JP4489479B2 - キャピラリアレイ検出用回転共焦スキャナ - Google Patents

Description

本発明は、一般に、キャピラリアレイスキャナに関する。特に、本発明は、平面キャピラリアレイ上で行われる電気泳動分離を円形に走査し、検出する、キャピラリアレイ共焦スキャナに関する。

ヒトゲノムプロジェクトのゴールは、３×１０９個の塩基対からなるヒトゲノムの配列を決定することにある。最も自動化されたＤＮＡシーケンサは、多色蛍光検出を備えた大型のスラブゲルの構成を採用している。スラブゲルの検出との関連で使用される走査型共焦システムも、キャピラリアレイにおいて行われる電気泳動分離の検出に有用となっている。当業界の現状では、キャピラリアレイ電気泳動用の共焦検出システムにより、毎時２５，０００塩基（９６サンプル、サンプルあたり５００塩基、１回の運転は２時間）の配列決定速度が達成されている。しかしながら、最適化された電気泳動装置を使用して、この分離をさらに迅速に行うのが望ましく、この点で、この分離の検出はさらに困難なものとなっている。

写真平版的に製造されたチップ上でＤＮＡフラグメントの寸法及び配列を決定する方法は、様々な文献、例えば、非特許文献１、及び非特許文献２に記載されている。

これらの刊行物に記載されている装置では、ガラス基板またはチップを写真平版的にエッチングして、基板の表面にチャネルが形成されている。このチャネルは通常１０〜５０ミクロンの深さ、５０〜２００ミクロンの幅を有し、配置によってチップ上で５〜１０ｃｍ拡張することが可能である。次いで、第２の基板をエッチングした表面の上に接合して、キャピラリ電気泳動分離に好適な閉じたチャネルないしキャピラリを形成する。この微細加工したゲルが充填されたチャネルを使用して、スラブゲルよりも１００倍速く、かつ従来のキャピラリ分離よりも１０倍速く、高品質のＤＮＡ分離を行うことができることが、明らかにされている。また、ｄｓ−ＤＮＡフラグメント、短いタンデム繰返し体、ＤＮＡ配列フラグメント、タンパク質、アミノ酸及びその他の化学分析物の分離をこのチップ上で行うことができることも、明らかにされている。これらの研究では、単チャネルが使用され、検出には、従来の共焦または非共焦の顕微鏡構成を使用する単チャネル内のフラグメントのレーザ励起蛍光検出が採用されていた。

非特許文献３では、チップ上に多チャネルを形成し、ＣＣＤ検出器でチップ全体を照射しイメージングして、検出を行っている。

しかしながら、後者の研究における感度は低い。この設計をどのように利用すれば多数の多チャネルを高速で検出できるのかを理解するのは、困難である。

最近、チップには１２個までのチャネルが形成されるようになった（ウーリーら（１９９７年））。チャネルのアノード末端は、検出のために互いに束ねられ、次いで束ねられたチャネルは、共焦検出器を通過させてチップを動かす機械的走査ステージを用いて検出される。リニア走査共焦検出システムでは、２Ｈｚの速度の蛍光データが得られている。この方法は、多チャネルの高感度検出を行うのに良好に機能するが、検出器を通過させるチップの機械的走査が扱いにくいものであり、かつ走査速度（２Ｈｚに制限されている）が大部分のフラグメントの寸法及び配列決定の用途に十分な速さではないにもかかわらず、このアプローチをどのように１２チャネルよりも多くまで拡張できるのかを理解するのは、困難である。

チップ上でのＤＮＡ配列決定についての電気泳動時間は、極めて短く（＜１０分）、したがって、妥当なバンドの解像度を提供するには、１０Ｈｚ以上の速度でチップを走査する必要がある。走査工程の停止段階及び反転段階の間にモータシステム負荷がかかること、及び反転のための時間が必要であることから、リニアスキャナは高走査速度での使用には好適でない。

共焦走査システムの利点は、高い光収集効率に結びつく高い開口数、及び、光検出を蛍光共焦体積の範囲に制限する能力にある。これにより、迷走光に対するシステムの感受性が劇的に低減され、また、ガラスまたはプラスチックの基板からの迷走光、蛍光及び散乱光が遮断され、キャピラリチップが光学的に切断される。

共に係属している出願（該出願の明細書の記載内容は、本願明細書に含まれるものとする。）には、微細加工されたキャピラリアレイ電気泳動装置ないしチップが記載されている。この装置は、サンプルをチャネルに導入するために分離チャネルに結合されたサンプルリザーバのアレイを有するプレート上に形成された、分離チャネルのアレイを有している。この微細加工されたキャピラリアレイ電気泳動装置の一形態においては、チャネルが外向きに放射状あるいはらせん状に、プレートの中心からサンプルリザーバへ延び、平面アレイを形成している。他の形態においては、該平面アレイは、複数の平行な微細加工されたキャピラリないしチャネルを有している。キャピラリ分離チャネルの放射状アレイ、あるいは、線形に平行なチャネルの大型のアレイにおいて、高いサンプリング速度で、分離の高感度検出を行うことのできるスキャナを提供することに対する要求が存在する。

A.T.ウーリー及びR.A.マチスの『キャピラリ電気泳動チップを使用した超高速ＤＮＡ配列決定』、Anal.Chem.誌、第６７巻、第３６７６〜３６８０頁（１９９５年） A.T.ウーリー、G.F.センサボー及びR.A.マチスの『微細加工したキャピラリアレー電気泳動チップを使用した高速ＤＮＡゲノタイピング』、Anal.Chem.誌、第６９巻、第２１８１〜２１８６頁（１９９７年） L.B.コートニー、D.シュマルツィング、T.A.テイラー及びM.フクスの『血清コルチゾールのためのマイクロチップ電気泳動イミュノアッセイ』、Anal.Chem.誌、第６８巻、第１８〜２２頁（１９９６年）

本発明の目的は、一般に、キャピラリの平面アレイを高速でサンプリングする共焦走査システムを提供することにある。

本発明の他の目的は、電気泳動のレーン（キャピラリ）が中心アノードで中心放射状に配列されているチップのデザイン、及び、該レーンを円形運動により走査する回転共焦スキャナを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、キャピラリの放射状アレイを走査して、該キャピラリ内にある物質の分離を検出する装置を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、キャピラリ分離の平面アレイを、高サンプリング速度で、高感度で共焦検出する装置を提供することにある。

本発明のこれらの目的及びその他の目的は、電気泳動分離の間に連続的かつ反復してキャピラリの平面アレイにおける分離を検出する、回転共焦スキャナによって達成される。

本発明の上記の目的及びその他の目的は、添付図面との関係で以下の記載を参照することにより、さらに容易に理解することができるであろう。

図１及び２は、２個の多チャネルキャピラリアレイ電気泳動チップであって、キャピラリチャネル１１が、円形のガラスサンドイッチ構造体１２の上に、放射状及びらせん状に配列されているものを示す。この装置において、分析物は、マイクロプレートの周縁上に配列されたリザーバ１３から、チャネル１１に注入され、チャネル１１中に設置された分離媒体を通して中心リザーバに向かって分析物を移動させることにより、電気泳動または他の分離方法を介して分析される。

カソード１４と中心アノード１６との間に電圧を印加することにより、分析物を移動させる。中央アノード１６の入口の直前で、レーンを検出する。線状及び平行並びに放射状及びらせん状のキャピラリアレイチップは、共に係属している出願に詳細に記載されており、該出願の明細書の記載内容は、全て本願明細書に含まれるものとする。

本発明によれば、円運動によりレーンを走査する新規な共焦スキャナを使用して、キャピラリ中の分離の検出を行う。以下に詳細に記載する好ましい形態において、チップの上部を、溶液リザーバ１３、電極接点などへのアクセスが可能な状態にしたまま、回転しているスキャナにより、下からチップを走査するのが最も容易である。ただし、この方法が便利であるものの、同様のデザイン原理を利用した機械的または電流的スキャナを使用して、チップを上から走査することもできる。

図３〜６は、本発明による回転スキャナの機械的及び光学的部分の概略を示している。図３を参照して、未偏光または円偏光のレーザビーム１７は、レーザ１８から制限開口ａ₁を通過し、並進ステージｔ_1y上の二色性ビームスプリッタｄ₁によって進路を変更され、直交調節器により並進ステージｔ_2x上に取りつけられたミラーｍ₁に向かう。ミラーｍ₁は、２個の高精度のベアリングｂ₁及びｂ₂によって支持された中空のシャフト１９を通して、ビームを上方に送る。シャフトの頂部にあるハウジング２０（詳細には示していない）は、ビームを所定の量だけ排除する偏菱形のプリズムを有し、これを、顕微鏡対物レンズ２１（ＮＡ０．５、作業距離１．７ｍｍ、無限結合モードで使用）を通して上方に、チップ中のチャネル１１の平面に送る。示していない手段により、ｚ方向に沿って微小な増分で対物レンズを移動させて、レーザの焦点を全てのチャネルの中心に合わせることができる。図４は、対物レンズ２１によりチャネル１１上に焦点を合わせたレーザビームを示す。点線で描いた円２２は、円形の操作経路を示す。図５の拡大図は、プレート２４とプレート２５との間に設置されたキャピラリないしチャネル１１の体積２３中に合焦されたレーザビーム１７を示す。

精密ベルトＢは、高精度ベアリングｂ₁とｂ₂、及びベアリングｂ₃とｂ₄の間に固定されたベルトプーリーを介して、対物レンズ２１を駆動する。ベアリングｂ₃及びｂ₄を通るソリッドシャフトは、可撓性継手２７を介してマイクロステッピングモータ２６に接続されている。光ファイバ２８は、チップの上の移動するレーザビームの経路上に配置されている。回転している対物レンズからの光は、光ファイバに入り、データ獲得の開始をトリガするフォトダイオードに導かれる。

蛍光ＤＮＡフラグメントなどのサンプル体積からの光は、対物レンズ２１により収集され、逆経路で二色性ビームスプリッタｄ₁を通して送られる。次いで、４色検出器アッセンブリへと導く開口ａ₂の中心にビームを並進させるためにジンバルマウントされた平面平行の厚いガラス片ｇ₁を通過する（図６）。二色性ビームスプリッタＤ₂（図６）は、光を波長４９７〜５４８ｎｍで反射し、バンドパスフィルタＢ₁が、波長領域を５１０〜５４０ｎｍに制限する。アイリスＡ₃及びピンホールＰ₁の位置は、未合焦ビーム経路及び適切な二色性位置を規定するのに使用される。ｘｙｚ調節器を備えた色消しレンズＬ₁は、カラーフィルタをかけたビームの焦点を、２００μｍの共焦ピンホールＰ₁に合わせる。直交ミラーＭ₃は、Ｌ₁とＰ₁との間のビーム経路中に移動させることができ、コンパートメントの頂部カバーに画像平面を形成し、画像平面を観るために、２０倍のラムズデン接眼レンズＥ（ロリン光学）を使用する。ピンホールＰ₁を通過する光は、光電子倍増管によって検出される。

Ｄ₂を通過したビームは第２のコンパートメントに入るが、これは第１のコンパートメントの鏡像になっている。レーザ波長の追加のブロッキングのため、取り外し可能なロングパスガラスフィルタを使用する。各々の連続するコンパートメントは、各バンドパスフィルタによって規定される、より長い波長領域を測定する。コンパートメント２、３及び４は、光が光電子倍増管に入るのをブロックするため、直交ミラーの代りに、それぞれスライディングシャッタＳを有する。

コンパートメント４は、二色性ビームスプリッタの代りにミラーを有しており、長波長検出範囲を制限するため、バンドパスフィルタを使用していない。主レーザビーム中のプラズマラインは５９０ｎｍを超えると著しいため、ラインフィルタにより除去する。光電子倍増管（ＰＭＴｓ）の出力を増幅し、５００Ｈｚのローパスフィルタを使用してフィルタをかける。１ｋＨｚで動作する１６ｂｉｔのＡＤＣを使用して、信号をデジタル化する。強度データを双方向で収集し、ＰＣに保存する。検出された蛍光の焦点をピンホール上に合わせる操作は、共焦検出に影響を及ぼす。このことは、レーザにより照射されたチップ中のチャネルないしキャピラリ内の共焦体積のみから、放射が収集されることを意味する。

一形態として、半径が＜１ｃｍの中心アノードウェル１６に９６本の電気泳動レーンを集めた。回転スキャナにより生成されるビーム経路の半径はｒ_a（≒１ｃｍ）であり、ｒ＝１ｃｍの場合その経路長は６２．８３２ｃｍであった。データ獲得を開始する光ファイバのための空間を残すと、レーン中心の間は約６４０μｍであった。これを、電気泳動レーン及びレーンの間の空間に分割した。２０μｍ毎にデータを取り、１回転あたり３０７２個のデータ点をとった。６４０μｍのデータ空間をなす３２個のデータ間隔を、チャネルからのデータ及びチャネル間の空間からのデータに分割した。１０回転（ＲＰＳ）で、データ速度は３０．７２ｋＨｚないし３２．５５μｓ／データ点であった。増幅器／ローパスフィルタの出力を、４個の独立したアナログからデジタルへの変換器（ＡＤＣｓ）によってサンプリングした。全ての位置でサンプリングを行うマルチタスクプログラムによってＡＤＣｓを制御し、非チャネルデータを除去し、データの平均をとってコンピュータに記録した。チャネル空間及びデータ速度は可変であり、マルチタスクプログラム中で容易に変えることができる。

任意のキャピラリの平面アレイを走査するのに、この回転スキャナを使用することが可能であることは、明らかである。図７は、ガラス基板３２の上に線３３に沿って微細加工されたキャピラリ３１の平面平行アレイを走査するための、回転スキャナの使用の概略を示す。図８は、平面平行の関係に配列された、米国特許第５，２７４，２４０号明細書に記載されているような複数のキャピラリ３４を走査するための、回転スキャナの使用の概略を示す。

本発明は、マイクロチップ中のレーンの構成に依存するものではなく、円形の検出経路を使用する任意の構成との関係で、容易に使用することが可能である。共焦蛍光電流スキャナは、これらのチップの円形走査または楕円形走査を行うのに同等に使用し得る。本発明の回転共焦スキャナの利点は、極めて速いサンプリング速度（１０Ｈｚあるいはそれ以上）の、共焦検出及び同時に４色またはそれ以上の蛍光信号の検出を可能にすることにある。

多チャネル電気泳動解析を行うための、放射状のキャピラリアレイ電気泳動チップを示す図である。 多チャネル電気泳動解析を行うための、らせん状のキャピラリアレイ電気泳動チップを示す図である。 本発明による回転共焦スキャナの機械的部分及び光学的部分の概略図である。 電気泳動チップ、合焦したレーザビーム、及びスキャナによって調べられる円形の経路の概略図である。 照射され、検出される共焦体積を示す、図４の線５−５に沿って見た拡大図である。 回転スキャナ検出システムの、４色の検出器部分の概略図である。 回転スキャナにより走査される、微細加工されたキャピラリの平面平行アレイを示す図である。 回転スキャナにより走査される、従来のキャピラリの平面アレイを示す図である。

符号の説明

１１ キャピラリ
１８ レーザ
２１ 対物レンズ

Claims (10)

1. 電気泳動分離の間に、エネルギーを励起して検出し、近接するキャピラリ管の各平面アレイ内の励起体積を通過する材料を表す出力を発生するための共焦点スキャナであって、前記キャピラリ管は、中心リザーバ、周縁上に配列されたリザーバ、カソード及びアノードを有する円形のガラスサンドイッチ構造体の上に、放射状またはらせん状に配列されており、前記共焦点スキャナは、
   放射エネルギー源、
   前記放射エネルギーを、前記近接するキャピラリ管の各々において、前記電気泳動分離の間、励起体積に焦点を合わせるのに好適となるように、前記放射エネルギーを受け、当該放射エネルギーの焦点を合わせるように配列され、対物レンズを有する、光学的手段、
   合焦された放射エネルギーを、前記キャピラリ管の平面アレイにおいて円形に走査するのに好適となるようにし、もって前記電気泳動分離の間に一連のキャピラリ管内の前記励起体積を連続的に走査するように、連続的に、また反復して合焦された放射エネルギーを平面内で円形に走査するための手段であって、前記カソードと前記アノードとの間に分離電圧を連続的に印加して、分析物の電気泳動分離をもたらす手段と、前記一連のキャピラリ管内の前記励起体積を連続的に走査するのに好適となるようにし、各励起体積を通過する際に分離された分析物を検出できるように、前記対物レンズを前記平面内で円形に動かすための手段とを含む、前記連続的に、また反復して走査するための手段、及び、
   前記キャピラリ管内の励起体積からエネルギーを受け、前記電気泳動分離の間に、励起体積を通過する材料を表す、受けたエネルギーを示す出力信号を提供するための検出システム、
   を有する、前記共焦点スキャナ。
2. 前記受けたエネルギーを示す出力信号を受け、前記励起体積からの蛍光エネルギーを表す出力を提供するコンピュータ手段、及び、
   走査された体積の位置を検知して、これをコンピュータに提供して、出力と走査されるキャピラリの励起体積とを相関させる手段、
   をさらに有する請求項１に記載の共焦点スキャナ。
3. 前記励起体積から受けたエネルギーが、複数の異なった波長を持つ蛍光エネルギーを含み、
   前記システムが、
   前記複数の異なった波長の各々の前記蛍光エネルギーを選択的に、異なる位置に向ける複数の二色性のビームスプリッタ、
   前記異なる波長の各々に対して一組ずつの、複数の空間及びスペクトラルフィルタ手段の組、及び、
   各異なる波長の前記蛍光エネルギーを受け取り、対応する出力信号を提供する、空間及びスペクトラルフィルタ手段の各々の組に対して一つずつの複数の検出手段、及び、
   前記信号を受け取って処理し、前記複数の並んでいるキャピラリ管の各々の中の前記蛍光エネルギーを表す出力を提供するコンピュータ手段、
   を含む、請求項１に記載の共焦点スキャナ。
4. 各一連のキャピラリ管中の前記励起体積から蛍光エネルギーを収集して、当該蛍光エネルギーを向けるための前記対物レンズと空間フィルタ及びニュートラル・フィルタを含む光学的システムをさらに有する、請求項１に記載の共焦点スキャナ。
5. コンピュータが前記検出システムからの出力を受け、前記励起体積内の材料を表す出力を提供する、請求項１に記載の共焦点スキャナ。
6. 走査されたビームの位置を検出し、これをコンピュータに提供して、出力と走査されるキャピラリの励起体積とを相関させるための手段を含む、請求項５に記載の共焦点スキャナ。
7. 前記検出システムは、空間フィルタを含む共焦点システムである、請求項１、５または６に記載の共焦点スキャナ。
8. １０Ｈｚあるいはそれ以上の走査速度で動作するようになった、請求項１に記載の共焦点スキャナ。
9. 電気泳動分離の間に、共焦点スキャナを操作して、エネルギーを励起して検出し、近接するキャピラリ管の各平面アレイ内の励起体積を通過する材料を表す出力を発生する方法であって、前記キャピラリ管は、中心リザーバ、周縁上に配列されたリザーバ、カソード及びアノードを有する円形のガラスサンドイッチ構造体の上に、放射状またはらせん状に配列されており、前記方法は、
   中心リザーバ、周縁上に配列されたリザーバ、カソード及びアノードを有する円形のガラスサンドイッチ構造体の上に、放射状またはらせん状に配列されている、近接するキャピラリ管の平面アレイを提供する工程、
   放射エネルギー源を操作して、放射エネルギーを提供する工程、
   対物レンズを使用して、前記放射エネルギーを受け、前記放射エネルギーを、前記キャピラリ管の各々において、前記電気泳動分離の間、励起体積に焦点を合わせ、前記励起体積内の材料を励起し、前記材料がエネルギーを放射するようにする工程、
   検出システムを使用して、前記電気泳動分離の間に、励起体積を通過する材料を表す、前記キャピラリ管内の励起された励起体積からのエネルギーを受ける工程、
   コンピュータを使用して、前記検出システムからの出力を受け、前記励起体積内の材料を表す出力を提供する工程、及び、
   連続的に、また反復して合焦された放射エネルギーを前記キャピラリ管の平面アレイの平面内で円形に走査するための手段を使用して、もって前記電気泳動分離の間に一連のキャピラリ管内の前記励起体積を連続的に走査し、前記カソードと前記アノードとの間に分離電圧を連続的に印加して、分析物の電気泳動分離をもたらし、前記一連のキャピラリ管内の前記励起体積を連続的に走査するのに好適となるようにし、各励起体積を通過する際に分離された分析物を検出できるように、前記対物レンズを前記平面内で円形に動かす工程、
   を有する、前記方法。
10. 前記励起体積から受けたエネルギーが、複数の異なった波長を持つ蛍光エネルギーを含み、
    前記方法が、
    前記複数の異なった波長の各々の前記蛍光エネルギーを選択的に、異なる位置に向ける複数の二色性のビームスプリッタを使用する工程、
    前記異なる波長の各々に対して一組ずつの、複数の空間及びスペクトラルフィルタ手段の組を使用する工程、及び、
    各異なる波長の前記蛍光エネルギーを受け取り、対応する出力信号を提供する、空間及びスペクトラルフィルタ手段の各々の組に対して一つずつの複数の検出手段を使用する工程、及び、
    前記信号を受け取って処理し、前記複数の並んでいるキャピラリ管の各々の中の前記蛍光エネルギーを表す出力を提供するコンピュータ手段を使用する工程、
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。

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