JP2517187B2 - アナライト変異体分析 - Google Patents

アナライト変異体分析

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、異なるアナライトまたは被検物質（analyt
e）変異体群内におけるアナライト変異体のサブセット
の濃度を評価する方法、およびこの方法に使用するため
のテストキットおよび試薬組成物に関する。
生物学的分子、例えば酵素、抗原および他の生物学的
に重要なタンパク質は、共通の生物学的機能および性
質、例えば抗原性または酵素活性を有するが、その構造
が僅かに異なっている変異体の集団としてしばしば存在
する。この構造の変化は、タンパク質またはポリペプチ
ドのアミノ酸シークエンスにおける一次的、二次的また
は三次的構造の相違、あるいは分子の炭水化物部分また
は脂質組成の相違のためでありうる。与えられた集団中
の変異体分子間で共通の特徴となる性質または機能は保
持されているが、その構造のこのような相違は、変異体
の他の性質、例えば大きさ、電荷、等電点（pI）などを
変化させるのにしばしば役立ち、これは次に、異なる分
別系（システム）および分離系（システム）における挙
動を変化させるので、変異体混合物中の１個または数個
の変異体を分離するための基礎とすることができる。
酵素はしばしば変異体、例えばアイソエンザイムなど
して存在し、多くの他の生物学的タンパク質は２種以上
の変異体型で存在することが知られており、これら変異
体型は、タンパク質のグリコシル化の程度あるいは炭水
化物組成においてしばしば異なっている。与えられた体
組織または液体中のこのような変異体の相対的濃度は一
般に一定であるが、ある疾患または病的状態において、
あるいは体への他の障害の結果として乱されうる。例え
ばグリコシル化ヘモグロビンと非グリコシル化ヘモグロ
ビンとの割合は、糖尿疾患者の血清中で増加することが
知られている。同様に、分析上興味深いある構造を有す
るタンパク質、例えばミオグロビンは、異なる器官にお
いて僅かな構造の相違を有することがあり、疾患または
傷害に起因する細胞破壊に続いて、体液中に放出されう
る。
したがって、血液、他の体組織または体液中の異なる
変異体の濃度を測定することによって、疾患または細胞
破壊の状態を診断あるいは評価することができる。
この点において特に重要なことは、血清中のタンパク
質トランスフェリンの異なる変異体の濃度を評価するこ
とである。トランスフェリンは、一般に３個以上のシア
リル残基を有するシアリル化型で存在する。しかし慢性
アルコール乱用者においては、非アルコール常用者と比
較して、脱シアリル化トランスフェリン、即ち２個以下
のシアリル残基を有するトランスフェリンの含有量は増
加し、例えば１〜３％の正常レベルから、患者の血清の
全トランスフェリン含有量は約６〜25％に増加する。脱
シアリル化トランスフェリンは、しばしば炭水化物（糖
質）欠損トランスフェリン（CDT）と称され、今日、慢
性アルコール中毒の臨床的に信頼しうるマーカーと考え
られている。しかしながら、現在のトランスフェリン変
異体の定量には、時間がかかる上に最新の生化学的装置
を必要とする。このように、脱シアリル化トランスフェ
リンマーカーのための簡単かつ便利なテストが存在しな
いため、慢性アルコール中毒は、現在未だに、病歴、ア
ルコール消費に関する患者自身からの情報および多くの
実験室でのテストに基づいて診断されているが、これら
は全て感度および特異性に制限がある。血中アルコール
濃度は、血液がアルコール消費後24時間以内に採取され
た場合にのみ信頼できる基準である。全ての現在の臨床
化学的テストは、全てのアルコール乱用者を確実に同定
するためには、余りにも低い感度および特異性しか有し
ていない。
トランスフェリンの微小不均一性（microheterogenei
ty）およびそのアルコール乱用者との相互間系は、1980
年に最初に検知された（Stibler H,Sydow O,Borg S.,
“アルコール中毒者の血清トランスフェリンの異常微小
不均一性の定量的評価（Quantitative estimation of a
bnormal microheterogeneity of serum transferrin in
alcoholics）",Pharmac.Biochem,Behav,1980,13 Supp
l.1 47−51）。この微小不均一性の臨床的重要性は更に
調査され、異なるトランスフェリン変異体を定量的に分
離するために等電点電気泳動法および等電点クロマトグ
ラフィー法が研究された（Vesterberg O,Petren S.and
Schmidt E.:“アルコール乱用後のトランスフェリン変
異体の濃度増加（Increased concentrations of a tran
sferrin variant）",（Clinical Chemica Acta,141 33
−39,1984.Storey E.L.,Mack U.,Powell L.W.and Halli
day J.W.:“アルコール中毒患者の血清におけるトラン
スフェリン変異体を検出するための等電点クロマトグラ
フィーの使用（Use of chromatofocusing to detect a
transferrin variant in serum of alcoholic subject
s）",Clin.Chem.31:1543−1545,1985.）。Joustraおよ
びBlancheは1984年にスウェーデンに方法特許を出願
し、Stibler、BorgおよびJoustraは、1984年にアルコー
ル消費に関する血清中に糖質欠損トランスフェリンの定
量一濾過のためのミニカラム陰イオン交換クロマトグラ
フィー法を公開した。（Stibler H.,Horg S.,and Joust
ra M.:Alcoholism 10:535−544,1986.Joustra M ＆ Ban
che C.スウェーデン特許出願第84005875−５号）。これ
らの方法は、血清サンプル中のトランスフェリン変異体
の定組成（isocratic）イオン交換クロマトグラフィー
分離と、これに続く異なるフラクションのトランスフェ
リン含有量の二抗体ラジオイムノアッセイ定量法を基礎
としている。このイオン交換クロマトグラフィ技術によ
り、２個以下のシアル酸残基を有する全てのトランスフ
ェリン成分、即ち等電点が5.65より大であるトランスフ
ェリン成分が分離される。この方法を用いて、等電点
（pI）がpH5.65より大きい増加したトランスフェリン変
異体を有するということによって、80人の健康な「正常
消費者」および合計33人の絶対禁酒者から、77人のアル
コール中毒患者を、明確に分離することができた。
これらの方法の主な問題は、その実施が盆雑であり、
かつ時間を要することである。血清サンプル中のトラン
スフェリン変異体をクロマトグラフィーで分離し、次い
でこうして分離されたトランスフェリンをイムノアッセ
イで定量することを要する２工程の手順が必要である。
したがって、アナライト変異体の混合集団内の異なる
アナライト変異体の信頼できかつ簡単なアッセイ、特
に、トランスフェリンの異なる変異体を検出する改善さ
れた方法が要求されている。
このように臨床的に興味のあるアナライト変異体は、
その性質が通常はタンパク質性（proteinaceous）であ
り、容易に同定しうるタンパク質性結合パートナーをし
ばしば有しており、アナライト変異体はこれらの結合パ
ートナーと複合体を形成する。多くのタンパク質が他の
タンパク質またはペプチドに特異的に結合することが知
られており、したがって結合パートナーとして用いるこ
とができるが、最も一般的には、アナライト変異体は抗
原であり、結合パートナーは抗体である。即ち、例えば
タンパク質ハプトグラビンは、ヘモグロビンの特異的結
合パートナーである。このような結合パートナーは、例
えば酵素、他のリポーター原子または基によって標識す
ることができ、したがって興味のあるアナライト変異体
を標識するアッセイ法に用いることができる。
本発明は、タンパク質性アナライト変異体を、分離に
先立って、標識された結合パートナーを用いて標識する
ことができるため、分離されたフラクション中の標識の
評価が、変異体の相対的量の定量的指標を与えるという
概念に基づいている。しかしながら、分析すべき異なる
アナライト変異体の全てと反応性であるが、選択された
フラクションまたは分別系（分別システム）内では実質
的に一様な（均一な）分布または移動性を有する、標識
された結合パートナーの集団と、アナライト変異体とを
反応させることが重要であることが見出された。
このような手法は、分離した後、分離したフラクショ
ンについて通常のイムノアッセイを用いる従来の系と比
較して、実質的により簡単である。
したがって、本発明によれば、一つの態様において、
分別系によって分離しうるタンパク質性アナライト変異
体の集団を、標識されたタンパク質性特異的結合パート
ナーの集団と接触させて、標識された結合パートナー−
アナライト複合体を形成させ、次いでこの複合体を該分
別系による分離にかけて、該アナライト変異体のサブセ
ットを複合した形で含有している１個または数個のフラ
クションに分離し、こうして得られた１個または数個の
フラクション中の標識の量を評価することからなり、該
特異的結合パートナーは、反応の前には、該分別系中で
実質的に一様な分布または移動性を有していることを特
徴とする、分別系によって分離しうるタンパク質性アナ
ライト変異体の集団中の変異体サブセット濃度を評価す
る方法が提供される。
本明細書において、「タンパク質性（proteinaceou
s）」という用語は、ペプチトおよびポリペプチドの両
者を含む、基本的にタンパク質の性質を有する全ての分
子（ただし、これらの分子は、非タンパク質の性質を有
する付加部分、例えば脂質または糖質の基を有していて
もよい）を包含することを意図して用いられている。
変異体／結合パートナー複合体における結合パートナ
ーは、選択されたフラクションまたは分別系内で実質的
に一様な分布または移動性を有しているため、変異体／
結合パートナー複合体の分布または移動性間の相違は、
これら複合体中の変異体間の相違に、換言すればアナラ
イトの変異（変化）に帰すべきである。このようにして
得られたこれら変異体／結合パートナー複合体の１個ま
たは数個のフラクションは、選択された分別系によって
分離され、各分離フラクションの標識の量が評価され
る。
本発明の他の態様において、関心（興味）のあるアナ
ライトのための標識されたタンパク質性結合パートナー
を含有し、該結合パートナーが、１個または数個の分別
系中で実質的に一様な分布または移動性を有する、本発
明の方法を実施するための組成物が提供される。
本発明の更に他の態様において、前記の分別を行うた
めに必要な試薬および／または物質と一緒に、前記の組
成物を含有する、分析用テストキットが提供される。
便利には、アナライト変異体は、与えられた緩衝系内
でそれらの電荷によって異なっており、こうして、電荷
を基礎とする系、例えばイオン交換クロマトグラフィー
または電気泳動などによって容易に分離できる。あるい
は、アナライト変異体は、等電点（pI）において異なっ
ており、等電点電気泳動または等電点クロマトグラフィ
ーによって分離することができる。したがって、例えば
Pharmaia社（スウェーデン）製の“Mono−p"カラムおよ
び“Polybuffer"等電点電気泳動システムを用いること
ができる。複合体の等電点電気泳動は、二次元ゲルシー
ト中で行うことができ、あるいは複合体は、アガロース
ゲル中での単純な電気泳動によって分別することができ
る。本発明の方法には、様々なイオン交換媒体および固
相を用いることができる。これら媒体上のイオン化可能
な残基は、アミン残基、スルホン化残基およびカルボキ
シル化残基等によって構成され、ビーズ、粒子、ゲル、
膜、フィルターまたは他の任意の好適な固相に支持され
ていてよいが、これらに限定されるものではない。この
ような分別系は簡単に使用され、良好な結果を与えるの
で本発明に好ましいが、アナライトが変化し、したがっ
て選択されたパートナーが一定であるという特性を用い
る他の任意の分別系も使用することができる。
樹脂および粒子は、スラリーバッチ形態で、またはカ
ラムとして用いることができる。カラムは、塩勾配、pH
勾配あるいは定組成（isocratic）溶離によって溶離で
きる。実用上の観点から、スラリーバッチ形態および定
組成溶離が好ましい。磁性粒子が特に有利であることが
認められた。イオン交換固相は、硬質三次元構造体ある
いはイオン交換フィルターによって構成することもでき
る。フィルターを用いる場合は、濾過は、表面と平衡
に、例えば放射状にあるいはフィルターストリップに沿
って行なうことができる。
分別工程を実施するために必要な全てのまたは幾つか
の試薬を、標識された結合パートナー組成物とともにキ
ットの形態で提供することが便利である。上述したよう
に、このキットは、本発明の他の態様を構成する。
このような試薬および材料としては、一般的には、緩
衝塩または緩衝液、Tween 等の界面活性剤、ナトリウ
ムアジド等の保存剤、様々のゲル、樹脂または分別工程
を実施するために必要な他の媒体が挙げられ、所望によ
り使用時に即時組み立て可能な、例えばカラム等として
提供することもできる。
すでに述べたように、アナライト変異体／結合パート
ナー複合体の形成に続いて、この複合体は分離され、複
合体フラクション中に存在する標識の量が評価される。
このような標識は、この技術分野において知られてい
る従来の任意の標識システムによって構成することがで
きる。したがって、標識は、蛍光、着色、放射性あるい
は酵素によるものであってよく、公知の手段によって評
価できる。放射性標識は、例えばI125等のラジオイムノ
アッセイにおいて普通に用いられる放射性同位体から選
択され、また、多くの蛍光あるいは着色標識が文献に記
載されている。好適な蛍光標識の例としては、ジメチル
アミノナフタレン、フルオレセイン、ジクロロトリアジ
ニル−アミノフルオレセインまたは蛍光性金属化合物が
挙げられる。着色標識としては、４−ジメチルアミノベ
ンゼン、４−N,N−ジメチルアミノアゾベンゼン、トリ
ニトロベンゼン、ベンゾフラジン類、テトラメチルロー
ダミン、テキサスレッド、モルホリノローダミンおよび
その誘導体、アゾベンゼン類、アントラキノン類、オキ
サジン類、チアジン類、トリアジン類、ポルフィリン
類、フィコビリン類、クロロフィル類、インジゴ染料、
およびその類似物あるいは誘導体等が挙げられる。
上記したように、問題のアナライトのタンパク質性結
合パートナーの何れであっても、選択された分別系内で
実質的に一様な分布または移動性を有している限り、用
いることができる。抗体は、一般に抗原およびハプテン
に対する好ましい結合パートナーであるが、状況に合わ
せて、他の結合パートナー系、例えばハプトグロビン−
ヘモグロビン系またはホルモン−受容体系等を採用する
こともできる。
免疫活性抗体フラグメント、例えばＦ（ab）またはＦ
（ab′）２フラグメント等は、フラグメントの挙動が与
えられた分別系中で一様に保持される限り用いることが
できる。このようなフラグメントは、有利には、例えば
Ｓ−カルボキシメチル基等によってＳ−ブロックされて
いてもよい。
Ｆ（ab）フグメントの超可変性領域であるＦ（ｖ）フ
ラグメントも使用することができ、組み換えDNA技術ま
たは化学合成を経由した合成由来のものであってもよ
い。
本発明者らは、標識された抗体またはＦ（ab）２フラ
グメントのモル量が、アナライトのモル量に対してほぼ
同量または過剰である場合は、標識された試薬の２価の
反応性によって有意な架橋が生じることを見出した。こ
れは、アナライト分子の数の低い評価を与える。したが
って多くの場合、１価の標識されたアナライト−結合パ
ートナー、特に適切な抗体のＦ（ab）またはＦ（ｖ）フ
ラグメントを用いることが好ましい。
このような１価のフラグメントは、特に合成によって
製造された場合に、また均一な方法で注意深く標識すれ
ば、変異を受ける程度が少なくなるようであり、そして
選択された分別系中での一様な移動性および分布の基準
を達成するための分別工程を必要としないことに注目す
べきである。
以下に、簡便化のため、「抗体」という記載には、特
に言及しない限り、抗体のフラグメントが含まれる。
本発明の方法は、トランスフェリンの異なる変異体の
濃度を分析するのに特に適している。
したがって特別の態様において、本発明によれば、血
漿、血清、全血液または溶血物中のトランスフェリン変
異体（しばしばイソトランスフェリンと称される）を評
価する方法が提供される。前述したように、トランスフ
ェリン変異体は、主としてトランスフェリン分子中のシ
アル酸残基の数の違いによって異なっている。本発明の
新規方法は、好ましくは、ヒトトランスフェリンと反応
性であって、電気泳動、イオン交換、等電点クロマトグ
ラフィーまたは等電点電気泳動から選択される分別系に
おいて実質的に一様な移動性または分布を有する標識さ
れた抗体の集団を、サンプルと接触させることからな
る。好ましくは、抗体結合工程は、抗原−抗体複合体の
形成を許容する鉄イオン含有緩衝液中で行われる。この
ような抗原−抗体反応は、中性のpH付近、好ましくはpH
5〜pH9で、かつ抗原−抗体複合体の形成を阻害しない塩
濃度および塩組成において行うことが好ましい。
標識された抗体は、好ましくはモノクローナル抗体で
あるが、ポリクローナル抗体も用いることができる。な
ぜならば、本明細書に記載される精製処理は、一様な特
性を保証するからである。
抗トランスフェリン抗体の標識されたＦ（ab）または
Ｆ（ｖ）フラグメントは、トランスフェリン変異体分析
において特別に用いられる新規物質である。これらは、
相対的に非一様であっても、抗体全体よりも良好な結果
を与えることができる。１個または数個の分別系中での
移動性または組成が均一である、分別され標識されたＦ
（ab）およびＦ（ｖ）が特に好ましい。
サンプルのトランスフェリンは、抗体にさらす前、こ
れと同時にまたはその後に、第二鉄イオンで飽和するこ
とができる。この技術によるトランスフェリン変異体分
析には、該分別系を用いて抗原−抗体複合体を分離する
前またはこれと同時に、第二鉄イオンで飽和することが
一般に必要である。なぜならば、変異体の第一鉄イオン
含有量の相違が、シアル酸含有量の相違によって得られ
た該分別系中の分布パターンを消去するからである。
本発明のトランスフェリン変異体分析の好ましい方法
では、変異体／抗体複合体の混合物を、等電点クロマト
グロフィー、イオン交換、電気泳動または等電点電気泳
動等の分別系に付することが必要である。標識された抗
体は、これら分別系の一つにおいて実質的に均一な移動
性および分布を有しているため、これらの標識された抗
体は、トランスフェリン変異体（イソトランスフェリ
ン）と共に抗原−抗体複合体を形成する。この複合体
は、トランスフェリン変異体間の移動性および分布の相
違に対応する（しかし必ずしも同一ではない）、該分別
系の一つにおける移動性または分布の相違を有してい
る。ヒトトランスフェリンと一般に反応性であり、かつ
該分別系の一つにいおて実質的に一様の移動性または分
布を有するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドー
マ技術によって製造することができ、必要に応じて化学
的技術によって修飾することがでる。一般に、所望の抗
体の精製が必要であり、この精製は、該分離系の一つを
用いて、等電点クロマトグラフィー、イオン交換、電気
泳動または等電点電気泳動等によって行うことが好まし
い。
トランスフェリン分布に使用される本発明のテストキ
ットは、少なくとも１種の第二鉄イオンの塩または溶液
と一緒に、好ましくは標識された抗トランスフェリン抗
体を含有するか、または特に好ましくは、このような抗
体の標識されたFabフラグメントを含有する。本発明の
方法の幾つかの態様において、選ばれた範囲の等電点を
有するか、または前記の分離系中で特別の分布または移
動性を示す標識された抗体または他のタンパク質性結合
パートナーが好ましい。このような修飾されたタンパク
質を得るために、タンパク質を標識工程の前または後で
修飾することができる。一般に、このような修飾は、荷
電した基、例えば酸性基または塩基性基の数を変化させ
る。このような修飾は、例えばGlazer,Ddelange and Si
gman:“タンパク質の化学的修飾（Chemical modificati
on of Proteins）”、Elsevier Biomedical Press,Amst
erdam,New York,Oxford 1975および他の関連文献に記載
されたようにして、タンパク質のアミノ酸の側鎖と反応
する試薬を用いて行うことができる。その一例として、
アミン残基はカルバモイル化、アセチル化、ベンジル化
またはサクシニル化により修飾することができ、カルボ
ン酸残基はエステル化により、およびカルボジイミドま
たは他のカップリング剤を用いる求核性物質へのカップ
リングにより修飾することができる。同様に、抗体また
は他のタンパク質性結合パートナーの炭水化物部分も同
様にして修飾できる。
本発明の標識された糖タンパク質結合パートナー組成
物を製造するのにしばしば必要な修飾のための便利な方
法は、糖タンパク質の炭水化物部分を過ヨウ素酸塩で酸
化した後、得られたアルデヒドを、酸性基または塩基性
基を導入する試薬と反応させることである。ジスルフィ
ド橋を有するタンパク質に好適な他の便利な方法は、タ
ンパク質のアミノ酸ポリペプチド鎖間のシスチンのジス
ルフィド橋を部分還元することである。抗体は特に、幾
つかのこのようなジスルフィド結合を含有しており、全
部ではないが幾つかのジスルフィド結合は、抗原に対す
る抗体の親和性を弱めることなく、遊離のチオールに還
元することができる。これらの結合およびこうして得ら
れるチオールは、抗体の抗原結合部位から離れている抗
体のヒンジ領域に位置している。このような還元剤の例
としては、２−チオエタノールおよびジチオトレイトー
ルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
還元剤を除去したのち、酸性基または塩基性基を導入す
る試薬を、チオール部分および求核性部分と反応する２
官能性カップリング剤、例えばスルホサクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（ヨ
ードアセチル）アミノベンゾエートまたは他のスルホサ
クシンイミジルマレイミド含有試薬を用いて、１工程ま
たは２工程操作により遊離チオールと結合させる。その
代わりに、酸性基または塩基性基を導入する試薬を、置
換されたピリジルジスルフィドを用いて、あるいはジス
ルフィド結合を再確立するが酸性または塩基性の化学的
性質を有する化学的部分を持つチオール含有試薬を用い
て結合させることができる。
本発明の特別の態様において、求核性試薬は、酸性重
合体、例えばアミノ酸上に１個または数個の酸性側鎖を
有するポリペプチドによって構成することができる。
炭水化物での修飾および／または上流領域におけるシ
スチンの還元による修飾の利点は、こうして得られる抗
体の抗原結合部位の妨害が少ないことである。しかしな
がら、酸性ポリペプチドは、抗体のポリペプチド構造の
リジン残基または他の残基と結合させることもできる。
トランスフェリン変異体分析の場合には、２個以下の
シアル酸残基を有し、かつ３個以上のシアル酸残基を有
するトランスフェリン変異体よりも高いpI価を有するト
ランスフェリン変異体が、特に重要である。本発明の一
態様においては、あるpH、緩衝塩の濃度および組成の条
件で陰イオン交換樹脂が用いられ、この条件において、
３個以上のシアル酸残基を有するトランスフェリン変異
体は、その陰イオン交換固相と結合するのに対して、２
個以下のシアル酸残基を有するトランスフェリン変異体
との抗原−抗体複合物は結合しない。この態様におい
て、陰イオン交換固相と結合する標識された抗体（必要
により修飾されていてもよい）が好ましい。こうして２
個以下のシアル酸残基を有するトランスフェリン変異体
と複合体を形成した標識抗体のみが溶液として残る。こ
れの概要は図１に説明されている。実際の分離のpHおよ
び緩衝剤組成は、標識されたモノクローナル抗体と形成
される複合体のpIに基づいて選択される。例えば、固相
がスラリーバッチ形であるならば遠心または濾過によ
り、または陰イオン交換固相が磁化性であるならば磁気
分離により、または固相が硬質形またはカラムの形であ
るならば溶離により分離した後、抗原−抗体複合物の濃
度（これは２個以下のシアル酸残基を有するトランスフ
ェリン変異体濃度に相当する）の評価を得るために、溶
液中に残った標識物の測定値が用いられる。
本発明の方法は、アナライトの総量（全変異体）より
も過剰濃度の標識された結合パートナーを用いて、また
は結合パートナーよりも過剰濃度のアナライトを用いて
実施することができる。結合パートナーを過剰に用いる
場合には、異なる変異体の総濃度に相当するシグナルが
得られる。アナライトが過剰に存在する場合には、全変
異体の総濃度に対して相対的な量の、異なる変異体量に
相当するシグナルが得られる。
標識された結合パートナーを過剰に用いようとする場
合には、このパートナーは１価であることが好ましい。
前記のように、抗体のような２価の結合パートナーは、
特にほぼ等モル量で用いる場合に架橋して二つの別個の
アナライト分子を生じさせる傾向がある。従ってこの目
的のためには、Ｆ（ab）またはＦ（ｖ）フラグメントが
好ましい。
抗原に対する抗体またはそのフラグメントを用いる結
合パートナーの場合に、過剰の抗原を用いるならば、必
要に応じて修飾された固定化抗原を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製された、標識された
抗体を、所望により使用することができる。こうして、
抗体またはフラグメントの100％近くを免疫反応性にす
ることができ、したがってアッセイにおいて、複合して
いない遊離の抗体またはフラグメントのフラクションは
極めて低レベルに減少される。このようにして、抗原ア
ナライト分析方法における潜在的な干渉を減少させるか
または避けることができる。
本発明の利点は、免疫学的定量と分別とを１操作に組
み合わせたことであり、これは標識された結合パートナ
ーと異なるアナライト変異体との間で形成された複合体
を分離し、次いで免疫学的定量を行うことにより得られ
る。したがって、本発明は、特にアルコール消費に関し
て調査される人々からの血清または血漿中の低シアル酸
含有トランスフェリン変異体の測定を目的として、トラ
ンスフェリンおよび他のアナライト変異体の測定を、従
来法よりもはるかに容易に可能にする。
以下の実施例は、下記の図面を参照して、本発明を限
定することなく説明するものである。
図２は、修飾および標識されたヒトトランスフェリン
に対する抗体のpIを示す等電点電気泳動ゲルである。
図３は、強陰イオン交換カラムでのイオン交換クロマ
トグラフィー（緩衝液:20mMリン酸ナトリウムpH6.5）に
よる抗トランスフェリンFITC−誘導体の分離を示すグラ
フであり、実線は280nmでのUV吸収、点線は塩勾配（M N
aCl）を示す。
図４は、図２に示す調製物から得られた抗トランスフ
ェリンFITC−誘導体の３つの隣接するフラクションの、
強陰イオン交換カラムでの再イオン交換クロマトグラフ
ィー（緩衝液:20mMリン酸ナトリウムpH6.5）による分離
を示すグラフである。
図５は、イオン交換クロマトグラフィーから得られた
FITCで標識された抗トランスフェリンモノクローナル抗
体と混合した血清サンプルのフラクションの蛍光シグナ
ルを示すグラフである（□はアルコール乱用者からの血
清を示し、＋非飲酒者からの血清を示す）。
図６は、抗トランスフェリンモノクローナル抗体と、
ジシアローヒトトランスフェリン（□）およびトリシア
ローヒトトランスフェリン（＋）との複合体のイオン交
換クロマトグラフィーから得られた蛍光シグナルを示す
グラフである。
図７は、モノクローナル抗トランスフェリン抗体の標
識された未精製調製物の分取陰イオン交換クロマトグラ
フィーの結果を示すグラフである。
図８は、図７のクロマトグラフィーから得られた一つ
のフラクションの陰イオン交換系における移動性を示す
グラフである。
図９は、陰イオン交換（mono Q）カラムから溶離され
た、重度飲酒者（−△−）および正常被験者（...
○...）からの血清サンプルから得られたFITC−Fab−ト
ランスフェリン複合体の蛍光を示すグラフである。
実施例１ 抗トランスフェリンIgG−生成ハイブリドーマにより
マウス内で生成された商業的に入手される腹水から、リ
ン酸塩緩衝液中でイオン交換クロマトグラフィーとゲル
クロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体を精製
した。溶液中で固定化ヒトトランスフェリンとパーオキ
シダーゼ−結合ポリクローナル抗−マウス−IgG抗体と
を用いて、マイクロタイマーELISAシステムによって抗
体の免疫親和性をアッセイした。精製された抗トランス
フェリン抗体を、0.1M酢酸緩衝液pH5.6に対して透析
し、過ヨウ素酸イオン（最終濃度50mM）によって酸化し
た。ゲルクロマトグラフィーにより過ヨウ素酸イオンを
除去した後、抗体を、抗体に対して50倍モル過剰で酸ポ
リペプチドＮ−ala−ala−ala−ala−glu−glu−glu−g
lu−glu−COOHと反応させ、次いで溶液中でシアノボロ
ハイドライドイオン（最後濃度＝15mM）により結合を安
定化した。得られた修飾された抗体を0.1M炭酸ナトリウ
ム塩緩衝液pH9.5に対して透析し、そして10mMの最終濃
度で２−チオエタノールと室温で30分間反応させ、次い
で、リン酸塩緩衝液pH7.4中でゲルクロマトグラフィー
により、２−チオエタノールを除去した。得られたタン
パク質の遊離チオールとＮ−ala−ala−ala−ala−glu
−glu−glu−glu−glu−COOHとを、スルホサクシンイミ
ジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレートを用いて、抗体：カップリング試
薬：ペプチドの1:33:40のモル比で反応させた。次いで
炭酸塩緩衝液に対して透析した後、修飾された抗体をフ
ルオレセインイソチオシアネートと反応させ、続いてゲ
ルクロマトグラフィーで精製した。これらの修飾の各段
階で、抗原の親和力を試験した。極微量の減少しか認め
られなかった。図２に、ゲル電気泳動法（Phast Syste
m,Pharnacia）で行った等電点電気泳動の結果を示す。
この図は、到達pIの低下を示す。修飾されかつ標識され
た抗体の実質的フラクションは、２個以下のシアル酸残
基を有するイソトランスフェリンと同等またはそれ以下
のpIを有する。この図において、（ａ）から（ｅ）は以
下のことを示す。
ａ）ヒトトランスフェリン ｂ）非修飾モノクローナル抗トランスフェリンIgG ｃ）ｂ）と同様、ただし、ala−ala−ala−ala−glu−g
lu−glu−glu−glu−は炭水化物部分と結合している。
ｄ）ｃ）と同様、ただし、それに加えてala−ala−ala
−ala−glu−glu−glu−glu−glu−はヒンジ領域と結合
している。
ｅ）ｄ）と同様、ただし、フルオレセインイソチオシア
ネートはタンパク質と反応している。
本発明の方法の実施には、適切な分離系中で、抗体の
本質的に均質な分布あるいは移動性が必要である。そう
でないと、抗体複合体が不均質（または異質）になり、
抗体と別の抗原変異体との複合体の分離および定量を不
可能にする。
図３は、分取アニオン交換クロマトグラフィーによっ
て評価された修飾されたモノクローナル抗体の異質性を
示す。点線の垂直バーは、狭いpH範囲のフラクションを
得るために、この分取アニオン交換クロマトグラフィー
から20個のフラクションを集めたことを示す。
図４は、前記分取クロマトグラフィーから得られた隣
接する別の31個のフラクションからのアリコートの分析
クロマトグラフィーの結果を示す。この図は、各フラク
ションに関し、ほとんど均一な移動性が得られたことを
実証している。溶離において、よりゆるい勾配プロフィ
ルを用いるか、反復的なクロマトグラフィーあるいは他
のクロマトグラフィー技術を用いることにより、いっそ
う均一なフラクションを得ることができる。その代わり
にあるいはそれと組み合わせて、分取等電点泳動あるい
はクロマトフォーカシングが用いられる。
試験サンプルを、均一なまたはほとんど均一な移動性
または分布を有する前記標識されたモノクローナル抗ヒ
トトランスフェリン抗体と混合すると、相当する分離系
中で異なる移動性または分布を持つ抗原−抗体複合体が
形成される。これは、トランスフェリン変異体間での違
いを反映している。別の抗原−抗体複合体は、形成され
た複合体の電荷の違いを利用して、イオン交換クロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳
動、電気泳動あるいは他の化学的技術によって分離され
る。
実施例２ アルコール乱用者および非飲酒者の血清サンプルの分析 固相： ４級アミンで処理された表面残基が置換されたポリス
チレン粒子の1mlカラム（Mono−Ｑカラム、Pharnacia,U
ppsala,Sweden）。
溶離液： 100mM塩化ナトリウムを含む20mMビス−トリス緩衝
液、pH6.50 操作： 10μの血清サンプルを、サンプルのトランスフェリ
ン含量に対して20倍モル過剰のクエン酸第２鉄と混合
し、次いでモノクローナルマウス抗ヒトトランスフェリ
ン抗体を添加した。この抗体は、ヒトトランスフェリン
の全ての変異体と反応性であり、フルオレセインで修飾
され標識され、そして上記イオン交換系内および上記溶
離緩衝液中できわめて均一な移動性を有するように精製
されたものである。また、上記抗体は、血清中のトラン
スフェリン濃度に対して1:1モルの濃度で添加された。
室温で短時間インキュベートした後（５−10分）、混合
物をカラムに通して溶離し、次いで溶離緩衝液でさらに
溶離した。1.0mlのフラクション捕集し、フラクション
の蛍光を測定した（励起485nm、発光520nm、シマズ分光
光度計RF−540で測定）。図５は、飲酒者および非飲酒
者の血清で得られた典型的なパターンを表わす。比較の
ため、血清の代わりに精製したジシアロ−およびテトラ
シアロトランスフェリン溶液のサンプルで得られた対応
するパターンを、図６に示す。
実施例３ 実施例２で用いられた抗体フラクションの分析 図７は、実施例２からのモノクローナル抗体の標識さ
れた未精製調製物の分取アニオン交換クロマトグラフィ
ーの結果を表わすクロマトグラムである。このクロマト
グラフィーフラクションから、それぞれ0.5mlを捕集し
た。図８は、各フラクションがアニオン交換クロマトグ
ラフィーシステム中できわめて狭いかあるいは均一な移
動性をどの程度で有するかを示すクロマトグラムであ
る。クロマトグラフィーは、20mMトリス緩衝液pH8.0
（緩衝液Ａ）で平衡化されたPharnacia Mono Q HR5アニ
オン交換カラムで行われ、そして緩衝液Ｂ（0.7MのNaCl
を含む緩衝液Ａ）で溶離グラジエントを用いて溶離され
た。
実施例４ アニオン交換マトリックス上で実質的に均質な移動性を
有するフルオレセイン−標識モノクローナルFabフラグ
フラグメントの調製 抗トランスフェリンIgG−生成ハイブリドーマを用い
る確立された技術によってマウス中で生成された商業的
に入手される腹水から、リン酸塩緩衝液中でのイオン交
換クロマトグラフィー、これに続くサイズ排除ゲルクロ
マトグラフィーによって、モノクローナル抗体を精製し
た。この緩衝液を炭酸塩緩衝液に代え、次いでパパイン
とジチオトレイトールとを併用して、IgG抗体をFab抗体
フラグメントに消化する。この酵素修飾後に、遊離チオ
ール基（抗体上の遊離チオール基を含む）を、酵素活性
をも停止させるヨード−アセトアミドでブロックする。
形成されたFabフラグメントを、透析法とアニオン交換
クロマトグラフィーとの組合せにより精製する。
精製された抗体フラグメント（Fab）を、フルオレセ
イン−イソチオシアネートで修飾する前に、炭酸塩緩衝
液pH9.5に対して透析する。フルオレセインは抗体上の
アミノ基に結合し、フルオレセインで標識されたFabを
サイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、最後
に、標識されたFabフラクションを、アニオン交換クロ
マトグラフィーカラムから分離する。このフラクション
は、等電点に関して高度の均一性を有することによって
特徴づけられ、従ってアニオン交換マトリックス上で実
質的に均一な移動性を有する。
標識されたFabの免疫親和性を、溶液中で固定化ヒト
トランスフェリンとパーオキシダーゼ−結合ポリクロー
ナル抗マウス−IgG抗体を用いて、マイクロタイマーELI
SAシステムによって試験する。
実施例５ アニオン交換マトリックス上で実質的に均一な移動性を
持つAMCAで標識されたモノクローナルFab−フラグメン
トの調製 抗−トランスフェリンIgG−生成ハイブリドーマを用
いて確立された技術によってマウス内で生成された商業
的に入手しうる腹水から、リン酸塩緩衝液でのイオン交
換クロマトグラフィー、次いでサイズ排除ゲルクロマト
グラフィーによって、モノクローナル抗体を精製する。
この緩衝液を炭酸塩緩衝液に代えた後、パパインとジチ
オトレイトールとを併用して、IgG抗体をFab抗体フラグ
メントに消化する。この酵素修飾後に遊離チオール基
（抗体上の遊離チオール基を含む）を、酵素活性をも停
止するヨード−アセトアミドでブロックする。形成され
たFabフラグメントを、透析とアニオン交換クロマトグ
ラフィーとの組み合わせによって精製する。
精製した抗体フラグメントをホウ酸塩緩衝液pH8.0に
対して透析した後、７−アミノ−４−メチル−クマリン
−３−酢酸−Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド（AMCA−
NHS）を添加する。AMCA−NHSをDMSO溶液の形で加える
と、Fab分子の遊離アミノ基と反応する。AMCA−Fabを、
分子サイズ排除クロマトグラフィーにより、そしてアニ
オン交換マトリックス中で実質的に均一な移動性を有す
るフラクションが得られるように、最後にアニオン交換
クロマトグラフィーにより精製する。
標識されたFabの免疫親和性を、溶液中で固定化ヒト
トランスフェリンとパーオキシダーゼ結合ポリクローナ
ル抗マウス−IgG抗体を用いて、マイクロタイマーELISA
システムを用いてテストする。
実施例６ アニオン交換マトリックス中で実質的に均一な移動性を
有するRESOで標識されたモノクローナルFabフラグメン
トの調製 抗トランスフェリンIgG−生成ハイブリドーマを用い
て確立された技術によってマウス内で精製さ商業的に入
手しうる腹水から、リン酸塩緩衝液でのイオン交換クロ
マトグラフィー、次いでサイズ排除ゲルクロマトグラフ
ィーによって、モノクローナル抗体を精製した。この緩
衝液を炭酸塩緩衝液に代えた後、パパインとジチオトレ
イトールとの併用により、IgG抗体をFab抗体フラグメン
トに消化する。この酵素修飾の後、遊離チオール基（抗
体上の遊離チオール基を含む）を、酵素活性をも停止す
るヨード−アセトアミドでブロックする。形成されたFa
bフラグメントを、透析とアニオン交換クロマトグラフ
ィーの組合せによって精製する。
精製した抗体フラグメントを、0.1M炭酸塩緩衝液pH8.
5に対して透析する。Ｎ−（レゾルフィン−４−カルボ
ニル）−ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ′−ヒドロキ
シサクシンイミドエステルをDMSO溶液として過剰モル量
で添加すると、室温インキュベーション下で抗体のアミ
ノ基と反応する。標識されたFabを、分子サイズ排除カ
ラム、次いでアニオン交換クロマトグラフィーで精製す
る。アニオン交換マトリックス上で実質的に均一な移動
性を持つフラクションが分離される。
標識されたFabの免疫親和性を、溶液中で固定化ヒト
トランスフェリンとパーオキシダーゼ結合ポリクローナ
ル抗マウス−IgG抗体を用いて、マイクロタイマーELISA
システムを用いてテストする。
実施例７ 患者からの血清中の脱シアリル化されたトランスフェリ
ンの評価 脱シアリル化されたトランスフェリンの試験は、鉄で
飽和された血清サンプルについて行われる。鉄飽和は、
20μの血清に、FeCl30.25mg/mlを含む0.2Mトリス−マ
レイン酸塩pH7.0の溶液５μを加え、室温で20分間イ
ンキュベートすることにより行われる。
試験溶液は、５×10-8MFITC−Fab（フルオレセインで
標識された抗トランスフェリン−Fab、上記実施例４に
よる）を含む20mMトリス−HCl、70mMNaCl、0.05％Tween
−20、pH8.0の緩衝液500μに、10.2μの鉄飽和血清
を添加した溶液からなる。この溶液を室温で15分間イン
キュベートした後、強アニオン交換カラムで分離する。
500μのFITC−Fab−トランスフェリン複合体含有溶液
を、Mono Ｑ（Pharnacia）カラム上で20mMトリス−HC
l、70mMNaCl、0.05％Tween、pH8.0で溶離することによ
って分離する。図９は、重度飲酒者および正常被験者の
血清サンプルからのFITC−Fab−トランスフェリン複合
体の溶離結果を示す。フラクション１の蛍光は非結合Fa
bを表わし、フラクション３−７の蛍光は脱シアリル化
されたトランスフェリンに結合したFITC−Fabを表わ
し、９より上のフラクションの蛍光は正常のトランスフ
ェリンに結合したFITC−Fabを表わしている。No.7未満
のフラクションにおける蛍光の相違は、重度飲酒者と酒
の非乱用者とを識別する。
実施例８ 使い捨てミニカラムを用いる患者からの血清中の脱シア
リル化トランスフェリンの評価 強アニオン交換ゲル（Ｑ−Sepharose）から、内径0.7
cmのカラム中にゲル0.5mlを充填することによって使い
捨てカラムを調製する。このカラムを、20mMトリス−HC
l、70mMNaCl、0.05％Tween−20、pH8.0で平衡化する。
脱シアリル化トランスフェリンのためのミニカラム上
で、鉄飽和血清サンプルについて試験を行う。鉄飽和
は、20μの血清に、0.2Mトリス−マレイン酸pH7.0溶
液中のFeCl3（0.25mg/ml）５μを添加し、20分間室温
でインキュトすることにより行われる。
試験溶液は、５×10-8MFITC−Fab（フルオレセインで
標識された抗トランスフェリン−Fab、上記実施例４に
よる）を含む20mMトリス−HCl、70mMNaCl、0.05％Tween
−20、pH8.0の緩衝液500μに、10.2μの鉄飽和血清
を添加した溶液からなる。この溶液を、室温で15分間イ
ンキュベートを行った後、強アニオン交換カラムで分離
する。100μのFITC−Fab−トランスフェリン複合体含
有溶液をこのカラムに添加し、20mMトリス−HCl、70mMN
aCl、0.05％Tween−20、pH8.0を用いて、脱シアリル化
されたトランスフェリン−FITC−Fab複合体を溶離す
る。全溶離液を捕集し、フルオレセインからの蛍光を測
定し、そして使用したフルオレセイン標識Fabフラグメ
ントの標準希釈液と比較する。その結果は、重度飲酒者
とアルコールの非乱用者とを識別するのに用いられる。
下記表に、数名の重度飲酒者および正常者の結果を示
す。
実施例９ 血清中の脱シアリル化トランスフェリン（CDT）の試験
（１） 材料 i.溶液A:150kBg/mlの125I−抗トランスフェリン−Fab、
20mMビス−トリス、3.7×10-5クエン酸MFe3+、66mMNaC
l、5.9mMHCl、3.1mMNaアジド、0.05％Tween−20、pH7.
0。
ii.溶液B:20mMビス−トリス、55mMNaCl、5.9mMHCl、3.1
mMNaアジド、0.05％Tween−20、pH7.0。
iii.分離用カラム：溶液Ｂで平衡化された0.5mlの強ア
ニオン交換ゲル（Ｑ−Sepharose,Fast Flow,Pharnaci
a） iv.試験管 試薬およびカラムは長時間４−８℃で貯蔵する。
溶液とカラムは使用前に室温に平衡化する。
操作 1:試験溶液の調製 1.1:30μの血清を、試験管に入れた220μの溶液Ａ
に加える。正常の血清サンプルのみを用いる。
1.2:サンプルを室温で１−10分間インキュベートする。
2:カラム分離 2.1:まずキャップをはずし、次いで底のストッパーをは
ずして過剰な溶液をカラムから除去する。溶液をカラム
を通して溶離させ、溶離液を棄てる。
2.2:試験管をカラムの下に置く。
2.3:200μのテスト溶液を添加する。カラム中の頂部
フィルターに直接テストサンプルを加えるように注意す
る。サンプルが頂部フィルターに沈んだ後、3.0mlの溶
液Ｂを加えることによって溶離する。溶離液が停止する
までカラムを溶出させる。
3:測定 3.1:捕集された溶液をガンマカウントすることによって
測定する。
3.2:標準曲線を、CDTの既知％を含んでいる標準サンプ
ルに基づいて作成する。
3.3:未知の血清サンプル中の％CDTを、標準曲線を用い
て算出する。
実施例10 血清中の脱シアリル化トランスフェリン（CDT）の試験
（２） 材料 i.溶液A:0.14mg/mlのフルオレセイン標識抗トランスフ
ェリン−Fab、5mMトリス、55mMNaCl、pH8.0、3.1mMナト
リウムアジド。
ii.溶液B:20mMビス−トリス、3.7×10-5Mクエン酸F
e3+、66mMNaCl、5.9mMHCl、3.1mMNaアジド、0.05％トウ
ィーン20、pH7.0。
iii.溶液C:20mMビス−トリス、66mMNaCl、5.9MHCl、3.1
mMNaアジド、0.05％Tween−20、pH7.0 iv.溶液D:1.0Mトリス−塩基、3.1mMNaアジド。
v.分離用カラム：溶液Ｃで平衡化された0.5mlの強アニ
オン交換ゲル（Ｑ−Sepharose,Fast Flow,Pharmacia） vi.試験管 試薬ならびにカラムは長時間４−８℃で貯蔵する。
溶液ＡおよびＡ含有溶液は光から保護する。
処方 1:インキュベーション溶液の毎日の調製 1.1:溶液B10部と溶液A1部を混合する。
1.2:インキュベーション溶液は１日のテストのみに充分
な量で調製する。最低230μが各試験で必要であり、
標準測定用の20μがこれにプラスされる。
2:テスト調製 2.1:30μの血清を、試験管に入れた220μのインキ
ュベーション溶液（上記参照）に添加する。正常の血清
サンプルのみを使用すべきである。
2.2:サンプルは室温で１−10分間インキュベートする。
3:カラム分離 3.1:まずキャップをはずし、次いで底のストッパーをは
ずして過剰な溶液をカラムから除去する。溶液をカラム
を通して溶離させ、溶離液を棄てる。
3.2:キュベット（Cuvette）をカラムの下に設置する。
3.3:200μのテスト溶液を添加する。カラム中の頂部
フィルターに直接テストサンプルを加えるように注意す
る。サンプルが頂部フィルターに沈んだ後、3.0mlの溶
液Ｂを加えることによって溶離する。溶離液が停止する
まで溶出を続ける。
3.4:0.1mlの溶液Ｄを捕集された溶離液に添加し、キュ
ベットを逆にすることによって混合する。
4:測定 4.1:捕集された溶液を蛍光によって測定する。励起485n
m（範囲480−490）および発光520nm（範囲515−525）。
4.2:ゼロセッティングのサンプル： 3.0mlの溶液Ｃ＋0.1mlの溶液Ｄ 4.3:未知試料中のCDT％は、標準血清の測定によって確
立された標準曲線から決定することができる。
実施例11 バッチフォーマットでの分別 アッセイ溶液： 50mMNaClおよび0.05％Tweenを含む20mMビス−トリス3
00μ＋クエン酸Fe3+9.25mmol/を含む50mMトリスマ
レイン酸塩1.3μ＋フルオレセイン標識FABフラグメン
ト0.5μｇを含む溶液９μ。
粒子 Dyno Particles（ノルウェー）からのAQ4級アミン粒
子。
操作： 1. 溶液をアッセイするために、４μの血清サンプル
を添加する。
2. 50mMNaClおよび0.05％Tweenを含む20mMビス−トリ
ス緩衝液pH7中の粒子懸濁液を、最終体積が40体積％の
粒子懸濁液になるように添加し、この懸濁液を10分間撹
拌し、次いで1500gで５分間遠心分離する。
3. 上澄液の蛍光を測定する。
実施例12 抗体Fab−フラグメントの蛍光標識 1. 50mM炭酸塩緩衝液pH9.5中のFab2.5mgを、フルオレ
セイン−イソチオシアネート（FITC）25μｇに添加す
る。FITCはジメチル−スルホキシドに溶解したセライト
（10％）のFITCから調製される。
2. FabおよびFITC溶液を、暗所で18−24時間室温でイ
ンキュベートする。
3. フルオレセイン−Fabを、分子サイズゲルクロマト
グラフィーによって精製する（Superose 6 PrepGrade,P
harnacia,1.30cm）。標識されたFab−フラグメントを、
10mMNa−リン酸塩、0.5MNaCl、pH7.4緩衝液により溶離
する。抗体フラクションを分離する。
4. 捕集されたフルオレセイン−Fab溶液を、2.5mMトリ
ス−HCl、pH8.0に緩衝液交換し、強アニオン交換クロマ
トグラフィーでさらに処理する。
上記の操作は、トランスフェリンの全変異体に対して
反応性であるモノクローナル抗体から得られるFabフラ
グメントを標識するのに用いられている。抗トランスフ
ェリン抗体（IgG）を、商業的に入手しうる腹水から精
製し、このIgG分子をパパインを用いて消化し、こうし
て形成された遊離チオール基を、既知の操作に従ってヨ
ードアセトアミドを用いてブロックした。得られたFab
フラグメントをアニオン交換クロマトグラフィーにより
精製し、次いで上述したようにして標識操作を行った。
実施例13 抗体Fab−フラグメントのヨウ素−125I標識 1. ベンゼンに溶解した5mCiの125I−ボルトンハンター
試薬を、チッ素ガスを用いて蒸発乾固する。
2. 0.1Mホウ酸塩溶液pH8.5、体積0.96mlに溶解した0.6
5mgのFabを、125I−ボルトンハンター試薬に添加し、氷
上で30分間インキュベート／振盪する。
3. 0.1Mホウ酸塩、pH8.5、0.5ml中の50mMグリシンを、
反応を停止するために添加する。この溶液を、さらに氷
上で10分間インキュベートする。
4. 次いで反応溶液を、サイズ排除カラム（Superose 6
PrepGrade,Pharmacie,1×30cm）でクロマトグラフィー
により処理する。標識されたFab−フラグメントを、10m
MNa−リン酸塩、0.1MNaCl、pH7.4緩衝液により溶離す
る。抗体フラクションを分離する。
5. 分離された125I−Fabを、分子10,000を除去する超
遠心分離によって2.5mMトリス−HCl、pH8.0に緩衝液交
換し、そして1.5mlに濃縮する。
6. 強イオン交換クロマトグラフィーによってさらに処
理する。実施例12に述べたようにして得られた抗トラン
スフェリンFabフラグメントを、上記の操作を用いて標
識した。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分別系によって分離しうるタンパク質性ア
    ナライト変異体の集団を、標識されたタンパク質性特異
    的結合パートナーの集団と接触させて、標識された結合
    パートナー−アナライト複合体を形成させ、次いでこの
    複合体を該分別系による分離にかけて、該アナライト変
    異体のサブセットを複合した形で含有している１個また
    は数個のフラクションに分離し、こうして得られた１個
    または数個のフラクション中の標識の量を評価すること
    からなり、該特異的結合パートナーは、反応の前には、
    該分別系中で実質的に一様な分布または移動性を有して
    いることを特徴とする、分別系によって分離しうるタン
    パク質性アナライト変異体の集団中の変異体サブセット
    濃度を評価する方法。
  2. 【請求項２】アナライト変異体のための特異的結合パー
    トナーが、抗体またはそのフラグメントである、請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】特異的結合パートナーが１価である、請求
    の範囲第１項または第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】特異的結合パートナーが、抗体のＦ（ab）
    フラグメントである、請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】分別系が、電荷または等電点に基づいてい
    る、請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方
    法。
  6. 【請求項６】トランスフェリンの変異体を評価するため
    の請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】分別系が、電気泳動、イオン交換、クロマ
    トフォーカシングまたは等電点電気泳動から選ばれる、
    請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】トランスフェリン変異体の集団を、分離工
    程の前または分離工程と同時に第二鉄イオンで飽和する
    ことを更に含む、請求の範囲第６項または第７項に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】前記の分別系中での特異的結合パートナー
    集団の実質的に一様な分布または移動性が、修飾および
    ／または分別により得られる、請求の範囲第１項〜第８
    項のいずれに記載の方法。
  10. 【請求項１０】関心のあるアナライトのための標識され
    たタンパク質性結合パートナーを含有し、該結合パート
    ナーが、電荷または等電点に基づく１個または数個の分
    別系中で実質的に一様な分布または移動性を有する、請
    求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の方法に使用
    される組成物。
  11. 【請求項１１】抗−トランスフェリン抗体の標識された
    Ｆ（ab）またはＦ（ｖ）フラグメントを含有する、請求
    の範囲第10項に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】前記の分別を行うために必要な試薬およ
    び／または物質と一緒に、請求の範囲第10項または第11
    項に記載の組成物を含有する、分析用テストキット。
  13. 【請求項１３】分別用媒体、および緩衝塩、緩衝液、界
    面活性剤および保存剤から選ばれた１種または数種の剤
    と一緒に、請求の範囲第10項または第11項に記載の組成
    物を含有する、請求の範囲第12項に記載の分析用テスト
    キット。
  14. 【請求項１４】少なくとも１種の第二鉄のイオンまたは
    溶液を更に含有する、請求の範囲第13項に記載の分析用
    テストキット。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0605627B1 (en) * 1991-09-25 1999-05-19 MAKHLOUF, Samar Immunoassay for identifying alcoholics and monitoring alcohol consumption
US5843680A (en) * 1992-01-31 1998-12-01 Biometric Imaging, Inc. Differential separation assay methods and test kits
US5571729A (en) * 1992-06-17 1996-11-05 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Process for separating complex
SE501668C2 (sv) * 1993-08-06 1995-04-10 Biolin Medical Ab Kvantifiering av CD-transferrin vid hög alkoholkonsumtion med HPLC
DE4447334B4 (de) * 1994-12-31 2004-01-15 Karin Artelt-Zerfass Behandlungsgerät für medizinische und/oder therapeutische Anwendungen
JPH11500227A (ja) * 1995-02-22 1999-01-06 アクシス バイオケミカルズ エイエスエイ 炭水化物不足トランスフェリンアッセイ
US5798212A (en) * 1995-02-22 1998-08-25 Axis Biochemicals Asa CDT assay
CA2181109A1 (en) * 1995-07-18 1997-01-19 Nobuko Imajo Polypeptide and process for measuring living body components using the same
DE19543569C2 (de) * 1995-11-22 1998-01-22 Atou Lo Verwendung des Lectins Sambucus nigra zur Quantifizierung der endständigen Sialinsäurereste des Human-Transferrin-Moleküls mittels einer vollimmunoenzymatischen Methode (EIA)
SE9602234D0 (sv) * 1996-06-06 1996-06-06 Pharmacia Ab A novel diagnostic method utilizing ECP, and reagents to be used in the methods
AU8483698A (en) * 1997-07-15 1999-02-10 Bioprobes, Inc. Determining alcohol intake using sialic acid/apo j
GB9827411D0 (en) * 1998-12-11 1999-02-03 Axis Biochemicals Asa Dipstick assay
GB9929308D0 (en) * 1999-12-10 2000-02-02 Axis Shield Plc Assay
US6255047B1 (en) * 2000-02-28 2001-07-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Biosynthetic carbohydrate-deficient transferrin references
WO2004011905A2 (en) * 2002-07-29 2004-02-05 Correlogic Systems, Inc. Quality assurance/quality control for electrospray ionization processes
US7691640B2 (en) * 2005-09-30 2010-04-06 Adeline Vanderver Biochemical marker for diagnosing a leukodystrophy
WO2023177836A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for analyzing polypeptide variants

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4338396A (en) * 1976-10-06 1982-07-06 Kiyasu John Y Heart attack screening method and process
JPS59126246A (ja) * 1983-01-08 1984-07-20 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａもしくはｄｎａ部分分解物の塩基配列決定方法
SE440699B (sv) * 1984-02-06 1985-08-12 Pharmacia Ab Sett att medelst isotransferrinbestemning uppskatta en individs alkoholkonsumtion
JPH07113606B2 (ja) * 1986-10-27 1995-12-06 株式会社島津製作所 塩基配列決定装置
JPS6388747U (ja) * 1986-11-28 1988-06-09
JP2594925B2 (ja) * 1987-01-23 1997-03-26 株式会社日立製作所 電気泳動装置
WO1988008984A1 (en) * 1987-05-12 1988-11-17 Coulter Electronics, Inc. Method and test kit for neutralization/immunoinhibition assay
AU626563B2 (en) * 1988-01-29 1992-08-06 Abbott Laboratories Ion-capture reagents and methods for performing binding assays
JP2686565B2 (ja) * 1989-12-25 1997-12-08 忠三 岸本 Ｃ／ｅｂｐ２遺伝子及びリコンビナントｃ／ｅｂｐ２

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，３１（９），Ｐ１５４３−１５４５，（１９８５）
ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，１４１（１），Ｐ３３−３９，（１９８４）

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HU215555B (hu) 1999-01-28
HUT65621A (en) 1994-07-28
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FI925781A0 (fi) 1992-12-18
EP0535162A1 (en) 1993-04-07
AU8322891A (en) 1992-01-07
NO924912L (no) 1993-02-22
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CA2085579A1 (en) 1991-12-22
US5352616A (en) 1994-10-04
FI925781A (fi) 1992-12-18
NO924912D0 (no) 1992-12-18
ES2069902T3 (es) 1995-05-16
WO1991019983A1 (en) 1991-12-26
DE69108554D1 (de) 1995-05-04
SK279009B6 (sk) 1998-05-06
DE69108554T2 (de) 1995-08-31
EP0535162B1 (en) 1995-03-29
JPH06502912A (ja) 1994-03-31
AU654497B2 (en) 1994-11-10
DK0535162T3 (da) 1995-06-12
SK374392A3 (en) 1995-05-10
CZ374392A3 (en) 1993-05-12
CZ283072B6 (cs) 1997-12-17
ATE120551T1 (de) 1995-04-15

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