JPS62100660A - 高分子のイムノアツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物学的試料中に存在する微生物もしくは真
核細胞中に存在する高分子分析対象物（ａｎａｌｙｔｅ
）を含む、高分子分析対象物の同定および／または定量
化のための親和性−イムノメトリック　アッセイ（ｉｍ
ｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）１人に関する。

［発明の概要］ 高分子分＋Ｊｉ対象物のイムノアッセイのための本発明
の方法は、該分析対象物を含存する試料を同相に結合し
た基特異性／親和性（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｃｃｉｆ’ｌｃ
／ａｌ”ｌ’１ｎｉｔｙ）の吸着体と接触させ、該固相
を該高分子対象物に対する標識抗体と接触させ、標識の
結合した該固トロを分離し、ついで結合したまたは結合
していない標識を測定することからなる。

基特異性／親和性の吸着体は、細胞中に存在するいくら
かの化合物を含む生物学的起源の化合物の広い範囲にわ
たって存在する特定の構造の部分に対して高い親和性を
有する物質である。

そのような吸着体は、免疫グロブリンの産生をひきおこ
すタンパク質の特定の型に対する親和性のみを有する免
疫グロブリン（抗体）を含まない。本発明の方法は、た
とえば非酵素的にグリコジル化された（ｎｏｎ−ｃｎｚ
ｙｍａｔｉｃａｌｌｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）　（
以下、ｎａｇという）かたち（真性糖尿病の診断および
管理のだめの便利な指標として提唱されているパラメー
ター、アイ・ビーコンク（Ｉ　、Ｐｅａｃｏｋ）のジャ
ーナル　オブクリニ力ル　バソロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｃ１ｉＣ１１ｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏ　、３
７巻、８４１頁、１９８４年、およびケイ・ミーデマ（
Ｋ、旧ｅｄｅｍａ）およびティー・カスパリエ（Ｔ、Ｃ
ａ５ｐａｒｉｅ）のアナルズ　オブ　クリニカル　バイ
オケミストリー（Ａｎｎａｌｓ　ｏ「Ｃ１１ｒ＋１ｃａ
ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２１巻、２頁、１
９８４年参照）で血液試料中に存在するヘモグロビンお
よびアルブミンのようなタンパク質の相対量と同様に、
性ホルモン結合グロブリン（ｓｅｘｈｏｒｍｏｎｅ　ｂ
ｉｎｄｉｎｇ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ）のような生理学的に
重要な糖タンパクの血漿濃度を決定するために用いても
よい。

糖尿病患者の臨床管理のためにいくつかの方法が利用で
きるが、しかしながらｎａｇ−タンパク質の血中レベル
の測定は、糖尿病制御の医師の評価、絶食状態の血中グ
ルコース濃度、平均および最高の血中グルコース濃度、
家庭での尿試験の結果、２４時間糖尿（２４ｈｏｕｒ　
ｇｌｙｃｏｓｕｒＬａ）および血中グルコース濃度の家
庭モニタリングと相関関係があることが示されている。

この点で、グリコジル化されたヘモグロビンΔＩＣの測
定はとくにａ用である。というのは、グリコジル化され
たヘモグロビンＡｌｃは他の容易に分離しうるグリコジ
ル化されたヘモグロビンよりも豊富で、その濃度は糖尿
病制御に関連して広く変化するからである。グリコジル
化されたヘモグロビンＡｌｃは、ヘモグロビンＡ（以下
、ｌ１ｂＡという）の４種のグリコジル化誘導体のグル
ープの中で最も豊富であり、集合的に１ｌｂＡ１　とし
て示され、正常なヒトにおけるヘモグロビンの全濃度の
約６〜９％、不充分に制御された糖尿病患者では２０％
までを占める。

＋１ｂＡの非酵素的グリコジル化は、赤血球の１２０日
の寿命のあいだに徐々におこる。それゆえｎＢ−１１ｂ
の測定は先行する週の平均血中グルコース値を反映し、
糖尿病）と者における制御を改善するとｎ　ｅ　ｇ　−
Ｈｂレベルがわずか３〜４週間後に減少するという結果
になる。血漿アルブミンの寿命はＩＩｂＡ＋の寿命より
かなり短い（２０〜３０日）。したがって血漿ｎｅｇ−
アルブミンレベルの測定は１週間以内に糖尿病制御にお
ける改善を反映し、それによって患者の承諾（ｐａｔｉ
ｅｎｔｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）の一層迅速な評価を提供
する。糖尿病制御における改善とｎｅｇ−タンパクレベ
ルの変化とのあいだの遅滞とは対照的に、不充分な制御
は比較的短期間に血液中のｎ　ｅ　ｇ　−ｔｌ　ｂおよ
びｎａｇ−アルブミンレベルを迅速かつ不可逆的に増加
させつる。この理由によってこれらのパラメーターの測
定は、とりわけ、たとえば幼い子供におけるばあいのよ
うに患者の承諾が不充分なばあい、またはたとえば妊娠
中のように厳格な糖尿病制御が不可欠であるばあいに、
尿および血液のグルコース濃度の決定のために臨床的に
価値のある補助物である。

［従来の技術および発明か解決しようとする問題点］ 等電点分画１君気泳動、電気泳動／′電気浸透、陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフ、イー、分光測定、比色定１」を含むいくつかの方
法が、血液試料中のｎＣｇ−クンバクレベルの決定のた
めに広く臨床に用いられている。これらの方法の多くは
、その約７５％がグリコジル化されたｌ１ｂＡ１ｃの分
析のために特別に設計されており、ｎｃ４−アルブミン
のような他のｎｅｇ−タンパクの分析のためには容易に
改変することかできない。加え−にれらの方法は一般に
長時間を要し、１３度、ｐＨまたはイオン強度における
小さな変動に敏感であり、あるばあいには、良好なバッ
チ間アッセイ（ｂｅｔｗｅｅｎ−ｂａｔｃｈａｓｓａｙ
）精度を確実にするために、注意深＜１凋整しなければ
ならない走査型濃度計のような高度に特殊化された器具
の使用が要求される。それゆえ、ｎｅｇのかたちのヘモ
グロビンやアルブミンまたは臨床上重要な他のタンパク
の測定に一般に適用し・うる簡単、精密で正確な日令的
なアッセイの要求がある。フェニルボロン酸の使用にも
とづくアフィニティークロマトグラフィーは、これらの
基準のほとんどを満足させるように思われ、少なくとも
２社（アミコン・コーポレーション（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびビアス−ケミカル−カン
パニ−（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｓａｌＣｏｍｐａｎ
ｙ））が臨床使用のためのキットを開発しており、ｎｅ
ｇ−タンパクの分離および定】のための固定化したフェ
ニルボロン酸の使用の提案を公表している（英国特許出
願公開第２，０２４，８２９号および米国特許第４，２
［ｉ９．００５号各明細書参照）。しかしながら、これ
らの市販のキットは高価なアフィニティーゲルを大量に
必要とする通常のアフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーの手順の利用にもとづいており、該アフィニティー
ゲルは限られたばあいにその有効性を下げることなく再
使用できるたけである。他の多くの方法と比較しても、
それらもまた労働が激しく、比較的大皿の試料を必要と
し、完全には特異的ではないタンパク濃度の測定方法に
よっている。

イムノアッセイ手順は、生物学的試料、とりわけ予後、
診断または他の臨床上の１−１的のために患者から採血
した血液試料中の特定の成分分子を定量するために広く
用いられている。現（１ミのところ、最も重要な免疫化
学的分析方法は、放射性同位元素、蛍光もしくは生物ｆ
光特性を宵する分子または色の変化を促進する酵素のよ
うな測定が比較的容弓て種々のいわゆる（票識を使用し
ている。

従来のイムノアッセイにおいては、分ｔ１１対−豪物ま
たは分析対象物のた口似体の純粋な製造は、用いられた
検出方法にイア（存して適当な標識と咀み合わされる。

たとえばラジオイムノ“ア・ノセイにおいては、放射性
同位元素が標識として用いられ、これは液体または結晶
シンチレーションスペクトロメーター中で定量されうる
。この標識された分）１１対象物または分析々、■象物
の碩Ｉ１１物は、一定の濃度において、分析対家１力自
（トと同様に標識された分１１１対象物を認識する一定
ｉｎの抗体とともにインキコ・＼−トされる。それゆえ
、抗体結合部位に対する標識された分析対象物と標識さ
れていない分析対象物とのあいたで競合かおこり、抗体
によって結合された標識された分析対象物の二は標識さ
れていない分析対象物の量に反比例する。抗体結合複合
体は、たとえば抗体結合複合体かまたは結合していない
分析対象物（標識されたものおよび標識されていないも
の）の免疫吸着、物理化学的吸着または沈降によって分
離される。つぎに抗体の結合した標識された分析対象物
を定量し、知られた分析対象物の濃度（凛Ｑ　）から標
準曲線を作図し、これから分析対象物の未知の濃度が内
挿されてよい。このことは第１図で説明されている。

［問題点を解決するための手段］ 一方、イムノメトリック　アッセイは標識された分析対
象物のかわりに標識抗体の使用を含み、大きな分子たと
えば２個またはそれ以上の別々の抗原部位すなわちエピ
トープを有するタンパク質の測定にとくに有用である。

このタイプのアッセイでは、第２図に説明されているよ
うに、１種の抗体（または数種の抗体）か［捕捉抗体（
ｃａｔｃｈｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　Ｊとして用い
られ、これは固相支持体」二に固定化されてよい。「標
識抗体」は、好ましくは「捕捉抗体」に対する異なるエ
ピトープを認識する、このことは必ずしも必要なことで
はないが、１種またはそれ以」−の抗体から１個装され
る。標準ｍの分析対象物または生物学的試料中の未知の
濃度の分析対象物をインキュベートするあいだに、「捕
捉抗体」、該分析対象物および「標識抗体」とのあいた
で「サンドイッチ」が形成される。それゆえ、「捕捉抗
体」および「標識抗体」の両抗体の過剰量の存在下で、
そのような「サンドイッチ」に付いているし標識抗体」
の二は存在する分１１１対象物の量に正比例し、そうし
２て定；的な測定の根拠かえられる。イムノメトリック
技術は、従来のイムノアッセイに比べて多くの利点を提
供する。たとえば標識された分析対象物の純粋な調製の
必要がなく、また試薬を過剰量で用いるため、試薬をピ
ペットで精密に移す必要性を低下させ、反応速度を増加
させ、それによってインキュベート時間を短縮させる。

［作用および実施例］ 本発明の方法においては、特定のタンパクに対する標識
された抗体は、通常の固定化された「捕捉抗体」のかわ
りに固定化された基特異性／親和性の吸着体とともに、
生物学的試料中の高分子分析対象物（たとえば糖タンパ
ク）の濃度を１ｌｌｌ定するために、過剰試薬イムノメ
トリック　アッセイで用いられる。本発明の方法は感度
がよく、特異的で精密かつ正確であり、その簡便さのた
めに多量の試料の機械的分析に好適である。第３図に説
明した本発明の方法の一般原理は、異なる細胞型さえも
包む広範囲の種類の高分子分析対象物の検出および決定
に適用することかでき、それらは、たとえばプロティン
Ａのような特異的結合タンパク、たとえばチバクロン［
Ｆ］ブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ■ｂｌｕｅ）Ｐ３Ｇ−Ａ
のような色素、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ステロ
イド、ビオチン、ヘパリン、ゼラチン、ボロン酸、たと
えばレンチルレクチン、コムギ麦芽レクチンのような植
物レクチン、またはコンカナバリンＡなどの適切な固定
化された基特異性／親和性の吸着体との高い親和性相互
作用にもとづいて分離することができる。

異なる種類の高分子または細胞型を適切な固定化された
基特異性／親和性の吸着体との親和性相互作用によって
分離することかでき、該吸着体はポリアクリルアミド、
デキストラン、ビーズ状のアガロース、セルロース誘導
体、粘度（カオリン）、ガラス、ナイロン、ポリエステ
ル、ポリスチレン、ポリオレフィン、金属酸化物、多孔
質セラミック、ケイソウ土、磁粒子、ハロゲン化ポリビ
ニリデンまたは他の適切な材料などの不溶性マトリック
スに付着させてよい。

固定化された親和性マトリックスを用いる主な有利な点
は、それが一方では特定の種類の物質を比較的高い親和
性で結合させ、それによって遠心分離および上澄みの吸
引を用いて、または濾過によって汚染物質を物理的に洗
い出すことかできるようになる。基特異性／　ｖＡ相性
の吸着体はまた、洗浄工稈を容易にするために管、浅い
水ばち、磁粒子または計量棒上にコーティングしてもよ
い。吸着された材料はついで、もし必要ならば結合条件
（たとえばｐｌ＋）を物理的にかえることによって、ま
たは競争的結合リガンドまたは変性剤を用いた脱着によ
って、親和性マトリックスから取り除かれてよい。

糖タンパクはこの点ではとくによく特徴づけられ、異な
る種類の糖タンパクを選択的に！Ｊｉ離するために用い
ることのできる多数の基特異性／親和性の吸着体が同定
されており、そのうちのいくつかのものは、それらの炭
水化物含量に関してのみ異なる同じタンパクのアイソタ
イプのあいだでさえ識別することかできる。しかしなが
ら、植物レクチンおよびホウ酸またはボロン酸を含むこ
れらの吸着体は、非常に多数の複合多糖および糖脂質中
に存在する同様の炭水化物成分と相互作用することに注
意すべきである。

この理由から、これらの吸着体は同様の炭水化物構造を
角−する高分子の広範囲の種類を認識するということを
認めなければならない。このような他の大部分の基特異
性／　ＩｔＪ和性の吸１１１体に共通の絶対的な特異性
の制限にもかかわらず、これらの吸着体と分子残ｈ（の
ある型とのあいたの反応は抗体と抗原とのあいだの相互
作用と頌似しており、良好なアッセイ法の基礎を形成す
るのに充分特異的である。

したがって、いかなる固定化された基特異性／親和性の
吸着体も通常のイムノメトリックアッセイに用いる「捕
捉抗体」のかわりに用いることができる。このことか与
える角利さは数多い。たとえば （ω固定化に必要な人］の特異的な抗体を一定に供給す
る必要をなくする、 山）基特異性／親和性の吸１１体と高分子分析χ・を象
物または細胞とのあいたの親和性打ｊ互作用が、抗体と
抗原とのあいたの比較的遅い反応と比較するとほとんど
即時である、 （Ｃ）　４特異性／親和性の吸着体は、免疫化学的に認
識することができず、またそれに対して特異的な抗血清
またはモノクローナル抗体を産生ずることが困難である
特定の高分子中のマイナーな変化のあいだを識別するこ
とかできる、および （小標識された抗体を使用することによって測定かその
場でなしとげられるので、吸着された高分子を脱着によ
り回収する必要がない。

またある種の基特異性／親和性の吸着体か細胞表面タン
パクと相互作用することができることは、特定の細胞型
のアフィニティー精製にクロマトグラフィー的に利用さ
れている。それゆえ、親和性−イムノメトリック　アッ
セイの原理はまた、生物学試料中の病原微生物の同定お
よび定量に適用することもできる。

それゆえ本発明の親和性−イムノメトリンクアッセイ法
は、臨床化学的および微生物学的実験室試験の現行のリ
ストへの重要な追加を意味する。とりわけ親和性−イム
ノメトリック　アッセイは、その生物学的活性が何らか
の仕方で炭水化物残基と関連している糖タンベクの血漿
ｌ４度をａｌｉ１定するために用いることかて八、ｔｌ
：Ｉｉ　’永病患者の臨床管理のための血液のｎｅｇ−
タンパクレベルの決定にとくに角用である。

これらの適用を説明し、また市販のギノトの形で用いる
のに適したアッセイの実験観察記録を以下の実施例に示
すが、本定明はこれらに限られるものではない。

実施例１ 本実施例では血清の性ホルモー結合ゲロプリン（以下、
５ＩＩＢＧという）濃度の決定のための親和性−イムノ
ラシオメトリノク　アッセイについて述べる。５ＩＩＢ
Ｇは酵素的にグリコンル化されたタンパクであり、１分
子あたり２個の２触角的に（ｂｉａｎｎｔｃｎｎａｒｙ
）Ｎ−結合したオリゴ糖鎖および１個の〇−結合したオ
リゴ糖を含み、ステロイド性ホルモンであるテストステ
ロンおよびニストランオールのための」Ｅ要な血漿であ
る輸送タンパクである。さらに重要なことには、その濃
度がこれらのホルモンの生物学的活性を規制すると考え
られ、多くのクリニカル　アッセイ（ｃｌｉｎｉｃａｌ
　ａｓｓａｙ）かイムノラジオメトリックアッセイ（以
下、ＩＲＭＡという）を含むいくつかの臨床アッセイが
血液試料中のこれらのホルモンの定量のために考案され
ている（ジー・エル・ハモンド（Ｇ、Ｌ、）ｌａｍｍｏ
ｎｄ）らのジャーナル　オブ　ステロイド　バイオケミ
ストリー （Ｊ、５ｔｅｒｏｊｄ　ＢｔｏｃｂｅＩＩｌｉｓｔｒｙ
）、１９８５年印刷参照）。

胞状奇胎または栄養膵疾患の患者は、コンカナいリンＡ
に結合しないＳ　ＨＢ　Ｇの１形態を産生ずることか報
告されている（ビー・エンブレビーン（Ｐ、ＥｌｌｇＩ
ｅｂｉｅｎｎｅ）およびシー・トイエン（Ｇ、Ｄｏｙｅ
ｎ）のアイ・アール・シー・ニス　メディカル　サイエ
ンス（ＩＲｃｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）、
１０巻、　６００頁、１９８２年）。このものは血液血
漿を循環し、従来のステロイド結合能力またはイムノア
ッセイによっては５ＩＩＢＧから識別することかできな
い。本実施例においては、基特異性／親和性の吸着体、
コンカナバリンＡは固定化され、従来のＩＩ州Ａにおい
て用いられる「捕捉抗体」にとってかわり、それによっ
てイム、ノアソセイに特異性をさらに付！うし、フンカ
ナバリンＡの結合したおよび結合していない形の５ＩＩ
ＢＧのあいだの分割がｌ＋Ｊ能になる。

ＮａＣｆｆ　１モル、ＭｎＣｌ２１ミリモル、ＭｇＣｆ
ｆｒｌミリモル、ＣａＣ（ｒ　　１　ミリモルおよびメ
ルチオレ・ｒｌ−０，０１％を倉何するｐＨ６のＮａ−
酢酸塩バソフア−中に懸濁Ｓｋの状態で保たれた（マグ
ネチックスターシー）５０％コンカナバリンＡ−セファ
ロース　スラリーのアリコー１−　１００１１Ｊｌｌを
、容積式ピペットを用いてすべてのアッセイ管に加えた
ｏ　ＮａＣｌ　ｏ、９％、ラクトースＯ，６２５％、ウ
シガンマグロブリン１％およびＮａＮ３　０．０５９６
をＤ　’Ｈするり］１７．Ｂのリン酸緩→ｉ食塩水（Ｐ
ＢＳ）２５ｍＭ中に１００＋　　１に希釈した標準（ウ
シ血清中でのヒト妊娠血清の連続希釈）１００μｇおよ
びヒト血清試料を、管２本ずつにそれぞれ加え、これら
を攪拌混合（ｖｏｒｔｅｘ　ｍ１ｘｅｄ）した。室温（
〜２１℃）で３０分間のインキュベートしたのち、ウシ
血清２９６を含有するρ１１７．４のＰＢ３１ｍｌをす
べての管に加え、攪拌混合し室温で１５分間放置した。

つぎに管を１００ＯＧで５分間遠心分離し、上澄みを吸
引して取り除き、　　　１で標識したモノクローナル抗
体（ＰＢＳ中で〜４Ｇ、０００ｃｐｍ　）の７１Ｊコ一
ト１００μｇをすべての管に加えた。断続的に振とうし
ながらさらに１時間インキュベートしたあと、洗浄希釈
剤（ｗａｓｈ／ｄｉｌｕｅｎｔ）　２　ｍｌをすべての
管に加え、１．０００Ｇで５分間遠心分離し、−１−澄
みを吸引した。つぎにゲルベレットを同じツノ法で再び
洗浄した。管をガンマカウンター中で〕分間カウントし
、知られた５ＩＩＢＧ濃度の一連の標準から作製された
標準曲線から未知の試料の値を内挿した。５ＩＩＢＧの
親和性−Ｉ　ＲＨＡの（頂僧曲線の一例を第４図に示し
た（第４図において図中の短い縦線は重複測定の範囲を
示す）。またコンカナバリンＡ親和性−イムノメトリッ
クアッセイによりえられた血清５ｌｉｔ（Ｇのための参
照値を第１表に示した。

第　　１　　表 上記親和性−イム、ツメドリンク　アッセイおよび市販
の５ＩＩＢＧ−ＩＲ）（Ａ　　（ファルモス　ディアグ
ノステイカ　リミ　ンテイット（ＦａｒｍｏｓＤｉａｇ
ｎｏｓｉｉｃａ　Ｌｔｄ）を用いてえられた値のあいだ
て比較を行ない、これを第５図に示した。

実施例２ 本発明例ではｎｅｇ−ヘモグロビン（ｌＩｂＡ＋）のた
めの親和性−イムノメ！・リック　アッセイにおける固
定化されたフェニルボロン酸の血液を説明する。

＋ｆｕ　ｉｔｌ試料および標章を同様に１週整した。ず
なわち、サポニン１％およびＥＤＴＡを含有する溶解溶
液５０μｇにアリコート５０μΩを加えた。菅を攪拌混
合し、アッセイ　バッファー（グリシン０．１モル、Ｍ
ｇＣ１ｒ　　０．０１モル、ＮａＮ３０，１９６、ｐ＋
＋　８．３）　　９００μｇを加える前に５分間インキ
ュベートした。管を再び攪拌混合し、試料１００μｇを
２個ずつ取りフェニルボロン酸−セファロース親和性ゲ
ルのスラリー　１００μΩを含釘する管に加えた。この
混合物を１０分間おだやかに攪拌しアッセイ　バッファ
ー２　ｍｌをそれぞれの管に加え、これらをつぎに５分
間、１，０ＯＯＧで遠心分離した。上澄みを吸引し、ゲ
ルベレットを同様の方法でアッセイ　バグファー２ｍｌ
で再び洗浄シた。　　１で標識したヘモグロビン抗体（
ウシ胎児血清５％を含有するアッセイ　バッファーで〜
４０，０００ｃｐｍ　／　２００μｇ）をすべての管に
加え、これらをつぎに断続的に振とうしなから１時間イ
ンキュベートシた。アッセイ　バッファー２　ｍｌをす
へての管に加え、これらをつぎに１．０［１０Ｇで５分
間遠心分離し、上澄みを吸引して取り除いた。これを繰
り返し５、ゲルベＩｙ　ノドをカンマカウンター中で１
分間カウントシた。

ｎｅｇ−１１ｂの濃度か翔られているコントロールを用
いて作成した標章曲線（第６図）から試料中のｒ＋ｅｇ
−］１ｂの濃度を内挿し、Ｉｌｂの総濃度は、アッセイ
　バッファーで希釈（１：４０）したのち同じ試料中で
分光測光的に測定した。

また親和性−イムノメトリック　ア・ノセイおよび市販
の電気泳動法によって血液試料中で測定したｎＢ−１１
ｂの割合のあいだで比較を１１なった（第７図）。

実施例３ 本実施例では、ｎｅｇ−アルブミンのだめの親和性−イ
ムノメトリック　アッセイにおける固定化されたフェニ
ルボロン酸の使用を説明する。

血液の試料および標章は実施例２に記載したようにニー
１整し、でもよいが、または血液の血漿または血清を実
施例２で用いた同じアッセイ　バッファー中に１：２０
に希釈してもよい。希釈し溶解した血液または血漿の試
料のアリコート１（１０μΩを、フェニルボロン酸−セ
ファロース親和性ゲルの固定化されたスラリー１００μ
Ωを含有する管に加えた。この混合物を１０分間おだや
かに攪拌し、アッセイ　バッファー２　ｍｌをそれぞれ
の管に加え、つぎにこれらを　１．０００Ｘｇで５分間
遠心分離した。−１−澄みを吸引し、ケルペレットを同
様の方法でアッセイ　バッファー２ｍ１で再び洗浄した
。つぎに　　１で標識したアルブミン抗体（ウシ胎児血
清５？６を六角゛するアッセイ　バッファー中で〜４０
．０００ｃｐｍ　／　２００μΩ）をすべての管に加え
、継続的に振とうしながら１時間インキュベートした。

アッセイバッファー２　ｍｌをすべての管に加え、１０
０Ｇで５分間遠心分離したのち」二澄みを吸引した。こ
れを繰り返し、ゲルベレットをガンマカウンター中で１
分間カウントした。ｎｅｇ−アルブミンの濃度は、ｎｃ
ｇ−アルブミンの濃度が市販のボロン酸塩（ｂｏｒｏｎ
ａｔｃ）アフィニティークロマトグラフィー　キット（
ピアス　グリコテストＴＭ（ＰｉｅｒｃＣＧｌｙｃｏ　
Ｔｅ５ｔ　ＴＭ）　）を用イテ決定された血漿試料を用
いて作成した標章曲線（第８図）から内挿することかで
きる。これらのデ〜りはまた、親和性−イムノメトリン
ク　アッセイおよび［１的なアフィニティークロマトグ
ラフィー法のあいたにｑ在する良好な相関関係を説明す
るのにも役立つ。

双子、の３つのすべての実施例において、すｆ１ンドは
固相支持体としてのセファロースにイ・１４ｅ□してい
る。これはｒＴ効で便ｆｌｌな固定化マトリックスであ
るか、標識抗体のＪｌ−、特異的な捕ＩＷが小太な問題
であるという不利益をこうむる。このことは、コントロ
ールした多孔質メｆ−′７スまたはカオリンのような、
非’ｌ’ｌ’ｒに低い非特異的吸青ど連合したかわりの
固相支持体をｆｉＥ用することによって克服することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は標識した分１ｉ対象物を用いた従来の固相ラジ
オイムノアッセイの手順を示す模式図、第２図は標識し
た抗体を用いた従来の固ｉｌｌイムツメトリック　アッ
セイの手順を示す模式図、第３図は本発明の固相親和性
−イムノメトリック　アッセイの手順を示す模式図、第
４図は実施例１においてえられたヒト５ＩＩＢＧの親和
性−イムノメトリック　アッセイのための標章曲線を示
すグラフ、第５図はＩＲＭＡおよび親和性−Ｉ　ＲＭＡ
によって測定した血清５ＩＩＢＩ度の比較を示すグラフ
、第６図は実施例２においてえられたｎ　ｅ　ｇ　−ヘ
モグロビンの親和性−イムノメトリック　アッセイのた
めの標準曲線を示すグラフ、第７図は実施例２において
親和性−イムノメトリックアッセイおよび電気泳動法に
より測定した血液試料中のｎｃｇ−ヘモグロビンの割合
の比較を示すグラフ、第８図は実施例３においてえられ
たｎｃｇ−アルブミンの親和性−イムノメトリックアッ
セイのための標章曲線を示すグラフである。 才１　図 抗体でおおわれた釣険管　　　　　　　　　　　インキ
：Ｌゞ−ト用量一応答標準曲線 第２図 ［ｉ］：□’ｉ　　１’Ｃ−答標準曲線２３吊 ■特異性／親位姓の吸着体でおおわれたぁ〉萱　　　　
　イシキュゞ−ト用星−ｃＨ＝二答忙邸曲線 第４因 慎 ５ＨＢＧ　　標　　　　準　　（ｎｍｏｌ／１）２５図 親和性−ＩＲＭＡによ６　ＳＨＢ　Ｇ　（ｎｍｏｌ／ｌ
！　）第６因 ｎｅｇ−ヘモグロビンの濃度（９／ｐ）オフ０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　高分子分析対象物を含有する試料を固相に結合した
   基特異性／親和性の吸着体と接触させ、該固相を該高分
   子分析対象物に対する標識抗体と接触させ、標識の結合
   した該固相を分離し、ついで結合したまたは結合してい
   ない標識を測定することからなる高分子分析対象物のイ
   ムノアッセイ法。 ２　基特異性／親和性の吸着体がオリゴヌクレオチド、
   アミノ酸、ステロイド、色素、ビオチン、ボロン酸誘導
   体、ヘパリン、ゼラチン、免疫グロブリン以外の特異結
   合タンパク、または植物レクチンである特許請求の範囲
   第１項記載のイムノアッセイ法。 ３　前記固相がポリアクリルアミド、デキストラン、ビ
   ーズ状アガロース、セルロース誘導体、ポリアミド、ポ
   リエステル、ポリスチレン、ポリオレフィン、金属酸化
   物、多孔質セラミック、カオリン、ケイソウ土、ガラス
   、磁粉末またはハロゲン化ポリビニリデンである特許請
   求の範囲第１項または第２項記載のイムノアッセイ法。 ４　前記標識抗体が、放射性同位元素、酵素、または蛍
   光、冷光、リン光もしくはスピンラベル分子で標識した
   前記分析対象物に対して産生されたポリクローナルまた
   はモノクローナル抗体である特許請求の範囲第１項、第
   ２項または第３項記載のイムノアッセイ法。 ５　前記分析対象物が、糖タンパク、ホルモン、ＤＮＡ
   もしくはＲＮＡ、ウィルス、原核微生物または特定の真
   核細胞型である特許請求の範囲第１項、第２項、第３項
   または第４項記載のイムノアッセイ法。 ６　（１）分析対象物に対する標識抗体、 （２）固相に結合した、該分析対象物に結合する基特異
   性／親和性の吸着体および （３）分析対象物の度盛り定め基準からなる、高分子分
   析対象物を含有する試料を固相に結合した基特異性／親
   和性の吸着体と接触させ、該固相を該高分子分析対象物
   に対する標識抗体と接触させ、標識の結合した該固相を
   分離し、ついで結合したまたは結合していない標識を測
   定することからなる高分子分析対象物のイムノアッセイ
   法に用いるためのアッセイキット。 ７　基特異性／親和性の吸着体が第２の結合剤によって
   固相に間接的に結合された特許請求の範囲第６項記載の
   アッセイキット。