JPH09243597A - マルチキャピラリーdnaシーケンサ - Google Patents
マルチキャピラリーdnaシーケンサInfo
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- JPH09243597A JPH09243597A JP8080750A JP8075096A JPH09243597A JP H09243597 A JPH09243597 A JP H09243597A JP 8080750 A JP8080750 A JP 8080750A JP 8075096 A JP8075096 A JP 8075096A JP H09243597 A JPH09243597 A JP H09243597A
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- capillary
- optical system
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Abstract
て、さらに処理能力を高める。 【解決手段】 レーザ3aと3bから出た励起光ビーム
Eは走査方向Sと平行に検出部2に入射し、対物レンズ
12によりキャピラリー1a中を泳動しているDNAフ
ラグメントに照射されて、その蛍光標識を励起する。励
起されたDNAフラグメントからの蛍光は対物レンズ1
1で集光され、集光レンズ13で絞られ、ピンホール1
5を通って凹面ミラー14により凹面グレーティング1
6上に結像される。凹面グレーティング16で分光され
て得られたスペクトルは検出器17で検出され、そのD
NAフラグメントの末端塩基の種類が判定される。CP
U5は検出部2の走査と同期して検出器17からの信号
を取り込むことによって、検出された信号がどのキャピ
ラリーのものであるかも認識する。
Description
識として蛍光物質を化学結合させたプライマー)を用い
サンガーの方法で前処理されたDNAフラグメント(断
片)試料を電気泳動させ、泳動途中でDNAフラグメン
ト試料からの蛍光を検出して塩基配列を決定するオンラ
イン式のDNAシーケンサに関するものである。特に、
本発明は泳動ゲルを充填した複数のキャピラリーを用い
て複数の試料を同時に電気泳動させるマルチキャピラリ
ーDNAシーケンサに関するものである。
DNAの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大
処理能力をもったDNAシーケンサが必要となる。その
1つの方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに
代わってゲルを充填したキャピラリーを複数本配列した
マルチキャピラリーDNAシーケンサが提案されてい
る。キャピラリーは、スラブゲルに比べて、試料の取扱
いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高
感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加
すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、
温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリー
ではそのような問題は少なく、高電圧を印加して高速泳
動をさせても、バンドが広がりが少なく高感度検出がで
きるのである。
がA(アデニン)、G(グアニン)、T(チミン)、C
(シトシン)からなる4種類のDNAフラグメント試料
が生成される。処理能力を上げるためには複数のキャピ
ラリーで同時に電気泳動させる必要があるが、その場
合、末端塩基別の試料を異なるキャピラリーで泳動させ
ると、キャピラリー間の泳動速度の差が塩基配列決定の
誤差となる。そのため、各キャピラリーには4種類の末
端塩基のDNAフラグメントを含んだ試料を注入し、複
数のキャピラリーで同時に泳動させなければならない。
その際、末端塩基の異なる4種類のDNAフラグメント
を識別するために、2種類以上の蛍光物質で標識するこ
とが行なわれている。
別するための標識物質としては、FAM、JOE、TA
MRA及びROXの4種類の発蛍光団を標識として用い
る方法(Anal. Chem. 1994, 66, 1021-1026(以下、引
用例1という)参照)や、FAMとJOEの2種類を比
率を異ならせ結合させることによりコード化して4種類
のDNAフラグメントを識別する方法(Anal. Chem. 19
92, 64, 2149-2154(以下、引用例2という)参照)が
提案されている。いずれにしても、マルチキャピラリー
DNAシーケンサの処理能力を上げるためには、多色蛍
光標識によって識別できるようにした末端塩基の異なる
4種類のDNAフラグメントを含む試料を各キャピラリ
ーに注入し、複数のキャピラリーで複数の試料を同時に
泳動させることが背景となっている。
料から発生する蛍光を検出する光学系の一例は、キャピ
ラリーの配列の側面側から励起光ビームを入射し、キャ
ピラリー配列の垂直方向から蛍光を検出するものである
(引用例1参照)。そこでは、キャピラリー表面での散
乱に基づくバックグラウンド信号を除去するために、励
起光を入射する位置では泳動されてきた試料はキャピラ
リーを出てシースフローとなるようにしているが、いず
れにしてもキャピラリー配列の側面側から複数のシース
フローに対し同時に励起光を入射している。
を照射するように励起光学系で集光し、キャピラリー中
の試料からの蛍光を受光光学系で検出する。励起光学系
と受光光学系はともに固定しておいて、キャピラリーが
励起光を横切るようにキャピラリーの配列を走査するこ
とによって、複数のキャピラリー中の試料からの蛍光を
順次検出する(引用例2参照)。
シースフローを形成しているので、ビーム強度の減衰は
少ないが、シースフロー状態にするためのキャピラリー
のセッティングが難しく、マルチ化しにくい問題があ
る。引用例2の方法では、キャピラリーアレイを機械的
に動かせて走査するため、キャピラリーがよじれ、マル
チ化の本数に制約を受けやすい。
同時に泳動を行なうキャピラリーの本数に限界があり、
1度に分析できる試料の数に制約を受け、処理能力の点
でなお改良の余地がある。本発明は高感度で、高速処理
に適したマルチキャピラリーDNAシーケンサにおい
て、さらに処理能力を高めることを目的とするものであ
る。
リーDNAシーケンサは、ゲルが充填された複数のキャ
ピラリーが配列され、2種類以上の蛍光物質により識別
可能に標識された4種類の末端塩基の異なるDNAフラ
グメントを含む複数の試料が1つずつ前記キャピラリー
に注入されて、全てのキャピラリーで同時に電気泳動さ
れるマルチキャピラリーアレイ泳動部と、マルチキャピ
ラリーアレイ泳動部のキャピラリーアレイの面に対する
垂直方向からキャピラリーごとに励起光ビームを集光し
て照射し、かつ泳動方向と直交する1直線上を走査する
励起光学系と、励起光学系の励起光ビームにより励起さ
れた試料からの蛍光を受光し、その蛍光の波長特性を検
出する受光光学系と、励起光学系による励起光ビームの
走査と受光光学系による検出とを同期させ、キャピラリ
ーの位置と検出したDNAフラグメントの種類とを認識
することにより各キャピラリーにおける試料の塩基配列
を決定するデータ処理・制御部とを備えている。
ラリーアレイ泳動部1は紙面垂直方向に立てられた複数
のキャピラリー1aが1列に配列されたものであり、図
には示されていないがキャピラリー1aの配列位置によ
る温度差やキャピラリーの長さ方向における温度分布を
なくすために加温調節機構が備えられている。キャピラ
リー1aには泳動用のゲルが充填されており、各キャピ
ラリー1aには、例えば引用例1のように末端塩基別に
異なる蛍光物質FAM、JOE、TAMRA及びROX
により標識された4種類のDNAフラグメント、又は2
種類の蛍光物質を用いて4種類が識別できるようにコー
ドされた4種類のDNAフラグメントを含むDNA試料
がそれぞれ注入され、同時に電気泳動がなされる。キャ
ピラリー1aに充填されるゲルや泳動用の印加電圧は引
用例1,2にも記載されていて既知のものであるが、例
えば、ゲルとしてはポリアクリルアミドゲルを用い、印
加電圧は100〜300V/cmとすることができる。
ピラリー1aに照射する励起光学系と、キャピラリー中
のDNAフラグメントからの蛍光を受光し分光する受光
光学系とが搭載されている。検出部2は、泳動部1のキ
ャピラリーアレイの配列方向と平行な方向Sに往復移動
できるように、一対のリニアガイド21,21により案
内され、モータ4により駆動されるボールねじ22によ
り矢印S方向に往復方向に駆動される。
のうち、対物レンズ11は励起光Eをキャピラリー1a
に照射し、キャピラリー1a中を泳動してきたDNAフ
ラグメントからの蛍光を集光する。励起光Eを発生する
ために、光源としてアルゴンイオンレーザ3aとYAG
レーザ3bが設けられており、アルゴンイオンレーザ3
aからのレーザ光がダイクロイックミラー12aを透過
し、YAGレーザ3bからのレーザ光がダイクロイック
ミラー12aで反射して同じ光軸上の励起光Eとなるよ
うに、アルゴンイオンレーザ3a、YAGレーザ3b及
びダイクロイックミラー12aが配列されており、また
励起光Eのレーザビームが検出部2の走査方向Sと平行
に検出部2に入射するように、それらの光学系の方位が
定められている。
ンイオンレーザ3aからは488nmのレーザー光を発
振させ、YAGレーザ3bからは532nmのレーザー
光を発振させて2種類の波長を含むレーザ光を励起光E
とするものである。励起光Eを発生する他の方法は、ア
ルゴンイオンレーザ3aのみを用い、その488nmと
514.5nmの2種類の波長のレーザ光を同時に発振
させて励起光Eとするものである。
方向Sと平行に検出部2に入射し、ダイクロイックミラ
ー12bにより反射され、対物レンズ11を経て1つの
キャピラリー1aに照射される。キャピラリー1a中を
泳動するDNAフラグメントからの蛍光を検出するため
に、1つのキャピラリー1a中のDNAフラグメントか
らの蛍光が対物レンズ11で集光される。対物レンズ1
1は落射光学系を構成し、キャピラリー1aごとの蛍光
を集光していく。対物レンズ11で集光された蛍光がダ
イクロイックミラー12bを透過し、集光レンズ13で
集光され、ピンホール15を経て凹面ミラー14に入射
する。ダイクロイックミラー12bは励起光の波長域を
反射し、蛍光の波長域を透過する特性をもったものであ
る。集光レンズ13、ピンホール15及び凹面ミラー1
4により共焦点系の光学系を構成しており、キャピラリ
ー表面からの散乱によるバックグラウンド信号を除く。
ーティング16が配置されており、受光された蛍光は凹
面ミラー14により凹面グレーティング16上に結像さ
れる。検出器17としてCCD又はフォトダイオードア
レイ(PDA)が配置されており、凹面グレーティング
16により分光されたスペクトルは検出器17で同時に
検出される。
あり、I/Oポートを備えている。CPU5には検出器
17の検出信号が取り込まれてそのスペクトルから標識
の蛍光物質が識別され、DNAフラグメントの末端塩基
の種類が判定される。CPU5はまた検出部2の走査も
制御する。
aと3bから、又はレーザ3aのみから出た励起光ビー
ムEは走査方向Sと平行に検出部2に入射し、対物レン
ズ12によりキャピラリー1a中を泳動しているDNA
フラグメントに照射されて、その蛍光標識を励起する。
励起されたDNAフラグメントからの蛍光は対物レンズ
11で集光され、集光レンズ13で絞られ、ピンホール
15を通って凹面ミラー14により凹面グレーティング
16上に結像される。凹面グレーティング16で分光さ
れて得られたスペクトルは検出器17で検出され、その
DNAフラグメントの末端塩基の種類が判定される。C
PU5は検出部2の走査と同期して検出器17からの信
号を取り込むことによって、検出された信号がどのキャ
ピラリーのものであるかも認識する。
例と比較すると、走査される検出部2aのステージ上か
ら分光器部を除いている点で異なる。分光器部6は、固
定された別のステージに配置されている。具体的には、
励起光をキャピラリー1aに照射する機構は図1のもの
と同じであるが、キャピラリー1a中のDNAフラグメ
ントからの蛍光を受光する光学系では対物レンズ11、
ダイクロイックミラー12及び平面ミラー31のみを検
出部2aのステージ上に搭載し、機械的に走査するよう
にしている。平面ミラー31からの蛍光反射光を別ステ
ージの分光器部6上の集光レンズ13に導き、集光レン
ズ13で集光された蛍光はピンホール15及び凸レンズ
14aを経て凹面グレーティング16上に結像させ、凹
面グレーティング16で分光されたスペクトルを検出器
17で検出する。
が侵入するのを防ぐとともに、検出部2aが分光器部6
に対し自由に移動できるように、検出部2aと分光器部
6の間に蛇腹32が設けられている。図2の実施例で
は、走査される検出部2aのステージの慣性負荷が小さ
くなって高速走査が可能になる。また、検出部2aのス
テージから電気配線が出ない利点もある。
面図、(B)は斜視図である。ここでは、マルチキャピ
ラリーアレイ泳動部1はキャピラリー1aが円筒状に配
列されており、その中心軸線上から励起光ビームEが入
射するように励起光学系が配置されている。検出部2b
中のダイクロイックミラー12bの励起光ビームEが当
たる点Oが検出部2bのステージの回転中心となってい
る。図3の実施例は、図1の実施例と比べると、走査が
回転制御であるので、直線制御よりも制御性がよいとい
う利点を備えている。
面図、(B)はそのスプリット・フィルタを示す正面
図、(C)はそのレンズアレイを示す正面図、(D)は
そのピンホール・アレイを示す正面図である。励起光学
系及び受光光学系は図1と同様に検出部2のステージ上
に搭載されたものであるが、図4の実施例ではポリクロ
メータで分光検出するのではなく、対物レンズ11で集
光した蛍光を透過波長の異なる4つのバンドパスフィル
タに分割されたスプリット・フィルタ41を用いてA、
G、C、Tに対応する標識蛍光の波長域を選択してい
る。フィルタ41は、(B)に示されるように、それぞ
れの標識蛍光からの蛍光を透過させるバンドパスフィル
タに分割されている。バンドパスフィルタ41の後に
は、各バンドパスフィルタを透過した蛍光をそれぞれ集
光する凸レンズを備えたレンズアレイ42が配置されて
いる。レンズアレイ42の後には、レンズアレイ42の
各凸レンズで集光された光を検出する光電子増倍管43
が配置されている。レンズアレイ42と光電子増倍管4
3の間には、それぞれの光を絞るピンホールを備えたピ
ンホール・アレイ44が配置されている。
で、各々の波長域についての光量は1/4に減少する
が、他の実施例におけるグレーティングでの回折効率や
検出器のCCDやPDAの感度と、光電子増倍管43で
の高感度とを考慮すると、むしろ図4の実施例の方がS
/Nがよくなる。
動部のキャピラリーアレイの面に対する垂直方向からキ
ャピラリーごとに励起光ビームを集光して照射し、かつ
泳動方向と直交する1直線上を走査するようにしたの
で、キャピラリーアレイを機械的に移動させて走査する
のに比べると、キャピラリーがよじれたりする問題がな
く、またキャピラリーアレイの側面から複数のキャピラ
リーに同時に励起光ビームを入射するのに比べるとビー
ム強度の減衰を抑えることができ、キャピラリー間での
入射ビーム強度のばらつきを抑えることができる。
図、(B)は斜視図である。
図、(B)はそのスプリット・フィルタを示す正面図、
(C)はそのレンズアレイを示す正面図、(D)はその
ピンホール・アレイを示す正面図である。
Claims (1)
- 【請求項1】 ゲルが充填された複数のキャピラリーが
配列され、2種類以上の蛍光物質により識別可能に標識
された4種類の末端塩基の異なるDNAフラグメントを
含む複数の試料が1つずつ前記キャピラリーに注入され
て、全てのキャピラリーで同時に電気泳動されるマルチ
キャピラリーアレイ泳動部と、 前記マルチキャピラリーアレイ泳動部のキャピラリーア
レイの面に対する垂直方向からキャピラリーごとに励起
光ビームを集光して照射し、かつ泳動方向と直交する1
直線上を走査する励起光学系と、 前記励起光学系の励起光ビームにより励起された試料か
らの蛍光を受光し、その蛍光の波長特性を検出する受光
光学系と、 前記励起光学系による励起光ビームの走査と前記受光光
学系による検出とを同期させ、キャピラリーの位置と検
出したDNAフラグメントの種類とを認識することによ
り各キャピラリーにおける試料の塩基配列を決定するデ
ータ処理・制御部と、を備えたことを特徴とするマルチ
キャピラリーDNAシーケンサ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8080750A JPH09243597A (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | マルチキャピラリーdnaシーケンサ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8080750A JPH09243597A (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | マルチキャピラリーdnaシーケンサ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09243597A true JPH09243597A (ja) | 1997-09-19 |
Family
ID=13727090
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8080750A Pending JPH09243597A (ja) | 1996-03-08 | 1996-03-08 | マルチキャピラリーdnaシーケンサ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH09243597A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7029562B2 (en) | 1998-10-26 | 2006-04-18 | Hitachi, Ltd. | Capillary array electrophoresis apparatus |
US7090758B2 (en) * | 1999-01-27 | 2006-08-15 | Affymetrix, Inc. | Capillary array electrophoresis scanner |
WO2016125244A1 (ja) * | 2015-02-03 | 2016-08-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 多色検出装置 |
-
1996
- 1996-03-08 JP JP8080750A patent/JPH09243597A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7029562B2 (en) | 1998-10-26 | 2006-04-18 | Hitachi, Ltd. | Capillary array electrophoresis apparatus |
US7090758B2 (en) * | 1999-01-27 | 2006-08-15 | Affymetrix, Inc. | Capillary array electrophoresis scanner |
WO2016125244A1 (ja) * | 2015-02-03 | 2016-08-11 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 多色検出装置 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040210 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040412 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040518 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040720 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040831 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041027 |
|
A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20041221 |
|
A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20050304 |