NO163754B - Fremgangsmaate for detektering eller determinering av et agglomerat samt et sett for gjennomfoering av fremgangsmaaten. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for detektering og/eller determinering i en blot overleggsanalyse av et agglomerat dannet av et bindemiddel og den tilsvarende akseptor omfattende i et første trinn,

i) immobilisering av akseptorsubstansen til et blot-medium ved direkte adsorbsjon og/eller kovalent binding og quenching av de gjenværende bindingsseter, eller immobilisering av akseptorsubstansen til et blot-medium ved å tillate akseptorsubstansen å bli bundet av et spesifikt bindemiddel som er blitt immobilisert til blot-medie og som derefter ble quenchet.

Forbindelsen angår også et prøvesett for detektering eller determinering av en av komponentene av reaksjonen mellom et spesifikt bindemiddel og den tilsvarende akseptorsubstans ifølge generelle metoder for blotoverleggsanalyse.

Liganden er vanligvis inneholdt i en vandig prøve og blir på et tidligere trinn av analysen absorbert og/eller kovalent bundet til en immobiliserende matriks. Eksempler på immobiliserende matrikser er nitrocellulose (NC)-film (tynne folier av salpetersyre-forestret cellulose med kjent porøsitet), diazobenzyloksymetyl (DBM)- og diazofenyltioeter (DPT)-modifisert cellulosepapir, papir eller celluloseacetat aktivert med cyanogenbromid, og nylon-baserte membraner som "Gene Screen" og "Zetabind". Den sistnevnte er en nylon-matriks (et polyheksametylenadipamin (kalt nylon 66), modifisert ved innføring av tallrike tertiære aminogrupper under fremstillingen. Disse immobiliseringsmatriksene kalles generelt "blot"-medier, her kalt sugemedier (se for eksempel J.M. Gershoni og G.E. Palade, "Analytical Biochemistry", 131, 1-15, (1983)).

Sugeoverlagsanalysemetoder kan generelt deles i to forskjellige teknikker: A. I sandwich-overlagsanalysen blir renset eller anriket spesifikt bindemiddel festet til den immobiliserte matriks i henhold til B nedenfor, fortrinnsvis som en liten flekk, og akseptorsubstansen tillates binding dertil, noe som resulterer i immobilisering på matriksen av akseptorsubstansen, som så kan detekteres. På grunn av det spesifikke bindemiddels spesifisitet vil dette tillate å isolere akseptorsubstansen ut av en kompleks prøve som urin, plasma, serum, andre kroppsvæsker, cellefrie translasjonssystemer, celle- og vevlysater og så videre, og så bruke denne tilnærmelse for semikvantitative og/eller kvalitative (diagnostiske) analyser: de såkalte sandwich-sugeoverlagsanalyser (SBOA). Til nu har den praktiske verdi av SBOA vært neglisjerbar, fordi kun relativt komplekse detekteringsmetoder er tilgjengelige idag. På grunn av utførelsesformen ifølge foreliggende oppfinnelse er detekteringen gjort meget enkel og interessen for SBOA for diagnostisk bruk kan økes.

B. I den direkte sugeoverlagsanalysen blir akseptorsubstansen direkte bundet til et sugemedium ved en prosedyre kjent som "overføring" eller "blotting", her kalt suging. Det foreligger forskjellige fra litteraturen godt kjente måter å gjøre dette på. For eksempel kan små dråper inneholdende en kjent eller ukjent mengde akseptorsubstans (i ren form eller ikke), i en vandig oppløsning, i størrelsesorden 1 pl (men andre volumer kan også benyttes) bragt på som en flekk på sugemediet for å tillate at akseptorsubstansen blir bundet til sugemediet. Slike oppsugde flekker kan potensielt benyttes for diagnostisk detektering av nærvær av spesifikke bindemidler for den immobiliserte akseptorsubstansen i forskjellige kroppsvæsker. Hvis akseptorsubstansen er en del av en kompleks blanding, kan denne først separeres ved et antall kromatografiske teknikker som tynnsjiktskromatografi eller elektroforetiske teknikker, for eksempel i polyakrylamidgeler, som natriumdodecylsulfat (SDS), elektroforese, iso-elektrisk fokusering, 2-D-gel-elektroforese, gradientgeler- og syre-urea-gel-elektroforese og ikke-denaturerende gel-elektroforese, for å lette identifiseringen av akseptorsubstansen. I enkelte tilfeller som for eksempel nukleinsyrer, kan agargeler også benyttes. De elektroforetisk oppløste komponenter (som proteiner, peptider og nukleinsyrer) overføres så til immobiliseringsmatriksen ved prosedyrer kjent som kapillær-, vakuum- eller elektrooverføring (eller -suging). Komponentene immobiliseres så på sugemediet mens det originale elektroforetiske mønsteret stort sett bibeholdes. Dette komplette mønsteret kan visualiseres ved kjente flekkingsteknikker som amidosort og Coomassieblå og den angjeldende komponent (akseptorsubstansen) kan detekteres (se senere) og lokaliseringen relateres til det hele elektroforetiske mønsteret.

Så langt har de fleste av de spesifikke bindemidler som har vært benyttet, vært proteiner som binder til godt definerte områder av akseptorsubstansen. Lektiner benyttes for å påvise glykoproteiner. Polyklonale og monoklonale antistoffer for å detektere deres tilsvarende antigener eller haptener (for eksempel biotin eller biotinilerte DNA-prober med anti-biotin, DNP på dinitrofenylerte proteiner med anti-DNP). Sugeoverlagsanalyser er allerede hyppig brukt for utprøving av spesifisiteten av antistoffer, og for bedømmelse av produksjonen av monoklonale antistoffer. Ved siden av disse hyppig benyttede systemer kan mange andre gjensidige påvirkninger mellom protein-protein (for eksempel kalmodulin eller actin-bindende protein), eller protein-1igand (for eksempel avidin-biotin), der en av komponentene immobiliseres, analyseres. Dette inkluderer gjensidig reaksjon mellom DNA-protein og RNA-protein, systemet reseptor-1igand, og generelt enhver annen makromolekyl-makromolekyl med tilstrekkelig spesifisitet eller affinitet.

En vesentlig del av sugeoverlagsprøven er den metoden som benyttes for å visualisere den immobiliserte akseptorsubstansen. Direkte og indirekte teknikker eksisterer. Visualise-ringsprinsippene benytter markører: radioaktive isotoper (<3>H, <1>4C, 32P, <35>S eller 125I), fulgt av autoradiografisk fremkalling; enzymer som kan danne uoppløselige farvede produkter, eller fluorokromer. I direkte metode blir markørene bundet til det spesifikke bindemiddel. I den indirekte metoden blir den bundet til et makromolekyl som spesifikt binder til det første spesifikke bindemiddel. Hvis det sistnevnte er et antistoff, kan makromolekylet være protein A eller et annet antistoff. Flertrinnsteknikker som avidin-biotinylert pepperrot-peroksydasekompleks (ABC)-umerket peroksydase-anti-peroksydase (PAP)-metoder kan også benyttes for antistoffer.

Det vesentlige punkt ved foreliggende oppfinnelse er bruken av en dispersjon eller et metall eller en metallforbindelse eller kjerner belagt med et metall eller en metallforbindelse som visualiserings- og/eller detekteringselement i suge-overlagsteknikker. Uttrykket "kolloid metallpartikkel" slik det her benyttes, er ment å inkludere dispersjoner av partikler, eventuelt en sol, bestående av et metall, en metallforbindelse eller en kjerne belagt med et metall eller metallforbindelse.

Kolloide metallpartikler kan fremstilles ved å følge kjente prosedyrer, for eksempel som for fremstilling av kolloid gull, sølv eller jernoksyd og lignende. Kolloide metallpartikler kan bindes direkte eller indirekte til det spesifikke bindende protein eller akseptorsubstansen, eller til et makromolekyl som binder spesifikt til det første spesifikke bindemiddel, for eksempel til protein A, et sekundært antistoff (når det gjeldet et primært antistoff), eller streptavidin og avidin (når en av komponentene er biotinylert), med retensjon av mesteparten av de originale bindingsaktivitetene, ved å følge kjente prosedyrer. Under festing eller binding menes enhver kjemisk eller fysikalsk binding som binding via kovalente bindinger, via hydrogen-broer, polartiltrekning og absorpsjon.

Det er nu funnet at når et sugemedium med en dertil bundet akseptorsubstans enten indirekte (se A) eller direkte (se B), inkuberes med den egnede konsentrasjon av det spesifikke bindemiddel merket med kolloide metallpartikler (direkte detekteringsmetode) eller først med umerket spesifikt bindemiddel og så med et makromolekyl merket med en kolloid metallpartikkel som spesifikt kan binde til det første spesifikke bindemiddel (indirekte detekteringsmetode), vil kolloide metallpartikler akkumuleres på de spesifikke bindingsseter og overraskende bli synlige som farvekarak-teristika for de kolloide metallpartikler som benyttes. For eksempel oppnår man en rosa til mørkerød farve når et metall som gull benyttes og gult til brunsort når sølv benyttes. Farven danner et signal som kvalitativt kan avleses med det blotte øyet, eller eventuelt måles med kjente spektrofotometriske prosedyrer som densitometri.

Partikkelstørrelsen for de kolloide metallpartiklene er fortrinnsvis mellom 3 nm og 100 nm og helst mellom 5 nm og 50 nm.

Som eksempler på kolloide metallpartikler som kan bindes til spesifikke bindingsmidler er nevnt metallene platina, gull, sølv og kobber, og metallforbindelsene sølvjodid, sølvbromid, kobberaquoksyd, jernoksyd, jernhydroksyd og -aquoksyd, aluminiumhydroksyd eller -aquoksyd, kromhydroksyd eller

-aquoksyd, vanadiumoksyd, arsensulfid, manganhydroksyd, blysulfid, kvikksølvsulfid, bariumsulfat og titandioksyd. Det er også kjent at kolloider bestående av kjerner belagt med de ovenfor nevnte metaller eller metallforbindelser, kan benyttes. Disse partiklene har egenskaper tilsvarende de til metall- eller metallforbindelseskolloidene mens størrelse, densitet og metallinnhold optimalt kan kombineres. Generelt kan alle kolloide metallpartikler eller -metallforbindelser

som kan bindes til spesifikke bindemidler uten å ødelegge bindeaktiviteten, og som gir en farveintensitet i sugeoverlagsanalysen tilstrekkelig til å kunne sees med det blotte øyet, brukes. Fortrinnsvis er sensitivitetene like eller bedre enn de som oppnås med gull eller sølv.

Bruken av kolloide metallpartikler, spesielt i form av gullsol, som dekkes på overflaten med spesifikke bindemidler som antistoffer, lektiner, protein A, avidin og mange andre, eller sågar akseptorproteiner som antigener, er nu godt erkjent i mange cytokjemiske markeringsteknikker ved transmisjons- og skanderende elektronmikroskopi. Et eksempel på bruken av en kolloid metallpartikkel bestående av en polymer belagt med et metall er dekstran belagt med jern som, bundet til antistoffer, gir en meget brukbar markør for transmisjonselektronmikroskopi. Disse anvendelser eksploa-terer imidlertid den typiske elektronopasitet for disse markører (transmitterende EM) eller deres potensiale til å emittere sekundære elektroner eller tilbakekastede primær-elektroner (skanderende EM).

Kolloide metallpartikler, spesielt de som er laget av gull og sølv, benyttes også som markører for lysmikroskopi; cytokjemiske markeringsteknikker efter at det var vist at akkumuleringer av slike kolloide metallpartikler på bindingsseter i vev eller på celleoverflater kunne sees, forutsatt at et lysmikroskopi ble benyttet for å se på preparatet.

Kolloide metallpartikler benyttes også for visse in vitro kvalitative eller kvantitative bestemmelser av immunologiske komponenter som haptener, antigener og antistoffer i et vandig medium. Disse teknikker er kalt solpartikkel-immunoanalyser, og passiv gullagglutinering (Geoghegan).

Den passive gullagglutineringsteknikk er basert på agglutinering av et gullmerket antigen (gullpartikler 18-20 nm) ved umerket antistoff, og involverer bruken av et standard mikrotitersett der ikke-aggregert gull strømmer ned sidene brønnene og lager en rød strek. Denne teknikken er analog klassisk passiv hemagglutinering og er likeledes følsom og kreves å ha potensiale for revers-agglutinering der det er antistoffet som merkes med gull.

Solpartikkel-immunoanalyser faller innenfor to kategorier. Den første er kalt homogensolpartikkel-immunoanalyse og er basert på agglutinering av antistoffmerkede kolloidpartikler med immunokjemisk bi- eller multivalente antigener eller med haptener koblet til et baererprotein. Agglutineringen resulterer i en farvereduksjon som måles kolorimetrisk med en buffer som blindprøve. Agglutineringen av de kolloide metallpartiklene kan så inhiberes ved frie haptenmolekyler fra prøver. Slike metoder er beskrevet i EP-PS 0 007 654.

Den andre typen solpartikkel-immunoanalyse er basert på bundet/fri kolloid metallpartikkelkonjugat-separering analog med radioimmunoanalyse og enzymimmunoanalyse. Slike metoder er beskrevet i det i forrige avsnitt nevnte europeiske patent. En slike metode er kalt "Sandwich Sol Partikkel Immunoanalyse" (SSPIA) og er analog en sandwich-ELISA eller fastfasesandwich radioimmunoanalyse. I SSPIA blir karakteristisk et antistoff mot det antigen som skal bestemmes først absorbert på overflaten av en mikrotitreringsplate, (for eksempel av polystyren). En prøve (antigen-standard eller blind), oppløst i et egnet buffersystem, pipetteres i brønnene belagt med antistoff og inkuberes på hensiktsmessig måte. Gullmerket antistoff tilsettes og reaksjonsblandingen inkuberes ytterligere. Brønnene luftes og vaskes for å fjerne ikke-bundet konjugat. Til slutt utløses det bundne immun-kompleks sammen med de homogeniserte kolloide metallpartikler. Enten blir farveintensiteten for den oppnådde dispersjon undersøkt visuelt eller metallkonsentrasjonen målt ved hjelp av et kolorimeter. Den visuelle undersøkelses-metoden, det vil si farven av det dispergerte gull, kan kun benyttes ved høyere antigenkonsentrasjoner.

De skal påpekes at solpartikkelanalyser også er beskrevet som brukbare for ikke-immunologiske analyser, generelt "for detektering og/eller bestemmelse av en eller flere komponenter i reaksjonen mellom et spesifikt bindende protein og den tilsvarende bindbare substans, i en vandig prøve, mens man benytter seg av den kjente bindende affinitet for slike komponenter overfor hverandre, hvori en eller flere merkede komponenter benyttes oppnådd ved kobling, direkte eller indirekte, av den ønskede komponent i reaksjonen til partikler av en vandig dispersjon av et metall, metallforbindelse eller en polymerkjerne belagt med et metall, eller en metallforbindelse, en partikkelstørrelse på minst 5 nm, hvorved det under reaksjonen eller efter en adekvat reak-sjonstid, eventuelt efter separering av bundne og frie merkede komponenter, de fysiske egenskaper og/eller mengden av metall og/eller dannet metallagglomerat bestemmes i prøven ved en derfra hentet fraksjon, ved å følge kjente prosedyrer, hvilken bestemmelse giren kvalitativ og/eller kvantitativ indikasjon på komponenten eller komponentene som skal bestemmes".

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av kolloide metallpartikler som markører i sugeoverlagsanalysemetoder, hvilken anvendelse er helt nyt og helt overraskende har vist seg å være mulig.

Kolloide metallpartikler er ment å inkludere en dispersjon av et metall, metallforbindelse eller en kjerne belagt med et metall eller en metallforbindelse.

Bruken av kolloide metallpartikler som markører gjelde alle former for sugeoverlagsanalyser og innfører den fordel at kolloide metallpartikler agglomererer på bindesetene på overflaten av sugemediet og direkte blir synlige for det blotte øyet med en sensitivitet som minst er sammenlignbar med den høye sensitivitet for eksisterende teknikker slik som enzymbaserte sugeoverlagsanalyser. Det skal påpekes at oppfinnelsen ikke vil ha praktisk verdi hvis de siste punktet ikke kan inkluderes. Det har den viktige fordel at analysen kan avleses uten behovet for en sekundær enzymatisk reaksjon, autoradiografi eller betraktningssystemer for fluorescente farvestoffer, eller for en løsning av de bundne kolloide metallpartikler for efterfølgende målinger med det blotte øyet (lav sensitivitet), kolorimetri eller CRAAS (høyere sensitivitet) som i sandwich-solpartikkel-immunoanalyser. Hovedfordelen er enkeltheten fordi farven fremkalles under reaksjonen. Dette gjør det mulig å stanse reaksjonen når det ønskede signalet er dannet, eller å kalibrere systemet for å oppnå et på forhånd bestemt resultat i løpet av en fast tidsgrense.

Bruken av gullmerkede antistoffer er meget enklere, og like følsomme som en angitt meget sensitiv immunoperoksydase-metode. Denne enkle prøve kan benyttes for et prøvesett for indirekte å påvise nærvær av spesifikt bindemiddel til en akseptorsubstans som er festet til sugemediet, og et kolloid metallpartikkelmerket spesifikt bindemiddel for det første spesifikke bindende middel. Hvis det bindende middel er et antistoff, kan dette være et kolloid metallpartikkelmerket sekundært antistoff eller protein A. Dette kan gjennomføres som en meget enkel type dyppepinneprøve, for eksempel en flekksugeoverlagsimmunoanalyse for hurtigundersøkelse på nærvær av antistoffer mot et valgt antigen i en vandig prøve slik som serum.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å forbedre den kjente teknikk og angår i henhold til dette en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den som ytterligere trinn omfatter: ii) å bringe blot-mediet i kontakt med kolloidmetallpar-tikkelmerket bindemiddel, eller

å bringe blot-mediet i kontakt med et ikke-merket spesifikt bindemiddel og derefter med kolloid-

metallmerket protein som er spesifikt for det ikke-merkede spesifikke bindemiddel; og

ili) detektering eller determinering av det farvede signal som fremstilles av og er karakteristisk for de bundne kolloidmetallpartikler på setet mellom det spesifikke bindemiddel og den tilsvarende akseptorsubstans på overflaten av blot-mediet, med det blotte øye eller ved bruk av spektrofotometriske teknikker, eventuelt efter påføring av en fysikalsk fremkaller.

Oppfinnelsen angår som nevnt også et prøvesett av den innledningsvis nevnte art og dette karakteriseres ved at det inneholder a) kolloidmetallpartikkelmerkede komponenter som forårsaker et farvet signal på reaksjonssetet mellom akseptorsubstansen og det spesifikke bindemiddel på overflaten av et

blot-medium;

b) komponenter av en fysikalsk fremkaller; og

c) andre reagenser.

Et eventuelt trekk ved oppfinnelsen gjør bruk av det faktum

at detekteringen av kolloide metallpartikler bundet på overflaten av det sugende medium, som et resultat av sugeoverlagsanalysen, og så indirekte kan visualiseres eller fremheves ved å anvende en fysisk fremkaller som kan reduseres til det tilsvarende metall. Egnede fysikalske fremkallere er for eksempel sølvlaktat, sølvnitrat og lignende. Når for eksempel sølv benyttes som slik fremkaller, skjer reaksjonen først på overflaten av metallpartiklene som katalyserer reaksjonen, og blir derefter autokatalytisk på disse podeelementer. Dette resulterer i dannelsen av et sort og meget kontrastrikt signal, tilveiebragt ved akkumulering av metallisk sølv. Dette gir en betydelig sensitivitets-økning. For å oppnå lysintense sølvbunnfall er det også oppdaget at de oppnådde reaksjoner må fikseres med fiksativ som ellers benyttes for mikrografi-trykk.

Fysikalske fremkallere har vært brukt i mange år for visualisering av vannuoppløselige metaller, spesielt metallsulfider, i vev (se Danscher, "Histochemistry", 71, 1-16-1981). Metallsulfidene og metallisk sølv har en katalytisk virkning for reduksjon av sølvioner. Kolloid gullmetall i vev kan også påvises med en fysikalsk fremkaller og denne er eksploatert av Holgate et al., "J. Histochem. Cytochem., 31. 938-944, (1983) for innføring av immunogull/sølv-flekkmetoden som resulterer i en intensivitet som er langt høyere enn den opprinnelige immunogullflekkingsmetode.

Hovedfordelen ved det eventuelle trekk ifølge oppfinnelsen ligger i den enorme sensitivitet som overskrider den til enhver annen påvisningsmetode for sugeoverlagsanalyser. Den kan benyttes når brukeren ønsker å økonomisere med mengden benyttede reagenser, eller når ekstremt lave mengder akseptorstoffer og/eller spesifikke bindende midler er til stede.

Et ytterligere eventuelt trekk ved oppfinnelsen er bruken av en fotografisk fikserer, som forminsker bakgrunnen og forbedrer stabiliteten for reaksjonsproduktet av den fysikalske fremkaller.

De følgende eksemplene er ment å illustrere oppfinnelsen uten å begrense oppfinnelsens ramme.

EKSEMPLER

Eksempel I

En enkelt flekksugeoverlagsimmunoprøve for indirekte påvisning av antistoffer mot hundehjerne-tubulin og kalmodulin med gullmerkede sekundære antistoffer i serum fra immuniserte kaniner.

I.1 Fremstilling av antisera

1.1 Dyrking av antisera

1 mg hundehjerne-tubulin (ekstrahert fra SDS-polyakrylamidgel) i 1,0 ml buffer (0,1 M Pipes, pH 6,9), eller 1 mg elektroforetisk rent hundehjerne-kalmodulin (i ItøO) ble blandet med 1,0 ml total Freund's adjuvans (DIFCO). Efter homogenisering ble antigenet injisert intradermalt på fem punkter langs ryggraden til hvite kaniner. Booster-injeksjoner ble gitt hver 4. uke. Antigenet ble fremstilt på samme måte bortsett fra at man benyttet ufullstendig Freund's adjuvans. En uke, efter hver booster, ble det tatt blodprøver fra kaninene (± 60 ml blod), serum ble fremstilt og lagret i mengder ved —20°C til bruk.

1.2 Kolloid gullmerkede sekundære antistoffer

Disse var kommersielt tilgjengelige fra Janssen Life Sciences Products, under koden GAR G20. Dette er affinitetsrenset geiteantistoffer mot kanin IgG, merket med 20 nm kolloide gullpartikler.

Fremstilling av nitrocellulose- papirstrimler med antigenholdige flekker

10 1-jj1 dråper av 4-gangers serief ortynninger (ut fra

250 ng/jjl), av rent tubulin i 0,1 M Pipes, l mM EGTA, l mM MgCl2, pH 6,75 eller rent kalmodulin i H2O, ble flekket som en rekke på tørre nitrocellulosestrimler (6 cm x 0,6 cm). Efter at flekkene hadde tørket, efter ca. 5 minutter, ble gjenværende proteinbindingsseter på strimlene "quenched" ved inkubering av dem med en oppløsning av 5$ storfeserumalbumin (BSA), i 20 mM tris-bufret saltoppløsning, pH 8,2 i 30 minutter ved 37<0>C.

1.3 Prøveprotokoll for påvisning av tubulin- og kalmodulin-antistoffer. Sammenligning mellom bruken av gullmerkede antistoffer og ABC- peroksvdase- påvisningsmetoden Bufferen som ble benyttet under hele prosedyren var 0,1$ BSA tris (0,1* BSA i 20 mM tris-HCl, 0,956 NaCl pH 8,2, 20 mM NaN3), hvis ikke annet er sagt.

a) Inkubering med prlmær- antiserum

2 strimler ble inkubert og anordnet i tiltettede 5 ml plastrør med 1 ml kaninantitubulinserum, 1:1000 fortynnet i 0,1* BSA-tris i 2 timer ved romtemperatur . 2 strimler ble inkubert som ovenfor med det samme antiserum absorbert på tubulin, kovalent bundet til "Sepharose-4B", for å tjene som kontroll for antigen-spesifisiteten . 2 strimler ble inkubert som ovenfor med 1 ml kanin-antikalmodulinserum, 1:1000 fortynnes i 0,1* BSA-tris, i 2 timer ved romtemperatur. 2 strimler ble inkubert som ovenfor med det samme absorberte kalmodulin, kovalent bundet til "Sepharose-4B".

Efter inkubering med de absorberte og ikke-absorberte primærantisera ble strimlene vasket 3 x 10 minutter i 0,1* BSA-tris. En strimmel fra hvert par ble inkubert ytterligere med "GAR G20", (se 1.3.b).

Den andre ble inkubert med det meget følsomme Vectastain ABC immunoperoksydasesett, oppnådd fra Vector Laboratories og brukt i henhold til produsentens instruksjoner, (se 1.3.c).

b) Inkubering med gullmerket sekundært antistoff: " GAR G20"

De vaskede strimler, (se 1.3.a) ble inkubert med "GAR G20", fortynnet ved O.D.528<m>nm = 0,2 i 0,1* BSA-tris 0,4* i 2 timer. Efter denne inkubering ble strimlene vasket i 0,1* BSA-tris i 2 x 10 minutter og luft-tørket.

c) Inkubering med Vectastain- settet

De vaskede strimlene (se 1.3.a) ble inkubert med

sekundær biotinylert antistoffoppløsning (1:200 i 0,1* BSA-tris) i 1 time. Strimlene ble vasket i et overskudd av 0,1* BSA-tris i 3 x 10 minutter og derefter inkubert i avidin-biotinylperoksydase-komplekset i 1 time. Komplekset ble fremstilt ifølge produsentens instruksjoner: 100 pl av reagens A (avidin DH) ble satt til 20 ml PBS (Dulbecco's, uten Mg<2+> og Ca<2+>). 100 pl av reagens B (biotinylert pepperrotperoksydase) ble tilsatt under kontinuerlig omrøring. Komplekset ble benyttet efter 5 minutter. Strimlene ble vasket i 0,1* BSA-tris i 2 x 10 minutter, og derefter i 100 mM tris-HCl-buffer, pH 7,6. Den immobiliserte peroksydasen ble derefter visualisert med 4-klor-l-naftol som substrat; 20 mg 4-klor-l-naftol ble oppløst i 1 ml etanol og ytterligere fortynnet med 20 ml 100 mM tris-HCl-buffer pH 7,6, oppvarmet til ca. 50°C. 200 pl 1* H20 ble tilsatt og substratoppløsningen tilsatt med sprøyte til strimlene gjennom et mikrofilter (0,2 pm, millipore) på sprøyten. Reaksjonen ble tillatt å skje i 5 minutter og reaksjonen stanset ved vasking av strimlene med H20 og lufttørking.

1.4 Bedømmelse

I ABC-prosedyren ble positivitet påvist som en blåfarve. Når kolloid gull ble benyttet, er positiviteten rosa til rødaktig, alt efter som størrelsen av det benyttede gullet (større gullpartikler, for eksempel 40 nm, gir en purpuraktig farve). Sensitiviteten for de begge metoder er helt sammenlignbar og er av størrelsesorden 5 ng/pl for tubulin og 30 ng/pl for kalmodulin, under de benyttede betingelser. Spesifisiteten vises ved den negative reaksjonen når antisera absorberes med deres respektive antigen.

Eksempel II

Bedømmelse for nærvær av monoklonale muse-antistoffer mot mikrotubul-forbundne proteiner i kultursupernatanter av voksne hydridomer, ved bruk av gullmerkede geiteantistoffer mot muse-IgG.

2.1 Immunisering av mus

Mus (Balb/C), ble injisert med en homogenisert blanding (se eksempel 1.1) av rottehjerne-mikrobutulproteiner (100 pg/mus), (fremstilt ved to cykler av temperatur-avhengig polymerisering-depolymerisering) og komplett Freund's adjuvans. Injeksjoner ble gitt subkutant på fem punkter på ryggen. Booster-injeksjoner av antigen (100 pg), fremstilt med ukomplett Freund's adjuvans, ble gitt 3 ganger hver 14. dag. 3 dager før fusjon av miltceller med myeolomcellelinjen ble musene gitt en intravenøs injeksjon av 50 pg antigen/mus i 100 pl PBS-buffer.

2.2 Fusjon av miltceller med NS- 1 myelom- celler

NS-l-celler ble fusert med miltceller fra to immuniserte mus i henhold til kjente prosedyrer, og de resulterende hybridomer ble dyrket i fem 96 brønners plater (Nunc) ved 37°C i en vannmettet atmosfære, inneholdende 7* CO2. Efter ca. 2 ukers dyrking ble 100 pl av kultursuperna-tanten fra brønnene inneholdende voksende hybridomer tatt av og behandlet for nærværet av det utskilte monoklonale antistoffet (se 2.4).

2.3 Fremstilling av nitrocellulose- papirstrlmler på hvilket et mønster av proteiner fra SDS- polvakrvlamidgel er elektrofiksert

SDS-polyakrylamidgel-elektroforese av antigenet, (2 x polymerisert mikrotubul-proteiner) ble gjennomført i henhold til Laemmli, på en 7,5* gel. Antigenet som var oppløst og kokt i prøvebufferen ble anbragt på toppen av gelen som et kontinuerlig sjikt, 300 pg pr. gel. Efter at farvestof f-f ronten hadde migrert 3 cm inn i den separerende gel, ble elektroforesen stoppet. En liten vertikal strimmel av gelen ble skåret av for "Coomassie blå"-farving og resten ble benyttet for elektrooppsuging på nitrocellulosepapipr. Gelen ble ekvilibrert ved overføringsbuffer (25 mM tris-192 M glycin/20* (vol/vol) metanol ved pH 8,3), i 30 minutter ved romtemperatur. Gelen ble bragt på et nitrocelluloseark (for-dynket i buffer), og man passet på å unngå eller å fjerne alle innfangede luftbobler. Det hele ble lagt mellom to på forhånd dynkede filterpapirer og to nylondukputer. Dette resulterte i en tett tilpakning i en lukket elektrode-ramme på en EC-elektrooppsugingsapparatur, hvori elektrosugingen ble gjennomført over natten ved 400 mA

ved romtemperatur. Efter elektroforetisk overføring ble gjenværende proteinbindingsseter på nitrocellulose-papiret "quenched" ved inkubering av arkene i 5* BSA i 20 mM' tris-bufret saltoppløsning, pH 8,2, i 30 minutter

ved 47°C. Nitrocellulosearket ble derefter skåret i 3 mm brede strimler, parallelt med elektroforeseretningen. Disse strimlene ble benyttet for bedømmelse av superna-tanten av hybridomceller.

2.4 Detektering av monoklonale antistoffer

100 pl av hver hybridomkultur-supernatant ble overført til 3,5 cm lange 0,5 ml Eppendorf-spisser og fortynnet i 1:5 med 0,4 ml 0,1* BSA-tris. Spissene og strimlene ble gitt et kodenummer. Hver spiss mottok en strimmel og det ble inkubert i 2 timer. Strimlene ble vasket satsvis i

et overskudd av 0,1* BSA-tris og også inkubert satsvis med "GAM G20" (geite-anti-mus-IgG, merket med 20 nm kolloide gullpartikler), oppnådd fra Janssen Life Sciences Products, "GAM G20" ble fortynnet med 0,1* BSA-tris + 0,4* gelatin til en O.D.^28<m>nm = °»1 °6 omsatt over natten. Strimlene ble vasket med 0,1* BSA-tris og H20 og lufttørket.

Positiviteten var klart synlig som rosa til rødaktige bånd (det henvises til de vedlagte eksempler), tilsvarende proteinbånd med en gitt molekylmasse. Denne meget enkle bedømmelsesprosedyren identifiserer ikke bare antistoffutskillende hybridomer, men gir umiddelbart informasjon hva angår spesifisiteten for det angjeldende antistoffet, og er derfor til stor hjelp når det gjelder selektering av interessante antistoff-sekreterende hybridomer.

Eksempel III

En sandwich-immuno-sugeoverlagsanalyse for detektering av antigener ii en vandig prøve: detektering av IgG'er i en vandig prøve.

3.1 Analysens prinsipp

En liten dråpe (± 1 pl) av et renset eller anriket antistoff monospesifikt for antigenet som skal påvirkes, suges på en strimmel av nitrocellulosepapir (eller et annet hensiktsmessig sugemedium), tørkes og fri-proteinbindingssetene "quenches", (se eksempel 1.3). Eventuelt kan disse antistoffholdige og quenchede strimler vaskes i vann, lufttørkes og lagres. Strimlene inkuberes så med et volum antigenholdig prøveoppløsning i en fastsatt tid. Efter avvasking av ikke-bundet substans blir strimlene ytterligere inkubert med egnet fortynnet kolloid metallpartikkel (for eksempel en sol av gull eller sølv), merket monospesifikt antistoff, tilsvarende det som er absorbert på sugemediet. Eventuelt kan to monoklonale antistoffer, hver erkjen-nende en forskjellig antigenisk epitop, benyttes. En bindes til sugemediet, den andre til de kolloide metallpartikler. Under faste betingelser vil analysen være I stand til å påvise en på forhånd bestemt minimal konsentrasjonantigen og kan brukes som en kvalitativ diagnoseprøve, forutsatt at den kan detektere en minimal krevet konsentrasjon i en gitt prøveoppløsning.

3.2 Eksempel på prinsippet: detektering av kanin- IgG i en bufret oppløsning av kanin- IgG med k. ient konsentrasjon For å prøve anvendeligheten av prinsippet ved denne nye sandwich-analysen ble følgende forsøk gjennomført: 6 strimler på 6 cm x 0,6 cm av nitrocellulosepapipr ble gitt 6 dråper på 1 pl, inneholdende synkende mengder (VS fortynningsserie startende med 125 ng/pl) av affinitetsrenset geite-antistoffer mot kanin-IgG (GAR-IgG) som beskrevet i eksempel 1.2;

Gjenværende proteinbindingsseter ble quenchet som beskrevet i eksempel 1.2. 1 strimmel, (nr. 6), ble vasket i 20 mM tris-buffer saltoppløsning, suget opp tørr på filterpapir, lufttørket og benyttet efter lagring i tørr tilstand over natten ved romtemperatur ;

De gjenværende 5 strimler ble inkubert i tilstoppede plastrør i 30 minutter ved romtemperatur som følger:

Kanin-IgG ble fortynnet i 0,1* BSA-tris. Strimmel nr.

6 ble inkubert med 0,25 pg/ml RIgG.

Strimlene ble vasket 2 x 10 minutter i 0,1* BSA-tris.

Alle strimlene ble inkubert i nøyaktig 1 time ved romtemperatur i "GAR G20" (geite-antistoffer mot kanin-IgG, merket med kolloide gullpartikler med diameter på 20 nm), fra Janssen Life Sciences Products. "GAR G20" ble fortynnet ved en O.D.£28<m>nm = 0,2 med 0,1* BSA-tris + 0,4* gelatin;

Strimlene ble vasket med 0,1* BSA-tris, så med vann og lufttørket.

3.3 Bedømmelse

Flekker inneholdende helt ned til 15 ng absorbert GAR-IgG, ble synlige som rosa flekker efter inkubering i 30 minutter i 1 ml av en oppløsning inneholdende 15 ng/ml RIgG fulgt av inkubering med 1 ml "GAR G20" 0,0520 nm= 0,2 i en time. Oppløsninger inneholdende minst denne mengden RIgG, ville være bedømt positive. Resultatene av strimmel nr. 6 er identisk med de til strimmel nr. 2, noe som indikerer at strimlene kan tørkes efter quenchingstrinnet, med retensjon av antistoff-aktivi-teten.

Eksempel IV

Direkte detektering av et antigen festet til NC-papir med kolloid sølvmerket primærantistoff: detektering av flekker av muse-IgG med kolloid sølvmerkede geiteantistoffer mot muse-IgG.

NC-papir i strimler på 6 cm x 0,6 cm ble merket med flekker av muse-IgG (1 pl) inneholdende en to-ganger seriefortynning fra 250-0,4 ng/pl som beskrevet i eksempel 1.2;

De gjenværende proteinbindingsseter ble quenchet som i

eksempel 1.2;

Strimlene ble inkubert med kolloid sølvmerkede geite-antistoffer mot muse-IgG fra E.Y. Laboratories, fortynnet i 1:100 i 0,1* BSA-tris, i Vå time ved romtemperatur;

Strimlene ble vasket 2 x 10 minutter med 0,1* BSA-tris H2O

og lufttørket;

Positive flekker ble karakterisert ved gul farve. Under

disse betingelser, kunne ± 3 ng i 1 pl flekker detekteres.

Eksempel V

Utprøving av spesifisiteten for et affinitetsrenset kanin-antistoff, mot kyllingkråsaktin for aktin som opptrer i totalcellelysater av sekundære kulturer av kyllingembryo-lungeepitelceller ved bruk av en sugeoverlagsimmunoprøve og gullmerket sekundærantistoff fulgt av sølvforbedring.

5.1 Fremstilling av anti- aktin- antiserum

Elektroforetisk rent kyllingkråsaktin ble homogenisert og injisert i kaniner som beskrevet for tubulin og kalmodulin i eksempel 1.1. Serum ble fremstilt og lagret som beskrevet i eksempel 1.1.

5.2 Affinitetsrensing av antistoffet mot aktin

Aktin ble koblet til "Sepharose-4-B-CNBr" i henhold til produsentens instruksjon. Antistoffet ble renset direkte fra serum. Det sistnevnte ble inkubert med antigenholdig gel. 20 ml serum for 10 mg koblet antigen ble benyttet. Efter 2 timers inkubering ble gelen helt i en kolonne og vasket med 10 nM tris-bufret saltoppløsning (TBS), inntil O.D. ved 280 nm så å si var 0. Ikke-spesifikt absorberende materiale ble eluert med TBS inneholdende 1 M NaCl, efterfulgt av vasking med TBS. Det spesifikke antistoffet ble eluert med 0,1 M glycin-HCl-buffer ved pH 2,8. 1 ml fraksjoner ble umiddelbart nøytralisert med 100 pl 1 M tris-HCl-buffer, pH 8,5. Antistoffreaksjonen ble målt til 280 nm ved bruk av = 14,3. Enhets-mengder av eluerte antistoffer ble lagret ved -20°C uten ytterligere behandling.

5.3 Dyrking av embryonlske kvllinglungeepitelceller Embryoniske kyllinglungeepitelceller ble isolert fra 14-dagers gamle kyllingembryolunger. Vevet ble hakket for hånd og trypsinisert i 0,25* trypsin i Ca<2+> og Mg<2+> fri Hanks balansert saltoppløsning ved 37°C for 20 minutter. Reaksjonen ble stanset med medium og 10* FCS. Efter sentrifugering og resuspendering ble cellene overført til en 75 cm<2> T-kolbe og tillatt binding i 12-24 timer før mediet ble forandret. Efter 24 dager i kulturen ble cellene kort, 2-3 minutter, trypsinisert (i 0,25* trypsinoppløsning) og lagt på plate i 9 cm petriskåler og benyttet efter 3-5 dager i kultur når cellene var konfluente. Cellene ble dyrket i Eagle's minimumsbehov-medium supplert med ikke-vesentlige aminosyrer og 10* fetal kalveserum, og i en fuktet 5* CC^/luftatmosfære ved 37°C.

5.4 Fremstilling av total celle SDS- lysat av embryoniske kyllinglungeepitelceller

Celler, dyrket i 9 mm petriskåler, ble vasket i Ca<2+->, Mg<2+->fri PBS (Dulbecco's) og samlet med en "policeman" av gummi, og nedsenket i absolutt aceton ved —20°C, Eppendorf-spiss (1,5 ml). Acetonet ble fordampet og den tørre celleresten oppløst i kokende SDS-prøvebuffer inneholdende 1 mM TAME (en proteaseinhibitor). Uoppløse-lige rester ble kassert efter sentrifugering. SDS-gel ifølge Laemmli ble kjørt med dette lysatet seriefortyn-net med prøvebuffer og flekket med coomassie-blått, for å bedømme den mest hensiktsmessige prøvefortynning. 1:16 ble benyttet for den efterfølgende elektroforetiske overføring til et Gene dukmembran. En overføringsenhet ble dannet med et spor av slik fortynnet lysat og et spor av en blanding av rensede referanseproteiner: Ch.g. filamin, Ch.g. myosin (H + L hjerne), Ch.g. a-aktinin, BSA, rottehjernetubulin, grisemavetropomyosin, hver i 0,06 pg pr. spor.

Bufferfronten ble nu tillatt å nå bunnen av gelen og elektroforeseoverføringen til Gene dukmembranen ble gjennomført nøyaktig som i eksempel 2.3. Sugeenheten ble skåret ut og gjenværende proteinbindingsseter ble quenchet som beskrevet i eksempel 1.2 og 2.3. Inkubering med et antistoff mot aktin (0,5 pg/ml)og "GAR G20" (O.D. 520 nm = 0,2) og fortynning av "GAR G20" med 0,1* BSA-tris 0,4* gelatin ble gjennomført i forseglede plastposer ± størrelsen av arket, i 2 timer hver, på samme måte som beskrevet i eksempel 2.4.

Efter 2 timers inkubering med "GAR G20" ble arkene vasket med 0,1* BSA-tris og separert for sølvforsterk-ning. På dette tidspunktet var det et rosa-rødaktig bånd, med mobiliteten av aktin, i lysatet, og tilsvarende med aktin i proteinblandingen allerede synlig.

5.5 Sølvforsterkning

Arkene ble vasket i 2 minutter i 1:10 fortynnet citratbuffer-oppløsning. Denne bufferen inneholdt pr. 100 ml 15,5 g trinatriumcitrat og 23,5 g sitronsyre for pH 4;

Arkene ble så inkubert i 15 minutter, omhyggelig beskyttet fra lys i fysikalsk fremkaller inneholdende :

60 ml deionisert H20,

0,85 g hydroquinon i 15,0 ml deionisert H2O,

10 ml citratbuffer pH 4,

0,11 g sølvlaktat i 15,0 ml deionisert H2O.

Sølvlaktatet beskyttes omhyggelig mot lys og tilsettes til de andre komponentene rett før bruk.

Efter reaksjonstiden ble arkene vasket i et overskudd av H2O og behandlet med Agefix (1:4 i EtøO), et fotografisk fikseringsmiddel.

Arkene ble igjen vasket i det overskytende EtøO og lufttørket.

5.6 Resultatet

Båndet som tidligere var synlig som rosa/rødaktig farvebånd er nu helt sort. Antistoffet mot aktin kan ansees som ekstremt spesifikt og har gitt tilfredsstil-lende resultater for immunocytokjemisk flekking av aktinholdige strukturer i de dyrkede cellene.

5.7 Konklusjon

Denne sølvforsterkning øker sterkt kontrasten og sensitiviteten ved detekteringsmetoden. For eksempel ble eksempel 4, flekket med kolloid sølvmerkede antistoffer, ytterligere fremkalt og efter kun 5 minutters reaksjon var detekteringsgrensen 3 i stedet for 30 nm/flekk.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for detektering og/eller determinering i en blot overleggsanalyse av et agglomerat dannet av et bindemiddel og den tilsvarende akseptor omfattende i) immobilisering av akseptorsubstansen til et blot-medium ved direkte adsorbsjon og/eller kovalent binding og quenching av de gjenværende bindingsseter, eller immobilisering av akseptorsubstansen til et blot-medium ved å tillate akseptorsubstansen å bli bundet av et spesifikt bindemiddel som er blitt immobilisert til blot-medie og som derefter ble quenchet; karakterisert ved at den videre omfatter ii) å bringe blot-mediet i kontakt med kolloidmetall-partikkelmerket bindemiddel, eller å bringe blot-mediet i kontakt med et ikke-merket spesifikt bindemiddel og derefter med kolloidmetall-merket protein som er spesifikt for det ikke-merkede spesifikke bindemiddel; og ili) detektering eller determinering av det farvede signal som fremstilles av og er karakteristisk for de bundne kolloidmetallpartikler på setet mellom det spesifikke bindemiddel og den tilsvarende akseptorsubstans på overflaten av blot-mediet, med det blotte øye eller ved bruk av spektrofotometriske teknikker, eventuelt efter påføring av en fysikalsk fremkaller.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som spesifikt bindemiddel benyttes et spesifikt bindende protein.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at blot-membranet vaskes før avlesning av signalet på overflaten av blot-mediet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som kolloide metallpartikler anvendes gull, sølv, platina eller forbindelser av disse metaller eller jern- eller kobberforbindelser med en partikkelstørrelse mellom 3 nm og 100 nm.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som kolloide metallpartikler benyttes gull eller sølv med en partikkelstørrelse mellom 3 nm og 100 nm.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det benyttes gull og/eller sølv med en partikkel-størrelse mellom 5 og 50 nm.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at sluttdetekteringen av de kolloide metallpartikler gjennomføres efter påføring av en fysikalsk fremkaller.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det som fysikalsk fremkaller benyttes en som inneholder sølvioner og et reduksjonsmiddel.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det benyttes en fysikalsk fremkaller som inneholder sølvlaktat eller sølvnitrat.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det benyttes en fysikalsk fremkaller som inneholder hydrokinon.

11. Prøvesett for detektering eller determinering av en av komponentene av reaksjonen mellom et spesifikt bindemiddel og den tilsvarende akseptorsubstans ifølge generelle metoder for blotoverleggsanalyse, karakterisert ved at det inneholder a) kolloidmetallpartikkelmerkede komponenter som forårsaker et farvet signal på reaksjonssetet mellom akseptorsubstansen og det spesifikke bindemiddel på overflaten av et blot-medium; b) komponenter av en fysikalsk fremkaller; og c) andre reagenser.

12. Sett ifølge krav 11, karakterisert ved at de andre reagenser er valgt blant i) buffere ii) ikke-merket bindemiddel og iii) en fikserende oppløsning.