JPH02218941A

JPH02218941A - 蛍光検出型ゲル電気泳動パターン解析装置

Info

Publication number: JPH02218941A
Application number: JP1038729A
Authority: JP
Inventors: Hidehiko Fujii; 藤井　英彦
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1989-02-18
Filing date: 1989-02-18
Publication date: 1990-08-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はアガロースやポリアクリルアミドを用いて電気
泳動させたパターンを解析する装置に関するものである
。

電気泳動パターン解析装置は、例えば電気泳動による展
開後に臭化エチジウムなどで螢光染色を行なって検出す
るＤＮＡ解析装置や、サンガーの方法によって核酸の塩
基配列を決定する過程で、予めプライマーを螢光物質で
ラベルしておき、最終段階のゲル電気泳動からの配列の
読取りをその螢光物質からの螢光を利用して分光学的方
法により行なう塩基配列決定装置として利用される。

（従来の技術）ゲル電気泳動によって展開した核酸断片のバンドの螢光
式読取り方式としては、オンライン方式とオフライン方
式の２通りが考えられる。

オンライン方式では核酸断片を泳動ゲル中に電気泳動さ
せながら、泳動レーンのある一点の螢光の時間変化を読
み取り、オフライン方式では別途泳動させた泳動ゲルを
泳動終了後に読取り専用装置に装着して泳動パターンを
読み取る。

サンガー法による塩基配列決定法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４．５４６３（１９７
７）参照）では、試料は末端塩基がそれぞれＡ（アデニ
ン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）又はＣ（シトシン
）のいずれかである４種類の核酸断片試料で１組の試料
となし、同様のゲル電気泳動のパターン解析を行なう。

スラブ状泳動ゲルの螢光測定装置の第１の形式は、ゲル
の面に対向する方向から励起光を照射して電気原動力向
と直交する方向に走査させ、ゲルの面に対向する方向で
螢光を受光するものである（例えば、Ｌａ５ａｒ　Ｆｏ
ｃｕｓ／Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ。

Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ、５５−１０（１９８８）参照）。

スラブ状泳動ゲルの螢光測定装置の第２の形式は、励起
光を集光レンズによって泳動ゲルの端面から泳動ゲルに
平行な方向に入射させ、泳動ゲルの面の法線方向に螢光
受光レンズを設けて螢光を一次元的又は二次元的に一度
に受光するものである（例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３４，３１３−３１９
（１９８３）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６．
８１６−８２１（１９８ｇ）などを参照）。

（発明が解決しようとする課題）今までの何れの装置も、泳動ゲルを１枚だけしか処理で
きず、高価なレーザその他の光学機器の利用率が低い問
題がある。

（課題を解決するための手段）本発明では、泳動ゲルを平行又はほぼ平行に複数枚重ね
ておき、その法線方向から励起光ビームをあて、各泳動
ゲルの螢光は各泳動ゲルの端面で受光する。

（作用）泳動ゲルが透明なために、励起光は１つの泳動ゲル中の
螢光物質を励起しても、その泳動ゲルを通過して次の泳
動ゲルに到達し、その泳動ゲル中の螢光物質を励起し、
さらに次の泳動ゲルに到達してその泳動ゲル中の螢光物
質も励起する。このようにして多数の泳動ゲルを同時に
照明する。励起された螢光物質から放射された螢光光は
、各々泳動ゲルの中を反射し、端面に達し、そこで受光
される。

（実施例）第１図は本発明をオフライン方式のパターン解析装置に
適用した実施例を表わす。

２−１〜２−３はポリアクリルアミド泳動ゲルであり、
サンガー法によって予めＦＩＴＣ（４８８ｎｍで励起す
ると５２０ｎｍ付近の螢光を出す物質）でラベルしたＤ
ＮＡ断片のプライマーを各電気泳動ゲル２−１〜２−３
の一端に末端塩基Ａ。

Ｇ、Ｔ、Ｃ別に注入し、別の電気泳動装置で電気泳動さ
せたものである。４はこのように電気泳動により展開さ
れたバンドである。各泳動ゲル２−１〜２−３はそれぞ
れのガラス板の間に挾まれている。泳動ゲル２−１〜２
−３はまた。ＤＮＡ断片の電気泳動後に螢光物質で染色
したものであってもよい。図の状態はＤＮＡ断片の泳動
後で、かつ、ＤＮＡ断片が螢光物質でラベルされた状態
の泳動ゲルを螢光パターン解析専用装置（クロマトスキ
ャナを含む）に装着した状態である。

励起光を発生する励起光源としてのアルゴンレーザ６か
らのレーザ光である励起光８を集光レンズ１０で集光す
る。アルゴンレーザは４８８ｎｍの光を発振する。１２
は励起光を泳動ゲル２−１の表面上で泳動方向（Ｘ方向
）へ走査するためのガルバノミラ−であり、１４はガル
バノミラ−１２で反射された励起光８を泳動ゲル２−１
の表面上で泳動方向と直交する方向のゾーン方向（Ｙ方
向）に高速走査させるためのガルバノミラ−である。ガ
ルバノミラ−１２，１４の回転角は泳動ゲル２−１〜２
−３上の励起光照射位置を示す情報として信号処理装置
１６に取り込まれ、ガルバノミラー１２．１４は信号処
理装置１６からの信号により即動機構（図示路）を経て
駆動される。

各泳動ゲル２−１〜２−３の側方にはそれぞれシリンド
リカルレンズ１８−１〜１８−３を介して光ファイバ束
２０−１〜２０−３　（２０−３は図示路）が設けられ
ている。光ファイバ束２０−１〜２０−３の一端はその
端面の配列が泳動ゲル２−１〜２−３の一端面に対応し
た形状であり。

薄い長方形の面を形成するように配列されており、この
端面ばそれぞれのシリンドリカルレンズ１８−１〜１８
−３を介して泳動ゲル２−１〜２−３の一端面と対応し
て配置されている。光ファイバ束２０−１〜２０−３の
他の端面ば小さい束に束ねられ、それぞれの端面から出
た光がそれぞれのレンズ２２−１〜２２−３　（２２−
３は図示路）。

螢光測定用干渉フィルタ２４−１〜２４−３　（２４−
３は図示路）、レンズ２６−１〜２６−３（２６−３は
図示路）を経て光電子増倍管２８−１〜２Ｂ−３（２８
−３は図示路）に導かれるようになっている。光電子増
倍管２８−１〜２８−３の検出信号は信号処理装置１６
に取り込まれ、デジタル信号に変換された後に処理され
る。

光ファイバ束２０−１〜２０−３の例としては、例えば
ＥＳＫＡ（三菱レーヨン株式会社の商品）を用いること
ができる。

次に１本実施例の動作について説明する。

レーザ６から出た励起光８は２個のガルバノミラ−１２
，１４でＸ、Ｙ方向に走査され、３枚の泳動ゲル２−１
〜２−３を上から順に照明する。

一般に、泳動ゲルは透明性が高く、また測定しようとし
ている螢光サンプルは大変微量のため、１枚の泳動ゲル
を通過してもレーザ励起光８の減衰は極めて少なく、無
視できる。また、受光部が各泳動ゲル２−１〜２−３の
端にあるので、泳動ゲル同士を極度に近づけることがで
き、そのため励起光ビーム８のスポットサイズの変化は
極小に抑えられる。また、励起光ビーム８の照明位置は
泳動ゲル２−１〜２−３間隔に応じて僅かに変わるが、
信号処理の過程でその補正をするのも簡単である。

もし、励起光８が照明された位置にＤＮＡ断片サンプル
のバンド４があれば、そこから螢光を発し、その螢光は
ガラスと泳動ゲルの間で反射を繰り返し、結局泳動ゲル
端面に達する。ガラスの方が泳動ゲルより屈折率が大き
いので、この反射は全反射ではないが、界面への入射角
が大きいので大部分の光が界面で反射する。この反射光
はそれぞれのシリンドリカルレンズ１８−１〜１８−３
で光ファイバ束２０−１〜２０−３に集光され。

螢光波長を通す干渉フィルタ２４−１〜２４−３を通っ
て光電子増倍管２８−１〜２８−３に達し信号となる。

このとき、励起光の位置はガルバノミラ−１２，１４の
回転角によってわかっているから、ガルバノミラ−１２
，１４を次々と動かして行けば、結局各泳動ゲルのバン
ドパターンが全てわかる。

この場合、ＤＮＡ断片はすでに電気泳動によって長さの
短かい順に展開されているから、よく知られているよう
に、その泳動パターンを各ゾーンごと（末端塩基別）に
読み取れば、シーケンス決定を行なうことができる。

第２図は本発明をオンライン式の電気泳動パターン解析
装置に適用した一実施例を表ねすものである。

泳動ゲル２−１〜２−３の両端が電極槽３２゜３４に浸
され、泳動用電源３６から泳動電圧が印加されている。

泳動ゲル２−１〜２−３の一端の試料注入用スロット３
８にすでに説明したサンガーの方法によって準備され、
さらにプライマーをＦＩＴＣでラベルしたＤＮＡ断片が
末端塩基Ａ。

Ｇ、Ｔ、Ｃ別に注入され、泳動電圧によってバンド４に
なって泳動する。励起光８はアルゴンレーザ６から発振
された４８８ｎｍのレーザ光である。

４０は励起光８を一直線上で走査するポリゴンミラーで
ある。ポリゴンミラー４０によって励起光８のスポット
は泳動ゲル２−１〜２−３の泳動方向Ｘと直交するＹ方
向の一直線４２上を高速に走査する。

各泳動ゲル２−１〜２−３の一端面には第１図で用いら
れているのと同じ光ファイバ束２０−１〜２０−３の長
方形の端面が各シリンドリカルレンズ１８−１〜１８−
３を介して対向して設けられており、光ファイバ束２０
−１〜２０−３の他端には第１図と同じく、レンズ２２
−１〜２２−３、干渉フィルタ２４−１〜２４−３及び
レンズ２６−１〜２６−３を介して光電子増倍管２８−
１〜２８−３が設けられている。光電子増倍管２８−１
〜２８−３の検出信号は信号処理装置１６に取り込まれ
る。

次に、第２図の実施例の動作について説明する。

レーザ励起８光はポリゴンミラー４０により直線４２上
を高速に走査する。第１図と同様に、−番手前の泳動ゲ
ル２−１を透過した励起光８は殆ど減衰することなく、
またスポットサイズも殆ど変らずに２番目の泳動ゲル２
−２．３番目の泳動ゲル２−３を次々に照明する。各々
の泳動ゲル２−１〜２−３で励起光８の位置にもし螢光
ラベルされたバンド４があれば、ここで螢光を放射し、
その光は泳動ゲル端面に達し、最終的にそれぞれの光電
子増倍管２８−１〜２８−３で信号とじて検出される。

ポリゴンミラー４０の回転角によって励起光８の照明位
置がわかるので、ポリゴンミラー４０を回転することに
よって直線４２上のパターンが各々の泳動ゲル２−１〜
２−３で独立にわかり、泳動によって次々にバンド４が
上から下へ降りてくれば１時間が経つにつれてすべての
パターンがわかることになる。

泳動はＤＮＡ断片の分子長さの短かいＪｌ［に出てくる
ので、よく知られた方法で塩基配列を決定することがで
きる。

上記の実施例では、３枚の泳動ゲルを重ねているが、重
ねる泳動ゲルの数は３枚に限らず、２枚でもよく、４枚
以上でもよい。

第３図はさらに他の実施例において励起光の照射場所か
ら螢光光に強度補正を行なう場合を示している。

各泳動ゲル２の端面に達する螢光光５０は、励起光８が
当っている場所から端面をみたときの立体角０に依存す
ると考えられるが、実際には端面の条件などで変ってく
る。そこで、実測により励起光８の場所（ｘ、ｙ）によ
って励起光の強度を補正する。５４は強度補正の計算を
行なう部分であり、光電子増倍管２８からの信号強度と
照射位置（Ｘ、Ｙ）の値を入力することによって実験的
に補正する。信号処理装置１６ではこの補正された螢光
光を基にしてＤＮＡ塩基配列のシーケンスを決定する。

第４図はさらに他の実施例を示す概略平面断面図である
。

第４図の実施例では、各泳動ゲル２に対して紙面垂直方
向の表面側から裏面側に向かって励起光８を照射するも
のとする。各泳動ゲル２の一端面には光ファイバ束２０
が設けられており、反対側の端面にはミラー５８が設け
られて、光ファイバ束２０と反対方向に伝搬された螢光
光をミラー５８によって反射させて光ファイバ東方肉入
伝搬させている。

ミラー５８によって螢光光の利用効率が上がり、感度が
上がる。

第５図及び第６は本発明をオンライン方式に適用したさ
らに他の実施例を表わすものである。第６図は第５図の
Ａ−Ａ線位置での断面図である。

この実施例では螢光受光用の光ファイバ束２０が設けら
れている泳動ゲルの端面及び励起光８が入射し走査する
狭い領域以外をミラー６２で被っている。

このように、ミラー６２で被うことによって、螢光光の
利用効率がさらに上がり、感度が上昇する。

以上の実施例では泳動ゲルの端面から螢光光を受光する
装置として光ファイバ束を用いているが、受光装置は単
に泳動ゲルの端面で螢光光を受光して光電素子の光電面
に導くためのものであるので、そのような機能を果たす
ものであれば例えば光学的成形品であってもよい。

（発明の効果）本発明では複数の泳動ゲルを同時にパターン解析するこ
とができる。そのため、レーザや走査光学系といった高
価な装置の利用率が高まる。

【図面の簡単な説明】

第１図は一実施例を示す概略斜視図、第２図は他の実施
例を示す概略斜視図、第３図はさらに他の実施例におけ
る１枚のゲル部分を示す概略平面図、第４図はさらに他
の実施例における１枚のゲル部分を示す概略平面断面図
、第５図はさらに他の実施例における１枚のゲル部分を
示す概略平面断面図、第６図は第５図のＡ−Ａ線位置で
の断面図である。２．２−１〜２−３・・・・・・泳動ゲル、６・・・・
・・アルゴンレーザ、８・・・・・・励起光、１２，１
４・・・・・・ガルバノミラ−１２０，２０−１，２０
−２・・・・・・光ファイバ束、２４．２４−１．２４
−２・・・・・・干渉フィルタ、２８．２８−１．２８
−２・・・・・・光電子増倍管、４０・・・・・・ポリ
ゴンミラー特許出願人　株式会社島津製作所

Claims

【特許請求の範囲】

（１）螢光物質によりラベルした泳動サンプルを電気泳
動により展開させた若しくは展開中の、又はサンプル自
体は螢光物質をもっていないが展開後に処理されてその
展開パターンが螢光ラベルされたスラブ状泳動ゲルを互
いに平行又はほぼ平行に複数個重ねて配置し、これらの
スラブ状泳動ゲルの面の法線方向から励起光ビームを入
射させて前記複数個の泳動ゲルを通過させて走査する機
構と、各泳動ゲルごとに設けられ泳動ゲル中に展開した
泳動サンプルの螢光物質の出す螢光を泳動ゲルの端面で
受ける受光装置とを備えたゲル電気泳動パターン解析装
置。
（２）前記受光装置は、複数の光ファイバを束にし、一
方の端面形状を泳動ゲルの端面形状に対応した薄い長方
形とし、他方の端面を光電素子の光電面に導いたもので
ある請求項１記載のゲル電気泳動パターン解析装置。
（３）励起光スポットの照射位置によって受光強度を補
正する手段を備えた請求項１記載のゲル電気泳動パター
ン解析装置。
（４）前記泳動ゲルの測定端面、並びに表面及び裏面の
励起光照射部分以外の、端面、表面及び裏面の少なくと
も一部を反射鏡で被った請求項１記載のゲル電気泳動パ
ターン解析装置。