JPS6110772A - 生体成分の分析法 - Google Patents
生体成分の分析法Info
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- JPS6110772A JPS6110772A JP59131556A JP13155684A JPS6110772A JP S6110772 A JPS6110772 A JP S6110772A JP 59131556 A JP59131556 A JP 59131556A JP 13155684 A JP13155684 A JP 13155684A JP S6110772 A JPS6110772 A JP S6110772A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１１↓ｐμ月分！
本発明は、生体成分を免疫血清学的および病理組織学的
に定性、定量するに際して用いられる分析法の改良なら
びにこの分析法を用いる癌の診断法に関する。
に定性、定量するに際して用いられる分析法の改良なら
びにこの分析法を用いる癌の診断法に関する。
従来の技術
従来、生体成分たとえば血清蛋白質の検出には色素染色
法、シルバースティン法、オートラジオグラフィー法、
標識抗体を用いる免疫学的方法たとえば酵素免疫測定法
（ＥＩ’Ａ）、螢光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射性同位
元素免疫測定法（ＲＩ Ａ）などが知られている。酵素
免疫測定法としてはＴａｋｅｄａらの方法（Ｂｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９８３．４．３７１−３７３
）が知られている。従来これらの測定法に従って癌の
診断が行われてきた。
法、シルバースティン法、オートラジオグラフィー法、
標識抗体を用いる免疫学的方法たとえば酵素免疫測定法
（ＥＩ’Ａ）、螢光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射性同位
元素免疫測定法（ＲＩ Ａ）などが知られている。酵素
免疫測定法としてはＴａｋｅｄａらの方法（Ｂｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９８３．４．３７１−３７３
）が知られている。従来これらの測定法に従って癌の
診断が行われてきた。
発註が解決しようとする問題点
色素染色法は、バックグラウンドが高く、不鮮明で検出
感度が劣る。
感度が劣る。
シルバースティン法、オートラジオグラフィー法は、高
感度で精度的にも優れているが、操作が煩雑で、迅速、
′簡！に行えない。また、重金属やアイソトープを用い
るため、廃棄上の問題があり、さらには、測定対象も限
られており、汎用性に乏しい。
感度で精度的にも優れているが、操作が煩雑で、迅速、
′簡！に行えない。また、重金属やアイソトープを用い
るため、廃棄上の問題があり、さらには、測定対象も限
られており、汎用性に乏しい。
免疫学的手法は、単一物質を特異的に検出でき測定感度
が非常に高く、定量性に優れており、応用範囲が広い。
が非常に高く、定量性に優れており、応用範囲が広い。
しかし、放射性同位元素免疫測定法は、ラジオアイソト
ープを用いるため、被爆。
ープを用いるため、被爆。
取扱い管理、廃棄などの問題があり、螢光免疫測定法は
、操作が煩雑で、また二重染色法への適用ができず、用
途が限られている。酵素免疫測定法は、一般に検出感度
が高く、鮮明で、かつ操作も比較的簡単で、迅速性も優
れているといわれている。しかし、従来の酵素標識抗体
を用い、ゲル状支持体内で発色を行わせる方法において
は、バックグラウンドが高く、不鮮明で、感度が低いな
どの問題点があった。
、操作が煩雑で、また二重染色法への適用ができず、用
途が限られている。酵素免疫測定法は、一般に検出感度
が高く、鮮明で、かつ操作も比較的簡単で、迅速性も優
れているといわれている。しかし、従来の酵素標識抗体
を用い、ゲル状支持体内で発色を行わせる方法において
は、バックグラウンドが高く、不鮮明で、感度が低いな
どの問題点があった。
ゲル状支持体または支持膜に生体成分を担持させ、電気
泳動法により生体成分を展開させるとき、一般に泳動の
コントロールマーカーは生体成分とは別に生体成分と平
行に泳動させている。この方法においては、生体成分の
移動距離の再現性が悪く、測定値の精度も低いなどの問
題点があった。
泳動法により生体成分を展開させるとき、一般に泳動の
コントロールマーカーは生体成分とは別に生体成分と平
行に泳動させている。この方法においては、生体成分の
移動距離の再現性が悪く、測定値の精度も低いなどの問
題点があった。
問題点を解決するための 段
ゲル状支持体内での発色系に酵素免疫測定法を応用する
方法はあまり知られておらず、反応の最適条件、つまり
標的物質に特異的に結合する受容体と、酵素、基質など
との組み合わせなどについては充分に検討されていない
。
方法はあまり知られておらず、反応の最適条件、つまり
標的物質に特異的に結合する受容体と、酵素、基質など
との組み合わせなどについては充分に検討されていない
。
本発明者は、生物現象の中で特異反応と考えられるもの
、たとえば抗原と抗体との特異反応、酵素と基質、酵素
と補酵素、アビジンとビオチン。
、たとえば抗原と抗体との特異反応、酵素と基質、酵素
と補酵素、アビジンとビオチン。
ホルモンとレセプター、レクチンと特殊な糖結合。
核酸の相補性（たとえばｐｏｌｙ Ｌｌとｐｏｌｙ Ａ
など）特異結合蛋白（例えばＢ−２蛋白結合蛋白、Ｃ−
反応性蛋白など）、プロティンＡとＩｇＧ分子などに着
目し、生体成分の分析について研究を行った。その結果
、これらの反応の生成物の検出をゲル状支持体中で行う
場合、（ａ）生体成分または生体成分を含む標的物質、
（ｂ）該生体成分または該生体成分を含む標的物質に特
異的に結合する受容体および（ハ）パーオキシダーゼ（
ＰＯＤ）の結合を利用し、結合したパーオキシダーゼの
量に基づいて該生体成分を分析する方法において、過酸
化水素および４−メトキシ−１−ナフトールを基質とし
て用いれば、生体成分を高感度、鮮明、簡便、迅速に定
量分析できることを見出した。
など）特異結合蛋白（例えばＢ−２蛋白結合蛋白、Ｃ−
反応性蛋白など）、プロティンＡとＩｇＧ分子などに着
目し、生体成分の分析について研究を行った。その結果
、これらの反応の生成物の検出をゲル状支持体中で行う
場合、（ａ）生体成分または生体成分を含む標的物質、
（ｂ）該生体成分または該生体成分を含む標的物質に特
異的に結合する受容体および（ハ）パーオキシダーゼ（
ＰＯＤ）の結合を利用し、結合したパーオキシダーゼの
量に基づいて該生体成分を分析する方法において、過酸
化水素および４−メトキシ−１−ナフトールを基質とし
て用いれば、生体成分を高感度、鮮明、簡便、迅速に定
量分析できることを見出した。
先に示したＴａｋｅｄａ らの方法においては、４−ク
ロロ−１−ナフトールを用いる方法が示されているが、
本発明方法は４−メトキシ−１−ナフトールを用いる点
で異なり、しかも効果の点で顕著に優れている。たとえ
ば発色時間、泳動時間が非常に短縮され、しかも泳動図
が鮮明で分析感度。
ロロ−１−ナフトールを用いる方法が示されているが、
本発明方法は４−メトキシ−１−ナフトールを用いる点
で異なり、しかも効果の点で顕著に優れている。たとえ
ば発色時間、泳動時間が非常に短縮され、しかも泳動図
が鮮明で分析感度。
分解能が１桁以上上昇した。
また電気泳動により生体成分を分析定量するとき、従来
法のように泳動のコントロールマーカーを平行して泳動
させず、ブロムフェノールブルーなどの色素を結合した
コントロールマーカーを生体成分と混合して泳動させる
ことによって、従来の方法に比べ、泳動距離の再現性を
著しく高め、測定値の精度を上げることができた。
法のように泳動のコントロールマーカーを平行して泳動
させず、ブロムフェノールブルーなどの色素を結合した
コントロールマーカーを生体成分と混合して泳動させる
ことによって、従来の方法に比べ、泳動距離の再現性を
著しく高め、測定値の精度を上げることができた。
作−一一里
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、生体成分または生体成分を含む標的物質、該
生体成分または該生体成分を含む標的物質に特異的に結
合する受容体およびパーオキシダーゼの結合を利用し、
結合したパーオキシダーゼの量に基づいて該生体成分本
分析する方法において、過酸化水素および４−メトキシ
−１−ナフトールを基質として用いる生体成分の分析法
に関する。
生体成分または該生体成分を含む標的物質に特異的に結
合する受容体およびパーオキシダーゼの結合を利用し、
結合したパーオキシダーゼの量に基づいて該生体成分本
分析する方法において、過酸化水素および４−メトキシ
−１−ナフトールを基質として用いる生体成分の分析法
に関する。
本発明において分析できる生体成分としては、抗原、抗
体、酵素、酵素の基質、補酵素、蛋白質。
体、酵素、酵素の基質、補酵素、蛋白質。
糖蛋白質、糖質、糖脂質、リポ蛋白質、核酸またはホル
モンなどがあげられ、これらは通常各種体液、病理組織
切片中に存在する。
モンなどがあげられ、これらは通常各種体液、病理組織
切片中に存在する。
各種の体液としては例えば血液、尿、唾液、胃液、腸液
、膵液、胆汁１組織液、浮腫液、腹水。
、膵液、胆汁１組織液、浮腫液、腹水。
膨水、心嚢液、関節液、脳を髄液、羊水、性器分泌液、
母乳、鼻汁、喀液、涙、汗、硝子体等が挙げられるが、
就中特に血液を血清または血漿として使用するのが好ま
しい。
母乳、鼻汁、喀液、涙、汗、硝子体等が挙げられるが、
就中特に血液を血清または血漿として使用するのが好ま
しい。
標的物質としては抗原、抗体、酵素、酵素の基質、補酵
素、蛋白質、糖蛋白質、糖質、糖脂質。
素、蛋白質、糖蛋白質、糖質、糖脂質。
リポ蛋白質、核酸、ホルモン、アビジン、ビオチンなど
が挙げられる。
が挙げられる。
受容体としては抗体、プロティンＡ、酵素、酵素の基質
、補酵素、核酸、ホルモン−レセプター。
、補酵素、核酸、ホルモン−レセプター。
特異結合蛋白（Ｂ−２蛋白結合蛋白、Ｃ−反応性蛋白な
ど）、アビジン、ビオチン、レクチンなどが挙げられる
。
ど）、アビジン、ビオチン、レクチンなどが挙げられる
。
本発明方法は一般的酵素免疫測定法に適用できるが、特
にゲル状支持体に担持された生体成分の分析に有用であ
る。特に、受容体としてプロティンＡ９酵素としてパー
オキシダーゼ、基質に過酸化水素および４−メトキシ−
１−ナフトールを用いる方法が優れている。
にゲル状支持体に担持された生体成分の分析に有用であ
る。特に、受容体としてプロティンＡ９酵素としてパー
オキシダーゼ、基質に過酸化水素および４−メトキシ−
１−ナフトールを用いる方法が優れている。
測定を実施するにあたって検体試料の量、酵素標識受容
体の量および比率、基質の量１反応時間および温度など
の条件は測定する物質の種類、使用する受容体の力価、
支持体の種類などによって異なるので各測定について最
も適当な条件を選択する。
体の量および比率、基質の量１反応時間および温度など
の条件は測定する物質の種類、使用する受容体の力価、
支持体の種類などによって異なるので各測定について最
も適当な条件を選択する。
例えば、ゲル電気泳動後の染色に、標識プロティンＡを
用いた場合では、ゲル電気泳動抜脱蛋白操作をしたのち
、ＰＯＤ標識プロティンＡを一定量ゲルの表面上に滴下
し、はぼ室温下、好ましくは１５〜２５℃で３０〜４５
分間放置する。次いで３０〜４０分間適当な緩衝液で洗
浄した後、４−メドキシー１−ナフトールを加えて酵素
反応を行わせる。
用いた場合では、ゲル電気泳動抜脱蛋白操作をしたのち
、ＰＯＤ標識プロティンＡを一定量ゲルの表面上に滴下
し、はぼ室温下、好ましくは１５〜２５℃で３０〜４５
分間放置する。次いで３０〜４０分間適当な緩衝液で洗
浄した後、４−メドキシー１−ナフトールを加えて酵素
反応を行わせる。
沈降線が十分に発色したのち（通常は２〜３分間で反応
）洗浄脱色し、未反応物質を洗い流し反応を停止する。
）洗浄脱色し、未反応物質を洗い流し反応を停止する。
洗浄脱色には、適当な試液を使用しても良いが、流水を
用いるのが簡便迅速で好ましい。急激に乾燥処理すると
ゲルの乾燥に斑が生じ、表面が凸凹となり、測定に支障
をきたすので、室温〜６０℃で乾燥させるのが好ましい
。破損に気をつければ永久保存も可能である。
用いるのが簡便迅速で好ましい。急激に乾燥処理すると
ゲルの乾燥に斑が生じ、表面が凸凹となり、測定に支障
をきたすので、室温〜６０℃で乾燥させるのが好ましい
。破損に気をつければ永久保存も可能である。
ＰＯＤ標識プロティンＡ１１度は、適当な希釈液で０．
０１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）に調製されたものが好ましく
、希釈液には、ｐＨ約８．６のバルビタール緩衝液を用
いるのが好ましい。バルビタール緩衝液のＮａＣβ濃度
は０．０５〜０．５Ｍが好ましい。
０１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）に調製されたものが好ましく
、希釈液には、ｐＨ約８．６のバルビタール緩衝液を用
いるのが好ましい。バルビタール緩衝液のＮａＣβ濃度
は０．０５〜０．５Ｍが好ましい。
さらに発色用試液には４−メトキシ−１−ナフトールを
適当な溶剤で約１％に溶解したものをさらに０．００１
〜０．１％に希釈して用いる。希釈液としては、ｐＨ約
７，０〜８．５のトリス塩酸緩衝液が好ましい。ゲル状
支持体の調製法は特に限定されることなく、通常の方法
を採用できる。例えば蒸留水、ｐＨ約８．６のバルビタ
ール緩衝液またはトリス塩酸緩衝液などの希釈液に一定
量の寒天、アガロースなどを加え、静かに攪拌下、６０
〜８０℃に加温して溶解し所定の平板上に流し、放冷し
てゼリー状に凝固させる。
適当な溶剤で約１％に溶解したものをさらに０．００１
〜０．１％に希釈して用いる。希釈液としては、ｐＨ約
７，０〜８．５のトリス塩酸緩衝液が好ましい。ゲル状
支持体の調製法は特に限定されることなく、通常の方法
を採用できる。例えば蒸留水、ｐＨ約８．６のバルビタ
ール緩衝液またはトリス塩酸緩衝液などの希釈液に一定
量の寒天、アガロースなどを加え、静かに攪拌下、６０
〜８０℃に加温して溶解し所定の平板上に流し、放冷し
てゼリー状に凝固させる。
ゲルの濃度は生体成分（標的物質）−Ｆ織受容体結合体
、および反応生成物（色素）の大きさく分子量、立体構
造など）により選択される。該ゲルハ通常０．５〜２．
０％（Ｉｔ／Ｖ）、特ニ０．８〜１．０％（１１／ｖ）
が好ましく、またこのゲルには必要により防腐剤を添加
してもよい。
、および反応生成物（色素）の大きさく分子量、立体構
造など）により選択される。該ゲルハ通常０．５〜２．
０％（Ｉｔ／Ｖ）、特ニ０．８〜１．０％（１１／ｖ）
が好ましく、またこのゲルには必要により防腐剤を添加
してもよい。
本発明では、ゲル状支持体のほか、支持膜に担持さた生
体成分の分析においても有用であり、支持膜としては、
例えば、ニトロセルロース膜、セルロース−アセテート
膜、アセテート膜などが用いられる。さらには、組織化
学、細胞化学の分野で行われる組織切片の免疫組織化学
染色にも応用可能である。
体成分の分析においても有用であり、支持膜としては、
例えば、ニトロセルロース膜、セルロース−アセテート
膜、アセテート膜などが用いられる。さらには、組織化
学、細胞化学の分野で行われる組織切片の免疫組織化学
染色にも応用可能である。
電気泳動法により体液中の生体成分を分析定量する場合
は、泳動のコントロールマーカーとして、通常は色素を
結合したアルブミンを平行して泳動するが、一般的に従
来の方法ではゲルの位置による構造の歪み、ゲル構造の
不均一性、電気的負荷条件、温度の相違などにより、コ
ントロールマーカーと生体成分の泳動条件に差異が生じ
やすく、再現性に乏しく、測定値の精度にも問題が残る
。
は、泳動のコントロールマーカーとして、通常は色素を
結合したアルブミンを平行して泳動するが、一般的に従
来の方法ではゲルの位置による構造の歪み、ゲル構造の
不均一性、電気的負荷条件、温度の相違などにより、コ
ントロールマーカーと生体成分の泳動条件に差異が生じ
やすく、再現性に乏しく、測定値の精度にも問題が残る
。
本発明者は、生体成分と抗原特異性の異なる蛋白質を内
部標識物質として用い、かつ支持体中にこの内部標準物
質と特異的に結合する受容体を添加すれば、従来法より
精度および再現性に優れた測定値が得られることを見出
した。
部標識物質として用い、かつ支持体中にこの内部標準物
質と特異的に結合する受容体を添加すれば、従来法より
精度および再現性に優れた測定値が得られることを見出
した。
すなわち、色Ｓ（例えばプロムフェノルブルー以下ＢＰ
、Ｂ）で着色された内部標準物質と体液との混合物を、
生体成分および内部標準物質に対する抗体を含むゲル状
支持体上で電気泳動を行えば、精度および再現性に優れ
た測定値が得られる。
、Ｂ）で着色された内部標準物質と体液との混合物を、
生体成分および内部標準物質に対する抗体を含むゲル状
支持体上で電気泳動を行えば、精度および再現性に優れ
た測定値が得られる。
本発明に用いる内部標準物質は、生体成分と交差反応性
を示さない物質が適用される。該蛋白質としては、ヒト
血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン
、ニワトリ血清アルブミンなどが挙げられるが、とくに
、卵白アルブミン。
を示さない物質が適用される。該蛋白質としては、ヒト
血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン
、ニワトリ血清アルブミンなどが挙げられるが、とくに
、卵白アルブミン。
ニワトリ血清アルブミンが好ましい。
受容体としては、これらアルブミンに対するモノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体が用いられる。
ナルまたはポリクローナル抗体が用いられる。
内部標準物質を着色する色素としては、ブロムフェノー
ルブルー、ブロムチモールブルーなどが挙げられる。泳
動中の非結合型色素によるテーリングを避けるため、こ
れらの色素の濃度は０．００１〜０．１％（１１／Ｖ）
に調整するのが好ましい。
ルブルー、ブロムチモールブルーなどが挙げられる。泳
動中の非結合型色素によるテーリングを避けるため、こ
れらの色素の濃度は０．００１〜０．１％（１１／Ｖ）
に調整するのが好ましい。
本発明方法においては、色素、内部標準物質。
および体液を直接混合させるか、あるいは色素と内部標
準物質との混合物を反応平板上に塗抹し乾燥したのち、
体液をこの平板上に滴下して混合する。
準物質との混合物を反応平板上に塗抹し乾燥したのち、
体液をこの平板上に滴下して混合する。
後者の方法は体液中の生体成分濃度の影響を受けず、か
つ内部標準物質の保存安定性も優れており、操作も簡便
迅速で好ましい。
つ内部標準物質の保存安定性も優れており、操作も簡便
迅速で好ましい。
次に本発明を実施例を用いることによって具体的に説明
するが、本発明は以下の実施例によってその範囲を限定
されるものではない。
するが、本発明は以下の実施例によってその範囲を限定
されるものではない。
実施例１゜
ロケット、電気泳動法による定量性の検討ａ）ＡＦＰ標
準血清の調製： ΔＦＰｓ準血清（１０４１ｎｇ／ｍｌ、ダコ（ＤＡＫＯ
）社（デンマーク）製〕を正常ヒト血清（Ａ Ｆ Ｐ
： ５ｎｇ／ｍｌ以下）で希釈し、ＡＦＰＨＡ準血清（
１００，２００，４００，６００゜８００ｎｇ／ｍｌ）
を調製した。
準血清の調製： ΔＦＰｓ準血清（１０４１ｎｇ／ｍｌ、ダコ（ＤＡＫＯ
）社（デンマーク）製〕を正常ヒト血清（Ａ Ｆ Ｐ
： ５ｎｇ／ｍｌ以下）で希釈し、ＡＦＰＨＡ準血清（
１００，２００，４００，６００゜８００ｎｇ／ｍｌ）
を調製した。
ｂ）抗ＡＦＰ含有アガロース板の作製：１．０％アガロ
ース（ＦＭＣＭａｒｉｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓＤｉｖｉ
ｓｉｏｎ社（米）製、ｐＨ，８，６，イオン強度０．０
５のバルピタール緩衝液で溶解）１０ｍｌに抗ＡＦＰ血
清（ダコ社製）を２０μｌ≠耐混合した。この抗ＡＦＰ
血清含有アガロースゲルをゲルボンド（ＦＭＣＭａｒｉ
ｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ社製、 １
１０ Ｘ１２５ ＩＩｌｍ）に流し込み、凝固させて厚
さ約１ｆｌ１ｍの抗ＡＦＰ含有アガロース板を作製した
。
ース（ＦＭＣＭａｒｉｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓＤｉｖｉ
ｓｉｏｎ社（米）製、ｐＨ，８，６，イオン強度０．０
５のバルピタール緩衝液で溶解）１０ｍｌに抗ＡＦＰ血
清（ダコ社製）を２０μｌ≠耐混合した。この抗ＡＦＰ
血清含有アガロースゲルをゲルボンド（ＦＭＣＭａｒｉ
ｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ社製、 １
１０ Ｘ１２５ ＩＩｌｍ）に流し込み、凝固させて厚
さ約１ｆｌ１ｍの抗ＡＦＰ含有アガロース板を作製した
。
ｃ）ＰＯＤＩ織プロティンＡ希釈液の調製：ＰＯＤ標識
プロティンＡ （Ｂ、Ｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
（米）製〕２０μＪに、希釈液ＣＮａＣ１１４、Ｏｇを
バルビタール緩衝液（ｐＨ８，６）１１に溶解したも（
Ｄ〕１ Ｑｍｌを混和し、０．２％ＰＯＤ標識プロティ
ンＡ希釈液とした。
プロティンＡ （Ｂ、Ｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
（米）製〕２０μＪに、希釈液ＣＮａＣ１１４、Ｏｇを
バルビタール緩衝液（ｐＨ８，６）１１に溶解したも（
Ｄ〕１ Ｑｍｌを混和し、０．２％ＰＯＤ標識プロティ
ンＡ希釈液とした。
ｄ〉発色用試液の調製：
４−メトキシ−１−ナフトール（４−ｍｅｔｈｏｘｙ−
ｌ −ｎａｐｈｔｏ＋ 、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ ）社（米）製〕２００μＬ０．０５Ｍ）リス塩酸緩
衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン１２．１１
４ｇ／ｌと０．１Ｍ ＨＣｊ！を１００ニア７で混合
した液、ｐＨ７，６）１０ｍｌおよび３０％）１２０２
１滴を使用直前に混合し発色用試液とした。
ｌ −ｎａｐｈｔｏ＋ 、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ ）社（米）製〕２００μＬ０．０５Ｍ）リス塩酸緩
衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン１２．１１
４ｇ／ｌと０．１Ｍ ＨＣｊ！を１００ニア７で混合
した液、ｐＨ７，６）１０ｍｌおよび３０％）１２０２
１滴を使用直前に混合し発色用試液とした。
ｅ）ＡＦＰの測定：
上記（ａ）で得たへＦＰＪＩ準血清（１００，２００゜
４００．６００．８００ｎｇ／ｍｌ）各々１０ｔｔｌｌ
を上記（ハ）で調製した抗ＡＦＰ含有アガロース板の孔
（直径４．０ ｍｓ ）に注入し、３＋ｎ＾／ｃｍ、
９０分。
４００．６００．８００ｎｇ／ｍｌ）各々１０ｔｔｌｌ
を上記（ハ）で調製した抗ＡＦＰ含有アガロース板の孔
（直径４．０ ｍｓ ）に注入し、３＋ｎ＾／ｃｍ、
９０分。
１０℃冷却下にて電気泳動を行った。泳動後、吸着バッ
ト（日本商事社製）で２〜３分間処理して脱蛋白したの
ち、リン酸緩・衡液（ｐＨ７，２）で３０分間洗浄した
。再び吸着バットを用いて乾燥し、上記（Ｃ）で調製し
たＰＯＤ標識プロティンＡ １ Ｑｍｌを平板上に流し
た。３０分間反応後、再び吸着バットによる乾燥、洗浄
〔リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で３０分間〕、吸着バッ
トによる乾燥を上記と同様に繰り返したのち、上記（６
）で調製した発色用試液Ｉ Ｑｍｌを加え、２〜３分間
反応させた。２〜３分間水洗したのち、吸着バットで乾
燥させて、沈降線の高さを測定した。
ト（日本商事社製）で２〜３分間処理して脱蛋白したの
ち、リン酸緩・衡液（ｐＨ７，２）で３０分間洗浄した
。再び吸着バットを用いて乾燥し、上記（Ｃ）で調製し
たＰＯＤ標識プロティンＡ １ Ｑｍｌを平板上に流し
た。３０分間反応後、再び吸着バットによる乾燥、洗浄
〔リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で３０分間〕、吸着バッ
トによる乾燥を上記と同様に繰り返したのち、上記（６
）で調製した発色用試液Ｉ Ｑｍｌを加え、２〜３分間
反応させた。２〜３分間水洗したのち、吸着バットで乾
燥させて、沈降線の高さを測定した。
得られた標準曲線を第１図に示また。
実施例２゜
コンカナバリン−Ａ〔以下″Ｃｏｎ−Ａ″という。ファ
ルマシア・ファインケミカルズ社（スウェーデン）製〕
−吸着交叉免疫電気泳動（ＣＡＦＥ’）法による羊水中
ＡＦＰの測定 ａ）被検試料の調製： 妊娠７〜１８週の妊婦１６名から採取した羊水を遠心分
離（３０００ｒｐｍ、２０分間）にかけ、上清にＮ ａ
Ｎ ｓを約０．００１％（Ｗ／Ｖ）になるように加え
て一２０℃にて凍結乾燥し被検試料とした。
ルマシア・ファインケミカルズ社（スウェーデン）製〕
−吸着交叉免疫電気泳動（ＣＡＦＥ’）法による羊水中
ＡＦＰの測定 ａ）被検試料の調製： 妊娠７〜１８週の妊婦１６名から採取した羊水を遠心分
離（３０００ｒｐｍ、２０分間）にかけ、上清にＮ ａ
Ｎ ｓを約０．００１％（Ｗ／Ｖ）になるように加え
て一２０℃にて凍結乾燥し被検試料とした。
ｂ）Ｃｏｎ−Ａ含有アガロース板の作製（−次元のバル
ピタール緩衝液で溶解＞１０ｍ１にＣａｎＡ含有Ｔカロ
ース−１）ｍｌをゲルボンド（ＦＭＬ；Ｍａｒｉｎｅ
Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ社製、１１０Ｘ１
２５ＩＩＩＩ１１）上に流し込み、凝固させて、厚さ約
１圓のＣｏｎ−Ａ含有アガロース板を作製した。
ピタール緩衝液で溶解＞１０ｍ１にＣａｎＡ含有Ｔカロ
ース−１）ｍｌをゲルボンド（ＦＭＬ；Ｍａｒｉｎｅ
Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ社製、１１０Ｘ１
２５ＩＩＩＩ１１）上に流し込み、凝固させて、厚さ約
１圓のＣｏｎ−Ａ含有アガロース板を作製した。
ｃ）ＡＦＰの測定：
（ａ）で得たサンプル１０μ矛を（ハ）で調製したＣｏ
ｎ−Ａ含有アガロース板の孔（直径４ｍｍ）に注入し、
−次元電気泳動を行った。泳動は、バルビクール緩衝液
（ｐＨ８，６）を用いて、３ｍＡ／ｃｍ、９Ｑ分、１０
℃冷却下に行った。また対照として３％（Ｉｆ／Ｖ）ヒ
ト血清アルブミン〔シグマ社（米）製、 ｆｒａｃｔｉ
ｏｎＶ、 ０．０１％（１１／Ｖ ）ＢＰＢ含有）５ｔ
ｔｌを用い、約６ＣＩ１１泳動した位置に印をつけた。
ｎ−Ａ含有アガロース板の孔（直径４ｍｍ）に注入し、
−次元電気泳動を行った。泳動は、バルビクール緩衝液
（ｐＨ８，６）を用いて、３ｍＡ／ｃｍ、９Ｑ分、１０
℃冷却下に行った。また対照として３％（Ｉｆ／Ｖ）ヒ
ト血清アルブミン〔シグマ社（米）製、 ｆｒａｃｔｉ
ｏｎＶ、 ０．０１％（１１／Ｖ ）ＢＰＢ含有）５ｔ
ｔｌを用い、約６ＣＩ１１泳動した位置に印をつけた。
一次元電気泳動後、アガロース板を泳動方向と平行に約
ＩＣｌ１１の巾で切り取り、実施例１−（社）で調製し
た抗ＡＦＰ含有アガロース板に密着させ、−次元展開方
向に対して直角方向に２．５ｍＡ／ｃｍ、２時間、１０
℃冷却下に二次元電気泳動を行った。
ＩＣｌ１１の巾で切り取り、実施例１−（社）で調製し
た抗ＡＦＰ含有アガロース板に密着させ、−次元展開方
向に対して直角方向に２．５ｍＡ／ｃｍ、２時間、１０
℃冷却下に二次元電気泳動を行った。
泳動後、吸着バット（日本商事社製）で２〜３分間処理
して脱蛋白したのち、リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，２）で
３０分間洗浄した。再び吸着バットを用いて乾燥し、実
施例１−（Ｃ）で調製したＰＯＤ標識プロティンＡ １
０ｍｌを平板上に流した。３０分間反応後、再び吸着バ
ットによる乾燥、洗浄〔リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，２）
で３０分間〕、吸着バットによる乾燥を上記と同様に繰
り返したのち、実施例１−（６）で調製した発色試液１
０ｍ１を加え、２〜３分間反応させた。２〜３分間水洗
し、吸着バットで乾燥させて、−次元電気泳動で得たア
ルブミンの位置から二次元電気泳動で現れた泳動ピーク
までの距離を測定した。
して脱蛋白したのち、リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，２）で
３０分間洗浄した。再び吸着バットを用いて乾燥し、実
施例１−（Ｃ）で調製したＰＯＤ標識プロティンＡ １
０ｍｌを平板上に流した。３０分間反応後、再び吸着バ
ットによる乾燥、洗浄〔リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，２）
で３０分間〕、吸着バットによる乾燥を上記と同様に繰
り返したのち、実施例１−（６）で調製した発色試液１
０ｍ１を加え、２〜３分間反応させた。２〜３分間水洗
し、吸着バットで乾燥させて、−次元電気泳動で得たア
ルブミンの位置から二次元電気泳動で現れた泳動ピーク
までの距離を測定した。
羊水中のＡＦＰは、Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡ Ｉ Ｅを用いる
と、２個の分画に分かれる。−次元電気泳動でレクチン
を含有しないアガロース平板上でＡＦＰが泳動する位置
に免疫沈降峰を作る分画がＣｏｎ＝Ａ非吸着ＡＦＰ （
ｂ峰）で、これより陰極側に出現するピークがＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰ （ａ蜂）である。ａ峰とｂ峰の高さの和
を１００％として、ｂ峰の割合を給金に従ってグラフに
したものが第２図である。第２図は、羊水中のＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰは経時的に増加の傾向をしていることを示
している。
と、２個の分画に分かれる。−次元電気泳動でレクチン
を含有しないアガロース平板上でＡＦＰが泳動する位置
に免疫沈降峰を作る分画がＣｏｎ＝Ａ非吸着ＡＦＰ （
ｂ峰）で、これより陰極側に出現するピークがＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰ （ａ蜂）である。ａ峰とｂ峰の高さの和
を１００％として、ｂ峰の割合を給金に従ってグラフに
したものが第２図である。第２図は、羊水中のＣｏｎ−
Ａ吸着ＡＦＰは経時的に増加の傾向をしていることを示
している。
実施例３゜
Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥによる肝癌患者血清中のＡＦＰの
測定 ａ）被検試料の調製： 原発性肝癌４７例、転移性肝癌８例の各血清を正常ヒト
血清（Ａ Ｆ Ｐ ： ５ｎｇ／ｍｌ以下）で希釈し、
１５．０００ｎｇ／ｍ１以下にｍ製したものを被検試料
とした。
測定 ａ）被検試料の調製： 原発性肝癌４７例、転移性肝癌８例の各血清を正常ヒト
血清（Ａ Ｆ Ｐ ： ５ｎｇ／ｍｌ以下）で希釈し、
１５．０００ｎｇ／ｍ１以下にｍ製したものを被検試料
とした。
ｂ）ＡＦＰの測定：
実施例２と同様の方法で行った。
その結果、Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡ Ｉ Ｅによる肝癌患者血
清の代表的な泳動像は、ａ峰のみ出現するタイプ（１型
）、ａ峰、ｂ峰の２分画が出現するタイプ（２型）、お
よびｂ峰のみ出現するタイプ（３型）に分かれる。第１
表および第２表に示される通り、原発性肝癌血清中のＡ
ＦＰは、１型（ａ峰のみ）および２型（ａ峰〉ｂ峰）に
分画されるが、転移性肝癌では２型（ａ峰くｂ峰）およ
び３型（ｂ峰のみ）に分画され、癌の鑑別診断に有用で
ある。
清の代表的な泳動像は、ａ峰のみ出現するタイプ（１型
）、ａ峰、ｂ峰の２分画が出現するタイプ（２型）、お
よびｂ峰のみ出現するタイプ（３型）に分かれる。第１
表および第２表に示される通り、原発性肝癌血清中のＡ
ＦＰは、１型（ａ峰のみ）および２型（ａ峰〉ｂ峰）に
分画されるが、転移性肝癌では２型（ａ峰くｂ峰）およ
び３型（ｂ峰のみ）に分画され、癌の鑑別診断に有用で
ある。
第 １ 表
Ｃｏｎ−Ａ−ＣＡＩＢによるＡＰＰ分画の発現頻度１型
ａ ２９ （６１，７％） ０２型
ａ 、 ｂ １ｇ （３８，３％） ６（７
５％）３型 ｂ Ｏ２（２５％）本 １症
例について２回以上測定し、１度でも２型が出た例はす
べて２型に分類した。
ａ ２９ （６１，７％） ０２型
ａ 、 ｂ １ｇ （３８，３％） ６（７
５％）３型 ｂ Ｏ２（２５％）本 １症
例について２回以上測定し、１度でも２型が出た例はす
べて２型に分類した。
第 ２ 表
Ｃｏｎ−＾−ＣＡＩＢの２型におけるｂ峰の高さと肝癌
の種類検討数 １８ ６ ｂ峰の高さ 平均％ １４．１±３．６” ４４．５±２０．２”
範 囲 ８〜２２１７〜６８″１ 山級
り電：゛１■定０１合１゛１１高パ９″２ 山駁掻七Ｍ
ｒｌ［［定Ｌ ｆｓ ＠ ’６１．： Ｉｔ“パ７実施
例４゜ 内部標準物質としてニワトリ血清アルブミン（シグマ社
製品、 ｆｒａｃｔｉｏｎＶ ）を用いる癌患者血清中
のＡＦｐ測定方法 ａ）被検試料の調製： ０．００２５％（ｌ！ｌ／ｖ）ニワトリ血清アルフミン
を用いて、ＢＰＢ （シグマ社製）を０．０．０５％ｕ
ｌ／Ｖ）に調製したのち、その１０μｌをプレート上に
塗抹し乾燥させた。このプレート上に肝癌患者血清をパ
スツールピペットで１ｍ（２５μり滴下混合し、被検試
料とした。
の種類検討数 １８ ６ ｂ峰の高さ 平均％ １４．１±３．６” ４４．５±２０．２”
範 囲 ８〜２２１７〜６８″１ 山級
り電：゛１■定０１合１゛１１高パ９″２ 山駁掻七Ｍ
ｒｌ［［定Ｌ ｆｓ ＠ ’６１．： Ｉｔ“パ７実施
例４゜ 内部標準物質としてニワトリ血清アルブミン（シグマ社
製品、 ｆｒａｃｔｉｏｎＶ ）を用いる癌患者血清中
のＡＦｐ測定方法 ａ）被検試料の調製： ０．００２５％（ｌ！ｌ／ｖ）ニワトリ血清アルフミン
を用いて、ＢＰＢ （シグマ社製）を０．０．０５％ｕ
ｌ／Ｖ）に調製したのち、その１０μｌをプレート上に
塗抹し乾燥させた。このプレート上に肝癌患者血清をパ
スツールピペットで１ｍ（２５μり滴下混合し、被検試
料とした。
ｂ）レンチルレクチン（以下ＬＣＨという。ファルマシ
ア・ファインケミカルズ社製）含有アガロース板の作！
Ｉ！ｌ（−次元泳動用）：Ｃ）二次元泳動用アガロース
板の作製：実施例１−（ｂ）に準じて、１゜０％アガロ
ース１０ｍ１に抗ＡＦＰ血清（ダコ社製）２０μβふよ
び抗ニワトリ血清アルブミン血清（（：ａｐｐｅ１社（
米）製〕１０μβを混合し、以下同様の方法で作製した
。
ア・ファインケミカルズ社製）含有アガロース板の作！
Ｉ！ｌ（−次元泳動用）：Ｃ）二次元泳動用アガロース
板の作製：実施例１−（ｂ）に準じて、１゜０％アガロ
ース１０ｍ１に抗ＡＦＰ血清（ダコ社製）２０μβふよ
び抗ニワトリ血清アルブミン血清（（：ａｐｐｅ１社（
米）製〕１０μβを混合し、以下同様の方法で作製した
。
ｄ）ＡＦＰの測定：
上記（ａ）で得た被検試料１０μβを上記ら）で調製し
たＬＣＨ含有アガロース板の孔に注入し、実施例２−（
Ｃ）と同一条件下で一次元電気泳動を行い、泳動後のＢ
ＰＢマーカーの位置に印をつけた。
たＬＣＨ含有アガロース板の孔に注入し、実施例２−（
Ｃ）と同一条件下で一次元電気泳動を行い、泳動後のＢ
ＰＢマーカーの位置に印をつけた。
次いで、アガロース板を泳動方向と平行に切り取り上記
（Ｃ）で作製したアガロース板に密着させ、以下実施例
２−（Ｃ）と同一条件下で二次元電気泳動を行い、発色
させた。ニワトリ血清アルブミンの沈降篩の位置を原点
とし、ここから、各泳動ピークまでの距離を測定した。
（Ｃ）で作製したアガロース板に密着させ、以下実施例
２−（Ｃ）と同一条件下で二次元電気泳動を行い、発色
させた。ニワトリ血清アルブミンの沈降篩の位置を原点
とし、ここから、各泳動ピークまでの距離を測定した。
その結果ニワトリ血清アルブミンの沈降篩は、肝癌患者
血清の沈降篩と交叉せず、かつ、−次元泳動後のＢＰＢ
マーカーとほぼ同一の位置に、沈降篩を形成した。
血清の沈降篩と交叉せず、かつ、−次元泳動後のＢＰＢ
マーカーとほぼ同一の位置に、沈降篩を形成した。
発明の効果
本発明により、生体成分の検出が従来より低いバックグ
ラウンドで、鮮明にかつ高感度で迅速。
ラウンドで、鮮明にかつ高感度で迅速。
簡便に、再現性よく、高い精度で行なえることとなった
。とくに、ゲル状支持体内での発色系においては、測定
感度が２．０００ｍｇ／ｍ＋から約１１００ｎ ／ｍｌ
と約２０倍感度アップし、またスクリーニング用として
も充分適用可能である。さらに内部標準系の導入で高い
再現性と高い精度がもたらされた。一般的に、反応時間
を短縮すると測定感度右よび精度は低下するという問題
があったが、本発明により、測定時間が著しく短縮でき
、しかも測定感度および精度も著しく向上された。
。とくに、ゲル状支持体内での発色系においては、測定
感度が２．０００ｍｇ／ｍ＋から約１１００ｎ ／ｍｌ
と約２０倍感度アップし、またスクリーニング用として
も充分適用可能である。さらに内部標準系の導入で高い
再現性と高い精度がもたらされた。一般的に、反応時間
を短縮すると測定感度右よび精度は低下するという問題
があったが、本発明により、測定時間が著しく短縮でき
、しかも測定感度および精度も著しく向上された。
例えば、実施例２のＣｏｎ−Ａ−ＣＡＩＥ法の場合、第
二次元の泳動時間は蛋白染色で１６時間を要していたも
のが２時間で泳動可能となった。
二次元の泳動時間は蛋白染色で１６時間を要していたも
のが２時間で泳動可能となった。
また発色時間も、通常の方法では３０分〜１時間を要し
ていたのが、わずか２〜３分間に短縮された。さらには
、感度アップしたために、第二次元泳動の抗体濃度も、
０．１５〜０．３％で検出可能となったことも大きい。
ていたのが、わずか２〜３分間に短縮された。さらには
、感度アップしたために、第二次元泳動の抗体濃度も、
０．１５〜０．３％で検出可能となったことも大きい。
また、本発明の染色物はまったく退色もせず、データは
永久保存もできるので非常に有利である。
永久保存もできるので非常に有利である。
本発明は、従来の酵素免疫測定法により分析し得た物質
はすべて分析可能であるが、定性的な分析のみならず定
量性にも優れているため、特に癌の診断、治療効果の判
定などに重要な意義を有する。
はすべて分析可能であるが、定性的な分析のみならず定
量性にも優れているため、特に癌の診断、治療効果の判
定などに重要な意義を有する。
第１図は実施例１におけるＡＦＰ標準血清測定の標準曲
線を示す。 第２図は、実施例２における羊水中ＡＦＰ測定の結果を
示す。 特許出願人 協和メデックス株式会社 代表者若木重敏 第 ２ 日 １．Ｏｔｏｏ １５０談 全 （
日） 手 続 補 正 書 昭和夕９年８月２０日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１３１５５６号 ２、発明の名称 生体成分の分析法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 明細書第１４頁２２行目のｒｌＯｍｌＪを削除する。
線を示す。 第２図は、実施例２における羊水中ＡＦＰ測定の結果を
示す。 特許出願人 協和メデックス株式会社 代表者若木重敏 第 ２ 日 １．Ｏｔｏｏ １５０談 全 （
日） 手 続 補 正 書 昭和夕９年８月２０日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１３１５５６号 ２、発明の名称 生体成分の分析法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 明細書第１４頁２２行目のｒｌＯｍｌＪを削除する。
Claims (11)
- （１）（ａ）生体成分または生体成分を含む標的物質、
（ｂ）該生体成分または該生体成分を含む標的物質に特
異的に結合する受容体および（ｃ）パーオキシダーゼの
結合を利用し、結合したパーオキシダーゼの量に基づい
て該生体成分を分析する方法において、過酸化水素およ
び４−メトキシ−１−ナフトールを基質として用いるこ
とを特徴とする生体成分の分析法。 - （２）生体成分が、抗原、抗体、酵素、酵素の基質、補
酵素、蛋白質、糖蛋白質、糖質、糖脂質、リポ蛋白質、
核酸またはホルモンである特許請求の範囲第１項記載の
分析法。 - （３）標的物質が、抗原、抗体、酵素、酵素の基質、補
酵素、蛋白質、糖蛋白質、糖質、糖脂質、リポ蛋白質、
核酸、ホルモン、アビジンまたはビオチンである特許請
求の範囲第１項記載の分析法。 - （４）糖蛋白質が、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）ヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、γ−グルタミルト
ランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）または癌胎児性抗原（
ＣＥＡ）である特許請求の範囲第２項記載の分析法。 - （５）受容体が、抗体、プロテインＡ、酵素、酵素の基
質、補酵素、核酸、ホルモン−レセプター；特異結合蛋
白、アビジン、ビオチンおよびレクチンから選ばれる特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - （６）生体成分がゲル状支持体、支持膜または組織切片
に担持されたものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の分析法。 - （７）ゲル状支持体への生体成分の担持が電気泳動法に
より行われることを特徴とする特許請求の範囲第６項記
載の分析方法。 - （８）ゲル状支持体または支持膜に生体成分を担持させ
、電気泳動法により生体成分を展開させる方法において
、生体成分と抗原特異性の異なる蛋白質を内部標準物質
として用い、ゲル状支持体または支持膜中に該蛋白質と
特異的に結合する物質を受容体として添加することを特
徴とする生体成分の展開方法。 - （９）内部標準物質を０．００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）
の色素で着色をすることを特徴とする特許請求の範囲第
８項記載の分析法。 - （１０）蛋白質として牛血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミン、ニワトリ血清アルブミンまたは卵白アルブミン
を用い、受容体としてこれらアルブミンに対する抗体を
それぞれ用いることを特徴とする特許請求の範囲第８項
記載の分析法。 - （１１）特許請求の範囲第１項記載の分析法を用いる癌
の診断法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59131556A JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| US06/748,050 US4738920A (en) | 1984-06-26 | 1985-06-24 | Method for assaying a biocomponent using 4-methoxy-1-naphthol and hydrogen peroxide |
| AU43981/85A AU579379B2 (en) | 1984-06-26 | 1985-06-24 | Method for assaying a biocomponent |
| DK286985A DK167237B1 (da) | 1984-06-26 | 1985-06-25 | Fremgangsmaade til immunelektroforetisk proevning for en biokomponent |
| EP85304521A EP0167340B1 (en) | 1984-06-26 | 1985-06-25 | Method for assaying a biocomponent |
| DE19853586613 DE3586613T2 (de) | 1984-06-26 | 1985-06-25 | Verfahren zum testen eines biologischen bestandteiles. |
| CA000485381A CA1266612A (en) | 1984-06-26 | 1985-06-26 | Method for assaying a biocomponent based on bound peroxidase |
| JP5001221A JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59131556A JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| JP5001221A JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5001221A Division JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6110772A true JPS6110772A (ja) | 1986-01-18 |
| JPH0575396B2 JPH0575396B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=26334399
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59131556A Granted JPS6110772A (ja) | 1984-06-26 | 1984-06-26 | 生体成分の分析法 |
| JP5001221A Expired - Lifetime JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5001221A Expired - Lifetime JPH0718880B2 (ja) | 1984-06-26 | 1993-01-07 | 生体成分の展開方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4738920A (ja) |
| EP (1) | EP0167340B1 (ja) |
| JP (2) | JPS6110772A (ja) |
| AU (1) | AU579379B2 (ja) |
| CA (1) | CA1266612A (ja) |
| DK (1) | DK167237B1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5260428A (en) * | 1988-07-11 | 1993-11-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Agent for the detection of substances with hydrolase activity |
| US5202233A (en) * | 1988-07-11 | 1993-04-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the detection of substances with hydrolase activity |
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