JPH10206384A

JPH10206384A - マルチキャピラリー電気泳動装置

Info

Publication number: JPH10206384A
Application number: JP9019968A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Hayashizaki; 良英林崎; Shin Nakamura; 伸中村
Original assignee: Shimadzu Corp; Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Shimadzu Corp; Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 1998-08-07

Abstract

(57)【要約】【課題】信頼性を保ちつつ、同時に泳動させて検出で
きるキャピラリーの本数をより多くして処理能力を高め
る。【解決手段】サンプルステージ６８がサンプルタイタ
ープレート６６をキャピラリーアレイ端２ａに移動させ
接触させた後、両電極５４，５８間に高圧が所定時間印
加されて試料の注入が行なわれる。その後、泳動用リザ
ーバ６２がキャピラリーアレイ端２ａに接触し、泳動が
開始される。泳動分離されたＤＮ断片が被検出部２ｃを
通過する際、励起・受光光学系１０が走査されて試料を
標識している４種類の蛍光物質からの蛍光が光電子増倍
管で検出される。励起・受光光学系１０は落射光学系と
共焦点光学系を備えて高速に走査される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はサンガー反応を用
い、プライマー又はターミネータを蛍光物質で標識した
ＤＮＡフラグメント（断片）試料を電気泳動させ、泳動
途中でＤＮＡフラグメント試料からの蛍光を検出して塩
基配列を決定するオンライン式の電気泳動装置に関する
ものである。特に、本発明は泳動ゲルを充填した複数の
キャピラリーカラムを用いて複数の試料を同時に電気泳
動させるマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサの電気泳
動装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】人ゲノムのような長大な塩基配列をもつ
ＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大
処理能力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その
１つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに
代わってゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配
列したマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサが提案され
ている。キャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、
試料の取扱いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳
動させて高感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高
電圧を印加すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広
がったり、温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キ
ャピラリーカラムではそのような問題は少なく、高電圧
を印加して高速泳動をさせても、バンドの広がりが少な
く高感度検出ができるのである。

【０００３】サンガー法によって処理すれば、その末端
がＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ
（シトシン）からなる４種類のＤＮＡフラグメント試料
が生成される。処理能力を上げるためには複数のキャピ
ラリーカラムで同時に電気泳動させる必要があるが、そ
の場合、末端塩基別の試料を異なるキャピラリーカラム
で泳動させると、キャピラリーカラム間の泳動速度の差
が塩基配列決定の誤差となる。そのため、各キャピラリ
ーカラムには４種類の末端塩基のＤＮＡフラグメントを
含んだ試料を注入し、複数のキャピラリーカラムで同時
に泳動させなければならない。その際、末端塩基の異な
る４種類のＤＮＡフラグメントを識別するために、２種
類以上の蛍光物質で標識することが行なわれている。

【０００４】末端塩基の異なるＤＮＡフラグメントを識
別するための標識物質としてＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲ
Ａ及びＲＯＸの４種類の発蛍光団をそれぞれ異なるＤＮ
Ａフラグメントに標識として用いる方法（Anal. Chem.
1994, 66, 1021-1026（引用例１）参照）や、ＦＡＭと
ＪＯＥの２種類を比率を異ならせて用いることによりコ
ード化して４種類のＤＮＡフラグメントを識別する方法
（Anal. Chem. 1992,64, 2149-2154（引用例２）参照）
が提案されている。いずれにしても、マルチキャピラリ
ーＤＮＡシーケンサの処理能力を上げるためには、多色
蛍光標識によって識別できるようにした末端塩基の異な
る４種類のＤＮＡフラグメントを含む試料を各キャピラ
リーカラムに注入し、複数のキャピラリーカラムで複数
の試料を同時に泳動させることが背景となっている。

【０００５】複数のキャピラリーカラムで同時に泳動さ
せ、試料から発生する蛍光を検出する光学系の一例は、
キャピラリーカラムの配列の側面側から励起光ビームを
入射し、キャピラリーカラム配列の垂直方向からＣＣＤ
（電荷結合素子）カメラで蛍光を検出するものである
（引用例１参照）。そこでは、キャピラリーカラム表面
での散乱に基づくバックグラウンド信号を除去するため
に、励起光を入射する位置では泳動されてきた試料がキ
ャピラリーカラムを出てシースフローとなるようにして
いる。引用例１の方法では、シースフローを形成してい
るので、ビーム強度の減衰は少ないが、シースフロー状
態にするためのキャピラリーカラムのセッティングが難
しく、マルチ化しにくい問題がある。

【０００６】他の例は、励起光が１本のキャピラリーカ
ラムを照射するように励起光学系で集光し、キャピラリ
ーカラム中の試料からの蛍光を受光光学系で検出する。
励起光学系と受光光学系はともに固定しておいて、キャ
ピラリーカラムが励起光を横切るようにキャピラリーカ
ラムの配列を走査することによって、複数のキャピラリ
ーカラム中の試料からの蛍光を順次検出するものである
（引用例２参照）。引用例２の方法では、キャピラリー
アレイを機械的に動かせて走査するため、キャピラリー
カラムがよじれ、マルチ化の本数に制約を受けやすい。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これらの提案された方
法では、同時に泳動を行なうキャピラリーカラムの本数
に限界があり、一度に分析できる試料の数に制約を受
け、処理能力の点でなお改良の余地がある。キャピラリ
ーアレイからの蛍光をＣＣＤやＣＩＤ（電荷注入装置）
の撮像素子で検出する場合には、撮像素子の画素数の制
約もあって検出できるキャピラリーカラム本数に制限が
ある。またＣＣＤやＣＩＤの撮像素子は光電子増倍管に
比べて感度も低い。標識を２種類の螢光物質で行ないそ
の比率を異ならせる方法では、２色の信号強度比によっ
て塩基の種類を識別しなければならず、信頼性に問題が
ある。

【０００８】多数のキャピラリーカラムを用いた場合、
それぞれに異なる試料を注入するのが容易ではない。ま
た、キャピラリーカラム端を試料注入用容器の試料に浸
し電圧を印加する方法などにより注入した後、そのキャ
ピラリーカラム端を泳動用のバッファ液の入ったリザー
バに移し換えなければならず、試料注入から泳動開始に
至るまでに手間がかかり、自動化ができれば好都合であ
る。

【０００９】キャピラリー電気泳動装置では、１本のキ
ャピラリーカラムのみを用いた装置ではキャピラリーカ
ラムの温度を一定に保つようにしたものはあるが、マル
チキャピラリー電気泳動装置では温度を一定に保ってい
るものはない。そのため、泳動時の温度変化によって泳
動速度がばらついたり、検出される塩基の間隔が変動
（コンプレッション）するなどして、塩基配列決定の誤
差となる。

【００１０】本発明の第１の目的は、信頼性を保ちつ
つ、同時に泳動させて検出できるキャピラリーの本数を
より多くして処理能力を高めることである。本発明の第
２の目的は、多数のキャピラリーカラムへの試料注入か
ら泳動までを自動化することである。本発明の第３の目
的は、泳動中の温度変化による塩基配列決定誤差を防ぐ
ことである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】信頼性を保ちつつ、同時
に泳動させて検出できるキャピラリーカラムの本数をよ
り多くするために、本発明では４種類の末端塩基の異な
るＤＮＡフラグメントを４種類の蛍光物質を用いてそれ
ぞれ異なる蛍光物質で標識する。そして、マルチキャピ
ラリーアレイ泳動部は、一端側が試料注入側となってキ
ャピラリーカラム端が２次元的に配列されてバッファ液
に浸され、他端が別のバッファ液に浸されるとともに、
両バッファ液間を通して泳動電圧が印加されるようにな
っており、かつ他端側にキャピラリーカラムが１列に配
列された被検出部を備えたものとする。励起・受光光学
系は、励起光をキャピラリーアレイの被検出部の１本の
キャピラリーカラムに集光光学系により投光するととも
にキャピラリーカラム内を泳動する試料から発生する蛍
光を同じ集光光学系により受光する落射光学系と、キャ
ピラリーカラム内を泳動する試料から発生する蛍光をそ
の落射光学系とともに結像する共焦点光学系と、その共
焦点光学系による蛍光像からの蛍光を４種類の標識蛍光
物質のそれぞれに対応する波長ごとに空間的に４つに分
割する分割・分光光学系と、その４分割された蛍光をそ
れぞれ検出する光電子増倍管又はアバランシェ・フォト
ダイオードからなる光検出器とを備えたものとする。さ
らに、キャピラリーアレイの被検出部で全てのキャピラ
リーカラムからの蛍光を検出するために、励起・受光光
学系を被検出部でのキャピラリーアレイの面に平行で泳
動方向と直交する一直線に沿って往復方向に移動させる
走査機構を備える。

【００１２】４種類の蛍光物質を用いてＤＮＡフラグメ
ントを標識するので、信頼性が高くなる。励起・受光光
学系が落射光学系と共焦点光学系を備えたものとしたこ
とにより、構成が簡単になり、励起・受光光学系の走査
速度を高めることができる。それにより、走査幅が広く
なってマルチキャピラリーアレイ泳動部の被検出部に配
置できるキャピラリーカラムの本数、すなわち同時に泳
動させるキャピラリーカラム本数を増やすことができ
る。高速走査を行なった場合は光検出器の応答速度や感
度が問題となるが、光検出器として光電子増倍管やアバ
ランシェ・フォトダイオードを用いることにより、ＣＣ
ＤやＣＩＤの撮像素子に比べて応答速度も感度も高く、
高速走査に対応することができる。その結果として、キ
ャピラリーカラムの外径にもよるが、５００本程度のキ
ャピラリーアレイを用いた４色蛍光同時検出が可能にな
り、１回の塩基配列解読数が大幅に向上する。

【００１３】

【発明の実施の形態】励起・受光光学系の分割・分光光
学系の好ましい第１の局面は、共焦点光学系による蛍光
像からの蛍光を４つの光束に分割するレンズ系と、分割
された光束のそれぞれの光路上に配置された各標識蛍光
物質用の異なる４つの蛍光用分光フィルターとを備えた
ものである。

【００１４】励起・受光光学系の分割・分光光学系の好
ましい第２の局面は、共焦点光学系による蛍光像からの
蛍光を分光する分散素子と、その分散素子により分光さ
れた標識蛍光物質のそれぞれに対応する４つの波長の蛍
光を光検出器のそれぞれに導く光学系とを備えたもので
ある。

【００１５】本発明では、さらに、多数のキャピラリー
カラムへの試料注入から泳動までを自動化することが好
ましい。そのための好ましい局面では、マルチキャピラ
リーアレイ泳動部の試料注入側では２次元的に配列され
たキャピラリーカラム端が下向きに固定され、そのキャ
ピラリーカラム端の下方にはそのキャピラリーカラム端
の配列と対応して、試料が収容された試料容器が２次元
的に配列されて各キャピラリーカラムに電圧が印加され
る試料注入用リザーバ、及び泳動用バッファ液が収容さ
れて全キャピラリーカラムに電圧が印加される泳動用リ
ザーバが配置され、両リザーバのいずれかをキャピラリ
ーカラム端の下方に位置決めするための水平方向の移動
と、リザーバをキャピラリーカラム端方向に接近させた
り引き離したりするための垂直方向の移動とを行なうリ
ザーバ移動機構を備えている。

【００１６】試料注入用リザーバと泳動用リザーバをリ
ザーバ移動機構で切り換えてキャピラリーカラム端と接
触させるようにすることによって、キャピラリーカラム
端への試料注入も含めた電気泳動操作を自動化すること
ができるようになる。

【００１７】本発明では、さらに、泳動中の温度変化に
よる塩基配列決定誤差を防ぐ手段を備えていることが好
ましい。そのための好ましい局面では、マルチキャピラ
リーアレイ泳動部のマルチキャピラリーアレイを収容す
るチャンバーと、そのチャンバーを一定温度に保つ温調
機構とをさらに備えている。キャピラリーアレイを温調
することにより、泳動速度の変動に起因するコンプレッ
ションを起こさないような温度条件に制御することがで
きる。

【００１８】

【実施例】図１は一実施例を概略的に示す側面断面図で
ある。キャピラリーアレイ２は分離媒体のゲルが充填さ
れた複数のキャピラリーカラムが配列されたものであ
り、その一端側（下端側）２ａが試料注入側となってカ
セットホルダー４により二次元的に配列されて固定され
ており、試料注入用リザーバの試料又は泳動用の下側リ
ザーバのバッファ液と接触する。キャピラリーアレイ２
の他端側（上端側）２ｂはキャピラリーカラムが一列に
配列されており、先端で上側リザーババッファ液と接触
する。キャピラリーアレイ２のその他端側にはキャピラ
リーカラムが一列に配列されてカセットホルダー６によ
り支持されている被検出部２ｃが設けられている。キャ
ピラリーアレイ２、キャピラリーカラムの下端側を二次
元的に配列するためのカセットホルダー４、及び被検出
部２ｃでキャピラリーカラムを一列に配列するためのカ
セットホルダー６は図２に詳細に示されている。

【００１９】キャピラリーカラムは、石英ガラスやホウ
ケイ酸ガラス（例えばパイレックス）等を材質とするも
のであり、外形が２００〜３００μｍ、内径が７５〜１
００μｍのものである。キャピラリーカラムはその外周
をＳｉＯ₂など、紫外領域から近赤外領域の励起光によ
っては蛍光を発生しないか、発生しても蛍光測定の妨げ
にならない程度である無蛍光材質の被膜により被覆され
たものが好ましい。その場合には、被検出部２ｃでも被
膜を除去する必要がない。それに対し、キャピラリーカ
ラムが被膜として蛍光を発する樹脂被膜をもったもので
ある場合は、被検出部２ｃではその被膜を除去してお
く。キャピラリーアレイ２にはそのようなキャピラリー
カラムが９６〜４８０本配列されている。

【００２０】キャピラリーカラム内には分離媒体のゲル
として、ポリアクリルアミドゲル、リニアアクリルアミ
ドゲル、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）ゲルなどが
充填されている。各キャピラリーカラムには末端塩基別
に異なる螢光物質ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯ
Ｘ、Ｒ６Ｇ、Ｒ−１１０などの螢光物質から選ばれた４
種類の蛍光物質により標識された４種類のＤＮＡフラグ
メントを含む試料がそれぞれ注入され、同時に電気泳動
がなされる。

【００２１】標識蛍光物質を励起するための励起光源と
して、アルゴンガスレーザ装置８が設けられている。ア
ルゴンガスレーザ装置８は出力が４０〜１００ｍＷで、
マルチラインタイプであり、４８８ｎｍや５１４.５ｎ
ｍなどの波長のレーザ光を同時に発振する。

【００２２】励起・受光光学系１０は、図３（Ａ）に詳
細に示されたものである。１４はレーザ装置８からのレ
ーザビーム１２を被検出部２ｃのキャピラリーアレイの
面に垂直に照射するミラー、１６は中央部に穴をもち、
その穴から励起光ビームを透過させ、鏡面で蛍光を反射
させるトンネルミラー、１８は励起光を１本のキャピラ
リーカラムに集光して投光するとともに、そのキャピラ
リーカラムを泳動中の試料から発生する蛍光を受光する
集光レンズである。集光レンズ１８は励起光の投光と蛍
光の受光を同じレンズで行なうものであり、落射光学系
を構成している。集光レンズ１８で集光された蛍光はト
ンネルミラー１６の鏡面で反射される。

【００２３】２０はその反射光から励起光成分を遮蔽
し、蛍光を透過させる光学フィルター、２２は検出視野
を限定するためのピンホールスリット、２４は光学フィ
ルター２０を透過した蛍光をピンホールスリット２２の
位置に結像させる絞りレンズ２４である。キャピラリー
カラムでの蛍光発生点がピンホ−ルスリット２２の位置
に結像されることにより、共焦点光学系を構成してい
る。励起光除去のための光学フィルター２０としては、
エッジフィルターや色ガラスを利用することができる。
ピンホールスリット２２は検出視野を小さくして隣接す
るキャピラリーカラムからの迷光侵入を防ぐためのもの
である。

【００２４】ピンホールスリット２２での蛍光像を４つ
の光束に分割するために、図３（Ｂ）に詳細に示される
レンズパネル２６が配置されている。レンズパネル２４
は単レンズをカットして張りあわせたものや、ガラスモ
ールド成形品として製作することができる。その４つに
分割された光束のそれぞれの光路上には図３（Ｃ）に詳
細に示される各標識蛍光物質用の異なる分光用フィルタ
ーからなるフィルターパネル２８が配置されている。フ
ィルターパネル２８はバンドパスフィルターであり、各
標識蛍光物質に対応した４種類の波長特性の異なるフィ
ルターがそれぞれの光路上にくるように並列配置された
ものである。各フィルターの透過波長は、塩基Ａ，Ｇ，
Ｃ，Ｔを標識している蛍光物質の発光波長に対応したも
のである。それぞれのフィルターを透過した蛍光を検出
するために、それぞれの光路上には４つの光電子増倍管
３０が配置されている。

【００２５】ミラー１４、トンネルミラー１６、集光レ
ンズ１８、光学フィルター２０、ピンホールスリット２
２、絞りレンズ２４、レンズパネル２６、フィルターパ
ネル２８及び光電子増倍管３０を含む励起・受光光学系
は、走査機構３２のステージに取りつけられており、被
検出部２ｃでの全てのキャピラリーカラムからの蛍光を
検出するために、被検出部２ｃでのキャピラリーアレイ
の面に平行で、泳動方向と直交する一直線（図１では紙
面垂直方向、図３（Ａ）では上下方向）に沿って往復方
向に移動させられるようになっている。レーザービーム
１２がミラー１４に入射する方向は、この励起・受光光
学系の走査方向と平行になるように設定されており、励
起・受光光学系の走査によってもレーザービーム１２の
光軸が変動しないようになっている。

【００２６】キャピラリーアレイ２を一定温度に保つた
めに、図４に示されるように、発泡ポリウレタンなどの
断熱材４０で囲まれた泳動チャンバー４２が設けられ、
キャピラリーアレイ２はその泳動チャンバー４２内に収
容されている。泳動チャンバー４２にはペルチェ素子４
４が設けられて電子加熱冷却が行なわれるようになって
いる。４６，４８はぺルチェ素子の内側と外側のファン
である。泳動チャンバー４２内には温度センサーとして
白金抵抗体や熱電対が設けられており、その温度センサ
ーの検出出力をペルチェ素子４４にフィードバックして
ＰＩＤ制御することにより、泳動チャンバー４２内を一
定温度に保つようになっている。

【００２７】泳動チャンバー４２のカバー５０は、図５
（Ａ）に示されるように、上端の丁番５２を中心として
開閉できるようになっている。カバー５０には上側電極
５４が取りつけられており、図５（Ｂ）に示されるよう
に、カバー５０を被せた状態で上側電極５４が上側リザ
ーバ５６のバッファ液に接触する。上側リザーバ５６の
バッファ液にはキャピラリーアレイ２の上端２ｂが浸さ
れている。図１に示されるように、泳動チャンバー４２
の下側には下側電極５８が取りつけられており、試料注
入用リザーバ又は泳動用の下側リザーバのバッファ液が
キャピラリーアレイ２の下端２ａに接触する位置まで押
し上げられたときに、下側電極５８がその下側のリザー
バ内のバッファ液に接触してキャピラリーアレイ２の下
端２ａと導通するようになっている。両電極５４，５８
を通して電源及び制御ボックス６０の高圧電源装置から
両リザーバのバッファ液間に試料注入用電圧又は泳動電
圧が印加される。その電源電圧は例えば３０ｋＶで、電
流容量は１０〜３０ｍＡである。

【００２８】図６は下側に配置される２つのリザーバ６
２，６４を示したものであり、泳動用リザーバ６２と試
料注入用リザーバ６４が水平面内に並べて、Ｘ−Ｚサン
プルステージ６８上に支持されている。Ｘ−Ｚサンプル
ステージ６８は、いずれかのリザーバ６２，６４をキャ
ピラリーアレイ２の下端２ａの下方に位置決めする水平
方向（Ｘ方向：図１では紙面垂直方向）の移動と、リザ
ーバ内のバッファ液をキャピラリーアレイ２の下端２ａ
に接触させたり、下端２ａから引き離したりするための
垂直方向（Ｚ方向：図１では上下方向）の移動を行な
う。

【００２９】リザーバ６２，６４にはバッファ液が収容
され、リザーバ６４にはキャピラリーアレイ２の下端２
ａのキャピラリー端の配列に対応したウエルが形成され
たサンプルタイタープレート６６が乗せられる。サンプ
ルタイタープレート６６はウエルの底が貫通し、その貫
通した底にはメンブレンが張られ、それぞれのウエルの
メンブレン上には試料が吸着されている。リザーバ６４
中のバッファ液がメンブレンと接触し、バッファ液を通
して下側電極５８からキャピラリーアレイ２の下端２ａ
のキャピラリー端に試料注入用の電圧が印加される。両
リザーバ６２，６４には下側電極用スペース６８，７０
が設けられており、そのスペースに下側電極５８が入っ
たときに下側電極５８がリザーバ内のバッファ液と接触
する。

【００３０】サンプルタイタープレート６６は貫通した
ウエルの底に試料を吸着させたメンブレンを設けたもの
のほか、底をもつウエルに試料を入れ、各ウエルに泳動
電圧が印加されるようにしたものでもよい。その場合に
はリザーバ６４にはバッファ液を入れる必要はなく、ウ
エルの試料がキャピラリーアレイ２の下端２ａと接触す
るまでサンプルタイタープレート６６が押し上げられた
とき、下側電極５８がウエルの電極と接触できるように
しておけばよい。

【００３１】電源及び制御ボックス６０は、試料注入及
び泳動用の高圧電源のほか、レーザ装置の電源装置や制
御基板を備えている。その制御基板は、図７に示される
ように、ＣＰＵ８０、光電子増倍管３０からの検出信号
をデジタル信号に変換してＣＰＵ８０に取り込むＡ／Ｄ
変換器８２、ＣＰＵ８０からの指示により各部と信号の
授受を行なうＩ／Ｏインターフェース８４、及び泳動チ
ャンバー４２の温度制御を行なう温度コントローラ８６
を備えている。Ｉ／Ｏインターフェース８４は、温度コ
ントローラ８６、試料注入用及び泳動用の高圧電源、走
査機構３２のセンサー及びモータ、Ｘ−Ｚサンプルステ
ージ６８のセンサー及びモータ、レーザ装置の電源、イ
ンターロック用安全スイッチ、表示灯などと接続されて
いる。ＣＰＵ８０は外部のパーソナルコンピュータ８８
と接続され、パーソナルコンピュータ８８でデータ処理
が行なわれる。

【００３２】次に、この実施例の動作について説明す
る。試料はサンガー反応を用いて調製されたＤＮＡ断片
試料であり、末端塩基の種類に応じてプライマー又はタ
ーミネータが異なる蛍光物質で標識されている。その試
料はサンプルタイタープレート６６に用意する。

【００３３】キャピラリーアレイ２の各キャピラリーカ
ラムにはアクリルアミドモノマー溶液又はロングレンジ
ャー（アクリルアミドを主成分とするゲル原料で、アメ
リカＦＭＣ社の商品名）モノマー溶液を電気泳動ゲル組
成に調製したものを真空ポンプやアスピレーターを用い
て負圧吸引し、ゲル重合させる。キャピラリーアレイ２
をカセットホルダー４，６により図１の泳動装置の所定
の位置に装着する。

【００３４】上下のリザーバ５６，６２，６４にバッフ
ァ液を入れて泳動装置に装着し、試料を入れたサンプル
タイタープレート６６は下側リザーバ６４に装着して試
料とバッファ液とを接触させる。

【００３５】その後、パーソナルコンピュータ８８から
シーケンス開始が入力されると、サンプルステージ６８
がサンプルタイタープレート６６をキャピラリーアレイ
端２ａの下方に移動させ、サンプルタイタープレート６
６を上昇させてキャピラリーアレイ端２ａをサンプルタ
イタープレート６６中の試料に接触させる。その後、両
電極５４，５８間に高圧が所定時間印加されて試料の注
入が行なわれる。

【００３６】試料注入後、サンプルステージ６８が作動
し、泳動用リザーバ６２がキャピラリーアレイ端２ａの
位置に位置決めされてキャピラリーアレイ端２ａが泳動
用バッファ液に浸された後、両電極５４，５８間に高電
圧が印加されて泳動が開始される。泳動中はコンプレッ
ションを起こさないように泳動チャンバー４２内を４０
〜６０℃の一定温度になるように制御される。

【００３７】泳動分離されたＤＮ断片が被検出部２ｃを
通過する際、励起・受光光学系１０が走査されて試料を
標識している蛍光物質からの蛍光が検出される。このと
き、フィルターパネル２８の４つのフィルターを通過し
て４つの光電子増倍管３０で検出された蛍光による信号
の強度比により、その蛍光標識が判別されて塩基が同定
される。励起・受光光学系１０の走査速度は、２５０〜
５００ｍｍ／秒で、１回の走査を１秒以下で行なうのが
好ましい。

【００３８】キャピラリーアレイ２の各々のキャピラリ
ーカラムの同定は、走査機構３２にエンコーダを設けて
おき、そのエンコーダから得られる出力パルスを用いて
行なうことができる。そのようにして求められたキャピ
ラリーカラム位置と蛍光信号が対比させられる。各キャ
ピラリーカラムごとの信号が波形処理され、移動度補正
などの補正処理が行なわれて各キャピラリーカラムごと
の塩基配列が決定される。移動度補正は標識蛍光物質の
分子量の違いにより泳動移動度が若干異なることがある
ため、それを補正する処理である。

【００３９】この実施例では各リザーバにバッファ液を
入れて泳動装置に装着する用にしているが、各リザーバ
を予め泳動装置に設置しておき、ノズルやポートを介し
てバッファ液を各リザーバに自動的に注入したり排出し
たりする送・排液手段を泳動装置に設けて、バッファ液
の入れ換えの自動化を図るようにしてもよい。

【００４０】図８は励起光源のレーザ装置８からの励起
光ビームが励起・受光光学系１０の走査によってもずれ
ないようにするための他の実施例を示したものである。
ここでは、レーザ装置８からのレーザビームがカップラ
ー９０により結合された光ファイバ９２を経てコリメー
タ９４から図３に示されたトンネルミラー１６に入射さ
れる。コリメータ９４は走査される励起・受光光学系１
０に固定されている。図８の実施例では、レーザ装置８
の方向を厳密に設定しなくても、励起光ビームが励起・
受光光学系１０の走査によってずれることはない。

【００４１】図９は励起・受光光学系１０における分割
・分光光学系の他の実施例を示したものである。図３の
実施例ではピンホールスリット２２に結像した蛍光を４
つに分割した後に分光するために、レンズパネル２６と
フィルターパネル２８を用いているのに対し、図９の実
施例ではピンホールスリット２２に結像した蛍光像を凹
面グレーティング９６で分割と分光を同時に行なってい
る。９８はピンホールスリット２２を透過した蛍光を凹
面グレーティング９６の方向に反射するための平面ミラ
ーである。凹面グレーティング９６による分光の結像位
置には、４つの標識蛍光物質に対応した波長位置からの
蛍光を受光するバンドルファイバ１００の一端が配置さ
れており、バンドルファイバ１００の他端は４つの光電
子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオード３０に導
かれている。

【００４２】

【発明の効果】本発明では４種類の蛍光物質を用いてＤ
ＮＡフラグメントを標識するので、信頼性が高くなる。
励起・受光光学系が落射光学系と共焦点光学系を備えた
ものとしたことにより、構成が簡単になり、励起・受光
光学系の走査速度を高めることができる。そして、光検
出器として応答速度や感度の高い光電子増倍管やアバラ
ンシェ・フォトダイオードを用いているので、高速走査
に対応することができる。その結果として、同時に泳動
させることのできるキャピラリーカラム本数を増やすこ
とができる。試料注入用リザーバと泳動用リザーバをリ
ザーバ移動機構で切り換えてキャピラリーカラム端と接
触させるようにすれば、キャピラリーカラム端への試料
注入も含めた電気泳動操作を自動化することができるよ
うになる。マルチキャピラリーアレイ泳動部のマルチキ
ャピラリーアレイを収容するチャンバーと、そのチャン
バーを一定温度に保つ温調機構とを備えることにより、
泳動速度の変動に起因するコンプレッションを防ぎ、塩
基配列決定誤差を防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】一実施例を概略的に示す側面断面図である。

【図２】キャピラリーアレイとカセットホルダを示す斜
視図である。

【図３】（Ａ）は一実施例における励起・受光光学系を
示す側面断面図、（Ｂ）はそこで用いられるレンズパネ
ルを示す斜視図、（Ｃ）はそこで用いられるフィルタパ
ネルを示す斜視図である。

【図４】（Ａ）は温度制御機構を備えた泳動チャンバー
を示す正面断面図、（Ｂ）は側面断面図である。

【図５】同泳動チャンバーのカバーを示す側面断面図で
あり、（Ａ）はカバーを開けた状態、（Ｂ）は閉じた状
態である。

【図６】下側に配置される２つのリザーバを示す図であ
り、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は側面図である。

【図７】電源及び制御ボックスに設けられる制御基板を
示すブロック図である。

【図８】他の実施例における励起光ビームを供給する機
構を示す平面図である。

【図９】さらに他の実施例における励起・受光光学系を
示す側面断面図である。

【符号の説明】

２キャピラリーアレイ２ｃ被検出部８アルゴンガスレーザ装置１０励起・受光光学系１２レーザビーム１８集光レンズ２２ピンホ−ルスリット２４絞りレンズ２６レンズパネル２８フィルターパネル３０光電子増倍管４２泳動チャンバー４４ペルチェ素子５６，６２，６４リザーバ６６サンプルタイタープレート６８Ｘ−Ｚサンプルステージ

フロントページの続き (72)発明者林崎良英茨城県つくば市高野台３丁目１番１理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター内 (72)発明者中村伸京都府京都市中京区西ノ京桑原町１番地株式会社島津製作所三条工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲルが充填された複数のキャピラリーカ
ラムが配列され、４種類の蛍光物質により識別可能に標
識された４種類の末端塩基の異なるＤＮＡフラグメント
を含む複数の試料が１つずつ前記キャピラリーカラムに
注入されて、全てのキャピラリーカラムで同時に電気泳
動されるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、前記マル
チキャピラリーアレイ泳動部のキャピラリーアレイの面
に対し、その垂直方向から泳動方向と直交する直線上に
励起光を照射し、励起光により励起された試料からの蛍
光を受光し、その蛍光の波長特性を検出する励起・受光
光学系とを備えたマルチキャピラリー電気泳動装置にお
いて、前記マルチキャピラリーアレイ泳動部は、一端側が試料
注入側となってキャピラリーカラム端が２次元的に配列
されてバッファ液に浸され、他端が別のバッファ液に浸
されるとともに、両バッファ液間を通して泳動電圧が印
加されるようになっており、かつ他端側にキャピラリー
カラムが１列に配列された被検出部を備えており、前記励起・受光光学系は、励起光をキャピラリーアレイ
の前記被検出部の１本のキャピラリーカラムに集光光学
系により投光するとともにキャピラリーカラム内を泳動
する試料から発生する蛍光を同じ集光光学系により受光
する落射光学系と、キャピラリーカラム内を泳動する試
料から発生する蛍光をその落射光学系とともに結像する
共焦点光学系と、その共焦点光学系による蛍光像からの
蛍光を４種類の標識蛍光物質のそれぞれに対応する波長
ごとに空間的に４つに分割する分割・分光光学系と、そ
の４分割された蛍光をそれぞれ検出する光電子増倍管又
はアバランシェ・フォトダイオードからなる光検出器と
を備えており、キャピラリーアレイの前記被検出部で全てのキャピラリ
ーカラムからの蛍光を検出するために、前記励起・受光
光学系を前記被検出部でのキャピラリーアレイの面に平
行で泳動方向と直交する１直線に沿って往復方向に移動
させる走査機構を備えていることを特徴とするマルチキ
ャピラリー電気泳動装置。
【請求項２】前記励起・受光光学系の分割・分光光学
系は、共焦点光学系による蛍光像からの蛍光を４つの光
束に分割するレンズ系と、分割された光束のそれぞれの
光路上に配置された各標識蛍光物質用の異なる４つの蛍
光用分光フィルターとを備えている請求項１に記載のマ
ルチキャピラリー電気泳動装置。
【請求項３】前記励起・受光光学系の分割・分光光学
系は、共焦点光学系による蛍光像からの蛍光を分光する
分散素子と、その分散素子により分光された標識蛍光物
質のそれぞれに対応する４つの波長の蛍光を前記光検出
器のそれぞれに導く光学系とを備えている請求項１に記
載のマルチキャピラリー電気泳動装置。
【請求項４】前記マルチキャピラリーアレイ泳動部の
試料注入側では２次元的に配列されたキャピラリーカラ
ム端が下向きに固定され、そのキャピラリーカラム端の
下方にはそのキャピラリーカラム端の配列と対応して、
試料が収容された試料容器が２次元的に配列されて各キ
ャピラリーカラムに電圧が印加される試料注入用リザー
バ、及び泳動用バッファ液が収容されて全キャピラリー
カラムに電圧が印加される泳動用リザーバが配置され、両リザーバのいずれかを前記キャピラリーカラム端の下
方に位置決めするための水平方向の移動と、リザーバを
キャピラリーカラム端方向に接近させたり引き離したり
するための垂直方向の移動とを行なうリザーバ移動機構
を備えている請求項１，２又は３に記載のマルチキャピ
ラリー電気泳動装置。
【請求項５】前記マルチキャピラリーアレイ泳動部の
マルチキャピラリーアレイを収容するチャンバーと、そ
のチャンバーを一定温度に保つ温調機構とをさらに備え
ている請求項１，２，３又は４に記載のマルチキャピラ
リー電気泳動装置。