JPH0210266A - 塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サンガーの方法によって核酸の塩基配列を決
定する過程で、特に予めプライマーを蛍光物質や燐光物
質などの標識色素でラベルしておき、最終段階のゲル電
気泳動からの配列の読取りをその標識色素からの発光を
利用して分光学的方法により行なう装置に関するもので
ある。

（従来の技術） 従来の塩基配列決定装置としては、例えばｒＮａＬｕｒ
ｅＪ誌、第３２１巻、第６７４−６７９ページ（１９８
６年）に記載のもの（第３図参照）や、　　ｒＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａｌＮｅｔ、ｈｏｄｓ　Ｊ誌、第１３巻
、第３１５〜３２３ページ（１９８６年）に記載のもの
などがある。これらの塩基配列決定装置は、予めサンガ
ー法（ｒＰｒｏｃ、Ｎａ七１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
ＡＪ誌、第７４巻、第５４６３ページ（１９７７年）参
照）で処理したＤＮＡ断片にその末端塩基の種類（Ａ　
（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シ
トシン））に応じて別々の蛍光物質をつけたものを単一
の泳動レーンで泳動させるか、又は同じ蛍光物質をつ・
けだものを別々の泳動レーンで泳動させるかし、その蛍
光物質をレーザ光で励起し、蛍光波長の光のみを受光し
測定することによりＤＮＡ断片の泳動パターンを検出し
、最終的に塩基配列を決定している。

従来の塩基配列決定装置を詳しく説明するために、代表
例を第３図に示す。第３図の装置と類似の装置がｒＨｉ
ｇｈ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ誌、１９８６年１２月号
、第４９ページに記載されている。

第３図において、２はポリアクリルアミドにてなる泳動
ゲルであり、その両端が電極槽４，６に浸されている。

電極槽４，６には電解液が収容されている。電極槽４，
６の間には泳動電源８によって泳動電圧が印加される。

泳動ゲル２の一端には試料を注入するためのスロット１
０が設けられており、このスロット１０に末端塩基別の
試料が注入され、泳動電源８からの泳動電圧によって試
料が泳動ゲル２中を矢印１２方向に電気泳動し展開され
ていく。

１４は励起光光源としてのレーザであり、励起光はハー
フミラ−又はダイクロイックミラー１６で反射され、対
物レンズ１８を経て泳動ゲル２に照射される。泳動ゲル
２中を泳動してきた試料の蛍光ラベルからの蛍光は再び
対物レンズ１８で集光され、ハーフミラ−又はダイクロ
イックミラー１６を透過して蛍光選択用干渉フィルタ２
０を通り、受光素子としての光電子増倍管２２に受光さ
れ検出される。

第３図の装置では、１つの対物レンズ１８を励起光照射
用及び蛍光受光用に共用し、対物レンズ１８及びそれと
関連する光学系全体を試料の配列方向２３（泳動方向１
２と直交する方向、図では横方向）に機械的に走査する
。

（発明が解決しようとする課題） 第３図の塩基配列決定装置を初め、従来の塩基配列決定
装置は、アルゴンレーザ光などの強力な励起光で蛍光物
質を励起し、出てくる蛍光光を分光し検出しているが、
蛍光光は非常に弱いので、泳動ゲルによる励起光のレー
リー散乱成分の一部や水のラマン散乱による成分の一部
が蛍光光の強力な背景光となってＳ／Ｎ比を低下させる
。

以下、第３図の塩基配列決定装置を例にして問題点を詳
しく説明する。

光電子増倍管２２で受光される光はダイクロイックミラ
ー１６及び蛍光選択用干渉フィルタ２０を透過してくる
が、光電子増倍管２２で受光される光は蛍光光のみでは
なく、厳密に言えば励起光のレーリー散乱光や水のラマ
ン散乱光が背景光として入っている。

レーザ光による励起ではレーザ光のスペクトルは極めて
狭く、ラマン散乱もそのスペクトルが極めて狭くなる。

レーリー散乱光やラマン散乱光は蛍光光とは波長が異な
るので、もし、蛍光光を完全な波長フィルタ（干渉フィ
ルタ）２０で取り出せるものならば光電子増倍管２２で
受光される光の中にレーリー散乱光やラマン散乱光が混
入することはなく、背景光が高くなることはなく、した
がってＳ／Ｎ比が悪化することはない筈である。

ところが、ダイクロイックミラー１６や干渉フィルタ２
０を用いているにも拘わらず励起光成分や水のラマン散
乱光成分が光電子増倍管２２に入射してくるのは、ダイ
クロイックミラー１６や干渉フィルタ２０が完全に波長
を分離することができないためである。例えば、干渉フ
ィルタ２０が理想的な干渉フィルタであっても、波長を
分離できるのは入射光が干渉フィルタ２０に直角に入射
するときだけである。実際には蛍光光はインコヒーレン
トであり、蛍光光源の大きさをもっているので、たとえ
対物レンズ１８で平行光を得てもこの条件は満たされな
い。

仮に、干渉フィルタ２０の代りに回折格子を用いても、
入射スリットがある大きさをもち、また回折格子の本数
も無限ではなく、蛍光光がインコヒーレントでもあるの
で、回折格子も同様に理想的波長フィルタとはならない
。

すなわち、実験的に可能な物理系では完全に蛍光波長の
みを分離することはできず、光電子増倍管２２に背景光
としてレーリー散乱による励起波長成分や水のラマン散
乱波長成分が混入することは避けられない。

第３図のように泳動させなから泳動ゲル上の特定の場所
での蛍光の時間変化をみる方式（オンライン方式）では
、いったん別の泳動装置で泳動させ展開させたパターン
を測定する方式（オフライン方式）に比べて泳動ゲル自
体の場所による光学特性の差が出てこなくて有利である
が、それでも結局、核酸断片の通過、泳動ゲル２自体の
光学特性の時間変動、泡の発生又はレーザ光自体の出力
のふらつきによって、励起光のレーリー散乱光や水のラ
マン散乱光による背景光強度が大きく変動し、本来の信
号である蛍光出力の変動を包み込んでしまい、測定感度
が低下してしまう。

以上の問題は標識色素として蛍光物質の代りに燐光物質
を用いても全く同じことである。

本発明は泳動ゲルに励起光照射をして検出した信号の変
動成分から背景光の変動による寄与を除去することによ
って測定感度の高い塩基配列決定装置を提供することを
目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明では泳動ゲルから蛍光測定や燐光測定を行なった
とき、その検出信号の背景光となる泳動ゲル自体の光学
特性の変化、レーリー散乱光強度の変化及びラマン散乱
光の変化などを含んだ光の強度を測定し、その測定出力
が一定になるように制御して蛍光検出信号や燐光検出信
号に背景光の変動の影響が入らないようにする。

そのため本発明では、核酸の塩基配列を決定するために
励起光ビームにより照射された泳動ゲルの部分からの光
の一部のうちの標識色素の発光波長成分を選択的に受光
する本来の受光部（第２の受光部）の他に、励起光ビー
ムにより照射された泳動ゲルの部分からの光の一部を受
光する監視用受光部（第１の受光部）を設け、自動制御
回路によって励起光ビーム出力を制御して第１の受光部
の出力を一定にする。

また、本発明では、第１の受光部と第２の受光部の受光
素子として光電子増倍管を備え、それらの２つの光電子
増倍管の印加電圧が同時に変化するように接続し、自動
制御回路によって光電子増倍管の印加電圧を制御して第
１の受光部の出力を一定にする。

（作用） 背景光強度が変化して、例えば第１の受光部への入射光
量が増加したとすると、第２の受光部への入射光量も増
加する。自動制御回路は、例えば励起光ビーム強度を下
げるように作用して第１の受光部の出力を一定にし、第
２の受光部への背景光の入射光量を一定に保つ。例えば
また、自動制御回路は両受光部の受光素子である光電子
増倍管の印加電圧を下げて増幅度を下げ、第１の受光部
の出力を一定にし、第２の受光部の出力の背景光成分を
一定に保つ。このようにして、第２の受光部の出力にお
ける背景光の変動の影響をなくす。

第１の受光部への入射光量が減少した場合は、自動制御
回路は上記とは逆に作用して、やはり第２の受光部の出
力における背景光の変動の影響をなくす。

（実施例） 第１図は第３図に示された塩基配列決定装置に本発明を
適用した例を表わす。第３図と同一の部分には同一の符
号を付す。

スラブ状泳動ゲル２としては８％ポリアクリルアミドよ
りなるゲルを使用する。泳動ゲル２の上下には電解液の
入った電極槽４，６を備え、泳動電源８によって泳動電
圧が印加されるようになっている。

泳動ゲル２の上端には試料を注入するためのスロット１
０が設けら九でおり、各スロット１０にはサンガー法で
処理されそのプライマーに標識色素である蛍光物質ＦＩ
ＴＣで予めラベルされたＤＮＡ断片がその末端塩基Ａ、
Ｔ、Ｃ，Ｇ別にそれぞれに入れられ、原動力向１２に泳
動させられてバンド１４を作る。蛍光物質ＦＩＴＣは吸
収ピークが４９０ｎｍ付近であり、発光する蛍光のピー
クが５２０ｎｍ付近である。

励起光源としてのレーザ１６には発振波長４８８ｎｍの
アルゴンレーザを用いる。

バンド１４にレーザビームがあたると、ここから５２０
ｎｍ付近の蛍光が発する。バンド１４からの光を集光す
る位置にレンズ１８が設けられている。レンズ１８で集
光された光の光路上にダイクロイックミラー（青反射）
又はガラス板２０が設けられて、その光の一部を透過さ
せ、一部を反射させる。

ダイクロイックミラー又はガラス板２０を透過した光を
受光する位置には干渉フィルタ２２を介して光電子増倍
管２４が設けられている。干渉フィルタ２２は蛍光ピー
ク波長５２０ｎｍに狭い透過バンドをもつものを使用す
る。

光電子増倍管２４の検出信号は増幅器２６で増幅され、
マイクロコンピュータへ導かれて塩基配列が決定される
。

レンズ１８、ダイクロイックミラー又はガラス板２０、
干渉フィルタ２２及び光電子増倍管２４は第２の受光部
を構成する。

ダイクロミックミラー又はガラス板２０で反射された光
の光路上には監視用光電子増倍管３０が設けられている
。この光電子増倍管３０はダイクロミックミラー又はガ
ラス板２０及びレンズ１８とともに第１の受光部を構成
する。

レーザ１６及び第１、第２の受光部からなる光学系は駆
動機構（図示路）によって原動力向と直交する方向２３
に機械的に高速走査される。

光電子増倍管２４，３０には高圧発生回路３２から共通
の高電圧が印加されている。

３４は誤差増幅器であり、その一方の入力端子には監視
用光電子増倍管３０の出力ラインが接続され、他方の入
力端子には基準電圧Ｖｒが印加されて差動増幅される。

誤差増幅器３４の出力はレーザ電源３６に入力され、こ
れにより光電子増倍管３０の出力が一定になるようにレ
ーザ１６の放電電流が制御される。

誤差増幅器３４の出力は、レーザ電源３６に入力される
のに代えて、高圧発生回路３２に入力するように接続し
てもよい。この場合は光電子増倍管３０の出力が一定に
なるように、光電子増倍管３０の増幅度が制御される。

このことは光電子増倍管２４の印加電圧も制御されて、
光電子増倍管２４の増幅度も同時に制御されることを意
味する。

本実施例の動作を説明する。

光電子増倍管２４で受光される光にはＤＮＡ断片の蛍光
ラベルからの蛍光光だけではなく、レーリー散乱光やラ
マン散乱光が干渉フィルタ２２の不完全な分離特性によ
って混入している。

光電子増倍管３０で受光された光は光電子増倍管２４で
検出された信号の背景光を反映している。

厳密には光電子増倍管３０の出力の中には蛍光成分も含
まれるが、大部分は背景光そのものである。

背景光はレーリー散乱光とラマン散乱光からなる。

光電子増倍管２４の受光信号が変動しても、もしその変
動が何らかの原因による背景光の変動に起因するもので
あれば、光電子増倍管３０の出力も同様に変動し、もし
光電子増倍管２４の受光信号の変動が蛍光光の変動によ
る真の信号であれば光電子増倍管２４の出力のみが変動
し、光電子増倍管３０の出力は殆んど変動しない。

背景光が変動して光電子増倍管３０の出力が変動した場
合の動作を、誤差増幅器３４の出力がレーザ電源３６に
入力される実施例について説明する。

光電子増倍管３０の出力が基準電圧Ｖｒより大きくなる
と、誤差増幅器３４から負の電圧が出力され、その出力
によりレーザ１６の放電電流が少なくなる方向に制御さ
れる。光電子増倍管３０の出力がＶｒと一致するまでレ
ーザ１６の放電電流が下げられる。

光電子増倍管３０の出力が基準電圧Ｖｒより小さくなる
と上記とは逆に誤差増幅器３４から正の電圧が出力され
、その出力によりレーザ１６の放電電流が多くなる方向
に制御される。光電子増倍管３０の出力がＶｒと一致す
るまでレーザ１６の放電電流が上げられる。

次に、誤差増幅器３４の出力が高圧発生回路３２に入力
される実施例の動作について説明する。

光電子増倍管３０の出力が基準電圧Ｖｒより大きくなる
と、誤差増幅器３４から負の電圧が出力され、その出力
により光電子増倍管２４，３０の印加電圧が低下する方
向に制御される。光電子増倍管３０の出力がＶｒと一致
するまで印加電圧が下げられる。

光電子増倍管３０の出力が基準電圧Ｖｒより小さくなる
と上記とは逆に誤差増幅器３４から正の電圧が出力され
、その出力により光電子増倍管２４．３０の印加電圧が
上昇する方向に制御される。

光電子増倍管３０の出力がＶｒと一致するまで印加電圧
が上げられる。

光電子増倍管３０の出力を一定にするための制御をレー
ザ１６の放電電流を制御して行なうか、光電子増倍管２
４，３０の印加電圧を制御して行なうかは結局同じこと
であり、どちらの方法でも光電子増倍管３０の出力は一
定に保たれ、同時に光電子増倍管２４の出力における背
景光の寄与も一定に保たれる。このように、何らかの原
因でレーリー散乱光が増えたり、レーザ出力が変動して
背景光量が変動しても、光電子増倍管２４の出力の背景
光成分は一定である。したがって光電子増倍管２４の出
力のうちから蛍光成分の変化だけを高いＳ／Ｎ比で取り
出すことができる。

光電子増倍管２４の出力から塩基配列を決定する方法は
よく知られている。例えば、ある瞬間にレーザ１６から
の励起光の照射位置にＤＮＡ断片のバンド１４があれば
、このバンド１４から蛍光が放出され、光電子増倍管２
４に入射する。マイクロコンピュータでは励起光の照射
位置と光電子増倍管２４からの蛍光の有無を示す信号に
よってＤＮＡのバンド１４の状態がわかる。バンド１４
はＤＮＡ断片の分子長さの短かい順に泳動されてくるの
で、これによって塩基配列を決定することができる。

第２図は他の実施例を表わす。

泳動ゲル２の上下両端に電極槽４，６を備え、泳動ゲル
２の上端の試料注入用スロット１０に注入されたＤＮＡ
断片試料を泳動電源８からの泳動電圧によって泳動ゲル
２中を電気泳動させる点は第１図の実施例と同じである
。

本実施例でも励起光源としてアルゴンレーザ１６を用い
る。４０はアルゴンレーザ１６からのレーザ光を反射さ
せて泳動ゲル２の面の法線方向に照射する正多角形ミラ
ーである。正多角形ミラー４０が回転することによって
励起光であるレーザ光は泳動ゲル２上を泳動方向１２と
直交する方向に走査させられる６ 励起されたバンド１４のＤＮＡ断片の蛍光ラベルからの
蛍光光を受光するために泳動ゲル２の一方の端面に光フ
ァイバ束４２の一端面が泳動ゲル２の端面と対向するよ
うに設けられている。泳動ゲル２の他方の端面、すなわ
ち光ファイバ４２が設けられた端面とは反対側の端面に
は蛍光光の受光感度を高めるためにミラー４４が設けら
れている。

光ファイバ束４２の他端は束ねられて、その他端から出
た光の光路には第１図と同様にダイクロイックミラー又
はガラス板２０が設けられ、ダイクロイックミラー又は
ガラス板２０を通過した光は蛍光選択用干渉フィルタ２
２を経て光電子増倍管２４に入射し、ダイクロイックミ
ラー又はガラス板２０で反射された光は光電子増倍管３
０に入射する。

２６は光電子増倍管２４の出力信号を増幅する増幅器で
あり、増幅器２６の出力はＡ／Ｄ変換器４６でデジタル
信号に変換されてマイクロコンピュータ４８に取り込ま
れる。

正多角形ミラー４０と泳動ゲル２の間にはハーフミラ−
５０が設けられており、泳動ゲル２に照射される励起光
の一部がハーフミラ−５０で取り出されて位置センサ５
２に入力され、位置センサ５２の検出信号がマイクロコ
ンピュータ４８に取り込まれることによって、励起光の
照射位置が検出される。位置センサ５２としては例えば
半導体装置センサであるＳ−１３５２（浜松ホトニクス
社の商品）などを用いることができる。

光ファイバ束４２として例えばＥＳＫＡ　（三菱レーヨ
ン株式会社の商品）を用いることができる。

自動制御回路を構成するために、第１図の実施例と同様
にして、光電子増倍管３ｏの出力を基準電圧Ｖｒと比較
する誤差増幅器３４が設けられ、その出力はレーザ電源
３６又は高圧発生回路３２に入力されている。

次に、本実施例の動作について説明する。

ＤＮＡ断片試料を泳動ゲル２中に電気泳動させ、レーザ
１６からの励起光を正多角形ミラー４ｏの回転によって
走査し、光ファイバ束４２を経て光電子増倍管２４で信
号を検出する。

第２図では泳動ゲル２の端面からの蛍光光を光電子増倍
管２４に導く装置として光ファイバ束４２を用いている
が、この装置は単に泳動ゲル２の端面で蛍光光を受光し
て光電子増倍管２４の光電面に導くためのものであるの
で、そのような機能を果すものであれば例えば光学的成
型品であってもよい。

本実施例によれば、蛍光の測定に大きな妨害となる励起
光のレーリー散乱の最もホさい９ｏ度方向での蛍光の受
光ができる。

以上の実施例は標識色素として蛍光物質を用いているが
、蛍光物質に代えて燐光物質を用いることもできる（特
願昭６２−８６２２３０号参照）。

（発明の効果） 本発明では励起光ビームにより照射された泳動ゲルの部
分からの光の一部を監視し、ｅＡｍ色素からの発光強度
を検出した信号の背景光を一定にするように自動制御す
るので、微弱な蛍光や燐光の検出時に問題となる背景光
の変動の影響が除かれ、Ｓ／Ｎ比が向上し、塩基配列の
決定が正確となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は一実施例を示す概略斜視図、第２図は他の実施
例を示す概略斜視図、第３図は従来の塩基配列決定装置
を示す概略斜視図である。 ２・・・・・・泳動ゲル、４，６・・・・・・ｆｉ！極
槽、８・・・・・・泳動電源、１６・・・・・・アルゴ
ンレーザ、２０・旧・・ダイクロイックミラー、２２・
・・・・・干渉フィルタ、２４゜３０・・・・・・光電
子増倍管、３２・・・・・・高圧発生回路、３４・・・
・・・誤差増幅器、３６・・・・・・レーザ電源。 特許出願人　株式会社島津製作所

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）標識色素によりラベルされた核酸断片を泳動ゲル
   中で電気泳動させる機構と、前記泳動ゲルに励起光ビー
   ムを照射する手段と、励起光ビームにより照射された泳
   動ゲルの部分からの光の一部を受光する第１の受光部と
   、前記部分からの光の一部のうちの標識色素の発光波長
   成分を選択的に受光する第２の受光部と、励起光ビーム
   出力を制御して第１の受光部の出力を一定にする自動制
   御回路とを備え、第２の受光部の出力をもとにして核酸
   の塩基配列を決定する塩基配列決定装置。
2. （２）標識色素によりラベルされた核酸断片を泳動ゲル
   中で電気泳動させる機構と、前記泳動ゲルに励起光ビー
   ムを照射する手段と、受光素子として光電子増倍管を備
   え励起光ビームにより照射された部分からの光の一部を
   受光する第１の受光部と、受光素子として光電子増倍管
   を備え前記部分からの光の一部のうちの標識色素の発光
   波長成分を選択的に受光する第２の受光部と、前記２つ
   の光電子増倍管の印加電圧が同時に変化するように接続
   し、その印加電圧を制御して第１の受光部の出力を一定
   にする自動制御回路とを備え、第２の受光部の出力をも
   とにして核酸の塩基配列を決定する塩基配列決定装置。