JPS63209600A - パ−オキシダ−ゼ標識による測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法に関する
。

【従来技術】

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて来ているが、それらの方法の生鰻も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プ
ロティンＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプタ、酵素と基質
等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られている。 −ａ的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変化
した該標識のシグナルを検出することにより特定成分の
測定が行われる。 特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。 例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルローズ股上に転写担持し、標識体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、ＴＬ
Ｃブレー１−上に展開した脂質等の特定成分に標識体を
反応させシグナルを検出する方法２膜上でＤＮＡと該Ｄ
ＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させシグナ
ルを検出する方法或は免疫組織化学染色法などである。 これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ろことができる。例えば電気泳動後膜」二に転写、担持
された蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開した指貫成
分等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを
結合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては
特定成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分
子量、等電点或は極性等の情報がえられる。 また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

【発明が解決しようとする問題点】

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分解能をもったものであることが必須である。 特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等が用いられている。 放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は投資
に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持させ
た標識体上にシグナルを検出する煩雑な操作を要する欠
点がある。 蛍光物質もしくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。 一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持体
上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色素を
生成、沈着させる方法において、標識酵素としてパーオ
キシダーゼが主として用いられ、その際、基質として、
従来ジアミノベンジジン、０−ジアニシジン、４−クロ
ロ−１−ナフトール等が使用されてきた。 ジアミノベンジジンや０−ジアニシジンは毒性が強くバ
ックグランドが出やすい欠点がある。 ４−クロロ−１−ナフトールは他に比べやや感度が高い
が、より微量の特定成分を測定するため、もしくは、特
定成分に対するより多くの情報を明確に得るには、感度
は充分とは言えない。 また、特開昭６１−１０７７２号によれば、基質として
、４−メトキシ−１−ナフトールを用いれば、４−クロ
ロ−１−ナフトールよりも分析感度、分解能が１桁以上
上昇したと記載されている。しかしこの方法は、ゲル支
持体内での発色を行わせる特殊な方法であり、かつ分析
感度、分解能においても不充分である。 従って本発明の目的は、簡易に且つ高感度、高分解能で
ありしかも迅速な特定成分の測定方法を提供することで
ある。

【問題点を解決するための手段】

前記目的に沿って、種々検討した結果、測宇対象の特定
成分を、パーオキシダーゼを標識として有している標識
体を用い、パーオキシダーゼの酵素反応により生成した
色素量によって測定する該特定成分の測定方法において
該酵素反応の基質として過酸化水素および４−アルコキ
シ−１−ナフトール（ただし、アルコキシ基は、工Ｉ・
キシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基〉を用いるこ
とにより問題点が解消され、前記本発明の目的は、達成
された。 次に本発明の詳細な説明する。 本発明に於て特定成分は支持体に物理的吸着、化学的結
合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の特異
結合物質を介して間接的に担持されてもよい、又、特定
成分を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめた後
、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させても
よいし、或は複合結合体を形成せしめた後に該複合結合
体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せしめてもよ
い、更に標識体は該特定成分と複合結合体を形成し、支
持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結合して
もよく、１つ以上の他の特異結合物質を介して結合して
もよい。 また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パーオ
キシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。 複合結合体中のパーオキシダーゼの酵素反応の基質とし
ては、過酸化水素及び４−アルコキシ−１−ナフトール
を用いる。パーオキシダーゼと過酸化水素の作用により
４−アルコキシ−１−ナフトールは自己カップリングし
て色素が生成する。 従来の過酸化水素及び４−クロロ−１−ナフｌ〜−ルを
基質として用いるアナリティ力ルバイオケミストリ（Ａ
　ｎａｌｙｔｉｅａｌ　　Ｂ　１ｏｃｈｅｓｉｉｓｔｒ
ｙ）ｑ、１４２−１４７（１９８２）に記載の方法と比
べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポットは鮮明
で感度は１０倍以上上昇した。また、その結果、パーオ
キシダーゼ標識体の量を低減する事ができコスト的にも
有利である。　本発明において、対象とする特定成分は
、その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が得ら
れる物質又は物質群である。 たどえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。 また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に還ぶ事ができる。たとえば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類
、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロティン
Ａ、アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素の
基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。 本発明に使用し得る支持体としては、セルロース、アセ
テート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、Ｔ　Ｌ　Ｃプレート等のシリカゲル
担体、プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、
金属、繊維等が挙げられる。また組織化学染色において
は、組織そのものも支持体として使用できる。 本発明に使用される４−アルコキシ−１−ナフトールは
、有機合成化学部会誌第１７巻第１２号ＰＰ２７〜３０
（１９５９）に記載の方法に従って合成できる。 支持体に担持された特定成分とパーオキシダーゼ標識体
との複合結合体上に色素を生成せしめるには、発色用基
質試液中に支持体を浸漬させれば良い０発色用基質試液
は、適当なｐＨのｗＩ街液中に過酸化水素、４−アルコ
キシ−１−ナフトールを溶解し、調整される。４−アル
コキシ−１−ナフトールは、少量の親水性の有機溶剤た
とえばメタノい。 酵素反応により支持体上に色素が生成した後、未反応物
質を洗い流す事により反応を停止する。 生成した色素についての情報は、目視にて、もしくは技
術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読み取る事
ができる。また、適当な有機溶剤を加え、色素を溶解し
た後、情報を読み取っても良い。

【実施例】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。 実施例１ ：ニトロセルロース股上での抗原の測定：純水にて洗浄
後、風乾したニトロセルロース膜（バイオラッド社製；
厚み０．４５μｌ）にリン酸緩衝液（以下ＰＩ３５と称
す）にて段階希釈したヤギＩｇＧの〕４μｌをスポット
した。 風乾後１％牛血清アルブミン（ＢＡＳ）−ＰＢＳ溶液に
より４℃にて一晩ブロッキングを行い、次いでパーオキ
シダーゼ標識ウサギ抗ヤギｔｇｃ抗体（カッペル社製；
１％ＢＳ＾−Ｐ［ｌＳ溶液により１５００倍希釈したも
の）と４℃２時間反応させた。　０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；
和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し発色用基質
試液中に浸漬した０発色用基質試液として次の３種を用
い、比較した。 （１）：３−ｇの４−クロロ−１−ナフト−ルを１＋１
１１のメタノールに溶解し、５ｎ＋１の０．０５Ｍ　ト
リス塩酸緩衝液（ｐ）［７，４，２００ｍＭ　Ｎ　ａｃ
ｊ！含有；以下Ｔ　Ｂ　Ｓと称す）を加え、さらに３％
過酸化水素２０μｌを加える。 （２）；３ｍｇの４−メトキシ−１〜ナフトールを０．
５ｍｌのＤＭＦに溶解し、５．５Ｔａ１のＴＢＳを加え
、さらに３％過酸化水素２０μ！を加える。 （３）；３鴎ｇの４−エトキシ−１−ナフトールを０．
５ｍｌのＤＭＦに溶解し、５．５ｍｌのＴＢＳを加え、
さらに３％過酸化水素２０μ！を加える。 発色用基質試液（２）は経時的に青色に着色したが、本
発明の発色用基質試液（３）は着色はなく安定であった
。 １５分間反応後、充分水洗し、風乾した０発色用基質試
液（１）を用いた場合、スポットは灰紫色であり抗原で
あるヤギＩｇＧの検出限界はＬｏｎｇであり、発色用基
質試液（２）を用いた場合、スポットは青色で、検出限
界はｌｏｇであった。一方、本発明の発色用基質試１（
３）を用いた場合、スポットは鮮かな青色であり、高い
解像力を有していた。 検出限界は０．５ｎｇ以下であった。また、（３）にお
いて、４−エトキシ−１−ナフトールの代わりに４＝プ
ロポキシ−１−ナフトール又は４−イソプロポキシ−１
−ナフトールを用いた場合も同様の高い解像力、感度を
示した。 実施例２ ：抗体及びハイブリドーマのスクリーニング：αビアフ
チトリプシン５０μ 全アジュバントと共にＢａ１ｂ／Ｃマウス（＃１、６週
齢）の腹腔内に注射した．３週間後、さらにαビアンチ
トリブシン５０）ｔｇをフロイントの不完全アジュバン
トと共に腹腔内に注射し、さらに２週間後αビアンチト
リブシン３０μｇを・ＰＢＳに溶解し、静脈注射した。 最終免疫の３８後ｌＩＩｔｍ細胞を取り出し、常法に従
い、マウスミエローマ細胞ｘ　６３．６．５．３と融合
しな．９６穴プレ一ト５枚に分配しＩＩＡＴ選択培地に
て培養した．Ｍ合の３週間後ハイブリドーマのコロニー
が生成したウェルについて、抗体の測定を以下の方法に
て行った。 ニトロセルロース、を４ＩＩｌｌＩ角の正方形に切断し
、おのおのにαじアンチトリプシン５００μｇ／ｘｌＰ
Ｒ５溶液１μ！をスポットした．９６穴マイクロタイタ
ープレート１穴当り１枚ずつ加え、１％ＢＡＳ−ＰＢＳ
溶液にて４℃、１晩ブロツキングした。ＰＢＳにて洗浄
後、ハイブリドーマの培養上清４０μｌを加え、室温に
て２時間反応させた，　Ｏ．ＯＳ％Ｔｗｅｅｎ−２０−
ＰＢＳ溶液にて３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製；１
％ＢＡＳ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）を
４０μ！加え、室温にて２時間反応させた，　０．０５
％Ｔｗｅｅｎー２０ーＰＢＳ溶液にて３回洗浄後、発色
用基質試液を加え、ニトロセルロース上に色素が生成し
たものを抗体活性陽性とした０発色用基質試液として（
１）：実施例１の（１）と同様 （２）：実施例１の（３）と同様 の２種類を用い比較した。 測定した３５０穴のうち（１）の試液を用いた場合は１
５穴しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなかっ
たが本発明の（２）の試液を用いた場合２３穴に抗体活
性陽性ハイブリドーマが検出できた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 測定対象の特定成分を、パーオキシダーゼを標識として
   有している標識体を用い、パーオキシダーゼの酵素反応
   により生成した色素量によって測定する該特定成分の測
   定方法において該酵素反応の基質として過酸化水素、お
   よび、４−アルコキシ−１−ナフトール、（ただし、ア
   ルコキシ基は、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポ
   キシ基）を用いることを特徴とする該特定成分の測定方
   法。