CN112285345A - 甘胆酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种甘胆酸检测试剂盒，其包含第一试剂、第二试剂以及任选的甘胆酸校准品或质控品。第一试剂包含甘胆酸的特异性抗体，第二试剂包含甘胆酸‑蛋白偶联物包被的胶乳颗粒。本申请提供的检测试剂灵敏度高、特异性强。
Description
技术领域
本申请涉及临床检验、生物学领域。更具体地，涉及一种检测样本中甘胆酸含量的方法及其试剂盒。
背景技术
血清甘胆酸(Cholyglycine，CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一。在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸，其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)。胆酸与甘氨酸结合即形成甘胆酸。
CG正常代谢途径为肠肝循环。CG由肝细胞合成后，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95％胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血液(如血清)中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1％。
在正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论是空腹还是餐后，其血清CG浓度稳定在低水平。当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。测定血清甘胆酸(SCG)是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
甘胆酸是胆汁酸代谢中胆酸的主要形式之一，然而胆酸代谢过程中的多种产物(如胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸)之间均具有极为相似的结构特征。因此，要求检测试剂具有高度特异性，无交叉反应性或具有极低的交叉反应性。
最早应用于甘胆酸检测的方法学为放射免疫法，但是该方法学需要有放射设施、存在放射性污染、试剂半衰期短、临床实验室难以便利开展等缺点。随后，出现了酶联免疫吸附法(ELISA)方法来进行甘胆酸的测定，但是检测时间长、操作复杂、重复性差、很难在短时间内完成大量临床样本的测定工作，因此不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
新近出现的一种基于EMIT的甘胆酸检测方法(CN103760348A)，是一种均相免疫检测方法，可以在全自动生化仪上进行血清甘胆酸含量的高通量检测。由于EMIT为酶学方法，该方法学的试剂存在热稳定性差的缺点。
专利申请CN104459113A、CN102998445A、CN102955033A、CN106841596A、CN102944673A、CN103940816A、CN105301255A中公开了胶乳免疫比浊法的甘胆酸检测试剂，其中涉及到将抗体包被于胶乳颗粒表面。在包被过程中通常存在抗体损失而直接导致试剂生产成本的上升；同时也很难兼顾到较高的灵敏度和较宽线性的要求。
发明内容
根据本申请的一些实施方案，提供了一种测定甘胆酸的试剂，其包含：第一试剂和第二试剂；
其中，
第一试剂包含甘胆酸抗体、反应促进剂、缓冲液，
第二试剂包含包被有甘胆酸-载体蛋白偶联物的胶乳颗粒和缓冲液。
在一个具体的实施方案中，第一试剂不包含选自以下的任一种：Triton X-100、TritonX-405、Tween 80、Tween 20、Brij 35。
在一个具体的实施方案中，第二试剂不包含选自以下的任一种：Triton X-100、TritonX-405、Tween 80、Tween 20、Brij 35。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液选自：磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1-乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲氨基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合物。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液的浓度为10mM至500mM；10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM±10％。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液的pH是7±10％至8.5±10％(范围内的任意整数或小数)。例如但不限于，7±10％、7.5±10％、8±10％、8.5±10％。
在具体实施方案中，第一试剂和第二试剂中缓冲液的浓度相同或不同。
在具体实施方案中，第一试剂和第二试剂中缓冲液的pH相同或不同。
在具体实施方案中，第一试剂和第二试剂中缓冲液的种类相同或不同。
在具体实施方案中，第一试剂和第二试剂中缓冲液的浓度是50±10％或100±10％mM。
在一些优选实施方案中，第一试剂和第二试剂中缓冲液类型不同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度相同。
在一个具体的实施方案中，第一试剂的缓冲液是50mM MES缓冲液；第二试剂的缓冲液是50mM甘氨酸缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素的改变缓冲液的pH值可以有所不同。
在一些实施方案中，所述甘胆酸抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；抗体源自动物或人工重组的抗体，例如兔、羊、鸡、骆驼、小鼠、大鼠。例如，单克隆抗体源自鼠、兔或羊。本申请中，如无相反教导，术语“抗体”涵盖其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述甘胆酸-载体蛋白为甘胆酸-牛血清白蛋白偶联物。
在一些实施方案中，所述颗粒是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒，颗粒平均直径在100-500nm之间(例如200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、350、360、370、380、390、400nm)。在一个具体实施方案中所述颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒，颗粒平均直径为220nm。
在一些实施方案中，所述颗粒表面修饰有氨基、巯基、羧基、酰肼、醛基或环氧基。
根据需要，根据本申请的甘胆酸测定试剂盒还包括校准品，校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的甘胆酸，校准品的值可以追溯到本领域公知的或商售的标准品。
在一些实施方案中，甘胆酸测定试剂盒还包括校准品，所述校准品包含已知浓度的甘胆酸，如2.50mg/L、7.50mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L、80.00mg/L。
本领域技术人员可以采用本领域常用的方法，自行制备适当浓度的校准品，也可以使用市售校准品、或制造商提供的产品校准品等。
在一个实施方案中，本申请的甘胆酸测定试剂盒包括5个不同浓度的校准品。校准品含有甘胆酸(分别为：但不限于，2.50mg/L、7.50mg/L、20.00mg/L、40.00mg/L和80.00mg/L)缓冲液。适当时，校准品还含有稳定剂或防腐剂等。校准品可以制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。
根据本申请的一些实施方案，提供了一种包被有甘胆酸-载体蛋白偶联物的胶乳颗粒。所述载体蛋白选自以下的一种：血蓝蛋白、血清白蛋白、血纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白。
根据本申请的一些实施方案，所述第一试剂中的表面活性剂不是选自以下的任一种：Triton X-100、TritonX-405、Tween 80、Tween 20、Brij 35。
根据本申请的一些实施方案，所述第一试剂中的表面活性剂是Brij-L23。
在一个实施方案中，甘胆酸检测试剂盒包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.9M至1.1M NaCl、
0.1％w/v至0.5％w/v Brij-L23、
0.1％w/v至0.5％w/v稳定剂、
0.5％w/v至1.2％w/v聚乙二醇、
0.1％w/v至0.5％w/v防腐剂、
20mg/L至100mg/L甘胆酸抗体或其抗原结合片段；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.5％w/v至10％w/v稳定剂、
0.1％w/v至0.5％w/v Brij-L23(任选)、
0.1％w/v至0.5％w/v防腐剂、
0.1％w/v至0.5％w/v包被有甘胆酸-载体蛋白偶联物的胶乳颗粒。
在一些实施方案中，所述稳定剂选自：牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、甘氨酸、聚乙二醇6000及其组合。
在一些实施方案中，所述稳定剂是牛血清白蛋白和/或蔗糖。
在一些实施方案中，所述防腐剂选自：叠氮化合物、MIT、以及生物防腐剂PC；优选所述叠氮化合物是叠氮钠或叠氮锂。
在一些实施方案中，甘胆酸检测试剂盒包含：
第一试剂，其包含：
第二试剂包含：
物的胶乳颗粒
在一些实施方案中，所述甘胆酸-载体蛋白偶联物是式I所示：
其中：
R为-NH-(CH2)n-马来酰亚胺基，n为1-25之间的任意整数(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25)。
附图说明
图1.甘胆酸测定试剂盒校准曲线。
具体实施方式
实施例
实施例1：甘胆酸衍生物的合成
为制备甘胆酸-载体蛋白偶联物，向甘胆酸引入活性反应基团，以便于和载体蛋白上的基团发生共价连接。技术人员可以根据载体蛋白种类选择适当的活性反应基团。以BSA为例，可以向甘胆酸引入马来酰亚胺基。具体的合成步骤如下：
向干燥洁净的25mL两口瓶中加入甘胆酸(1.0eq)、马来酰亚胺基乙胺(1.0g，1.0eq)、HOAt(1.0eq)和TEA(1.2eq)，再加入二甲基甲酰胺(5mL)搅至完全溶解；
用冰盐降温至-10℃至-15℃，再加入HATU 1.6eq，在该温度下持续搅拌2h，并HPLC进行监测，直至反应完毕；
向上述体系加入纯化水25mL，再加入EA(20mL×3)三次萃取。合并有机相，用无水Na2SO4干燥。
减压浓缩，所得油状物用柱层析法纯化(DCM/MeOH＝5/3)得到乳白色粉末状甘胆酸衍生物，收率约45％(M+：589.4)。
实施例2：甘胆酸-载体蛋白偶联物的制备
1)向100mL烧杯中加入50mL的HEPES(50mM，150mM NaCl，pH7.2)缓冲液，再称取87.6mg的TCEP加入到上述烧杯中，持续搅拌至完全溶解，约10min；
2)称取625mg的牛血清白蛋白加入步骤1)溶液中，持续室温(18℃-28℃)搅拌30min；
3)称取实施例1所制备的甘胆酸衍生物90.0mg，用2.5mL DMF充分溶解，将该溶液加入到步骤2)的溶液中，继续室温搅拌反应3h；
4)用G25脱盐柱(柱体积约300mL)在GE AKTA Purifier纯化仪上对步骤3)所得甘胆酸-牛血清白蛋白进行脱盐处理；HEPES缓冲液(20mM，pH7.2)作为脱盐缓冲液，流速为30mL/min，上样体积为50ml；收集OD280＞1000mAU部分的蛋白峰并混合均匀，即为甘胆酸-牛血清白蛋白偶联物(CG-BSA)。
取100μL的CG-BSA加入900μL的HEPES缓冲液(20mM，pH7.2)进行稀释，用ThermoPierce的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并据此推算CG-BSA的浓度(约为10mg/mL)；将CG-BSA置于-20℃中待用。
实施例3：第一试剂组成的优化
1.在第一试剂中添加不同浓度的NaCl，测定不同浓度的CG血清溶液：
2.结果如下表格所示：
表1.NaCl对测值的影响
不同的NaCl浓度对血清中CG的回收率有很大影响。注意到，只有当第一试剂中NaCl浓度为1M时，CG回收率可保持在90％至110％内，满足测值准确度的要求。
3.在第一试剂中添加不同浓度的表面活性剂，测定不同浓度的CG血清溶液。
4.结果如下表格所示：
表2.表面活性剂对测值的影响
Tween-20、Tween-80、Triton-X100、Brij-L35、Brij-L23均属于非离子表面活性剂，结果显示不同的表面活性剂对血清中CG回收率有很大影响。出乎意料的发现，只有当在第一试剂中加入Brij-L23时，各浓度CG血清中CG回收率可保持在90-110％范围内，满足测值准确度的要求。
5.基于优化结果，配制第一试剂：
实施例4：第二试剂的制备
1.CG-BSA包被胶乳颗粒的制备：
量取20.0ml的胶乳颗粒(220nm；10％)溶液，加入到240mL的20mM MES(pH6.0)缓冲液中；
称取60.0mg的EDAC用12mL的20mM MES(pH6.0)缓冲液充分溶解，加入到上述胶乳颗粒溶液中并迅速搅拌混合均匀；
置于恒温摇床中37℃，120rpm持续搅拌活化胶乳颗粒1h；
量取5.0ml的CG-BSA(10mg/mL)偶联物匀速加入到上述活化后的胶乳溶液中，于恒温摇床中37℃，120rpm持续搅拌偶联1h至3h(例如2h)；
取120.0ml封闭液(50mM甘氨酸，3％牛血清白蛋白、3％Tween-20 pH8.5)，匀速加入到上述偶联后胶乳溶液中；恒温摇床25℃，120rpm持续搅拌封闭过夜12至20h(例如16h)；
封闭完成后进行离心操作，20000g，温度16℃，时间1h；弃上清，用等体积纯化水清洗并离心弃上清；
将沉淀下来的胶乳颗粒重悬于约0.5L工作液(50mM甘氨酸、10％蔗糖、0.1％w/vBrij-L23(任选)、0.5％w/v牛血清白蛋白、0.1％w/v NaN3)中，冰浴超声分散颗粒；超声完毕后用工作液(同上)定容至1.6L，使胶乳颗粒终浓度为0.125％；
最后应用0.8μm滤膜过滤去除胶乳溶液中的杂质；得到第二试剂。
2.第二试剂组成：
实施例5：校准品制备
按照参考校准品所需浓度，将甘胆酸纯品加入到含有150mMNaCl、0.1％NaN3、0.2％BSA的50mM HEPES溶液中，制得不同浓度的甘胆酸校准品。
将上述第一试剂、第二试剂和校准品包装成试剂盒。
测试例
测试例1：校准曲线的绘制
在日立-7180全自动生化分析仪上的设定参数：
表3.设定参数
以校准品浓度为横轴，相应的Delta OD600为纵轴，采用非线性拟合，如Logit-Log4P为纵轴绘制出标准曲线，如图1所示。
测试例2：线性性能的测定
将某一高甘胆酸浓度样本(血清)与某一低甘胆酸浓度样本做等差混合稀释，测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，再与理论浓度相比较，计算其线性偏差。可以看出本申请试剂盒线性范围可达2-80mg/L。
表4.线性结果(mg/L)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 均值 | 理论值 | 相对偏差 | 绝对偏差 | |
| 0 | 2.34 | 2.27 | 2.51 | 2.37 | 3.67 | -35.4％ | -1.30 |
| 1 | 12.58 | 12.25 | 12.40 | 12.41 | 12.83 | -3.3％ | -0.42 |
| 2 | 20.71 | 21.37 | 21.45 | 21.18 | 22.00 | -3.7％ | -0.82 |
| 3 | 31.08 | 31.07 | 32.40 | 31.52 | 31.16 | 1.1％ | 0.36 |
| 4 | 42.26 | 42.58 | 41.00 | 41.95 | 40.32 | 4.0％ | 1.63 |
| 5 | 51.70 | 52.66 | 50.14 | 51.50 | 49.48 | 4.1％ | 2.02 |
| 6 | 60.92 | 61.95 | 62.73 | 61.87 | 58.65 | 5.5％ | 3.22 |
| 7 | 69.46 | 69.33 | 69.60 | 69.46 | 67.81 | 2.4％ | 1.66 |
| 8 | 73.34 | 75.47 | 74.59 | 74.47 | 76.97 | -3.3％ | -2.50 |
| 9 | 82.85 | 83.50 | 83.55 | 83.30 | 86.13 | -3.3％ | -2.83 |
| 10 | 86.49 | 87.26 | 85.23 | 86.33 | 95.29 | -9.4％ | -8.97 |
测试例3：精密度和回收率
重复测定高、中、低浓度(浓度分别为2.80、5.20、15.30mg/L)血清样本20次，检测数据及数据分析见下表。
表5.精密度和回收率
| 血清样本 | 低 | 中 | 高 |
| 样本浓度(mg/L) | 2.80 | 5.20 | 15.30 |
| 1 | 2.95 | 5.30 | 15.08 |
| 2 | 2.89 | 5.28 | 15.04 |
| 3 | 2.94 | 5.34 | 15.42 |
| 4 | 2.92 | 5.24 | 15.53 |
| 5 | 2.96 | 5.40 | 15.24 |
| 6 | 2.86 | 5.24 | 15.14 |
| 7 | 2.80 | 5.33 | 15.31 |
| 8 | 2.81 | 5.19 | 15.20 |
| 9 | 2.88 | 5.26 | 15.14 |
| 10 | 2.85 | 5.25 | 15.00 |
| 11 | 2.83 | 5.31 | 15.17 |
| 12 | 2.80 | 5.23 | 14.97 |
| 13 | 2.74 | 5.21 | 15.32 |
| 14 | 2.79 | 5.29 | 15.29 |
| 15 | 2.78 | 5.25 | 15.21 |
| 16 | 2.84 | 5.34 | 15.28 |
| 17 | 2.76 | 5.31 | 15.34 |
| 18 | 2.80 | 5.33 | 15.20 |
| 19 | 2.77 | 5.19 | 15.21 |
| 20 | 2.84 | 5.26 | 15.14 |
| 平均值(mg/L) | 2.84 | 5.28 | 15.21 |
| 标准差(SD) | 0.07 | 0.06 | 0.14 |
| 精密度(CV％) | 2.3％ | 1.0％ | 0.9％ |
| 回收率(％) | 101.4％ | 101.5％ | 99.4％ |
本申请的胶乳免疫比浊测定试剂盒的准确度高，回收率可达90％-110％之间，精密度良好，CV均不超过2.3％。
测试例4：对各种胆酸的交叉反应
选取结构相似程度最高的几种胆酸代谢类似物，将浓度均调整至40.0mg/L，进行交叉干扰试验。结果如表6所示。
表6.交叉反应率
现有技术中是将抗体包被到胶乳颗粒上，由于抗体在包被过程中不能避免损失，将导致抗体和胶乳颗粒的用量较高。例如，CN104459113A中胶乳颗粒用量高到1％；CN109444399A中包被有抗体的胶乳颗粒用量为5mg/mL；CN108982859A中胶乳微球-鼠抗甘胆酸单克隆抗体的含量为1％。然而，在本申请的试剂盒中，不同的是将抗原(CG-载体蛋白)包被到胶乳上，因此无论是抗体还是胶乳颗粒的用量都显著降低，而不降低试剂性能。
此外，现有技术中在试剂中引入了Tween、Span和Triton系列的表面活性剂，例如CN108982860A中向抗体所在试剂中引入了0.1％的Triton X-100、Tween 20、Brij35。然而，发明人出乎意料地发现不同类型的非离子表面活性剂对试剂的回收率影响显著(参见实施例3所示数据)，本申请的试剂盒在准确度方面得到了明显提高。
Claims (8)
1.一种甘胆酸检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂：
所述第一试剂包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.25M至1.25M的NaCl、
0.1％至0.5％w/v表面活性剂、
0.2％w/v至1.5％w/v反应促进剂、
甘胆酸抗体或其抗原结合片段；
所述第二试剂包含；
包被有甘胆酸-载体蛋白偶联物的胶乳颗粒、和
10mM至500mM缓冲液；
所述载体蛋白选自以下的一种：血蓝蛋白、血清白蛋白、血纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白；
所述第一试剂的缓冲液和所述第二试剂的缓冲液相同或不同；
所述缓冲液选自以下的一种或组合：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、MOPS缓冲液、MOPSO缓冲液、MES缓冲液；
所述表面活性剂是非离子型表面活性剂；
所述第一试剂不包含选自以下的任一种：Triton X-100、TritonX-405、Tween 80、Tween 20、Brij 35；
所述第二试剂不包含选自以下的任一种：Triton X-100、TritonX-405、Tween 80、Tween 20、Brij 35；
所述反应促进剂选自以下的任一种或组合：聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、溴化乙二甲胺、聚凝胺。
2.根据权利要求1所述的甘胆酸检测试剂盒，还包含校准品和/或质控品；
优选地，所述校准品或质控品包含：
10mM至500mM缓冲液；和
0mg/L至100mg/L甘胆酸。
3.根据权利要求1所述的甘胆酸检测试剂盒，所述表面活性剂是Brij-L23。
4.根据权利要求1所述的甘胆酸检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.9M至1.1M NaCl、
0.1％w/v至0.2％w/v Brij-L23、
0.1％w/v至0.5％w/v稳定剂、
0.5％w/v至1.2％w/v反应促进剂、
0.1％w/v至0.5％w/v防腐剂、
20mg/L至100mg/L甘胆酸抗体或其抗原结合片段；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM缓冲液、
0.5％w/v至10％w/v稳定剂、
0.1％w/v至0.5％w/v防腐剂、
0.1％w/v至0.5％w/v包被有甘胆酸-载体蛋白偶联物的胶乳颗粒；
所述稳定剂选自：牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘油、甘氨酸、聚乙二醇6000及其组合，优选牛血清白蛋白和/或蔗糖；
所述防腐剂选自：叠氮化合物、MIT、以及生物防腐剂PC；优选所述叠氮化合物是叠氮钠或叠氮锂。
5.根据权利要求1所述的甘胆酸检测试剂盒，其包含或由以下组成：
第一试剂，其包含：
第二试剂包含：
6.根据权利要求1至4任一项所述的甘胆酸检测试剂盒，所述甘胆酸-载体蛋白偶联物是式I所示：
其中：
R为-NH-(CH2)n-马来酰亚胺基，
n为1-25之间的任意整数。
7.根据权利要求1至6任一项所述的甘胆酸检测试剂盒，所述胶乳颗粒的平均粒径是100nm至500nm，优选200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、350、360、370、380、390、400nm；
更优选，所述胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。
8.根据权利要求1至7任一项所述的甘胆酸检测试剂盒，所述校准品包含：
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