2 mmol/L；所述偶联缓冲液A的pH=7.0-7.5；所述Tris-HCl溶液的pH=7.8-8.2。
作为优选，步骤b）中：所述偶联缓冲液B的pH=6.8-7.2，稀释倍数为8-12倍。
作为优选，步骤b）中：所述洗杂液A的pH=3.8-4.2；洗杂液B的pH=7.8-8.2；所述Gly-HCl的pH=2.3-2.7。
第二方面，本发明提供了支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为7-10）在竞争ELISA检测中作为包被抗原的用途。
在较低的偶联比下，ENR-PEI可作为包被抗原应用于ELISA检测中。现有技术中常用的包被抗原为大分子结构的蛋白，其复杂的三级结构易受各种条件的影响，尤其是当其与聚苯乙烯酶标板进行结合时，其结构易发生变化，导致小分子抗原被包裹，引起不稳定的ELISA结果。而支化聚乙烯亚胺的树枝状结构易于将小分子抗原暴露，增大小分子和抗体的结合，提高抗原和抗体的特异性结合，在偶联上小分子药物后，可显著降低非特异性结合反应的发生，显著提高检测灵敏度。
作为优选，上述用途包括以下步骤：
A）将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为水溶液后作为包被抗原溶液。
B）将恩诺沙星溶解于NaOH水溶液中作为储备液，分别用PBS梯度稀释为多个梯度浓度。
C）将包被抗原溶液加入到96孔板中，包被过夜。
D）用PBST洗板，采用脱脂奶粉溶液封闭，用PBST洗板；将梯度稀释的恩诺沙星溶液与等体积的抗体混合，并采用稀释抗体作为阳性对照；加入到包被孔中，孵育；
E）用PBST洗涤后，加入山羊抗兔IgG/HRP抗体孵育。
F）洗板后，加入TMB单组分显色液，孵育后，立即添加硫酸终止液终止反应，读取吸光值。
作为优选，步骤A）具体为：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为0.8-1.2mg/mL的水溶液，将其用PBS稀释至8-12 μg/mL作为包被抗原溶液。
作为优选，步骤B）中：所述的NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%；各梯度稀释浓度为2 ppm，1 ppm，400 ppb，200 ppb，100 ppb，40ppb，10 ppb。
作为优选，步骤C）中：包被抗原溶液的加入量为90-110 µL，包被温度为1-5℃。
作为优选，步骤D）中：脱脂奶粉溶液的浓度为3-7wt%，封闭温度为30-40℃，封闭时间为1-3h；所述等体积的抗体的稀释倍数为2000-3000倍，作为阳性对照的所述稀释抗体的稀释倍数为4000-6000倍；孵育温度为30-40°C，孵育时间为1-2h。
作为优选，步骤E）中，所述山羊抗兔IgG/HRP抗体的稀释倍数为4000-5000倍，加入量为90-110μL，孵育时间为0.5-1.5h。
作为优选，步骤F）中，TMB单组分显色液的加入量为90-110 µL，孵育温度为30-40°C，孵育时间为3-7min，添加40-60 µL、1.5-2.5 mol/L的硫酸终止液终止反应，用酶标仪在440-460 nm处读取吸光值。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）本发明利合成的ENR-PEI具有稳定的性质，且有助于增加不易溶于水药物的水溶性。本发明合成方法过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零。
（2）在极高的偶联比情况下，ENR-PEI可作为纯化特异性抗体的配基，可有效提高痕量抗体的结合效率，去除非特异性抗体，获得高纯度的特异性抗体。
（3）在较低的偶联比下，ENR-PEI可作为包被抗原应用于ELISA检测中。PEI的结构简单，在偶联上小分子药物后，可显著降低非特异性结合反应的发生，提高抗原和抗体的特异性结合，显著提高检测灵敏度。
附图说明
图1为ENR-PEI的合成示意图（（1）-（2）为ENR的活化过程；（3）-（4）为ENR-PEI的偶联合成过程）。
图2为ENR，PEI及ENR-PEI的紫外图谱。
图3为用ENR-PEI作为包被原及其不产生非特异性的原理图。
图4用ENR-PEI纯化抗体的步骤示意图。
图5采用ENR-PEI作为包被原的竞争抑制曲线图（IC50=51 ng/mL，注：在血清用蛋白作为包被原的情况下，未展示出任何抑制效果，此处未提供数据）。
图6为蛋白A柱纯化抗体及ENR-PEI纯化抗体的效果比较图（A为蛋白A柱纯化抗体的竞争效果。B 为ENR-PEI作为纯化柱纯化抗体竞争效果）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
（一）支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，如图1所示，利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，具体包括以下步骤：
1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星，NHS和EDC溶解在体积比为1:（3-5）的0.01-0.05wt%的NaOH水溶液和DMF的混合液中，在15-25℃下，摇床80-110 r/min振荡20-30h活化反应，得到活化的恩诺沙星。其中恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL。
2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到4-6mg/mL的支化聚乙烯亚胺（Mw=20000-30000）水溶液中，将所得混合溶液，1-6℃下偶联反应10-15 h。
3）透析：将步骤2）所得偶联产物在1-6℃水中透析处理2-4天以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。
（二）支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为45-55）在特异性抗体纯化中的用途：包括如下步骤：
a）将溴化氢活化的琼脂糖凝胶在0.8-1.2 mmol/L 的HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A（pH=7.0-7.5）将ENR-PEI与溴化氢活化的琼脂糖凝胶在室温、10-20 r/min、偶联4-8 h（琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）），未结合的ENR-PEI 通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液（pH=7.8-8.2）封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱。
b）血清采用偶联缓冲液B（pH=6.8-7.2）稀释8-12倍，加到柱床，并用洗杂液A（pH=3.8-4.2）和洗杂液B（pH=7.8-8.2）洗涤杂蛋白，用Gly-HCl（pH=2.3-2.7）洗脱特异性抗体。
（三）支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为7-10）在竞争ELISA检测中作为包被抗原的用途，包括以下步骤：
A）将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为0.8-1.2mg/mL的水溶液，将其用PBS稀释至8-12 μg/mL作为包被抗原溶液。
B）将恩诺沙星溶解于0.01-0.05wt%的NaOH水溶液中作为储备液，分别用PBS梯度稀释为多个梯度浓度（2 ppm，1 ppm，400 ppb，200 ppb，100 ppb，40ppb，10 ppb）。
C）将90-110 µL包被抗原溶液加入到96孔板中，1-5℃包被过夜。
D）用PBST洗板，采用3-7wt%脱脂奶粉溶液30-40℃封闭1-3h，用PBST洗板；将梯度稀释的恩诺沙星溶液与等体积的抗体（稀释倍数为2000-3000）混合，并采用稀释抗体作为阳性对照（稀释倍数为4000-6000）；加入到包被孔中，30-40°C孵育1-2h。
E）用PBST洗涤后，加入90-110μL山羊抗兔IgG/HRP抗体（稀释倍数为4000-5000）孵育0.5-1.5h。
F）洗板后，加入90-110 µL 的TMB单组分显色液，30-40°C孵育3-7min后，立即添加40-60 µL、1.5-2.5 mol/L的硫酸终止液终止反应，用酶标仪在440-460 nm处读取吸光值。
实施例1：ENR-PEI合成及用于特异性抗体纯化
（1）ENR-PEI的合成：支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星（偶联比为45-55）的合成方法，如图1所示，利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，具体包括以下步骤：恩诺沙星的活化：将97.2mg（0.27 mmol）的恩诺沙星，93.6 mg的NHS和167.4 mg的EDC溶解在4mL的0.03 wt%的NaOH水溶液和16 mLDMF的混合液中，在20℃下，摇床80-110 r/min振荡24 h活化反应，得到活化的恩诺沙星。将过量的活化的恩诺沙星加入到25mg (5mL)的支化聚乙烯亚胺（Mw=25000）水溶液中，将所得混合溶液，4℃下偶联反应12 h。透析：将所得偶联产物在4℃水中透析处理3天以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即高偶联比的ENR-PEI。
图2中分别为ENR，PEI及ENR-PEI的紫外图谱。
（2）将0.25 g溴化氢活化的琼脂糖凝胶在1 mmol/L的HCl中分散活化，利用pH 7.4的偶联缓冲液（0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl）将6 mg ENR-PEI在室温15 r / min条件下偶联6 h，未结合的ENR-PEI 通过偶联缓冲液洗涤掉，用pH 8.0的 0.1 M Tris-HCl 封闭未反应的位点（过夜），洗掉Tris-HCl 溶液并用30 mL PBS溶液洗涤，贮存在4 ℃备用，所得产物用于制备抗体纯化柱。
（3）如图4所示为抗体纯化过程示意图，血清采用pH 7.0 的偶联缓冲液（0.1 MNaHCO3，0.5 M NaCl）稀释10倍，取4 mL 加到柱床，并用pH 4.0 的洗杂液（0.1 M NaAc-HAc，0.5 M NaCl）以及pH 8.0 的洗杂液（0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl）洗涤，用pH 2.5 的 0.1M Gly-HCl 洗脱特异性抗体。
（4）同时用蛋白A柱纯化抗体，用竞争ELISA检测灵敏度，比较IC50值的差异。
如图6所示，经纯化后，IC50值为47.58 ng/mL, 与普通的蛋白A柱纯化的抗体相比（867.31 ng/mL），其灵敏度提高了18倍左右，满足恩诺沙星检测的限量要求。
实施例2：ENR-PEI的合成并应用于ELISA检测
（1）ENR-PEI（偶联比为7-10）的合成：将10.8 mg（0.03 mmol）的ENR，10.4 mg的NHS和18.6 mg的EDC溶解在1 mL 0.03wt％NaOH水溶液和4 mL DMF中，在20℃条件下，摇床95r/min振荡24 h活化恩诺沙星。将25 mg支化PEI（Mw=25000）溶解在5 mL超纯水中，然后，将活化的ENR加入到PEI溶液中。将混合溶液在4°C下振荡偶联12 h，然后在4°C超纯水中彻底透析72 h。将复合物冻干处理，保存在-20 ℃条件下备用。
（2）将ENR-PEI用作新型包被抗原，建立竞争ELISA检测方法：将ENR-PEI配成1mg/mL溶液备用，将其用PBS稀释至10 μg/mL作为包被抗原溶液。将ENR溶解在0.03％NaOH（1mg/mL）中作为储备液备用，用PBS梯度稀释至2 ppm，1 ppm，400 ppb，200 ppb，100 ppb，40ppb，10 ppb。将100 µL ENR-PEI溶液加入到96孔板中，4℃包被过夜。用PBST洗板三次。采用5wt%的脱脂奶粉37℃下封闭2h，用PBST洗板三次。将梯度稀释的ENR溶液与等体积的抗体（1/2500）混合，并采用稀释抗体（1/5000）作为阳性对照。加入到ENR-PEI包被孔，37°C下孵育1.5小时。用PBST洗涤三次后，加入100 μL山羊抗兔IgG/HRP抗体（1/4500）孵育1h。洗板三次。然后，加入100 µL TMB单组分显色液，并在37°C下孵育5分钟，立即通过添加50 µL 2mol/L硫酸终止液终止反应。用酶标仪在450 nm处读取吸光值。
（3）常规ELISA包被抗原及检测方法的建立：采用ENR-cBSA作为包被原（免疫原为ENR-cOVA)，其浓度为15 µg/mL, 其他过程同用ENR-PEI作为包被原的过程，根据下述公式求出ELISA竞争抑制率：
B/B0(%)= A/A0*100%
其中A为在竞争抗原存在的条件下，产生的吸光值，而A0为在没有竞争抗原存在的情况下，产生的吸光值。采用四参数拟合方法，根据回归方程计算出IC50和IC10的值，以IC10作为方法的检测下限。比较两种包被抗原的检测灵敏度。在我们采用BSA偶联恩诺沙星的完全抗原作为包被原的情况下，血清未表现出任何的抑制，在较高药物浓度时(10ppm)，未能计算出IC50值，这可能因为非特异性抗体与载体蛋白具有较强的结合，而小分子药物竞争不掉，而当采用ENR-PEI作为包被原时，竞争结果如图5所示，能达到IC50 约为60 ng/mL，灵敏度具有显著提高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在0.01-0.05wt%的NaOH水溶液和DMF体积比为1:（3-5）的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星；
2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应；
3）透析：将步骤2）所得偶联产物在水中透析处理以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
步骤1）中：
恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL；
活化反应条件为：在15-25℃下，摇床80-110 r/min振荡20-30h；
步骤2）中：
所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为4-6mg/mL；
偶联反应条件为1-6℃，反应时间10-15 h；
步骤3）中：透析条件为：1-6℃，2-4天。
3.一种以权利要求1或2所述合成方法所得的支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星在特异性抗体纯化中的用途，其特征在于，所述支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的偶联比为45-55。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI连接到溴化氰活化的琼脂糖凝胶上，制备抗体纯化柱，对多克隆抗体进行纯化，获得特异性抗体。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于包括如下步骤：
a）将溴化氰活化的琼脂糖凝胶在HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A将ENR-PEI与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，未结合的ENR-PEI 通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱；
b）血清采用偶联缓冲液B稀释，加到柱床，并用洗杂液A和洗杂液B洗涤杂蛋白，用Gly-HCl洗脱特异性抗体。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：
步骤a）中：
所述溴化氰活化的琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）；
偶联反应条件为：室温，10-20 r/min，4-8 h；
所述HCl溶液的浓度为0.8-1.2 mmol/L；所述偶联缓冲液A的pH=7.0-7.5；所述Tris-HCl溶液的pH=7.8-8.2；
步骤b）中：
所述偶联缓冲液B的pH=6.8-7.2，稀释倍数为8-12倍；
所述洗杂液A的pH=3.8-4.2；洗杂液B的pH=7.8-8.2；所述Gly-HCl的pH=2.3-2.7。
7.一种以权利要求1或2所述合成方法所得的支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星在竞争ELISA检测中作为包被抗原的用途，其特征在于，所述支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的偶联比为7-10。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于包括以下步骤：
A）将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为水溶液后作为包被抗原溶液；
B）将恩诺沙星溶解于NaOH水溶液中作为储备液，分别用PBS梯度稀释为多个梯度浓度；
C）将包被抗原溶液加入到96孔板中，包被过夜；
D）用PBST洗板，采用脱脂奶粉溶液封闭，用PBST洗板；将梯度稀释的恩诺沙星溶液与等体积的抗体混合，并采用稀释抗体作为阳性对照；加入到包被孔中，孵育；
E）用PBST洗涤后，加入山羊抗兔IgG/HRP抗体孵育；
F）洗板后，加入TMB单组分显色液，孵育后，立即添加硫酸终止液终止反应，读取吸光值。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：
步骤A）具体为：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为0.8-1.2mg/mL的水溶液，将其用PBS稀释至8-12 μg/mL作为包被抗原溶液；和/或
步骤B）中：所述的NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%；各梯度稀释浓度为2 ppm，1ppm，400 ppb，200 ppb，100 ppb，40ppb，10 ppb；和/或
步骤C）中：包被抗原溶液的加入量为90-110 µL，包被温度为1-5℃；和/或
步骤D）中：脱脂奶粉溶液的浓度为3-7wt%，封闭温度为30-40℃，封闭时间为1-3h；所述等体积的抗体的稀释倍数为2000-3000倍，作为阳性对照的所述稀释抗体的稀释倍数为4000-6000倍；孵育温度为30-40°C，孵育时间为1-2h；和/或
步骤E）中，所述山羊抗兔IgG/HRP抗体的稀释倍数为4000-5000倍，加入量为90-110μL，孵育时间为0.5-1.5h；和/或
步骤F）中，TMB单组分显色液的加入量为90-110 µL，孵育温度为30-40°C，孵育时间为3-7min，添加40-60 µL、1.5-2.5 mol/L的硫酸终止液终止反应，用酶标仪在440-460 nm处读取吸光值。
CN202011216660.5A 2020-11-04 2020-11-04 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用 Active CN112592473B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011216660.5A CN112592473B (zh) 2020-11-04 2020-11-04 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011216660.5A CN112592473B (zh) 2020-11-04 2020-11-04 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112592473A CN112592473A (zh) 2021-04-02
CN112592473B true CN112592473B (zh) 2022-04-05

Family

ID=75180598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011216660.5A Active CN112592473B (zh) 2020-11-04 2020-11-04 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112592473B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7964415B2 (en) * 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
CN107805279A (zh) * 2017-11-13 2018-03-16 广东医科大学 一种atf1蛋白的磷酸化抗原多肽、应激磷酸化抗体的制备方法及应用
CN110261451B (zh) * 2019-05-28 2021-11-16 广州钰芯传感科技有限公司 一种针对农药蝇毒磷分子识别的二茂铁标记的半抗原-聚乙烯亚胺结合物的制备方法与应用
CN110327982B (zh) * 2019-07-03 2020-05-12 燕山大学 一种以pei-环丙沙星胶束为模板的钯纳米粒子及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112592473A (zh) 2021-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108700584B (zh) 标记复合物及其制备方法、试剂盒、应用和检测系统
Sai et al. A sensitive immunoassay based on direct hapten coated format and biotin–streptavidin system for the detection of chloramphenicol
CA2096495C (en) Dual analyte immunoassay
Novak et al. Intra-molecular cross-linking of acidic residues for protein structure studies
WO2011129357A1 (ja) 標識化プローブ－水溶性担体複合体
CN106053443A (zh) 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒
CN109521192B (zh) 一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法
CN109734745B (zh) 一种杀螟硫磷的抗体的制备方法和应用
CN106146672B (zh) 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒
AU2011252747B2 (en) Binding systems
CN112592473B (zh) 一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用
EP4379377A1 (en) Magnetic bead coating, preparation method therefor, and test kit
WO2018006268A1 (zh) 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒
CN112285345A (zh) 甘胆酸检测试剂盒
CN106124777A (zh) 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒
EP2457916A1 (en) Compound for the covalent attachment of the chemiluminescent probe N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (ABEI) to target molecules and uses thereof
CN111320697A (zh) 一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgG@ZIF-L及其制备方法和应用
CN109932350A (zh) 荧光分子、其制备方法和应用、免疫凝聚试剂盒、其制备方法以及检测抗原的方法
CN112051404B (zh) 一种肌红蛋白检测试剂盒及其应用
CN109061187A (zh) 一种基于功能化纳米二氧化硅的临床药物分析方法
CN110672836B (zh) 磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒
WO2018006264A1 (zh) 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光试剂盒
JPS59176675A (ja) 酵素免疫測定用試薬
CN112540175A (zh) 一种新型冠状病毒IgM检测试剂盒及其制备方法与应用
CN112326971A (zh) 一种用于nmdar抗体定量检测的新方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant