SK279009B6

SK279009B6 - Spôsob stanovenia koncentrácie rôznych látok a ana

Info

Publication number: SK279009B6
Application number: SK3743-92A
Authority: SK
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals Asa
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-20
Publication date: 1998-05-06
Also published as: ES2069902T3; CZ283072B6; DK0535162T3; HU9204073D0; WO1991019983A1; CZ374392A3; CA2085579A1; AU654497B2; DE69108554T2; US5352616A; NO924912D0; AU8322891A; FI925781A0; EP0535162B1; DE69108554D1; SK374392A3; JPH06502912A; ATE120551T1; FI925781A; EP0535162A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu stanovenia koncentrácie rôznych látok, najmä bielkovinových látok v skupine, pri použití rôznych reakčných činidiel. Vynález sa tiež týka reakčných činidiel a skúšobného balíčka na toto použitie.

Doterajší stav techniky

Biologické molekuly, napríklad enzýmy, antigény a iné biologicky dôležité bielkoviny sa často vyskytujú vo forme skupín rôznych variantov týchto látok, pričom tieto varianty spája biologická funkcia alebo vlastnosť, napríklad antigénna schopnosť alebo enzymatická účinnosť, aj napriek tomu sa však líšia svojou štruktúrou. Tieto variácie štruktúry môžu byť spôsobené rozdielom v primárnej, sekundárnej alebo terciámej štruktúre reťazca aminokyselín v bielkovinách alebo v polypeptidoch, alebo môže ísť o rozdiely v uhľohydrátových skupinách lipidových častí molekuly. Aj napriek tomu, že je spoločná vlastnosť alebo funkcia v danej skupine zlúčenín zachovaná, určité rozdiely v štruktúre môžu meniť ďalšie vlastnosti zlúčenín z danej skupiny, ako sú velkosť molekuly, náboj alebo izoelektrický bod pi, čo opäť mení správanie týchto látok pri rôznych frakcionačných a deliacich postupoch, čo je tiež možné využiť na izoláciu jednej alebo väčšieho počtu týchto látok zo zmesi.

Enzýmy sa často vyskytujú vo forme zmesi rôznych variantov, napríklad izoenzýmov, o rade ďalších biologických bielkovín je teraz tiež známe, že existujú v dvoch alebo väčšom počte variantov, ktoré sa často líšia napríklad mierou glykozylácie bielkoviny alebo zložením uhľohydrátovej časti. Relatívna koncentrácia takýchto variantov v danom tkanive alebo telesnej tekutine je spravidla stála, môže však byť narušená pri niektotých ochoreniach alebo patologických stavoch alebo v dôsledku iných porúch v tele. Je napríklad známe, že sa pomer glykozylovaného hemoglobulínu k neglykozylovanému hemoglobulínu zvyšuje v sére chorých s cukrovkou. Podobne niektoré analyticky dôležité bielkoviny, napríklad myoglobíny sa môžu svojou štruktúrou líšiť v rôznych orgánoch a môžu byť uvoľnené do krvného obehu pri poškodení buniek v dôsledku ochorenia alebo poranenia.

Meraním množstva takýchto variantov v krvi alebo inej telesnej tekutine je teda často možné stanoviť diagnózu alebo odhadnúť stav ochorenia alebo mieru poškodenia buniek.

Zvláštny význam má stanovenie koncentrácie rôznych variantov bielkoviny transferínu v krvnom sére. Transferín sa zvyčajne vyskytuje v sialylovej forme, to znamená, že nesie tri alebo väčší počet sialylových zvyškov. Ale pri chronických alkoholikoch sa zvyšuje relatívne množstvo desialylovaného transferínu s menším počtom, t. j. dvoma alebo jedným uvedeným zvyškom v porovnaní so zdravými osobami, a to z pôvodného množstva 1 až 3 % na 6 až 25 % celkového obsahu transferínu v sére chorých. Desialylovaný transferín, ktorý je často uvádzaný tiež ako transferín, chudobný na uhľohydráty (CDT) je teraz považovaný za klinicky vhodné označenie metabolizmu pri chronickom alkoholizme. Ale súčasné metódy stanovenia rôznych variantov tejto látky sú náročné na čas a vyžadujú veľmi moderné biochemické zariadenie. To znamená, že vzhľadom na to, že nie je k dispozícii jednoduchá a pohodlná skúška dovoľujúca stanoviť jednotlivé varianty transferínu, je chronický alkoholizmus stále ešte diagnostikovaný len na báze klinickej histórie, informáciami získanými od chorých a na rade laboratórnych skúšok s obmedzenou citlivosťou a špecifickosťou. Hladina alkoholu v krvi je na stanovenie vhodná len v prípade, že sa krv odoberá v priebehu 24 hodín po použití alkoholu. Všetky klinické testy, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii, majú príliš nízku citlivosť a špecifickosť na identifikáciu všetkých chronických alkoholikov. Mikroheterogenita transferínu a jeho korelácia s výskytom alkoholizmu bola prvýkrát zistená v roku 1980, ako je opísané v Stibler H., Sydow O, Borg S., Quantitative esti.mation of abnormal microheterogenity od sérum transferrin in alkoholics, Pharmac. Biochem. Behav, 1980, dodatok 13, 1, 47 až 51. Klinická dôležitosť tohto javu bola ďalej skúmaná a boli sledované možnosti využiť izoelektrický bod a chromatograflcké metódy na kvantitatívne oddelenie rôznych variantov transferínu, ako bolo opísané v publikáciách Vestergerg 0., Petren S. a Schmidt E.. Increased concentrations of a transferrin variant after aleohol abuse, Clinical Chemica Acta, 141, 33 až 39, 1984. Storey E. L., Mack U., Powell L. W. a Halliday J. W., Use of chromatofocusing to detect a transferrin variant in sérum of alcoholic subjectets. Clin. Chem. 31: 154 až 1545, 1985. Joustra a Blanche podali v roku 1984 vo Švédsku patentovú prihlášku, týkajúcu sa spôsobu stanovenia a Borg, Stibler a Joustra uverejnili v roku 1984 postup, pri ktorom sa používa aniónmeničová chromatografia na malom stĺpci na kvantitatívnu filtráciu transferínu bez uhľohydrátových skupín v sére, v závislosti od spotreby alkoholu v publikácii Stibler H., Borg S. a Joustra M., Alcoholism 10: 535 až 544, 1986, Joustra M a Blanche C., Švédska patentová prihláška 8400587-5. Tieto postupy sú založené na izokratickom delení variantov transferínu v sére pomocou ionomeničovej chromatografie s následným stanovením pomocou rádioimunologického merania s využitím protilátok, čím je možné stanoviť v rôznych frakciách obsah transferínu. Táto technika oddeľuje všetky zložky transferínu s obsahom najviac 2 molekúl kyseliny sialovej, izoelektrický bod je teda na pH 5,65. Pri použití tohto postupu bolo možné jasne odlíšiť 77 alkoholikov od 80 zdravých bežných konzumentov a 33 úplných abstinentov vzhľadom na to, že izoelektrický bod pi bol u alkoholikov vyšší než pH 5,65.

Hlavnou ťažkosťou pri uskutočňovaní týchto postupov je ich veľká prácnosť a spotreba veľkého množstva času. Pri dvojstupňovom postupe je nutné chromatograficky oddeliť varianty transferínu vo vzorke séra a potom varianty imunologický kvantitatívne stanoviť.

Bolo by preto potrebné navrhnúť jednoduchú a ľahkú skúšku na rôzne varianty stanovenej látky v zmesi, zvlášť na stanovenie rôznych variantov transferínu.

Varianty uvedených látok sú zvyčajne bielkovinovej povahy a často je možné ľahko identifikovať ďalšiu špecifickú bielkovinu, s ktorou tieto látky vytvárajú komplex. Väčšinou majú varianty antigénny účinok a väzbovou látkou je teda protilátka, aj keď často tiež sa môžu bielkoviny viazať špecificky na iné bielkoviny alebo peptidy tak, že ide jednoducho o väzbových partnerov. Napríklad bielkovina haptoglobín sa špecificky viaže na hemoglobín. Túto špecifickú väzbovú látku je potom možné značiť, napríklad enzýmom alebo určitým atómom alebo skupinou, a potom použiť pri skúške na označenie variantu, ktorý má byť stanovený.

Vynález je založený na myšlienke, že varianty je možné označiť pred ich izoláciou pri využití značených špecifických väzbových látok, ktoré po oddelení umožnia kvantitatívne stanovenie relatívneho množstva variantu. Bolo zistené, že by sa varianty mali nechať reagovať so skupinou značených väzbových látok, ktoré reagujú s rôznymi variantmi analyzovanej látky, ale majú v podstate rovnomernú distribúciu alebo pohyblivosť vo zvolenom frakcionačnom alebo deliacom systéme.

Takýto postup je podstatne jednoduchší než známe systémy, v ktorých po oddelení nasledovala bežná imunologická skúška s použitím už oddelených frakcií.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí teda spôsob stanovenia koncentrácie rôznych látok, najmä variantov v skupine bielkovinových látok, oddeliteľných frakcionačným systémom, postup sa uskutočňuje tak, že sa skupina variantov uvedie do styku so skupinou značených bielkovinových špecifických väzbových látok pre tieto varianty za vzniku značeného komplexu väzbovej látky a varianty látky, ktorá má byť stanovená a tieto komplexy sa potom delia vo frakcionačnom systéme na jednu alebo väčší počet frakcií s obsahom uvedených komplexov, potom sa stanoví množstvo značenej látky v jednej alebo vo väčšom počte získaných frakcií, pričom skupina špecifických väzbových látok má pred reakciou v podstate rovnakú pohyblivosť v použitom frakcionačnom systéme a je v ňom rovnomerne rozdelená.

Pod pojmom bielkoviny sa rozumejú všetky molekuly, ktoré majú v podstate bielkovinovú povahu, to znamená peptidy aj polypeptidy, tieto látky môžu obsahovať skupiny nebielkovinovej povahy, napríklad lipidové alebo uhľohydrátové skupiny.

Vzhľadom na to, že špecifická väzbová látka v komplexe s hľadaným variantom má v podstate rovnomernú distribúciu alebo pohyblivosť vo zvolenom frakcionačnom systéme, je výsledný rozdiel medzi pohyblivosťou alebo distribúciou vzniknutého komplexu spôsobený rozdielom vo variante v tomto komplexe. To znamená, že je možné od seba oddeliť jednu alebo väčší počet frakcii s obsahom rôznych komplexov a potom stanoviť množstvo značenej látky v každej frakcii.

Podstatu vynálezu tiež tvorí analytický skúšobný balíček, obsahujúci reakčné činidlá a/alebo iné materiály na uskutočnenie frakcionácie.

Súčasťou analytického skúšobného balíčka je aj reakčné činidlo na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu, ktoré obsahuje značené bielkovinové väzbové látky, napríklad protilátky alebo ich imunoreaktívne fragmenty, ktoré majú v podstate rovnomernú pohyblivosť alebo distribúciu v jednom alebo vo väčšom počte frakcionačných systémov.

Varianty skúmanej látky sa zvyčajne líšia v danom pufri svojím nábojom a jc teda zvyčajne možné ich ľahko oddeliť, napríklad chromatografiou na ionomeniči alebo elektroforézou. Ďalšou možnosťou je využiť odlišné izoelektrické body pi na oddelenie uvedených látok, napríklad s použitím stĺpca Mono-P a systému Polybuffer (Pharmacia, Švédsko). Využitie izoelektrického bodu komplexu je možné uskutočniť v dvojrozmerných vrstvách gélu alebo je možné komplexy od seba oddeliť jednoduchou elektroforézou na agarózovom géle. Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu je možné použiť celý rad ionomeničov a tuhých fáz. Ionizovateľnými chemickými zvyškami v týchto prostrediach môžu byť napríklad zvyšky amínu alebo sulfonované alebo karboxylované zvyšky, nosičom môže byť gél, membrána, filter, časticový materiál, guľôčky alebo akákoľvek iná vhodná tuhá fáza. Aj napriek tomu, že takéto frakcionačné systémy majú jednoduché použitie, poskytujú dobré výsledky a sú teda pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu výhodné, je možné použiť aj iné frakcionačné systémy, využívajúce niektorú vlastnosť variantov, v ktorých je zvolená väzbová látka stála.

Živice alebo časticový materiál je možné použiť vo forme suspenzií alebo v stĺpcoch, ktoré je možné premývať gradientom soli alebo pH alebo izokratickým spôsobom. Z praktického hľadiska je výhodné použitie suspenzie po vsádzkach a izokratickú elúciu. Zvlášť výhodné sú magnetizovateľné častice. Ionomeničová tuhá fáza môže byť tiež tvorená pevnou trojrozmernou štruktúrou alebo ionomeničovým filtrom. V prípade, že sa použije filter, je možné filtráciu uskutočniť paralelne vzhľadom na povrch filtra, to znamená radiálne alebo pozdĺž prúžku filtra.

Všetky alebo aspoň niektoré z rôznych reakčných činidiel a zložiek na uskutočňovanie postupu je možné dodať vo forme skúšobného balíčka spolu so značenými väzbovými látkami.

Tieto reakčné činidlá a materiály zvyčajne zahrnujú roztoky puffov, zmáčadlá, napríklad TweenR a podobne, konzervačné látky, napríklad azid sodíka, rôzne gély, živice alebo iné prostredia, ktoré sú potrebné na frakcionáciu, pripadne vo forme už pripravenej na použitie, napríklad vo forme naplnených stĺpcov a podobne.

Ako už bolo uvedené, po tvorbe komplexu variantu s väzbovou látkou, sa komplex izoluje a stanoví sa množstvo značenej látky.

Značenie môže byť tvorené akýmkoľvek bežným známym systémom, využívaným v danej oblasti techniky na označenie. Môže isť o fluorescenčnú látku, farebnú, rádioaktívnu alebo enzymatickú látku, ktorá sa potom stanoví bežným spôsobom. Rádioaktívne označenie je zvyčajne tvorené bežne používanými rádioizotopmi, ako je I¹²⁵ a bol tiež opísaný celý rad fluorescenčných a farebných látok na toto použitie. Z fluorescenčných látok je možné použiť napríklad dimetylaminonaftalén, fluoresceín, dichlórtirazinylaminofluoresceín alebo fluorescenčné kovové zlúčeniny. Z farby ide napríklad o 4-dimetylaminobenzén, 4-N,N-dimetylaminoazobenzén, trinitrobenzén, benzofurazíny, tetrametylrodamín, texaskú červeň, morfblinorodamín a jeho deriváty, azobenzény, antrachinóny, oxazíny, tiazíny, triazíny, porfyríny, phycobilíny, deriváty chlorofylu, indigové farbivá a ich analógy a deriváty.

Ako už bolo uvedené, je možné pre variant stanovovanej látky použiť akúkoľvek špecifickú bielkovinovú väzbovú látku, ktorá má rovnomernú pohyblivosť alebo distribúciu vo zvolenom frakcionačnom systéme. Pre antigény a haptény sú zvyčajne výhodnými väzbovými látkami protilátky, je však možné použiť podľa situácie aj iné systémy, ako sú haptoglobin-hemoglobín alebo hormón-receptor.

Je tiež možné použiť aj imunoreaktívne fragmenty protilátok, napríklad F(ab) alebo F(ab)₂, pokiaľ zostáva v danom frakcionačnom systéme správanie fragmentu stále. Takéto fragmenty môžu byť chránené na atóme síry napríklad 5-karboxymetylovou skupinou.

Fragmenty F(v), to znamená hypervariabilné oblasti fragmentov F(ab) je možné tiež použiť a tieto fragmenty môžu mať aj syntetický pôvod a je možné ich získať z rekombinantnej DNA alebo chemickou cestou.

Bolo zistené, že v prípade, že moláme množstvo značeného fragmentu protilátky F(ab)₂ je približne rovnaké alebo je v prebytku vzhľadom na skúmaný variant, dochádza v značnej miere ku skríženej väzbe vzhľadom na divalentnú reaktivitu značeného reakčného činidla. Tým dôjde k nízkemu odhadu počtu stanovených molekúl. V rade prípadov je teda výhodnejšie použiť monovalentné značené väzbové látky, zvlášť fragmenty F(ab) alebo F(v) príslušných protilátok.

Je nutné uviesť, že tieto monovalentné fragmenty sú menej variabilné, zvlášť v prípade, že boli získané syntetic ky a v prípade, že boli starostlivo rovnomerne značené, nie je nutné použiť frakcionačný stupeň na dosiahnutie rovnomernej pohyblivosti alebo distribúcie vo zvolenom frakcionačnom systéme.

Pre jednoduchosť sa pod pojmom protilátky v priebehu prihlášky rozumejú aj fragmenty protilátok, ak nie je vyslovene uvedené inak.

Spôsob podľa vynálezu je zvlášť vhodný na analýzu množstva rôznych variantov transferínu. Vo zvláštnom uskutočnení sa teda vynález týka spôsobu stanovenia variantov transferínu, často nazývaných izotransferíny, v krvnej plazme, sére, krvi alebo hemolyzátu. Ako už bolo uvedené, líšia sa varianty transferínu od seba prevažne rôznym počtom zvyškov kyseliny sialovej v molekule transferínu. Nový postup podľa vynálezu výhodne spočíva v tom, žc vzorka uvedie do styku so skupinou značených protilátok, reaktívnych vzhľadom na ľudský transferín s rovnomernou pohyblivosťou alebo distribúciou vo frakcionačnom systéme zo skupiny elektroforéza, ionomeničová chromatografia, chromatografia alebo stanovenie pomocou izoelektrického bodu. Výhodne sa väzba protilátky uskutoční v roztoku pufra s obsahom železitého iónu, toto prostredie je vhodné na tvorbu komplexu antigénu a protilátky. Reakcia tohto typu dobre prebieha v blízkosti neutrálneho pH, výhodne v rozmedzí 5 až 9 pri koncentrácii soli, ktorá nebráni tvorbe komplexu antigénu a protilátky.

Značenými protilátkami sú výhodne monoklonálne protilátky, je však možné použiť aj polyklonálne protilátky vzhľadom na to, že opísané čistiace postupy zaisťujú rovnomerné využitie aj týchto protilátok.

Značené fragmenty F(ab) alebo F(v) protilátok proti transferínu sú nové látky, ktoré je možné zvlášť využiť pri analýze variantov transferínu. Aj keď sú pomerne neuniformné, je možné pri ich použití získať lepšie výsledky než pri použití úplných protilátok. Frakcionované značené fragmenty F(ab) a F(v) s rovnomernou pohyblivosťou v jednom alebo väčšom počte ftakcionačných systémov sú zvlášť výhodné. Transferíny vo vzorke je možné nasýtiť železitými iónmi pred väzbou na protilátky alebo súčasne s ňou. Pri nasýtení transferínu pred väzbou alebo súčasne s ňou za oddelenia komplexu antigénu a protilátky je zvyčajne veľmi vhodné pri uskutočňovaní tejto technológie, pretože inak by rozdiely v obsahu železnatých iónov v jednotlivých variantoch porušili distribúciu v uvedených deliacich systémoch tak, že už by nedochádzalo k deleniu len na základe rozdielu v obsahu kyseliny sialovej.

Výhodné uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu pre analýzu variantov transferínu teda spočíva v tom, že sa zmes komplexov variantu a protilátky podrobí chromatografli, chromatografli na ionomeniči, elektroforéze alebo deleniu na základe izoelektrického bodu. Vzhľadom na to, že značené protilátky majú v týchto systémoch v podstate rovnomernú pohyblivosť alebo distribúciu, je rozdiel pohyblivosti alebo distribúcie vytvoreného komplexu spôsobený v podstate rozdielom v pohyblivosti alebo distribúcii variantu transferínu a často mu tiež zodpovedajú. Monoklonálne protilátky, reagujúce s ľudským transferínom, s v podstate rovnomernou pohyblivosťou alebo distribúciou v deliacich systémoch je možné získať bežným spôsobom z hybridomov aje možné ich v prípade potreby modifikovať chemickým spôsobom. Tieto protilátky je zvyčajne nutné čistiť, k čisteniu sa výhodne použijú tie isté systémy, aké sa potom použijú na stanovenie množstva jednotlivých variantov.

Skúšobný balíček na použitie pri analýze transferínu výhodne obsahuje značené protilátky proti transferínu, zvlášť výhodne ide o značené fragmenty Fab týchto proti látok, súčasne skúšobný balíček obsahuje aspoň jednu železitú soľ alebo jej roztok.

V niektorých uskutočneniach spôsobu podľa vynálezu je výhodné použiť značené protilátky alebo iné špecifické bielkovinové väzbové protilátky so špecifickým rozmedzím izoelektrických bodov alebo so zvláštnym typom distribúcie alebo pohyblivosti v deliacom systéme. Na získanie takýchto látok je možné bielkoviny modifikovať pred značením alebo po ňom. Takáto modifikácia zvyčajne zmení počet skupín nesúcich náboj, napríklad kyslých alebo bázických skupín v molekule. Takéto modifikácie je možné dosiahnuť použitím reakčných činidiel, reagujúcich s bočnými reťazcami aminokyselín v bielkovinách tak, ako bolo opísané napríklad v Glazer, Delange a Sigman: Chemical modification of proteins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1975 a v ďalšej príslušnej literatúre. Ako príklad je možné uviesť, že zvyšky amínu je možné modifikovať karbamyláciou, acetyláciou, benzyláciou alebo sukcinyláciou a zvyšky karboxylových kyselín je možné modifikovať esterifikáciou alebo väzbou na nukleofily s použitím karbodiimidov alebo ďalších väzbových činidiel. Podobne je možné modifikovať aj uhľohydrátové skupiny v protilátkach alebo iných väzbových látkach bielkovinovej povahy.

Vhodným postupom pre modifikáciu, ktorá je často potrebná pri výrobe značených glykoproteínových väzbových látok je oxidácia uhľohydrátových skupín glykoproteínov pôsobením jodistanu s následnou reakciou vzniknutého aldehydu s reakčnými činidlami, zavádzajúcimi kyslé alebo bázické skupiny. Vhodným postupom pre bielkoviny s disulfidovými mostíkmi je čiastočná redukcia disulfidových mostíkov cystinu medzi polypeptidovými reťazcami aminokyselín v bielkovine. Najmä protilátky zvyčajne obsahujú niekoľko disulfidových väzieb, z ktorých je možné časť previesť na voľné tioly bez deštrukcie afinity protilátky pre príslušný antigén. Tieto väzby a tým aj výsledné tioly sú uložené v miestach protilátky, vzdialených od väzbového miesta protilátky pre antigén. Príkladom vhodných redukčných činidiel môžu byť 2-tioetanol a ditiotreitol. Po odstránení redukčného činidla sa pre voľný tiol použije reakčné činidlo na zavedenie kyslých alebo bázických skupín, ide zvyčajne o bifunkčné väzbové látky, reagujúce s tiolovou skupinou a nukleofilnou skupinou, ako sú sulfosukcínimidyl-4-(N-maleimidometyl)cyklohexán-1 -karboxylát, sulfosukcínimidyl-(4-jódacetyl)-aminobenzoát alebo iné činidlá s obsahom sukcínimidylmaleimidu, postup sa môže uskutočňovať v jednom alebo v dvoch stupňoch. Je tiež možné reakčné činidlo na zavedenie kyslých alebo bázických skupín naviazať pomocou substituovaných pyridylsulfidov alebo reakčných činidiel s obsahom tiolových skupín za opätovného vzniku disulfidovej väzby, ale s obsahom chemickej skupiny kyslej alebo bázickej povahy.

Vo zvláštnom uskutočnení vynálezu môže byť nukleofilné činidlo tvorené polymérom kyseliny, napríklad polypeptidom s jedným alebo väčším počtom kyslých bočných reťazcov v aminokyselinách.

Výhodou modifikácie uhľohydrátu a/alebo modifikácie redukcie cystinu v oblasti, vzdialeného od miesta pre väzbu antigénu je malá interferencia s týmto miestom vo vzniknutej protilátke. Kyslé polypeptidy je však možné viazať aj na zvyšky lyzínu alebo na iné zvyšky polypeptidovej štruktúry protilátok.

V prípade analýzy variantov transferínu sú v popredí záujmu tie varianty, ktoré nesú najviac dva zvyšky kyseliny sialovej a majú izoelektrický bod pi vyšší než varianty, obsahujúce aspoň tri zvyšky kyseliny sialovej. Pri uskutočňo vaní spôsobu podľa vynálezu je napríklad možné využiť ionomeničovú živicu pri pH a pri koncentrácii pufra, pri ktorých sa komplex antigénu a protilátky variantu transferínu s aspoň troma zvyškami kyseliny sialovej viaže na tuhú fázu anionomeniča, zatiaľ čo komplex variantu s najviac dvoma zvyškami kyseliny sialovej sa neviaže. V tomto prípade sú výhodné značené protilátky, pripadne modifikované, ktoré sa viažu na tuhú fázu anionomeniča; takže v roztoku zostáva len značená protilátka, ktorá vytvorila komplex s variantom transferínu s najviac dvoma zvyškami kyseliny sialovej. Postup je schematicky znázornený na obr. I. Hodnota pH a zloženie puta sa volí v závislosti od izoelektrického bodu značenej monoklonálnej protilátky a vytvoreného komplexu. Po oddelení, napríklad odstránením alebo fdtráciou v prípade, že tuhou fázou je suspenzia alebo magneticky v prípade, že tuhá fáza ionomeniča je magnetizovateľná alebo elúciou v prípade stĺpca sa meria množstvo označenia, zvyšného v roztoku, čím sa stanoví koncentrácia komplexu antigénu a protilátky, ktorá zodpovedá koncentrácii variantu transferínu najviac dvoma zvyškami kyseliny sialovej.

Spôsob podľa vynálezu je možné uskutočňovať s použitím značených väzbových látok v prebytku vzhľadom na celkové množstvo všetkých prítomných variantov alebo s použitím prebytku variantov vzhľadom na väzbové látky. V prípade, že sa použijú v prebytku špecifické väzbové látky, zistí sa celková koncentrácia rôznych variantov. V prípade, že sa použijú v prebytku varianty, získajú sa signály, týkajúce sa relatívneho množstva rôznych variantov v celkovom množstve všetkých variantov.

V prípade, že má byť použitá v prebytku špecifická väzbová látka, ide výhodne o monovalentnú väzbovú látku. Ako už bolo uvedené, dvoj väzbová väzbová látka, napríklad protilátka má tendenciu k väzbe na dve rôzne molekuly, zvlášť v prípade, že sa použije v približne ekvimolárnom množstve. Z tohto dôvodu sú na toto použitie výhodné fragmenty F(ab) alebo F(v).

V prípade, že sa v systéme väzbovej látky, ktorou je protilátka alebo jej fragment a antigénu použije antigén v prebytku, je možné použiť značenú protilátku, prípadne modifikovanú a čistenú afinitnú chromatografiu s použitím imobilizovaného antigénu. Približne 100 % protilátok alebo fragmentov je potom imunoreaktívnych, čím je možné znížiť frakciu voľných protilátok netvoriacich komplex alebo ich fragmentov na veľmi malé množstvo. Týmto spôsobom je možné znížiť alebo celkom vylúčiť potenciálne interferencie pri tomto postupe.

Výhodou spôsobu podľa vynálezu je kombinácia imunologického kvantitatívneho stanovenia a frakcionalizácie v jedinom stupni. Táto výhoda je dosiahnutá oddelením komplexov, vytvorených medzi značenými väzbovými látkami a rôznymi variantmi stanovených látok s následným kvantitatívnym stanovením imunologickým spôsobom. Pomocou spôsobu podľa vynálezu je teda možné stanoviť množstvo transferínu a variantov iných látok oveľa ľahšie než predtým, zvláštnym príkladom je stanovenie variantov transferínu s nízkym obsahom kyseliny sialovej v krvnom sére alebo v plazme u osôb s vysokou spotrebou alkoholu.

Vynález bude ďalej opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je schematicky znázornený spôsob delenia a variantov transferínu s rôznym obsahom kyseliny sialovej s použitím ionomeniča.

Na obr. 2 je znázornené stanovenie množstva transferínu pomocou izoelektrického bodu na géli.

Na obr. 3 je graficky znázornené delenie FITC- derivátov proti transferínu chromatografiou na stĺpci silného anionomeniča, ako pufer sa použije 20 mM fosforečnan sodný s pH 6,5. Plná čiara uvádza absorpciu v ultrafialovom svetle pri 280 nm, prerušovaná čiara gradient M chloridu sodného.

Na obr. 4 je graficky znázornené ďalšie delenie rechromatografiou troch susedných frakcii derivátov FITC proti transferínu z obr. 2 na stĺpci silného anionomeniča, ako pufer bol použitý 20 mM fosforečnan sodný s pH 6,5.

Na obr. 5 je graficky znázornená analýza pomocou fluorescenčných signálov frakcií vzorky séra po pridaní FITCznačených monoklonálnych protilátok proti transferínu po chromatografii na ionomeniči, štvorčeky znázorňujú sérum alkoholika, krížiky sérum normálnej osoby.

Na obr. 6 sú graficky znázornené fluorescenčné signály z frakcii, získaných chromatografiou komplexov monoklonálnych protilátok proti transferínu na ionomeniči. Bol použitý disialotransferín (štvorčeky) a tetrasialotransferín (krížiky).

Na obr. 7 sú graficky znázornené výsledky preparatívnej chromatografie značených nečistených monoklonálnych protilátok proti transferínu na anionomeniči.

Na obr. 8 je graficky znázornená pohyblivosť jednej frakcie, získanej chromatografiou z obr. 7 v anionomeničovom systéme. Na obr. 9 je graficky znázornená fluorescencia frakcií komplexov FITC-Fab-transferínu zo vzoriek séra ťažkého alkoholika (trojuholníky) a normálnej osoby (krúžky) pri použití stĺpca anionomeniča (mono Q).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Z bežne dodávanej tekutiny, produkovanej u myší hybridómom, vytvárajúcom IgG proti transferínu, boli čistené monoklonálne protilátky chromatografiou na ionomeniči a chromatografiou na géli s použitím fosfátového pufra. Imunologická afinita protilátok bola stanovená mikrotitračným systémom ELISA s použitím imobilizovaného ľudského transferínu a polyklonálnej protilátky IgG proti myšaciemu tkanivu, konjugovanej s peroxidázou z roztoku. Čistené protilátky proti transferínu boli dialyzované proti 0,1 M pufru s kyselinou octovou s pH 5.6 a oxidované jodistanovými iónmi s konečnou koncentráciou 50 mM. Po odstránení jodistanových iónov chromatografiou na géli boli protilátky uvedené do reakcie s polypeptidom kyslej povahy vzorca

N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu-COOH v 50 násobnom molámom prebytku, vzhľadom na protilátky s následnou stabilizáciou pôsobením iónov kyanoborohydridu v roztoku v konečnej koncentrácii 15 mM. Výsledné modifikované protilátky boli dialyzované proti 0,1 M pufru s uhličitanom sodným s pH 9,5 a potom boli uvedené do reakcie s 2-tioetanolom v konečnej koncentrácii 10 mM na čas 30 minút pri teplote miestnosti s následným odstránením 2-tioetanolu chromatografiou na géli vo fosfátovom pufri pri pH 7,4. Polypeptid vzorca

N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu-COOH bol uvedený do reakcie s výsledným voľným tiolom bielkoviny s použitím sulfosukcínimidyl-4-(N-maleimidometyl)cyklohexán-l-karboxylátu pri molárnom pomere protilátky, väzbového činidla a peptidu 1:33:40. Po nasledujúcej dialýze proti uhličitanovému pufru sa modifikované protilátky nechajú reagovať s fluoresceínizotiokyanátom a potom sa čistia chromatografiou na géli. V každom stupni uvedenej modifikácie sa stanoví afinita antigénu, bolo možné pozorovať len veľmi malé zníženie afinity. Na obr. 2 sú znázornené výsledky delenia podľa izoelektrického bodu elektroforézou na géli (Phast systém, Pharmacia), kde je zrejmé zníženie pi. Hlavné frakcie modifikovaných a značených protilátok má pi, ktoré je podobné alebo nižšie ako pi izotransferín pri s najviac dvoma zvyškami kyseliny sialovej. Na obr. 2 má značenie a) až e) nasledujúci význam:

a) ľudský transferín,

b) nemodifikovaná monoklonálna protilátka IgG proti transferínu,

c) to isté ako b), ale reťazec ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu- bol viazaný na uhľohydrátovú skupinu,

d) to isté ako c), ale vyššie uvedený reťazec bol viazaný v mieste vzdialenom od miesta väzby protilátky na transferín,

e) to isté ako d), ale na bielkovinu je viazaný flouresceínizotiokyanát.

K uskutočneniu spôsobu podľa vynálezu je nutná v podstate rovnomerná distribúcia alebo pohyblivosť protilátok v príslušnom deliacom systéme. V prípade, že táto podmienka nie je zachovaná, znemožní heterogenita komplexu protilátky oddelenie komplexu protilátky s antigénom a jeho kvantitatívne stanovenie.

Na obr. 3 je znázornená heterogenita modifikovaných monoklonálnych protilátok pri vyhodnotení preparatívnou anionomeničovou chromatografiou. Prerušované vertikálne čiary uvádzajú odobratie 20 frakcií na získanie frakcií s úzkym rozmedzím pH.

Na obr. 4 sú znázornené výsledky analytickej chromatografie podielov z troch rôznych susedných frakcií, získaných pri uvedenej preparatívnej chromatografii. Je zrejmé, že v prípade každej frakcie bola dosiahnutá takmer rovnomerná pohyblivosť. Ešte homogénnejšie frakcie je možné získať s použitím menej strmého gradientu pri elúcii, opakovanou chromatografiou alebo inou chromatografickou technikou. Okrem toho je ich možné použiť aj v kombinácii s uvedeným postupom preparatívneho delenia na základe izoelektrického bodu.

V prípade, že sa skúmaná vzorka zmieša so značenými monoklonálnymi protilátkami proti ľudskému transferínu s rovnomernou mobilitou alebo distribúciou, vznikajú komplexy antigénu a protilátky s rôznou mobilitou alebo distribúciou, pričom tieto vlastnosti komplexu odrážajú rozdiely medzi variantmi transferínu. Rôzne komplexy je potom možné od seba oddeliť chromatografiou na ionomeniči, elektroforézou, využitím izoelektrického bodu alebo inými technickými postupmi, pri ktorých sa využíva rozdiel v elektrickom náboji vytvorených komplexov.

Príklad 2

Analýza vzoriek sér alkoholikov a nealkoholikov

Tuhá fáza:

Tuhou fázou je stĺpec s objemom 1 ml, naplnený polystyrénovými časticami s kvartémym aminom a substituovanými zvyškami na povrchu častíc (Mono-Q column Írom Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Elučné činidlo:

m M bis-tris-pufra so 100 mM chloridu sodného, pufer má pH 6,50.

Uskutočnenie skúšky

Vzorka séra s objemom 10 mikrolitrov sa zmieša z roztokom citrátu železitého v dvadsaťnásobnom molámom prebytku vzhľadom na obsah transferínu vo vzorke, potom sa pridá monoklonálna protilátka myši proti ľudskému transferínu, ktorá je reaktívna so všetkými variantmi ľudského transferínu a ktorá bola modifikovaná a značená fluoresceínom a potom čistená, takže má veľmi rovnomernú mobilitu v použitom systéme ionomeniča a v pufri použitom na elúciu, molárna koncentrácia transferínu v sére a protilátky je 1 : 1. Po krátkej inkubácii 5 až 10 minút pri teplote miestnosti sa stĺpec po nanesení komplexu premyje a potom sa ďalej vymýva elučným pufrom. Odoberajú sa frakcie s objemom 1,0 ml a meria sa fluorescencia frakcií (excitácia 485 nm, emisia 520 nm, merané spektrofotometrom Shimadzu RF-540).

Na obr. 5 je znázornená typická krivka, získaná s použitím sér alkoholikov a nealkoholikov. Na porovnanie je uvedená zodpovedajúca krivka, získaná s použitím roztoku vzoriek čisteného dosialo- a tetrasialotransferínu namiesto vzorky séra. Táto krivka je znázornená na obr. 6.

Príklad 3

Analýza frakcie protilátok použitej v príklade 2

Na obr. 7 je znázornený chromatogram s výsledkami preparatívnej chromatografie značenej nečistenej monoklonálnej protilátky z príkladu 2 na anionomeniči. Pri tejto chromatografii boli odoberané frakcie s objemom 0,5 ml a na obr. 8 je znázornený chromatogram, ktorý dokazuje, že každá frakcia má veľmi úzke rozmedzie mobility v použitom systéme anionomeniča pri chromatografii alebo je v tomto zmysle celkom homogénna. Chromatografia bola uskutočnená na stĺpci anionomeniča Mono Q HRS (Pharmacia) v rovnovážnom stave v 20 mM trispufri s pH 8,0 (pufer A), na elúciu bol použitý gradient pufra B (pufer A s obsahom 0,7 M chloridu sodného).

Príklad 4

Príprava fluoresceínom značených fragmentov Fab monoklonálnej protilátky s v podstate rovnomernou mobilitou v matrici anionomeniča

Z bežne dodávaného ascitu myši boli pri použití štandardnej technológie s použitím hybridómu, produkujúceho IgG proti transferínu, čistené monoklonálne protilátky chromatografiou na ionomeniči s následnou chromatografíou na géli na rozdelenie podľa veľkosti molekúl vo fosfátovom pufri. Potom bol pufer zmenený na uhličitanový pufer a potom boli protilátky IgG štiepené pôsobením papínu v kombinácii s ditiotreitolom za vzniku fragmentov Fab protilátok. Po tejto enzymatickej modifikácii boli všetky tiolové skupiny vrátane voľných tiolových skupín protilátky blokované jódacetamidom, ktorý taktiež preruší účinky enzýmu. Vzniknuté fragmenty Fab sa potom čistia kombináciou dialýzy a chromatografie na anionomeniči.

Čistené fragmenty Fab protilátky sa potom dialyzujú proti uhličitanovému pufru s pH 9,5 a potom sa modifikujú fluoresceín izotiokyanátom. Fluoresceín sa viaže na aminoskupiny protilátok a fragment Fab, značený fluoresceínom sa čistí chromatografiou, ktorá delí molekuly podľa veľkosti, potom sa izoluje frakcia značeného fragmentu Fab chromatografiou na stĺpci anionomeniča. Táto frakcia má vysoký stupeň homogenity, pokiaľ ide o izoelektrický bod a má teda tiež v podstate rovnomernú mobilitu v matrici anionomeniča.

SK 279009 Β6

Imunologická afinita značeného fragmentu Fab sa skúša mikrotitračným systémom ELISA s použitím imobilizovaného ľudského transferínu a polyklonálnej protilátky IgG proti myšaciemu tkanivu, viazanej na peroxidázu.

Príklad 5

Príprava AMAC-značených fragmentov Fab monoklonálnej protilátky s v podstate rovnomernou mobilitou v matrici anionomeniča.

Z bežne dodávaného ascitu myší boli pomocou štandardnej technológie s použitím hybridómu, produkujúceho IgG proti transferínu, čistené monoklonálne protilátky chromatografiou na ionomeniči s následným delením chromatografiou na géli podľa veľkosti vo fosfátovom pufri. Potom bol pufer vymenený na uhličitanový pufer a potom boli protilátky IgG štiepené pôsobením papínu v kombinácii s ditiotreitolom za vzniku fragmentov Fab protilátok. Po tejto enzymatickej modifikácii boli všetky tiolové skupiny vrátane voľných tiolových skupín protilátky blokované jódacctamidom, ktorý taktiež preruší účinky enzýmu. Vzniknuté fragmenty Fab sa potom čistia kombináciou dialýzy a chromatografíe na anionomeniči.

Čistené fragmenty protilátky sa potom čistia dialýzou proti boritanovému pufru s pH 8,0 a potom sa pridá N-hydroxysukcínimid kyseliny 7-amino-4-metylkumarín-3-octovej (AMCA-NHS). AMCA-NHS sa pridá vo forme roztoku v DMSO a reaguje s voľnými aminoskupinami molekuly Fab. Komplex AMCA-Fab sa čisti chromatografiou, deliacou podľa molekulovej hmotnosti a potom ešte chromatografiou na anionomeniči, čím sa získa frakcia s v podstate rovnomernou mobilitou v matrici anionomeniča.

Imunologická afinita značeného fragmentu Fab sa skúša pomocou mikrotitračného systému ELISA s použitím imubilizovaného ľudského transferínu a polyklonálnych protilátok IgG proti myši, ktoré boli konjugované s peroxidázou.

Príklad 6

Príprava RESO-značených monoklonálnych fragmentov Fab s v podstate rovnomernou mobilitou v matrici anionomeniča

Z bežne dodávaného ascitu myší boli pomocou štandardnej technológie s použitím hybridómu, produkujúceho IgG proti transferínu, čistené monoklonálne protilátky chromatografiou na ionomeniči s následným delením chromatografiou na géli podľa veľkosti vo fosfátovom pufri. Potom bol pufer vymenený na uhličitanový pufer a potom boli protilátky IgG štiepené pôsobením papínu v kombinácii s ditiotreitolom za vzniku fragmentov Fab protilátok. Po tejto enzymatickej modifikácii boli všetky tiolové skupiny vrátane voľných tiolových skupín protilátky blokované jódacetamidom, ktorý taktiež preruší účinky enzýmu. Vzniknuté fragmenty Fab sa potom čistia kombináciou dialýzy a chromatografíe na anionomeniči.

Čistené fragmenty protilátky sa potom čistia dialýzou proti uhličitanovému pufru s pH 8,5. Potom sa v molámom prebytku pridá N-hydroxysukcínimidester kyseliny N-(resorufín-4-karbonyl)piperidín-4-karboxylovej (RESOS) v roztoku DMSO a táto látka sa nechá reagovať s aminokyselinami protilátky pri inkubácii pri teplote miestnosti. Značený komplex Fab sa čistí chromatografiou na stĺpci, deliacou podľa molekulovej hmotnosti a potom ešte chromatografiou na anionomeniči. Izoluje sa frakcia s v podstate rovnomernou mobilitou v matrici anionomeniča.

Imunologická afinita značeného fragmentu Fab sa skúša pomocou mikrotitračného systému ELISA s použitím imubilizovaného ľudského transferínu, ako mobilná fáza sa použije roztok polyklonálnej protilátky IgG proti myšaciemu tkanivu, konjugovanej s peroxidázou.

Príklad 7

Stanovenie desialylovaného transferínu v sére chorých

Skúška na desialylované transferíny sa uskutočňuje na vzorkách séra nasýtených železom. Sýtenie železom sa uskutočňuje tak, že sa pridá 5 mikrolitrov chloridu železitého s koncentráciou 0,25 mg/ml v 0,2 M tris-maleátovom pufri s pH 7,0 k 20 mikrolitrom séra a zmes sa potom inkubuje 20 minút pri teplote miestnosti.

Skúmaný roztok je tvorený 10,2 mikrolitrami séra, nasýteného železom a pridaného k 500 mikrolitrom 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 s pH 8,0 s obsahom 5 x 10-8 M FETC-Fab (fragment Fab proti transferínu, značený fluoresceínom, podľa príkladu 4). Uvedený roztok sa inkubuje 15 minút pri teplote miestnosti a potom sa materiál delí na stĺpci silného anionomeniča. 500 mikrolitrov roztoku, obsahujúceho komplex FITC-Fab-fragmentu a transferínu sa potom delí elúciou stĺpca s použitím 20 mM TR1S-HCI, 70 nm NaCl, 0,05 % Tween, pri pH 8,0, použitým stĺpcom je Mono Q (Pharmacia).

Na obr. 9 sú znázornené výsledky elúcie komplexu FITC-Fab a transferínu zo vzoriek séra, odobraných od ťažkých alkoholikov a od normálnych osôb. Fluorescencia vo frakcii 1 je mierou nenaviazaného fragmentu Fab, fluorescencia vo frakciách 3 až 7 zodpovedá množstvu FITC-Fab, viazaného na desialylovaný transferín a fluorescencia vo frakciách 9 a nasledujúcich zodpovedá množstvu FITC-Fab, viazaného na normálny transferín. Rozdiely vo fluorescencii vo frakciách s číslom nižším než 7 od seba odlišujú ťažkých alkoholikov a osoby, u ktorých k alkoholizmu nedošlo.

Príklad 8

Stanovenie množstva desialylovaného transferínu v sére chorých s použitím ministĺpcov na jediné použitie

Stĺpce na jediné použitie sa pripravia z gélu silného anionomeniča (Q-Sepharose, Pharmacia) s použitím 0,5 ml gélu v stĺpci s vnútorným priemerom 0,7 cm. Stĺpec je v rovnovážnom stave s 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 pri pH 8,0.

Test na ministĺpci na desialylovaný transferín sa uskutočňuje s použitím vzorky séra, nasýteným železom. Sýtenie železom sa uskutočňuje pridaním 5 mikrolitrov roztoku chloridu železitého s množstvom 0,25 mg/ml v 0,2 M trismaleátovom pufri s pH 7,0 k 20 mikrolitrom séra s následnou inkubáciou 20 minút pri teplote miestnosti.

Skúmaný roztok je tvorený 10,2 mikrolitrami séra, nasýteného železom, toto množstvo sa pridá do 500 mikrolitrov 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 s pH 8,0 s obsahom 5 x 10-8 M FITC-Fab (Fab proti transferínu, značený transferínom podľa príkladu 4). Tento roztok sa inkubuje 15 minút pri teplote miestnosti a potom sa delí chromatografiou na stĺpci silného anionomeniča. Na stĺpec sa nanesie 100 mikrolitrov roztoku s obsahom komplexu transferínu a FITC-Fab a na elúciu komplexu desialylovaného transferínu a FITC-Fab sa použije 3,0 ml 20 mM trisHCl, 70 mM NaCl a 0,05 % Tween-20 s pH 8,0. Všetok eluát sa zhromaždí a meria sa fluorescencia z fluoresceínu, ktorá sa porovnáva so štandardným riedením fragmentov Fab, značených fluoresceínom. Výsledky sa použijú na odlíšenie alkoholikov od osôb bez prejavov alkoholizmu.

V nasledujúcej tabuľke sú zhrnuté výsledky, získané zo sér alkoholikov a normálnych ľudí.

Tabuľka

sérum	nadmerná fluorescencia %
celkového množstva
A			10,9
B			8,5
C		alkoholici	8,4
D			7,8
E			5,2
F		nealkoholici	4,8
G			4,8

Príklad 9

Test na desialylovaný transferín CDT v sére (1)

Materiály:

Roztok A: 150 KBq/ml komplexu ^l25I-antitransferínu-Fab, 20 mM bis-TRIS, 3,7 x 10-5 M citronanu železitého, 66 mM NaCl, 5,9 mM HCI, 3,1 mM azidu sodíka, 0,05 % Tween-20, pH 7,0.

Roztok B: 20 mM bis-tris, 55 mM NaCl, 5,9 mM HCI, 3,1 mM azidu sodíka, 0,05 % Tween-20, pH 7,0.

Stĺpec na delenie: 0,5 ml gélu silného anionomeniča (Q-Sepharose Fas Flow, Pharmacia) v rovnovážnom stave v roztoku B.

Skúmavky.

Reakčné činidlo a stĺpec sa po dlhší čas skladujú pri teplote 4 až 8 °C.

Roztoky a stĺpce sa pred použitím uvedú do rovnovážneho stavu pri teplote miestnosti.

Uskutočnenie skúšky:

Príprava roztoku mikrolitrov séra sa pridá k 220 mikrolitrom roztoku A v skúmavke. Použijú sa bežné vzorky séra.

Vzorky sa inkubujú počas 1 až 10 minút pri teplote miestnosti.

Príprava stĺpca a delenie

Zo stĺpca sa odstráni prebytok roztoku tak, že sa najskôr odstráni horná zátka a potom zátka na dne stĺpca. Roztok sa nechá pretiecť stĺpcom a eluát sa odloží.

Pod stĺpec sa umiestni skúmavka.

Pridá sa 200 mikrolitrov skúmaného roztoku, pričom sa dbá o to, aby vzorka bola nanesená priamo na horný filter v stĺpci. Vzorka sa nechá nasiaknuť do filtra a až potom sa uskutočňuje elúcia pridaním 3,0 ml roztoku B. Eluát sa odoberá tak dlho, pokiaľ zo stĺpca nevyteká.

Meranie

Odobraný eluát sa meria s použitím gama-počítača. Vytvorí sa referenčná krivka s použitím referenčných vzoriek so známym obsahom CDT v %.

Obsah CDT v neznámej vzorke séra v % sa vypočíta s použitím referenčnej krivky.

Príklad 10

Test na desialylovaný transferín CDT v sére (2)

Materiály:

Roztok A: 0,14 mg/ml Fab proti transferínu, značeného fluorcsceínom, 5 mM Tris, 55 mM NaCl, pH 8,0, 3,1 mM azidu sodíka.

Roztok B: 20 mM bis-tris, 3,7 x 10-5 M citrátu železitého , 66 mM NaCl, 5,9 mM HCI, 3,1 mM azidu sodíka, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

Roztok C: 20 mM bis-tris, 66 mM NaCl, 5,9 mM HCI, 3,1 mM azidu sodíka, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

Roztok D: 1,0 M tris- ako bázy, 3,1 mM azidu sodíka.

Stĺpce na delenie: 0,5 ml gélu silného anionomeniča (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) v rovnovážnom stave v roztoku C.

Skúmavky.

Reakčné činidlá a stĺpce sa počas dlhšieho obdobia skladujú pri teplote 4 až 8 °C.

Roztoky a stĺpce sa pred použitím uvádzajú do rovnovážneho stavu pri teplote miestnosti.

Roztok A a roztoky, ktoré tento roztok obsahujú ako svoju zložku, je nutné chrániť pred svetlom.

Uskutočnenie skúšky

Každodenná príprava inkubačného roztoku

Roztok B sa zmieša s roztokom A tak, že sa zmieša 1 diel roztoku A a 10 dielov roztoku B.

Roztok pre inkubáciu sa pripravuje v dávke, dostačujúcej len na jeden deň. Na každú skúšku je potrebných aspoň 230 mikrolitrov a navyše 20 mikrolitrov na referenčné meranie.

Príprava vzorky mikrolitrov séra sa pridá k 220 mikrolitrom inkubačného roztoku uvedeného zloženia v skúmavke. Používajú sa bežné vzorky séra.

Vzorky sa inkubujú počas 1 až 10 minút pri teplote miestnosti.

Príprava stĺpca a delenie na stĺpci

Zo stĺpca sa odstráni prebytočný roztok tak, že sa najskôr vyberie horná zátka a potom zátka z dna stĺpca. Roztok sa nechá pretiecť stĺpcom a eluát sa odloží.

Pod stĺpec sa umiestni kyveta.

Pridá sa 200 mikrolitrov skúmaného roztoku a dbá sa o to, aby vzorka bola pridaná priamo na horný filter stĺpca. Vzorka sa nechá vsiaknuť do filtra a až potom sa pridá 3,0 ml roztoku C. Eluát sa odoberá tak dlho, dokiaľ vyteká.

K eluátu sa pridá 0,1 ml roztoku D a roztoky sa premiešajú prevracaním kyvety.

Meranie

Meria sa fluorescencia odobraného roztoku. Excitácia

485 nm (rozmedzie 480 až 490 nm) a emisia 520 mM (rozmedzie 515 až 525 nm).

Vzorka na nastavenie nulovej hodnoty. 3,0 ml roztoku C + 0,1 ml roztoku D.

Množstvo CDT v percentách v neznámej vzorke sa stanoví zo štandardnej krivky, získanej meraním hodnôt štandardných vzorcov séra.

Príklad 11

Frakcionácia po vsádzkach

Skúšobný roztok

300 mikrolitrov 20 mM bis-tris s 50 mM NaCl a 0,05 % Tween s pH 7,0 + 1,3 mikrolitrov 50 mM trismaleátu, 9,25 mmol/liter citrátu železitého + 9 mikrolitrov roztoku, obsahujúceho 0,5 mikrogramov Fab-fragmentov, značených fluoresceínom.

Časticový' materiál

Častice kvartémeho amínu AQ (Dyno Particles, Nórsko).

Uskutočnenie skúšky

K skúšobnému roztoku sa pridajú 4 mikrolitre vzorky skúmaného séra.

Suspenzia časticového materiálu v 20 mM bis-tris pufŕa s 50 mM NaCl a 0,05 % Tween 20 s pH 7 sa pridá do konečného objemu 40 % objemových častíc v suspenzii a potom sa suspenzia 10 minút mieša, potom sa odstredí 5 minút pri 1500 g.

Meria sa fluorescencia supematantu.

Príklad 12

Fluorescenčné značenie fragmentov Fab protilátky

2,5 mg Fab v 50 mM uhličitanovom pufri s pH 9,5 sa pridá k 25 tnikrogramom fluoresceínizotiokyanátu FITC. FITC sa pripraví z FITC na celíte (10%) po rozpustení v dimetylsulfoxide.

Fab sa inkubuje s roztokom FITC pri teplote miestnosti v tme celkom 18 až 24 hodín.

Fab, značený fluoresceínom sa čistí chromatografiou na stĺpci na delenie molekúl podľa veľkosti (gél Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1,30 cm). Značený fragment sa vymýva pufrom s 10 mM fosforečnanu sodného a 0,5 M chloridu sodného s pH 7,4. Izoluje sa frakcia, obsahujúca fragment protilátky,

Zhromaždený roztok Fab, značeného fluoresceínom sa upraví tak, že sa pufer zmení na 2,5 mM tris-HCl s pH 8,0 a potom sa ďalej spracováva chromatografiou na silnom anionomeniči.

Uvedený postup bol použitý na značenie fragmentov Fab, získaných z monoklonálnych protilátok, reaktívnych so všetkými variantmi transferínu. Protilátky IgG proti transferínu boli čistené z bežne dodávaných ascitických tekutín, molekuly protilátky boli rozštiepené pôsobením papeínu a vytvorené voľné tiolové skupiny boli blokované naviazaním jódacetamidu zvyčajným postupom. Výsledné fragmenty boli čistené chromatografiou na ionomeniči a potom značené uvedeným spôsobom.

Príklad 13

Značenie fragmentov Fab protilátky jódom ¹²⁵I mCi ^l25I-Bolton Hunterove reakčné činidla, rozpusteného v benzéne sa odparí do sucha v prúde dusíka.

0,65 mg Fab v roztoku v 0,1 M boritanovom pufri s pH 8,5 (0,96 ml) sa pridá k reakčnému činidlu zo stupňa 1 a zmes sa inkubuje 30 minút v ľade za stáleho pretrepávania.

Na ukončenie reakcie sa pridá 0,5 ml roztoku 50 mM glycínu v 0,1 M boritanovom pufri s pH 8,5 a potom sa roztok inkubuje v ľade ešte 10 minút.

Reakčný roztok sa potom chromatografuje na stĺpci na delenie molekúl podľa veľkosti (Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1 x 30 cm). Značený fragment Fab sa vymýva 10 mM fosfátom sodným s 0,1 M chloridu sodného s pH 7,4 a frakcia s obsahom fragmentu protilátky sa izoluje.

Vo frakcii s ^l2SI-Fab sa pufer nahradí 2,5 mM tris-HCl s pH 8,0 ultracentrifugáciou s oddelením zlúčenín do určitej molekulovej hmotnosti 10 000 a frakcie sa zahustia na objem 1,5 ml.

Materiál sa ďalej spracováva chromatografiou na silnom ionomeniči.

Fragmenty Fab protilátky proti transferínu, získané podľa príkladu 12 boli značené vyššie uvedeným spôsobom.

Claims

1. Spôsob stanovenia koncentrácie rôznych látok, najmä variantov v skupine bielkovinových látok, oddeliteľných od seba frakcionačným systémom, vyznačujúci sa tým, že sa skupina variantov uvedie do styku so skupinou značených bielkovinových špecifických väzbových látok pre tieto varianty za vzniku komplexu variantu a značenej väzbovej látky a tieto komplexy sa potom delia vo frakcionačnom systéme na jednu alebo väčší počet frakcií s obsahom komplexov, potom sa stanoví množstvo značenej väzbovej látky v jednom alebo vo väčšom počte získaných frakcií, pričom skupina špecifických väzbových látok má pred reakciou v podstate rovnomernú distribúciu alebo mobilitu v použitom frakcionačnom systéme.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že špecifickou väzbovou látkou pre varianty skúmanej látky sú protilátky alebo ich fragmenty.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že špecifická väzbová látka je monovalentná.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že špecifickou väzbovou látkou je fragment F(ab) protilátky.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa použije frakcionačný systém založený na princípe náboja alebo izoelektrického bodu.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa použije na stanovenie relatívneho množstva variantov transferínu.

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa frakcionačný systém volí zo skupiny elektroforéza, použitie ionomeniča, chromatografia a využitie delenia na báze izoelektrického bodu.

8. Spôsob podľa nárokov 6 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že sa pred delením alebo súčasne s deliacim stupňom skupina variantov transferínu nasýti železitými iónmi.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa v podstate homogénna distribúcia alebo mobilita skupiny špecifických väzbových látok v použitom frakcionačnom systéme dosiahne ich modifikáciou a/alebo frakcionáciou.

10. Analytický skúšobný balíček na použitie pri uskutočňovaní spôsobu podľa nárokov laž9, vyznačujúci sa tým, že obsahuje skupinu značených bielkovinových väzbových látok pre varianty skúmanej látky, pričom tieto väzbové látky majú v podstate rovnomernú mobilitu alebo distribúciu v jednom alebo vo väčšom počte frakcionačných systémov.

11. Analytický skúšobný balíček podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fragmenty F(ab) alebo F(v) protilátok proti transferínu.

12. Analytický skúšobný balíček podľa nároku 9 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že obsahuje reakčné činidlá a/alebo materiály, ktoré sú potrebné na uskutočnenie frakcionácie.

13. Analytický skúšobný balíček podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že obsahuje frakcio9 načné prostredie a jedno alebo väčší počet reakčných činidiel vybratých zo skupiny pufre v forme solí alebo roztokov, zmáčadlá a konzervačné látky.

14. Analytický skúšobný balíček podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zložky na stanovenie variantov transferínu a okrem toho aspoň jednu soľ s obsahom železitého iónu v tuhej forme alebo vo forme roztokov.