JP2594925B2 - 電気泳動装置 - Google Patents

電気泳動装置

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JP2594925B2
JP2594925B2 JP62012363A JP1236387A JP2594925B2 JP 2594925 B2 JP2594925 B2 JP 2594925B2 JP 62012363 A JP62012363 A JP 62012363A JP 1236387 A JP1236387 A JP 1236387A JP 2594925 B2 JP2594925 B2 JP 2594925B2
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    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44717Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本装置はDNAの塩基配列決定装置あるいはDNAプローブ
など蛍光標識DNA検出装置に関するものである。
〔従来の技術〕
従来、塩基配列の決定には放射性リン(32P)でDNA断
片を標識し、電気泳動分離後のパターンをオートラジオ
ブラフィーで写真フィルムに転写する方式が用いられて
いた。最近、紫外線励起の蛍光体や蛋白質の標識に用い
られるFITC(フルオレセインイソチオシアネート(fluo
rescein isothiocyanate)),TRITC(テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート(tetramethyl uhodamine is
othiocyanate)),Texas Red(スルフォローダミン101
(sulforhodamine101))などの色素で核酸を標識し、
紫外レーザーあるいはアルゴンレーザー(488nm、514n
m)で標識DNAを励起して発する蛍光を検出する事で核酸
断片の検出を行なう方法が提案された。(Nature321,67
4(1986)) 〔発明が解決しようとする問題点) このような蛍光標識によるDNA検出法の難点は十分な
検出感度が得られない点であった。すなわち、蛍光標識
DNAをゲル中に泳動させた後、あるいは泳動中に光を照
射してDNAを検出しようとすると蛍光標識DNAから出る蛍
光に加えて、ゲルから出る散乱光、蛍光が観測されるた
めDNAから出る微弱な光を検出できない問題があった。
本発明の目的は上記課題を克服し、高感度で蛍光標識
DNAを検出する電気泳動装置にある。
〔問題点を解決するための手段) 上記目的は測定上防害となるゲルからの蛍光の分光特
性の検討、原因の探求、および励起光源と蛍光色素の注
意深い選択により、励起光源の波長が540nm以上のレー
ザーとして、ゲル蛍光を低減し、蛍光色素発光を相対的
に高める事により達成される。
〔作用〕
標識用蛍光体として用いられているエテノアデノシ
ン、FITC、TRITCおよびTexas Redの最適励起波長および
極大蛍光発光波長はそれぞれ、(300nm,410nm),(490
nm,520nm),(550nm,580nm),および(580nm,605nm)
である。これら色素の励起に都合が良く、出力の比較的
大きなレーザー光源として、YAG(4倍波265nm)やAr
(488nm,514.5nm)レーザーが用いられている。一方、
ゲルからの発光は励起波長および発光波長によって大き
く変化する。第1図はゲル発光強度の励起光依存性を示
したもので発光波長は各色素の発光波長と一致させてあ
る。すなわち101は520nm、102は580nm、103は605nmの発
光である。これから励起波長および発光波長が長くなる
につれゲルからの発光が小さくなる事がわかる。ゲルか
らの発光にはゲル素材中の不純物の発するものと、アク
リルアミドが重合した事により生ずるものがある。後者
は励起波長が短かいと大きいが、波長が長くなるにつれ
減少し、530〜540nm以上の励起波長では非常に小さくな
る。そこで励起光源として530〜540nm以上の波長を持つ
レーザーを用い、発光波長が600nm前後あるいはそれ以
上の発光波長を持つ蛍光色素を用いてDNAを標識する事
により高感度でDNA断片を検出できる。
〔実施例〕
以下、本発明の一実施例を第2図により説明する。測
定装置は光源1、泳動分離器2、および検出器10からな
る。光源には543nm発振のHe−Neレーザー(1mW)を用い
た。泳動分離はポリアクリルアミド板を用いた電気泳動
で行なった。レーザー光はレンズで細く絞られた後、泳
動板の泳動始点から一定距離にある部分を照射する。本
実施例ではレーザー光はゲル平面に平行な方向から、す
なわちゲル側面からゲル中に入射しているが、レーザー
光を斜め前方あるいは後方から入射させスキャンさせる
こともできる。試料の調整は次のように行なう。試料DN
Aの一端をTexas RedあるいはTRITC蛍光体で標識し、他
端がアデニン塩基(A)で終る種々の長さの断片群
{A}を作成する。同様に他端がG,C,あるいはTである
断片群{G},{C},および{T}を作成する。すな
わち、塩基配列を決定しようとするDNA1種につき4種の
断片群を作成する。これら断片群を別々のウェル3に注
入し、電気泳動を行なう。DNA断片は長いものほどゆっ
くり、短かいものは早く泳動するので図に示したように
バンド状に分離され短かい断片から順次レーザー照射部
に到達し、そこで蛍光を発する。蛍光はフィルターを通
過後、集光レンズを用いてイメージ増幅器7上に蛍光像
として結像され増幅された後にフォトダイオードアレー
8で検出されコンピューター12で処理される。本実施例
ではレーザー照射部分のab間の領域が検出されるが、こ
の領域をいくつもの泳動路が交叉する。1つの泳動路に
注目すると蛍光ラベルDNAが照射ラインを通過する毎に
蛍光信号が増加するので各泳動路毎の信号の時間変化は
図中14に示したようになる。泳動路毎に注入した断片群
の種類(A,G,CあるいはT)は既知なので、時間と共に
出現する信号を順次読む事により塩基配列が決定でき
る。
第3図は蛍光標識に用いられるFITC、TRITCおよびTex
as Redの励起スペクトルである。試料濃度は10nmole/1
である。励起光源としてFITC用には488nmアルゴンレー
ザー、TRITC用には543nmのHe−Neレーザー、Texas Red
用には567nmのクリプトンレーザーが最適である。これ
らを用いた時、発光強度はTexas Red、FITC、TRITCの順
である。FITCは溶媒のpHなどによっても強度が変化する
がほぼTexas Redと同等と評価できる。しかし、ゲルか
らの背景光強度で規格化した蛍光強度は大きく異なる。
第4図はゲル背景光を1とした時の各蛍光体の強度を示
したものである。蛍光体の濃度は1nmole/1である。543n
m励起のTexas Redから出る蛍光の絶対量はFITCより少な
いが、ゲル蛍光の量が少ない(第1図参照)ため相対強
度はFITCより大きくなり高い感度が得られる事になる。
第4図から明らかなように、発光波長が約595nm以上、
約640nm以下では、蛍光体から発する蛍光の強度のゲル
から発する蛍光の強度に対する比は、543nmによる励起
の時は5以上であり、580nmによる励起の時は13以上で
あることは明らかである。He−Neレーザーはアルゴンレ
ーザーに比べて非常に安価であり、安価なレーザーでよ
り高感度が得られる。実際の検出限界は蛍光の絶対強度
にも依存する。蛍光強度が大きいとそのゆらぎも小さく
なり、微量まで検出できる事になる。通常、蛍光体から
の発光信号は干渉フィルターを通して受光される。干渉
フィルターは通過波長帯域が狭く、透過率も低い。本実
施例のようにArレーザー(通常10〜20mWを使用)より出
力の小さい543nmHe−Ne(最高出力1mW)レーザーを用い
る場合には受光系を工夫し受光量をふやすことやフィル
ター設計を最適にして蛍光の損失を防ぐ必要がある。本
実施例では透過波長帯域が広く、透過率も高いバンドパ
スフィルターを用いている。バンドパスフィルターの透
過帯の立ち上がりは急なほど良いが、通常、透過率が0
%となる波長と透過率が70〜80%以上の透過帯の波長領
域との波長差は20〜30nm以上である。第4図を用いてフ
ィルターの設計をし、595nm〜620nmの領域を高透過率に
し、これより短および長波長側で急激に透過率が減衰す
るフィルターを用いた。このフィルターでは570nmでの
透過率はほとんど0%である。光源にクリプトンレーザ
ー(568nm)を用いると更に高感度が得られるが、受光
系に入る散乱光を除去するため、色ガラスフィルターを
バンドパスフィルターと合わせて用いる必要がある。光
源として570〜580nmに波長をセットした色素レーザーや
銅蒸気レーザーあるいは半導体レーザーなどを使用する
こともできる。
〔発明の効果〕
本発明の電気泳動装置によれば、ゲル発光の小さい波
長領域での蛍光発光を利用するので微量の蛍光ラベルDN
Aを高感度で検出する事ができる。
【図面の簡単な説明】
第1図はゲルからでる蛍光強度の励起光依存性を示す特
性図、第2図は計測装置の概念図、第3図は各種色素の
スペクトル、第4図はゲル蛍光で規格化した色素蛍光強
度の発光波長依存性を示す特性図である。 1……レーザー、2……電気泳動ゲル、3……試料注入
ウェル、4……レーザー光路、5……ミラー、6……レ
ンズ、7……イメージ増幅器、8……ダイオードアレ
ー、9……フィルター、10……蛍光受光系、11……泳動
電源、12……コンピューター、13……出力器機、14……
データチャート。

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出す
    る電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポリ
    アクリルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部
    を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射して前記蛍
    光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー光の照射
    により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、前
    記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記光検出手
    段は前記ポリアクリルアミドゲルからの発光が小さい波
    長領域で前記蛍光を検出することを特徴とする電気泳動
    装置。
  2. 【請求項2】特許請求の範囲第1項に記載の電気泳動装
    置において、電気光検出手段は、600nm以上の領域で高
    透過率を有するフイルターを具備することを特徴とする
    電気泳動装置。
  3. 【請求項3】特許請求の範囲第1項に記載の電気泳動装
    置において、前記光検出手段は、600nm前後、又はそれ
    以上の波長域で前記蛍光を検出することを特徴とする電
    気泳動装置。
  4. 【請求項4】特許請求の範囲第1項に記載の電気泳動装
    置において、前記蛍光体は、スルフォローダミン 101
    (sulforhodamine101)、テトラメチル ローダミン
    イソチオシアネート(tetramethyl rhodamine isothioc
    yanate)、及びこれらの誘導体のいずれかであることを
    特徴とする電気泳動装置。
  5. 【請求項5】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出す
    る電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポリ
    アクリルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部
    を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射して前記蛍
    光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー光の照射
    により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、前
    記レーザー光源が、He−Neレーザー、クリプトンレーザ
    ー、半導体レーザー、色素レーザーのいずれかであり、
    前記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記光検出
    手段は前記ポリアクリルアミドゲルからの発光が小さい
    波長領域で前記蛍光を検出することを特徴とする電気泳
    動装置。
  6. 【請求項6】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出す
    る電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポリ
    アクリルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部
    を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射して前記蛍
    光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー光の照射
    により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、前
    記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記蛍光体の
    極大蛍光発光波長が、600nm近傍、もしくは600nm以上で
    あり、前記光検出手段は前記ポリアクリルアミドゲルか
    らの発光が小さい波長領域で前記蛍光を検出することを
    特徴とする電気泳動装置。
  7. 【請求項7】蛍光体が標識された核酸試料の断片を電気
    泳動分離して検出し、核酸試料の塩基配列を決定する塩
    基配列決定装置において、前記断片が泳動するポリアク
    リルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部を泳
    動する前記断片にレーザー光を照射して前記蛍光体を励
    起するレーザー光源と、前記レーザー光の照射により生
    じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、前記レーザ
    ー光の波長が530nm以上であり、前記光検出手段は前記
    ポリアクリルアミドゲルからの発光が小さい波長領域で
    前記蛍光を検出し、前記光検出手段の出力に基づいて前
    記核酸試料の塩基配列を決定する手段とを具備すること
    を特徴とする塩基配列決定装置。
  8. 【請求項8】蛍光体が標識された核酸試料の断片を電気
    泳動分離して検出し、核酸試料の塩基配列を決定する塩
    基配列決定装置において、前記断片が泳動するポリアク
    リルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部を泳
    動する前記断片に530nm以上のレーザー光を照射する半
    導体レーザーと、前記レーザー光の照射により生じた蛍
    光を検出する光検出手段とを具備し、前記レーザー光の
    波長が530nm以上であり、前記蛍光体の極大蛍光発光波
    長が、600nm近傍、もしくは600nm以上であり、前記光検
    出手段は前記ポリアクリルアミドゲルからの発光が小さ
    い波長領域で前記蛍光を検出し、前記光検出手段の出力
    に基づいて前記核酸試料の塩基配列を決定する手段とを
    具備することを特徴とする塩基配列決定装置。
  9. 【請求項9】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出す
    る電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポリ
    アクリルアミドゲルを含む複数のゲル泳動路と、該ゲル
    泳動路を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射して
    前記蛍光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー光
    の照射により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備
    し、前記レーザー光の波長が530nm以上であることを特
    徴とする電気泳動装置。
  10. 【請求項10】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出
    する電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポ
    リアクリルアミドゲルを含む複数のゲル泳動路と、該ゲ
    ル泳動路を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射し
    て前記蛍光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー
    光の照射により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具
    備し、前記レーザー光源が、He−Neレーザー、クリプト
    ンレーザー、半導体レーザー、色素レーザーのいずれか
    であり、前記レーザー光の波長が530nm以上であること
    を特徴とする電気泳動装置。
  11. 【請求項11】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出
    する電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポ
    リアクリルアミドゲルを含む複数のゲル泳動路と、該ゲ
    ル泳動路を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射し
    て前記蛍光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー
    光の照射により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具
    備し、前記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記
    蛍光体の極大蛍光発光波長が、600nm近傍、もしくは600
    nm以上であることを特徴とする電気泳動装置。
  12. 【請求項12】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出
    する電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポ
    リアクリルアミドゲルを含む複数のゲル泳動路と、該ゲ
    ル泳動路を泳動する前記核酸試料に530nm以上のレーザ
    ー光を照射する半導体レーザーと、前記レーザー光の照
    射により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、
    前記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記蛍光体
    の極大蛍光発光波長が、600nm近傍、もしくは600nm以上
    であることを特徴とする電気泳動装置。
  13. 【請求項13】蛍光体が標識された核酸試料を分離検出
    する電気泳動装置において、前記核酸試料が泳動するポ
    リアクリルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動
    部を泳動する前記核酸試料にレーザー光を照射して前記
    蛍光体を励起するレーザー光源と、前記レーザー光の照
    射により生じた蛍光を検出する光検出手段とを具備し、
    前記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記光検出
    手段は、透過率が0%となる波長と、透過率が70%以上
    となる波長の差が20以上であるフイルタを備えることを
    特徴とする電気泳動装置。
  14. 【請求項14】蛍光体が標識された核酸試料の断片を電
    気泳動分離して検出し、核酸試料の塩基配列を決定する
    塩基配列決定装置において、前記断片が泳動するポリア
    クリルアミドゲルを含む電気泳動部と、該電気泳動部を
    泳動する前記断片に530nm以上のレーザー光を照射する
    半導体レーザーと、前記レーザー光の照射により生じた
    蛍光を検出する光検出手段と、該光検出手段の出力に基
    づいて前記核酸試料の塩基配列を決定する手段とを具備
    し、前記レーザー光の波長が530nm以上であり、前記光
    検出手段は、透過率が0%となる波長と、透過率が70%
    以上となる波長の差が20以上であるフイルタを備えるこ
    とを特徴とする塩基配列決定装置。
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