WO2020245961A1 - マルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析方法 - Google Patents

マルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析方法 Download PDF

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fluorescence
capillary
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周志 隅田
穴沢　隆
満 藤岡
基博 山崎
太朗 中澤
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株式会社日立ハイテク
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    • G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples

Definitions

  • the present invention relates to a multi-capillary electrophoresis apparatus and a sample analysis method.
  • Electrophoresis is widely known as a method for analyzing the base sequence or base length of DNA. Further, as one of the electrophoresis methods, there is a capillary electrophoresis method in which electrophoresis is performed in a capillary tube (hereinafter referred to as "capillary").
  • capillary electrophoresis method a sample containing DNA is injected into a capillary filled with a separation medium, and a high voltage is applied to both ends of the capillary in that state.
  • DNA which is a negatively charged charged particle, moves toward the anode side in the capillary depending on its own size, and as a result, a band according to the molecular weight is generated in the capillary.
  • Each DNA is fluorescently labeled and fluoresces when irradiated with excitation light. Multiple fluorescent dyes may be used. By detecting this, the base sequence and base length of DNA are determined.
  • a capillary array in which a plurality of capillaries are arranged in one electrophoresis device may be used for the purpose of speeding up the analysis.
  • Such an electrophoresis device is also called a multi-capillary array electrophoresis device, and an array of a plurality of capillaries is also called a capillary array.
  • excitation light for example, laser light
  • the laser beam passes through the plurality of arranged capillaries one after another.
  • the laser beam is scattered at the interface between substances having different refractive indexes (for example, the material of the capillary and air), and the laser beam is attenuated.
  • the laser beam irradiating the capillary near the light source has the highest intensity, and the intensity of the laser beam irradiating the distant capillary is weakened. Therefore, the fluorescence intensity detected in each capillary also changes depending on the distance from the light source.
  • Patent Document 1 employs a method of changing the integration time of light for each capillary. Further, Patent Document 2 proposes a method of correcting the fluorescence intensity using an internal standard sample.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a multi-capillary electrophoresis apparatus and a sample analysis method capable of quantitative comparison between a plurality of capillaries.
  • the multi-capillary electrophoresis apparatus detects a capillary array formed by arranging a plurality of capillaries, a light source for irradiating the plurality of capillaries with excitation light, and fluorescence from a sample in the capillaries. It includes a photodetector and an arithmetic control unit that calculates the signal intensity of the fluorescence according to the signal of the photodetector.
  • the arithmetic control unit is configured to correct the signal intensity according to a correction index determined for each combination of any one of the plurality of capillaries and the phosphor labeling the sample.
  • the multi-capillary array electrophoresis apparatus is derived from a capillary array formed by arranging a plurality of capillaries, a light source for irradiating the plurality of capillaries with excitation light, and a sample in the capillaries.
  • An operation configured to calculate the signal intensity of the fluorescence according to the photodetector for detecting fluorescence and the signal of the photodetector, and to correct the signal intensity according to a correction index determined for each of the plurality of capillaries. It includes a control unit and a correction index calculation unit that calculates the correction index.
  • the correction index calculation unit irradiates the plurality of capillaries with excitation light to measure Raman light, and calculates the correction index based on the signal intensity of the Raman light.
  • the sample analysis method is a sample analysis method for analyzing a sample using a multi-capillary electrophoresis apparatus provided with a plurality of capillaries, in which the sample is electrophoresed through a plurality of capillaries.
  • the sample analysis method is a sample analysis method for analyzing a sample using a multi-capillary electrophoresis apparatus provided with a plurality of capillaries, in which the sample is electrophoresed through a plurality of capillaries.
  • a plurality of steps a step of detecting fluorescence generated by irradiating the plurality of capillaries with excitation light using a photodetector, a step of calculating the signal intensity of the fluorescence according to a signal of the photodetector, and a plurality of steps.
  • the capillary is irradiated with excitation light to measure Raman light, and the correction index is calculated based on the signal intensity of the Raman light, and the fluorescence signal intensity is corrected according to the correction index.
  • the multi-capillary electrophoresis apparatus 1 includes an apparatus main body 101 and a control computer 102.
  • the device main body 101 is connected to the control computer 102 with a communication cable, and the operator operates the control computer 102 to control each part of the device main body 101 and controls the data detected by the photodetector 104.
  • the control computer 102 includes a display as a data display screen for displaying the exchanged data.
  • the control computer 102 may be included in the device main body 101.
  • the apparatus main body 101 further includes an arithmetic control circuit 103, a photodetector 104, a constant temperature bath 105, a capillary array 106, a light source 107, and a light irradiation unit 108.
  • the arithmetic control circuit 103 executes arithmetic processing of the measured value (fluorescence intensity) based on the detection signal of the photodetector 104, and also executes correction for the measured value (fluorescence intensity). Further, the arithmetic control circuit 103 controls the apparatus main body 101 in accordance with inputs and commands from the control computer 102.
  • the photodetector 104 is an optical sensor that detects the fluorescence generated by the laser beam as the excitation light emitted from the light source 107 to the capillary array 106.
  • the light source 107 a liquid laser, a gas laser, or a semiconductor laser can be appropriately used, and an LED can be used instead. Further, the light source 107 may be configured to irradiate the excitation light from both sides of the array of the capillary array 106, or may be configured to irradiate the excitation light in a time-division manner.
  • the constant temperature bath 105 is a temperature control mechanism for controlling the temperature of the capillary array 106.
  • the constant temperature bath 105 is covered with a heat insulating material in order to keep the temperature constant, and the temperature is controlled by the heating / cooling mechanism 123. As a result, most of the temperature of the capillary array 106 is maintained at a constant temperature of, for example, about 60 ° C.
  • the capillary array 106 is configured by arranging a plurality of capillaries 119 (4 in the example of FIG. 1).
  • the capillary array 106 can be configured as a replacement member that can be replaced with a new one as appropriate when damage or deterioration in quality is confirmed. Further, the capillary array 106 can be replaced with another multi-capillary array having different numbers and lengths of capillaries depending on the measurement.
  • Each of the plurality of capillaries 119 constituting the capillary array 106 may be composed of a glass tube having an inner diameter of several tens to several hundreds ⁇ m and an outer diameter of several hundreds ⁇ m. Further, in order to improve the strength, the surface of the glass tube may be coated with a polyimide film. However, the polyimide film on the surface of the capillary 119 is removed from the portion irradiated with the laser beam and its vicinity. The inside of the capillary 119 is filled with a separation medium for separating DNA molecules in a biological sample (sample).
  • the separation medium is, for example, a polyacrylamide-based separation gel (hereinafter, polymer) commercially available from various companies for electrophoresis.
  • a light irradiation unit 108 is arranged in a part of the capillary array 106. As will be described later, the light irradiation unit 108 is configured so that the laser light (excitation light) from the light source 107 is commonly incident on the plurality of capillary 119s, and the fluorescence emitted from the plurality of capillary 119s can be guided to the photodetector 104. Has been done.
  • the light irradiation unit 108 has a light projecting optical system such as an optical fiber or a lens in order to irradiate the light irradiation portion provided on the capillary array 106 with laser light which is measurement light.
  • the apparatus main body 101 further includes a load header 109, a cathode buffer container 111, a sample container 112, a polymer cartridge 113, an anode buffer container 114, an array header 117, and a conveyor 118.
  • a load header 109 is provided at one end of the capillary array 106.
  • the load header 109 functions as an electrode (cathode) to which a negative voltage is applied to introduce a biological sample (sample) into the capillary 119.
  • An array header 117 is provided at the other end of the capillary array 106, and the array header 117 bundles a plurality of capillary 119s into one. Further, the array header 117 is provided with a sharp portion 121 on the lower surface thereof for insertion into the polymer cartridge 113.
  • the transporter 118 is configured to mount and transport the cathode buffer container 111, the sample container 112, the polymer cartridge 113, and the anode buffer container 114 on the upper surface thereof.
  • the conveyor 118 is provided with three electric motors and a linear actuator, and can be moved in three axial directions of up and down, left and right, and front and back.
  • the cathode buffer container 111 and the anode buffer container 114 are containers for holding a buffer for migration
  • the sample container 112 is a container for holding a sample (sample) to be measured.
  • the polymer cartridge 113 is a container for holding a polymer for electrophoresis.
  • the upper portion 122 of the polymer cartridge 113 is sealed with a highly plastic material such as rubber or silicon, and is connected to a syringe mechanism 120 for filling the polymer and a conveyor 118.
  • an anode 115 for applying a positive voltage for electrophoresis is arranged so as to be in contact with the buffer.
  • a DC power supply 116 is connected between the anode 115 and the load header 109 as the cathode.
  • the transporter 118 transports the cathode buffer container 111 and the sample container 112 to the cathode end 110 of the capillary 119.
  • the buffer container 114 for the anode moves in conjunction with the tip 121 which corresponds to the anode end of the capillary 119.
  • the sample container 112 contains the same number of sample tubes as the capillary 119. The operator dispenses the DNA into the sample tube.
  • the calculation control circuit 103 further includes a measurement value calculation unit 1032, a correction index calculation unit 1033, a correction unit 1034, and a correction index database 1035.
  • the measured value calculation unit 1032 calculates the measured value (fluorescence intensity) based on the detection signal of the photodetector 104.
  • the correction index calculation unit 1033 calculates a correction index for correcting the measured value calculated by the measurement value calculation unit 1032. Further, the correction unit 1034 calculates the corrected measurement value by applying the correction index to the measurement value of the measurement value calculation unit 1032.
  • the correction index database 1035 is a database that stores the correction index calculated in this way.
  • the procedure for filling the polymer in the capillary 119 from the polymer cartridge 113 is as follows. (1) The conveyor 118 operates, and the array header 117 moves to the upper side of the polymer cartridge 113. (2) The tip 121 of the array header 117 penetrates the upper portion 122 of the polymer cartridge 113. At this time, the upper 122 of the highly plastic polymer cartridge 113 wraps the apex 121 of the array header 117 so that they are in close contact with each other, and the polymer cartridge 113 and the capillary 119 are connected in a sealed state. (3) The syringe mechanism 120 pushes up the polymer inside the polymer cartridge 113 to inject the polymer into the capillary 119.
  • the light irradiation unit 108 is composed of a plurality of reflection mirrors 202 and a condenser lens 203.
  • the reflection mirror 202 is a reflection member for changing the traveling direction of the laser beam from the light source 107.
  • the condenser lens 203 concentrates the laser beam on the light irradiation portion of the capillary array 106.
  • Other optical elements such as a filter, a polarizer, and a wave plate can be appropriately provided, but the illustration is omitted here for the sake of simplicity.
  • the laser beam 201 emitted from the light source 107 changes the traveling direction by the reflection mirror 202, is focused by the condenser lens 203, and then is irradiated to the plurality of capillarys 119.
  • the laser beam 201 is made to be incidentally incident on the plurality of capillaries 119 one after another. By observing the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the incident of the laser beam 201 with the photodetector 104, it is possible to analyze the DNA in the sample.
  • step S300 the wavelength of the laser beam emitted by the light source 107 is calibrated before analyzing the sample to be analyzed (hereinafter referred to as "actual sample”).
  • actual sample a known DNA sample (hereinafter referred to as “standard product”) labeled with the same phosphor as the phosphor labeled on the actual sample is electrophoresed, and reference wavelength spectrum data is acquired. This work is always performed when the capillary array 106 is replaced due to deterioration or length change.
  • the operator sets the cathode buffer container 111, the sample container 112, the polymer cartridge 113, and the anode buffer container 114 in the conveyor 118 (step S301). After that, the analysis is started by the instruction from the control computer 102 by the operator (step S302).
  • the carrier 118 is first operated to carry the polymer cartridge 113 to the tip 121 of the array header 117 (step S303).
  • the capillary cathode end 110 comes into contact with the cathode buffer contained in the cathode buffer container 111.
  • the syringe mechanism 120 injects the polymer into the capillary array 106 (step S304).
  • the old polymer used in the past electrophoresis is discarded from the capillary 119 into the cathode buffer container 111.
  • the amount of polymer injected from the polymer cartridge 113 into the capillary 119 is specified by the control computer 102, and the specified amount of polymer is injected by the syringe mechanism 120.
  • the preliminary electrophoresis is subsequently started (step S305).
  • Preliminary electrophoresis is performed prior to the original analytical process to bring the polymer in the capillary 119 into a suitable state for analysis.
  • the preliminary electrophoresis is performed by applying a voltage of about several to several tens of kV between the anode 115 and the load header 109 for several to several tens of minutes.
  • the capillary cathode end 110 is washed with the cathode buffer container 111 (step S306).
  • the sample container 112 is conveyed to the capillary cathode end 110 (step S307).
  • a voltage of about several kV is applied to the capillary cathode end 110
  • an electric field is generated between the sample liquid and the tip 121, and the sample in the sample container 112 is introduced into the capillary 119 (step S308). ..
  • the capillary cathode end 110 is washed again with the cathode buffer container 111.
  • Electrophoresis is to give mobility to a sample in capillary 119 by the electric field action generated between the cathode and anode buffers, and to separate the samples by the difference in mobility depending on the properties of the sample.
  • the sample is DNA
  • the case where the sample is DNA will be described as an example.
  • DNA has a negative charge in the separation medium (polymer) due to the phosphodiester bond that corresponds to the skeleton of the double helix. Therefore, it moves to the anode side in the DNA electric field.
  • the separation medium (polymer) since the separation medium (polymer) has a network structure, the mobility of DNA depends on the ease of passing through the network, in other words, the size of DNA. DNA with a short base length easily penetrates the network structure and has high mobility, and vice versa with DNA with a long base length.
  • the DNA having the shortest base length is optically detected by the light irradiation unit 108 in order.
  • the measurement time and the voltage application time are set according to the sample having the longest migration time.
  • the detected fluorescence is collated with the reference spectrum obtained by the wavelength calibration 300 to identify the phosphor. This step is called color conversion (step S310).
  • the voltage application is stopped after data acquisition, and the analysis is completed (step S311).
  • the above is the basic procedure of electrophoresis analysis. In this way, in the measured value calculation unit 1032 of the calculation control circuit 103, the value of the fluorescence intensity is obtained as the measured value for each capillary 119.
  • the outline of the procedure for correcting the obtained measured value (fluorescence intensity) will be described with reference to the schematic diagram of FIG.
  • a "correction coefficient" to be multiplied by the measured value is acquired with respect to the obtained measured value, and this correction coefficient is applied to the measured value.
  • the correction coefficient acquired here is set to a different value for each combination of the plurality of capillaries 119 and the plurality of phosphors. In other words, even in the same capillary 119, when the phosphors labeled on the samples to be measured are different, different correction coefficients are given to the different phosphors.
  • correction index is a correction coefficient to be multiplied by the measured value, but the correction index may be any format as long as the measured value can be corrected according to the purpose.
  • the capillary array 106 includes four capillaries 119-1 to 119-1 to 4 (FIG. 4A).
  • FIG. 4A shows the procedure for calculating the correction coefficient
  • FIG. 4 (e) shows a numerical example of the fluorescence intensity after correction by the correction coefficient.
  • the numerical values in the tables of FIGS. 4 (c) to 4 (e) are virtual values described for the sake of explanation and are not related to the actual measured values.
  • the signal intensities of each of the four capillarys 119-1 to 119-1 to 4 are measured with each phosphor.
  • the measurement is performed by giving the same conditions to the four capillaries 119-1 to 119-1 to 4.
  • an equal amount of DNA is dispensed into each sample tube corresponding to the four capillaries 119-1-4. In this state, ideally, the fluorescence intensity obtained from wavelength calibration will not differ between capillaries.
  • the correction coefficient is calculated by the following procedure, stored in the correction index database 1035, and used for the correction of the measured value.
  • the fluorescence intensities Int (nX) of the phosphors A, B, and C are obtained in the respective capillaries 119-1 to 119-1 to 4 (FIG. 4 (b)).
  • n is a number (1 to 4) at the end of the capillary
  • X is a type of phosphor (A, B, C).
  • FIG. 4B the fluorescence intensities of the three types of phosphors A, B, and C are obtained in each of the four capillaries 119-1 to 4.
  • the fluorescence intensities Int (1A), Int (2A), Int (3A), and Int (4A) can be obtained for the four capillaries 119-1 to 119-1 to 4.
  • the fluorescence intensities Int (1B), Int (2B), Int (3B), and Int (4B) can be obtained for the four capillarys 119-1 to 119-1 to 4.
  • the fluorescence intensities Int (1C), Int (2C), Int (3C), and Int (4C) can be obtained for the four capillarys 119-1 to 119-1 to 4.
  • the one having the smallest value is the lowest fluorescence intensity Int (yA), Int (yB), Int ( It is defined as yC).
  • the fluorescence intensity Int (4A) 0.7 of the capillary 119-4 is the minimum fluorescence intensity Int (yA), and for the phosphor B, the fluorescence intensity 119-
  • the fluorescence intensity Int (1B) 0.6 of 1 is the minimum fluorescence intensity Int (yB)
  • the fluorescence intensity Int (2C) 0.9 of the capillary 119-2 is the minimum fluorescence intensity Int ( yC).
  • the minimum fluorescence intensity Int (yA), Int (yB), and Int (yC) are used as reference values, and each measured value is divided by this reference value to obtain a correction coefficient k (nX). Is calculated.
  • the correction coefficient k (nX) related to the minimum fluorescence intensity Int (yX) is the largest value of 1.00, while it is the highest for each of the phosphors A to C.
  • the smallest correction factor k (nX) is given for the combination of fluorescence intensities.
  • the numerical value of the correction coefficient is rounded to the second decimal place, but the present invention is not limited to this.
  • the obtained correction coefficient k (nX) is stored in the correction index database 1035.
  • the correction coefficient was calculated using the minimum fluorescence intensity Int (yX) as a reference value, but the correction coefficient is not limited to this, and for example, the average value of the fluorescence intensity or The maximum, median, or numerical value in a particular capillary may be typically used in the calculation.
  • the actual sample is electrophoresed to obtain the fluorescence intensity f (nX).
  • the corrected fluorescence intensity f'(as shown in FIG. 4E) ( nX) can be obtained.
  • the fluorescence intensity f (nX) before correction has variations among different capillaries even when the same sample is measured using the same phosphor, but as shown in FIG. 4 (e), the correction coefficient By multiplying by k (nX), the corrected fluorescence intensity f'(nX) can be set to substantially the same value among a plurality of capillaries 119-1 to 119-1 for the same phosphor.
  • the correction by the correction coefficient k (nX) does not need to be set so that the corrected fluorescence intensities f'(nX) are substantially the same as each other.
  • the correction coefficient k (nX) is applied (multiplied) to the signal strengths of a plurality of capillaries, at least the variation of the corrected signal strength among the plurality of capillaries is reduced as compared with the variation before the correction. It suffices if the correction coefficient k (nX) is set in the numerical value.
  • the correction coefficient obtained from the wavelength calibration data in one device is used to correct the measured value in the same device.
  • the correction factor obtained in one particular device can be used to correct the measured value of the actual sample obtained in another device.
  • Example The effect of the embodiment of the present invention was actually confirmed using the sample shown below.
  • PowerPlex registered trademark
  • 4C Matrix Standard manufactured by Promega
  • a product amplified by PowerPlex (trademark) 16HS System manufactured by Promega
  • Both samples were prepared according to the standard protocol recommended by Promega.
  • both the standard product and the actual sample were labeled with four types of phosphors (5-FAM, JOE, TMR, CXR).
  • the correction coefficient k (nX) was calculated using the data at the time of wavelength calibration (step S300), but in this modification 1, the phosphor X is labeled on a sample having an arbitrary concentration known.
  • the correction coefficient k (nX) is calculated using the fluorescence intensity data obtained as a result of electrophoresis.
  • c (nX) be the concentration of DNA in a sample with a known concentration used to calculate the correction coefficient k (nX).
  • n is the number at the end of the capillaries 119-1 to 4
  • X is the type of phosphor.
  • the average value obtained by averaging the DNA concentrations c (nX) among a plurality of capillaries is defined as avg (X).
  • y is the number of the capillary that minimizes the fluorescence intensity, as in the first embodiment.
  • the correction coefficient k (nX) When the correction coefficient k (nX) is obtained in this way, the fluorescence intensity f (nX) obtained by measuring the actual sample is multiplied by the correction coefficient k (nX) to carry out the first implementation.
  • the correction can be performed in the same manner as the form.
  • the correction coefficient k (nX) was calculated using the average value of the concentration c (nX), but the maximum value, the minimum value, the median value, or a specific capillary of the fluorescence intensity. The numerical value in may be used in the calculation.
  • the correction coefficient k (nX) was calculated using the data at the time of wavelength calibration (step S300), but in this modification 2, the phosphor X is labeled on a sample having an arbitrary concentration ratio known. And electrophoresis is performed, and the correction coefficient is calculated using the fluorescence intensity data obtained as a result.
  • the concentration ratio of DNA used for calculating the correction coefficient k (nX) is r (nX), and the fluorescence intensity of the phosphor X is Int (X).
  • n is the end number of the capillary and X is the type of phosphor.
  • y is the number of the capillary that minimizes the fluorescence intensity, as in the first embodiment.
  • the correction coefficient k (nX) When the correction coefficient k (nX) is obtained in this way, the fluorescence intensity f (nX) obtained by measuring the actual sample is multiplied by the correction coefficient k (nX) to carry out the first implementation.
  • the correction can be performed in the same manner as the form.
  • the corrected fluorescence intensity can be obtained by multiplying the fluorescence intensity f (nX) of the actual sample labeled with the phosphor X by the correction coefficient k (nX).
  • the correction coefficient is calculated using the average value, but the maximum value, the minimum value, and the median value may be used.
  • the method of calculating the correction coefficient is different from that of the first embodiment.
  • the correction coefficient is set so that the corrected fluorescence intensity is substantially the same among the plurality of capillaries, or at least the variation thereof is reduced. It was calculated.
  • the corrected fluorescence intensity is substantially the same, or at least the variation thereof is small for all combinations regardless of the difference in the capillary and the difference in the phosphor used. (So that significant variability is reduced to negligible variability), determine the correction factor. This point will be described with reference to FIG.
  • the capillary array 106 will be described as having four capillaries 119-1 to 119-1 to 4 (FIG. 6A).
  • 6 (b) and 6 (c) show the procedure for calculating the correction coefficient
  • FIG. 6 (e) shows a numerical example of the fluorescence intensity after correction by the correction coefficient. Similar to FIG. 4, the numerical values in the tables of FIGS. 6 (c) to 6 (e) are virtual values described for explanation only and are not related to actual measured values.
  • the signal intensities of the four capillarys 119-1 to 119-1 to 4 are measured at the time of wavelength calibration before the start of analysis (step S300 in FIG. 3), as in FIG. Measure with each phosphor. Up to this point, it is the same as that of the first embodiment.
  • the fluorescence intensity Int (1B) measured using the phosphor B in the capillary 119-1 is Int (n 0 X 0 ).
  • n 0 represents the end number of the capillary having the minimum fluorescence intensity
  • X 0 represents the type of the phosphor having the minimum fluorescence intensity in the capillary.
  • the correction is performed so that the fluorescence intensities are substantially the same among the combination of the plurality of capillaries and the plurality of phosphors, or at least the variation is smaller than that before the correction.
  • FIG. 6 (d) is an example of the correction coefficient k (nX) calculated in this way, and the lowest fluorescence intensity Int (nX) obtained as shown in FIG. 6 (c) shows the minimum fluorescence intensity Int ( It was obtained by dividing n 0 X 0 ).
  • the correction coefficient k (nX) of FIG. 6 (d) for example, the fluorescence intensity f (nX) of the actual sample labeled with the phosphor X is multiplied by k (nX) to correct the fluorescence intensity.
  • f'(nX) is obtained as shown in FIG. 6 (e). Unlike the first embodiment, all the fluorescence intensities f'(nX) are the same at 0.6 regardless of the type of phosphor and the type of capillary.
  • the multicapillary electrophoresis apparatus according to the third embodiment will be described with reference to FIG. 7. Since the configuration itself of the multi-capillary electrophoresis apparatus of the third embodiment may be the same as that of the first embodiment (FIG. 1), duplicate description will be omitted. In addition, the overall operation is substantially the same (Fig. 3). However, in this third embodiment, instead of calculating the correction coefficient k (nX) using the measured value of the fluorescence intensity Int (nX), the fitting curve according to the distribution of the fluorescence intensity Int (nX). An approximate value based on is obtained, and a correction coefficient k (nX) is calculated from this approximate value.
  • FIG. 7 The method of calculating the correction coefficient in the third embodiment will be described with reference to FIG. 7.
  • a case where the capillary array 106 includes 96 capillaries 119-1 to 96 and two types of phosphors A and B are used will be described (FIGS. 7A and 7B). It goes without saying that this number of 96 is only an example, and other numbers can be adopted.
  • 7 (b) to 7 (e) show a procedure for calculating an approximate value and further calculating a correction coefficient based on the approximate value.
  • FIG. 7 (f) shows a numerical example of the fluorescence intensity after correction by the correction coefficient.
  • the numerical values in the tables of FIGS. 7 (c) to 7 (f) are virtual values described for the sake of explanation and are not related to the actual measured values.
  • the horizontal axis is the distance from the light source 107 of the capillary, and the vertical axis is the fluorescence intensity Int.
  • a scatter plot with (nX) is created (FIG. 7 (c)).
  • the fitting curves Ca and Cb for the fluorescence intensities Int (nA) and Int (nB) of the phosphors A and B are obtained by using, for example, the least squares method. From the fitting curves Ca and Cb, an approximate value Int (nX') of fluorescence intensity is calculated for each capillary and each phosphor (FIG. 7 (d)).
  • the multi-capillary electrophoresis apparatus according to the fourth embodiment will be described with reference to FIG. Since the configuration itself of the multi-capillary electrophoresis apparatus of the fourth embodiment may be the same as that of the first embodiment (FIG. 1), duplicate description will be omitted. In addition, the overall operation is substantially the same (Fig. 3). However, in this fourth embodiment, the method of detecting light by the photodetector 104 and the method of calculating the correction coefficient are different from those of the above-described embodiment.
  • the fluorescence intensity was measured using a sample labeled with the same phosphor as the actual sample, and the correction coefficient was calculated based on the result.
  • the plurality of capillaries 119 are filled with the same substance (for example, a buffer or another substance (for example, water)) and irradiated with excitation light, and the intensity of the Raman light is emitted. Is measured by the photodetector 104 to calculate the correction coefficient.
  • the material that fills the capillary 119 to measure the intensity of Raman light is, for example, a buffer. In the following, the case of measuring Raman light from the buffer will be mainly described, but the same effect can be obtained by measuring Raman light from a substance other than the buffer.
  • the Raman light intensity Ints (nX) obtained in each of the capillaries 119-1 to 119-1 the one having the lowest signal intensity is specified as the lowest Raman light intensity Int (yX).
  • the calculated correction coefficient k (n) is stored in the correction index database 1035.
  • the sample to be analyzed (hereinafter referred to as “actual sample”) is run to obtain the fluorescence intensity f (nX).
  • the corrected fluorescence intensity f'( nX) can be obtained.
  • the fluorescence intensity f (nX) before correction varies even when the same sample is measured using the same phosphor, but as shown in FIG.
  • the correction coefficient k (n) By multiplying by, the corrected fluorescence intensity f'(nX) can be set to substantially the same value among the plurality of capacitors 119-1 to 119-1. That is, substantially the same fluorescence intensity can be obtained between the capillaries under the same conditions regardless of the structural variation between the capillaries.
  • the multicapillary electrophoresis apparatus according to the fifth embodiment will be described with reference to FIG.
  • This fifth embodiment is configured to calculate the correction coefficient based on the Raman light intensity, as in the fourth embodiment. Since the configuration itself of the multi-capillary electrophoresis apparatus of the fifth embodiment may be the same as that of the first embodiment (FIG. 1), duplicate description will be omitted. In addition, the overall operation is substantially the same (Fig. 3).
  • the correction coefficient was calculated using the signal intensity at the peak position of the Raman light signal intensity distribution of the buffer, but in the fifth embodiment, the signal intensity distribution of the Raman light of the buffer is used. The correction coefficient is calculated using the signal intensities at a plurality of included wavelengths. This will be described with reference to FIG.
  • the capillary array 106 will be described as having four capillaries 119-1 to 119-1 to 4 (FIG. 9A).
  • 9 (b) to 9 (d) show the procedure for calculating the correction coefficient.
  • the capillaries 119-1 to 119-1 to 4 are filled with a buffer, and then the light source 107 irradiates the light irradiation unit 108 with the laser beam, as in the fourth embodiment. Then, for example, as shown in FIG. 9B, the intensity distribution P3 of Raman light from the buffer has a wider wavelength range than the intensity distributions P1 and P2 of the fluorescence emitted by the phosphor.
  • the wavelengths ⁇ a and ⁇ b are the fluorescence wavelengths of the phosphors A and B that label the actual sample. As shown in FIG.
  • the Raman light intensity Int (2A) of the capillary 119-2 is the lowest Raman light intensity Int (yA)
  • the Raman light intensity Int (yA) of the capillary 119-1 is the lowest Raman light intensity Int (yB).
  • the correction coefficients k (nA) and k (nB) obtained in this way are multiplied by the fluorescence intensity f (nX) of the actual sample labeled with the phosphor X to fluoresce the phosphors A and B. The intensity is corrected appropriately.
  • the multicapillary electrophoresis apparatus according to the sixth embodiment will be described with reference to FIG.
  • the correction coefficient was calculated based on the fluorescence intensity obtained by the electrophoresis separately from the electrophoresis of the actual sample (for example, step S300 in FIG. 2), but in the sixth embodiment.
  • the device of the form is configured to calculate a correction coefficient from the fluorescence intensity obtained by electrophoresis of an actual sample.
  • the capillary array 106 includes four capillaries 119-1 to 119-1 to 4 (FIG. 10A).
  • 10 (b) to 10 (d) show the procedure for calculating the correction coefficient
  • FIG. 10 (e) shows a numerical example of the fluorescence intensity after correction by the correction coefficient.
  • the numerical values in the tables of FIGS. 10 (c) to 10 (e) are virtual values described for the sake of explanation and are not related to the actual measured values.
  • a standard product labeled with the same fluorescent substance as the phosphor used for labeling the actual sample is mixed with the actual sample. While the actual sample mixed with such a standard product is electrophoresed and the fluorescence intensity of the actual sample is measured as usual, the fluorescence intensity of the standard product is also measured in the same process. At this time, the standard product must be temporally or spatially distinguishable from the actual sample on the migration data. For example, as shown in FIG. 10B, the standard product is mixed in the actual sample so that the peak T1 of the fluorescence intensity of the actual sample is temporally different from the peak R of the fluorescence intensity of the standard product, and the migration control is performed. Need to do.
  • the observed fluorescence intensity of the standard product is defined as Intr (nX).
  • n is the capillary number and X is the type of phosphor.
  • Intr (1X), Intr (2X), Intr (3X), and Intr (4X) the one with the smallest value is defined as the lowest fluorescence intensity Intr (yX). ..
  • the fluorescence intensity Intr (3X) of the capillary 119-3 is the lowest fluorescence intensity Intr (yX).
  • k (nX) Int (yX) / Int (nX)
  • the intensity difference between the phosphors can be corrected by multiplying the fluorescence intensity f (nX) of the actual sample by k (nX) in the same manner as in other embodiments.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and includes various modifications.
  • the above-described embodiment has been described in detail in order to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and is not necessarily limited to the one including all the described configurations.
  • it is possible to replace a part of the configuration of one embodiment with the configuration of another embodiment and it is also possible to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment.
  • each of the above configurations, functions, processing units, processing means and the like may be realized by hardware by designing a part or all of them by, for example, an integrated circuit.

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Abstract

このマルチキャピラリ電気泳動装置は、複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出する演算制御部とを備える。この演算制御部は、前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体との組み合わせ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成される。

Description

マルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析方法
　本発明は、マルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析方法に関する。
　ＤＮＡの塩基配列又は塩基長を分析する手法として、電気泳動法が広く知られている。また、電気泳動法の１つとして、電気泳動を毛細管（以下「キャピラリ」という）内で行うキャピラリ電気泳動法がある。このキャピラリ電気泳動法では、分離媒体が充填されたキャピラリに、ＤＮＡを含むサンプルを注入し、その状態でキャピラリの両端に高電圧を印加する。この時、負に帯電した荷電粒子であるＤＮＡは、自らの大きさに依存してキャピラリ内を陽極側に移動し、結果として分子量に従ったバンドをキャピラリ内に生じる。各ＤＮＡは蛍光標識されており、励起光の照射により蛍光を発する。蛍光色素は複数用いられることもある。これを検出することでＤＮＡの塩基配列や塩基長を決定する。
　分析の際に、その迅速化を図る目的で、１つの電気泳動装置内に複数のキャピラリを配列したキャピラリアレイを用いることがある。そのような電気泳動装置は、マルチキャピラリアレイ電気泳動装置とも呼ばれ、複数のキャピラリの配列を、キャピラリアレイとも呼ばれる。
　このようなキャピラリアレイへの光照射方法として、キャピラリアレイの一端又は両端から、励起光（例えばレーザ光）が複数のキャピラリを通過するように照射して蛍光を検出する検出方法がある。この場合、レーザ光は配列された複数のキャピラリを次々と通過する。レーザ光があるキャピラリを通過するとき、屈折率の異なる物質（例えばキャピラリの材質と空気）の境界面でレーザ光が散乱し、レーザ光は減衰する。このため、複数のキャピラリのうち、光源に近いキャピラリに照射されるレーザ光が最も強度が大きく、遠いキャピラリに照射されるレーザ光の強度が弱くなる。そのため、各キャピラリで検出される蛍光強度も、光源からの距離に依存して変化する。
　このようなマルチキャピラリ型電気泳動装置では、それぞれのキャピラリで同量のＤＮＡを分析しても、キャピラリによって得られる蛍光強度が異なる。以下では、同量のＤＮＡを分析してもなお生じるキャピラリ間の蛍光強度差を「構成的ばらつき」と表現する。
　この構成的ばらつきは、分析で得られた蛍光強度の複数のキャピラリ間での定量的な比較を困難にする。この問題に対処するため、特許文献１では、キャピラリごとに光の積算時間を変化させる方法を採用している。また、特許文献２では、内部標準試料を用いて蛍光強度を補正する方法が提案されている。
　しかし、特許文献１及び２の方法によっても、蛍光強度の複数のキャピラリ間での正確な定量的な比較は困難であった。
特開２０１２－１６８１３８号公報 特開２０１６－１７６７６４号公報
　本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであって、複数のキャピラリ間での定量的な比較を可能とするマルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様に係るマルチキャピラリ電気泳動装置は、複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出する演算制御部とを備える。この演算制御部は、前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体との組み合わせ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成される。
　また、本発明の別の態様に係るマルチキャピラリアレイ電気泳動装置は、複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出すると共に、前記複数のキャピラリ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成された演算制御部と、前記補正指数を演算する補正指数演算部とを備える。前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリに励起光を照射してラマン光を計測し、そのラマン光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する。
　また、本発明の一態様に係るサンプル分析方法は、複数のキャピラリを備えたマルチキャピラリ電気泳動装置を用いてサンプルを分析するサンプル分析方法において、複数のキャピラリを介して前記サンプルを電気泳動させるステップと、前記複数のキャピラリに励起光を照射することで発生する蛍光を光検出器を用いて検出するステップと、前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出するステップと、前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体の組み合わせごとに定められた補正指数に従い、前記蛍光の信号強度を補正するステップとを備える。
　また、本発明の別の態様に係るサンプル分析方法は、複数のキャピラリを備えたマルチキャピラリ電気泳動装置を用いてサンプルを分析するサンプル分析方法において、複数のキャピラリを介して前記サンプルを電気泳動させるステップと、前記複数のキャピラリに励起光を照射することで発生する蛍光を光検出器を用いて検出するステップと、前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出するステップと、前記複数のキャピラリに励起光を照射してラマン光を計測し、そのラマン光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算するステップと、前記補正指数に従って前記蛍光の信号強度を補正するステップとを備える。
　本発明によれば、複数のキャピラリ間での定量的な比較を可能とするマルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析法を提供することができる。
第１の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置の構成を説明する概略図である。 光照射部１０８の構成を更に詳細に説明する構成図である。 第１の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置におけるサンプルの分析の手順を説明するフローチャートである。 第１の実施の形態における補正係数の演算の方法を説明する概略図である。 実験の結果を示すグラフである。 第２の実施の形態を説明する概略図である。 第３の実施の形態を説明する概略図である。 第４の実施の形態を説明する概略図である。 第５の実施の形態を説明する概略図である。 第６の実施の形態を説明する概略図である。
　以下、添付図面を参照して本実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本開示の原理に則った実施形態と実装例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではない。
　本実施形態では、当業者が本開示を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
［第１の実施の形態］
　まず、図１の概略図を参照して、第１の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置の構成を説明する。このマルチキャピラリ電気泳動装置１は、装置本体１０１と、制御用コンピュータ１０２とを備える。
　装置本体１０１は、制御用コンピュータ１０２と通信ケーブルで接続されており、オペレータは、制御用コンピュータ１０２を操作して装置本体１０１が有する各部を制御し、光検出器１０４で検出するデータを制御用コンピュータ１０２において受信する。制御用コンピュータ１０２は、授受したデータを表示するためのデータ表示画面としてのディスプレイを備える。なお、制御用コンピュータ１０２は、装置本体１０１に内包されていても良い。
　装置本体１０１は、更に、演算制御回路１０３、光検出器１０４、恒温槽１０５、キャピラリアレイ１０６、光源１０７、光照射部１０８を備えている。
　演算制御回路１０３は、光検出器１０４の検出信号に基づいて測定値（蛍光強度）の演算処理を実行すると共に、測定値（蛍光強度）に対し補正を実行する。また、演算制御回路１０３は、制御用コンピュータ１０２からの入力や命令に従い、装置本体１０１を制御する。光検出器１０４は、光源１０７からキャピラリアレイ１０６に照射された励起光としてのレーザ光によって発生した蛍光を検出する光センサである。光源１０７としては、液体レーザ、気体レーザ、半導体レーザを適宜使用でき、ＬＥＤで代用することも可能である。さらに、光源１０７は、キャピラリアレイ１０６の配列の両側から励起光を照射するようにしてもよく、また、励起光を時分割で照射するように構成されても良い。
　恒温槽１０５は、キャピラリアレイ１０６の温度を制御するための温度制御機構である。恒温槽１０５は、槽内に温度を一定に保つために断熱材で覆われ、加熱冷却機構１２３により温度を制御する。これにより、キャピラリアレイ１０６の大部分の温度を、例えば６０℃程度の一定温度に維持する。
　キャピラリアレイ１０６は、複数本（図１の例では４本）のキャピラリ１１９を配列して構成される。キャピラリアレイ１０６は、破損や品質の劣化が確認された場合には、適宜新品と交換可能な交換部材として構成され得る。また、キャピラリアレイ１０６は、測定に応じて、異なる本数や長さのキャピラリを有する別のマルチキャピラリアレイに置き換え可能である。
　キャピラリアレイ１０６を構成する複数のキャピラリ１１９の各々は、内径数十～数百μｍ、外径数百μｍのガラス管で構成され得る。また、強度向上のため、ガラス管の表面はポリイミド被膜で被覆され得る。ただし、レーザ光が照射される箇所及びその近傍は、キャピラリ１１９の表面のポリイミド被膜は除去されている。キャピラリ１１９の内部には、生体試料（サンプル）中のＤＮＡ分子を分離するための分離媒体が充填される。分離媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲル（以下、ポリマ）である。
　キャピラリアレイ１０６の一部には光照射部１０８が配置されている。光照射部１０８は、後述するように、光源１０７からのレーザ光（励起光）を共通に複数のキャピラリ１１９に入射させ、複数のキャピラリ１１９から発する蛍光を光検出器１０４に導光可能に構成されている。具体的に光照射部１０８は、キャピラリアレイ１０６に設けられた光照射部位に測定光であるレーザ光を照射するため、光ファイバやレンズなどの投光光学系を有する。
　装置本体１０１は更に、ロードヘッダ１０９、陰極用バッファ容器１１１、サンプル容器１１２、ポリマカートリッジ１１３、陽極用バッファ容器１１４、アレイヘッダ１１７、及び搬送機１１８を備える。
　キャピラリアレイ１０６の一端にはロードヘッダ１０９が設けられる。ロードヘッダ１０９は、キャピラリ１１９内に生体試料（サンプル）を導入するための負電圧を印加される電極(陰極)として機能する。キャピラリアレイ１０６の他端には、アレイヘッダ１１７が設けられ、アレイヘッダ１１７は複数本のキャピラリ１１９を１つに束ねている。また、アレイヘッダ１１７は、その下面に、ポリマカートリッジ１１３に挿入するための尖部１２１を備えている。
　また、搬送機１１８は、その上面に陰極用バッファ容器１１１、サンプル容器１１２、ポリマカートリッジ１１３、及び陽極用バッファ容器１１４を載置し且つ搬送するよう構成されている。一例として、搬送機１１８は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備え、上下、左右、前後の３軸方向に移動可能とすることができる。陰極用バッファ容器１１１、及び陽極用バッファ容器１１４は、泳動用のバッファを保持する容器であり、サンプル容器１１２は、測定対象の試料（サンプル）を保持する容器である。
　また、ポリマカートリッジ１１３は、泳動用のポリマを保持する容器である。ポリマカートリッジ１１３は、上部１２２がゴムやシリコンなどの可塑性の高い素材で密閉され、ポリマを充填するためのシリンジ機構１２０及び搬送機１１８と連結されている。陽極用バッファ容器１１４には、泳動のための正電圧を印加する陽極１１５が、バッファと接触するように配置されている。陽極１１５と、陰極としてのロードヘッダ１０９との間には、直流電源１１６が接続されている。
　搬送機１１８は陰極用バッファ容器１１１及びサンプル容器１１２をキャピラリ１１９の陰極端１１０まで搬送する。この時、連動して陽極用バッファ容器１１４が、キャピラリ１１９の陽極端に当たる尖部１２１に移動する。サンプル容器１１２は、キャピラリ１１９と同数のサンプルチューブを内包する。オペレータはサンプルチューブにＤＮＡを分注する。
　演算制御回路１０３は更に、測定値演算部１０３２と、補正指数演算部１０３３と、補正部１０３４と、補正指数データベース１０３５とを備えている。
　測定値演算部１０３２は、光検出器１０４の検出信号に基づいて測定値（蛍光強度）を演算する。補正指数演算部１０３３は、測定値演算部１０３２で演算された測定値を補正するための補正指数を演算する。また、補正部１０３４は、測定値演算部１０３２の測定値に、補正指数を適用して補正された測定値を演算する。補正指数データベース１０３５は、このようにして演算された補正指数を記憶するデータベースである。
　キャピラリ１１９内にポリマカートリッジ１１３からポリマを充填させる際の手順は以下の通りである。
（１）搬送機１１８が動作し、アレイヘッダ１１７がポリマカートリッジ１１３の上側に移動する。
（２）アレイヘッダ１１７の尖部１２１がポリマカートリッジ１１３の上部１２２を貫通する。この時、可塑性の高いポリマカートリッジ１１３の上部１２２がアレイヘッダ１１７の尖部１２１を包み込むことで両者が密着し、ポリマカートリッジ１１３とキャピラリ１１９が密閉状態で連結される。
（３）シリンジ機構１２０がポリマカートリッジ１１３内部のポリマを押し上げて、ポリマをキャピラリ１１９に注入する。
　図２を参照して、光照射部１０８の構成を更に詳細に説明する。光照射部１０８は、一例として、複数の反射ミラー２０２、及び集光レンズ２０３から構成される。反射ミラー２０２は、光源１０７からのレーザ光の進行方向を変化させるための反射部材である。また、集光レンズ２０３は、キャピラリアレイ１０６の光照射部位にレーザ光を集光する。なお、フィルタ、偏光子、波長板等の他の光学素子を適宜設けることができるが、ここで
は簡略化のため図示は省略する。
　光源１０７から発せられたレーザ光２０１は、反射ミラー２０２により進行方向を変え、集光レンズ２０３で集光された後、複数のキャピラリ１１９に照射される。レーザ光２０１は、複数のキャピラリ１１９に次々に入射するようにされる。このレーザ光２０１の入射により発せられる蛍光の蛍光強度を光検出器１０４で観測することにより、サンプル中のＤＮＡの分析を実行することができる。
　以下、図３のフローチャートを参照して、第１の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置におけるサンプルの分析の手順について説明する。
　まず、ステップＳ３００では、分析したいサンプル（以下、「実サンプル」という）を分析する前に、光源１０７が発するレーザ光の波長校正を行う。波長校正では、実サンプルに標識された蛍光体と同じ蛍光体で標識された既知のＤＮＡサンプル（以下、「標準品」という）を電気泳動させ、基準となる波長スペクトルデータを取得する。本作業は、劣化や長さ変更に伴うキャピラリアレイ１０６の交換時に必ず実行する。
　次に、事前準備（消耗品導入）として、オペレータは、陰極用バッファ容器１１１、サンプル容器１１２、ポリマカートリッジ１１３、陽極用バッファ容器１１４を搬送機１１８にセットする（ステップＳ３０１）。その後、オペレータによる制御用コンピュータ１０２からの命令により、分析が開始される（ステップＳ３０２）。
　分析が開始されると、まず搬送機１１８を動作させて、ポリマカートリッジ１１３をアレイヘッダ１１７の尖部１２１に運ぶ（ステップＳ３０３）。この時、キャピラリ陰極端１１０が陰極用バッファ容器１１１に含まれる陰極用バッファに接触する。その後、シリンジ機構１２０によりキャピラリアレイ１０６にポリマが注入される（ステップＳ３０４）。同時に、過去の泳動で使用された古いポリマが、キャピラリ１１９から陰極用バッファ容器１１１に廃棄される。なお、ポリマカートリッジ１１３からキャピラリ１１９に注入されるポリマの量は、制御用コンピュータ１０２により指定され、この指定された量のポリマがシリンジ機構１２０により注入される。
　ポリマの充填が完了すると、続いて予備泳動が開始される（ステップＳ３０５）。予備泳動は、本来の分析工程に先立って実行され、キャピラリ１１９内のポリマを分析に適した状態にするために実行される。通常、予備泳動は、陽極１１５とロードヘッダ１０９との間に、数～数十ｋＶ程度の電圧を数～数十分間印加して実行される。
　予備泳動終了後、陰極用バッファ容器１１１でキャピラリ陰極端１１０を洗浄する（ステップＳ３０６）。次に、キャピラリ陰極端１１０にサンプル容器１１２を搬送する（ステップＳ３０７）。この状態で、キャピラリ陰極端１１０に数ｋＶ程度の電圧を印加すると、サンプル液と尖部１２１の間に電界が発生し、サンプル容器１１２中のサンプルがキャピラリ１１９内に導入される（ステップＳ３０８）。サンプル導入後、再びキャピラリ陰極端１１０を陰極用バッファ容器１１１で洗浄する。
　その後、所定の電圧を印加してサンプルの電気泳動を開始する（ステップＳ３０９）。電気泳動とは、陰極・陽極バッファ間に生じた電界作用により、キャピラリ１１９中のサンプルに移動度を与え、サンプルの性質に依存する移動度の差によりサンプルを分離することである。ここではサンプルがＤＮＡの場合を例にとって説明する。
　ＤＮＡは二重螺旋の骨格にあたるホスホジエステル結合により、分離媒体（ポリマ）中で負の電荷をもつ。そのため、ＤＮＡ電界中で陽極側へ移動する。この時、分離媒体（ポリマ）が網目状構造を有するため、ＤＮＡの移動度は、網目のくぐりやすさ、換言すればＤＮＡのサイズに依存する。塩基長の短いＤＮＡは網目状構造を潜り抜けやすく、移動度も高くなり、塩基長の長いＤＮＡではその逆になる。
　ＤＮＡには予め蛍光物質（蛍光体）が標識されているため、塩基長の短いＤＮＡから順番に光照射部１０８で光学的に検出される。通常は、泳動時間の一番長いサンプルに合わせて測定時間及び電圧印加時間が設定される。検出された蛍光を波長校正３００で得られた基準スペクトルと照合し、蛍光体の識別を行う。この工程を色変換と呼ぶ（ステップＳ３１０）。電圧印加開始から所定時間が経過した後、データ取得後に電圧印加を停止し、分析を終了する（ステップＳ３１１）。以上が基本的な電気泳動分析の手順である。このようにして、演算制御回路１０３の測定値演算部１０３２において、キャピラリ１１９毎に蛍光強度の値が測定値として得られる。
　続いて、第１の実施の形態において、得られた測定値（蛍光強度）を補正する手順の概略を、図４の模式図を参照して説明する。前述したように、この第１の実施の形態では、得られた測定値に対し、補正指数の一例として、測定値に乗算する「補正係数」を取得し、この補正係数を適用して測定値を補正する。ここで取得される補正係数は、複数のキャピラリ１１９、及び複数の蛍光体の組合せ毎に異なる値とされる。換言すれば、同じキャピラリ１１９であっても、測定対象のサンプルに標識された蛍光体が異なる場合、異なる蛍光体毎に異なる補正係数が付与される。また、使用される蛍光体が同じであっても、キャピラリ１１９が異なる場合には、異なる補正係数が付与される。なお、補正指数の好適な例は、測定値に対し乗算される補正係数であるが、補正指数は、測定値を目的に従って補正できるものであればよく、その形式は不問である。
　第１の実施の形態における補正係数の演算の方法について、図４を参照して説明する。ここでは、説明の簡略化のため、キャピラリアレイ１０６が４本のキャピラリ１１９－１～４を備えているものとして説明する（図４（ａ））。ただし、この４本という数は一例に過ぎず、他の数とした場合でも下記の説明が同様に適用できることは言うまでもない。図４（ｂ）及び（ｃ）は補正係数の演算の手順を図示したものであり、図４（ｅ）は、補正係数による補正後の蛍光強度の数値例を示している。なお、図４（ｃ）～（ｅ）の表中の数値は、あくまで説明のために記載した仮想の値であり、実際の計測値とは関連は無い。
　分析開始前の波長校正時（図３のステップＳ３００）に、４本のキャピラリ１１９－１～４の各々の信号強度を各蛍光体で測定する。蛍光体としては、一例として、蛍光体Ａ、Ｂ、Ｃの３種類を用いる。なお、波長校正においては、４本のキャピラリ１１９－１～４に同一の条件を与えて計測が行われる。例えば、４本のキャピラリ１１９－１～４に対応する各サンプルチューブには等量のＤＮＡが分注される。この状態では、理想的には波長校正から得られる蛍光強度は、キャピラリ間で差異がないこととなる。しかし、実際には、上述した「構成的ばらつき」が複数のキャピラリ間に存在すること、及びその他の理由から、上記の状況であっても、複数のキャピラリ間で得られる蛍光強度には有意な差異（ばらつき）が見出されることがあり得る。このばらつきを低減するため、第１の実施の形態では、以下の手順により補正係数を演算し、補正指数データベース１０３５に記憶させて、測定値の補正に利用する。
　波長校正時の基準スペクトルデータに色変換を行うと、蛍光体Ａ、Ｂ、Ｃの蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）が各キャピラリ１１９－１～４で得られる（図４（ｂ））。ここでｎとはキャピラリの末尾の番号（１～４）であり、Ｘとは蛍光体の種類（Ａ、Ｂ、Ｃ）である。図４（ｂ）では、３種類の蛍光体Ａ、Ｂ、Ｃの蛍光強度が、４本のキャピラリ１１９－１～４の各々で得られる。例えば、蛍光体Ａを用いた測定では、４本のキャピラリ１１９－１～４について、蛍光強度Ｉｎｔ（１Ａ）、Ｉｎｔ（２Ａ）、Ｉｎｔ（３Ａ）、Ｉｎｔ（４Ａ）が得られる。蛍光体Ｂを用いた測定では、４本のキャピラリ１１９－１～４について、蛍光強度Ｉｎｔ（１Ｂ）、Ｉｎｔ（２Ｂ）、Ｉｎｔ（３Ｂ）、Ｉｎｔ（４Ｂ）が得られる。蛍光体Ｃを用いた測定では、４本のキャピラリ１１９－１～４について、蛍光強度Ｉｎｔ（１Ｃ）、Ｉｎｔ（２Ｃ）、Ｉｎｔ（３Ｃ）、Ｉｎｔ（４Ｃ）が得られる。
　ここで、蛍光体Ａ～Ｃの蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）、Ｉｎｔ（ｎＣ）のうち、最も小さい値のものを、最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）、Ｉｎｔ（ｙＢ）、Ｉｎｔ（ｙＣ）と定義する。図４（ｂ）の例では、蛍光体Ａについては、キャピラリ１１９－４の蛍光強度Ｉｎｔ（４Ａ）＝０．７が最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）であり、蛍光体Ｂについては、キャピラリ１１９－１の蛍光強度Ｉｎｔ（１Ｂ）＝０．６が最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＢ）であり、蛍光体Ｃについては、キャピラリ１１９－２の蛍光強度Ｉｎｔ（２Ｃ）＝０．９が最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＣ）である。
　この第１の実施の形態では、この最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）、Ｉｎｔ（ｙＢ）、Ｉｎｔ（ｙＣ）を基準値として、各測定値をこの基準値で除算することで補正係数ｋ（ｎＸ）を演算する。例えば、蛍光体Ａに対する補正係数ｋ（ｎＡ）をｋ（ｎＡ）＝Ｉｎｔ（ｙＡ）／Ｉｎｔ（ｎＡ）と演算する。蛍光体Ｂに対する補正係数ｋ（ｎＢ）をｋ（ｎＢ）＝Ｉｎｔ（ｙＢ）／Ｉｎｔ（ｎＢ）と演算する。蛍光体Ｃに対する補正係数ｋ（ｎＣ）をｋ（ｎＣ）＝Ｉｎｔ（ｙＣ）／Ｉｎｔ（ｎＣ）と演算する。こうして、複数のキャピラリ１１９－１～４と複数の蛍光体Ａ～Ｃの計１２個の組合せの各々について、補正係数ｋ（ｎＸ）が演算される。
　図４（ｄ）に示すように、最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＸ）に係る補正係数ｋ（ｎＸ）は１．００と一番大きい値となり、一方で、蛍光体Ａ～Ｃの各々に関し、最も高い蛍光強度の組合せに対しては、最も小さい補正係数ｋ（ｎＸ）が与えられる。なお、図４（ｄ）では、補正係数の数値は小数点以下第２位で四捨五入しているが、これに限定されるものではない。得られた補正係数ｋ（ｎＸ）は、補正指数データベース１０３５に記憶される。
　なお、図４（ｃ）、（ｄ）の例では、最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｙＸ）を基準値として補正係数を算出したが、これに限定されるものではなく、例えば、蛍光強度の平均値や最大値、中央値、またはある特定のキャピラリにおける数値を代表で計算に用いても良い。
　キャピラリ１１９－１～４と蛍光体Ａ～Ｃの組合せの各々について補正係数ｋ（ｎＸ）が得られた後、実サンプルを電気泳動して蛍光強度ｆ（ｎＸ）を得る。この蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、図４（ｄ）のように得られた補正係数ｋ（ｎＸ）を乗算することで、図４（ｅ）に示すように、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）を得ることができる。
　補正前の蛍光強度ｆ（ｎＸ）は、同一の蛍光体を用いて同一のサンプルを計測した場合であっても異なるキャピラリ間でバラつきを有するが、図４（ｅ）に示すように、補正係数ｋ（ｎＸ）を乗算することで、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）は、同一の蛍光体については複数のキャピラリ１１９－１～４の間で略同一の値とすることができる。
　なお、補正係数ｋ（ｎＸ）による補正は、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）が互いに略同一となるように設定する必要はない。複数のキャピラリについての信号強度に、補正係数ｋ（ｎＸ）を適用（乗算）した場合に、少なくとも補正後の信号強度の複数キャピラリ間でのばらつきが、補正前のばらつきに比べ低減されるような数値に補正係数ｋ（ｎＸ）が設定されていれば足りる。なお、実サンプルの測定においては、波長校正時に用いた蛍光体と同一の蛍光体を用いるか、少なくとも発光波長帯が共通する蛍光体を用いることが、補正の効果を高める上で好ましい。
　また、上記の実施の形態では、一の装置における波長校正データから得られた補正係数を、同じ装置において測定値の補正に使用していた。これに代えて、ある特定の装置で得られた補正係数を、他の別の装置で得られた実サンプルの測定値の補正に用いるようにすることも可能である。
［実施例］
　本発明の実施の形態の効果を、下記に示すサンプルを用いて実際に確認した。
（サンプル）
　波長校正時の標準品には、PowerPlex(登録商標)4C Matrix Standard(プロメガ社製)を用いた。実サンプルには、プロメガ社から提供されたヒトゲノムＤＮＡを鋳型に、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（商標）１６ＨＳ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）で増幅した産物を用いた。サンプルは共にプロメガ社の推奨する標準プロトコルに従い調製された。なお、本実験では、標準品と実サンプルの双方が４種類の蛍光体（５－ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、ＣＸＲ）で標識されている。
（分析手順）
　キャピラリ型電気泳動においては、一般的に各キャピラリで異なる実サンプルを泳動することが多い。しかし本実験では、本発明の効果を明確にするため、全てのキャピラリに対して同じ実サンプルを等量ずつ分析した。より具体的には、図１に示す構成を有するキャピラリ型電気泳動装置のサンプル容器１１２に、波長校正時の標準品又は実サンプルを等量ずつ配置した。泳動時のキャピラリ長は３６ｃｍ、サンプル注入時の印加電圧は１．６ｋＶ、泳動時の印加電圧は１５ｋＶであった。
　波長校正３００で得られたデータに色変換３１１を施し、上記の方法で補正係数を算出した。次に実サンプルの泳動を行い、前記補正係数の適用前後で、キャピラリ間の蛍光強度差がどのように変化するかを比較した。
（実験結果）
　実験の結果を図５に示す。図５は縦軸が蛍光強度、横軸がキャピラリの末尾番号を示す。図中それぞれのドットが、各増幅産物で観測された蛍光強度を示す。本実験では上記の通り、サンプル容器に等量の実サンプルを配置している。そのため、理想状態にあってはキャピラリ間で蛍光強度は一致する。
　しかし補正前の観測値（左側）からは、キャピラリ間で２倍近い蛍光強度差が確認された。そしてこの蛍光強度差は、補正後の観測値（右側）から判るように、本実施例に従った補正により平準化できることが明示された。
［変形例１］
　次に、第１の実施の形態の変形例１を説明する。第１の実施の形態では、波長校正時（ステップＳ３００）のデータを用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出したが、この変形例１では、任意の濃度既知のサンプルに蛍光体Ｘを標識して電気泳動させ、その結果得られた蛍光強度のデータを用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出する。
　補正係数ｋ（ｎＸ）の算出のために用いる濃度既知のサンプルのＤＮＡの濃度をｃ（ｎＸ）とする。ただしｎはキャピラリ１１９－１～４の末尾の番号であり、Ｘは蛍光体の種類である。またＤＮＡの濃度ｃ（ｎＸ）を複数のキャピラリ間で平均した平均値をａｖｇ（Ｘ）とする。また、複数のキャピラリ間におけるＤＮＡの濃度比ｒ（ｎＸ）をｒ（ｎＸ）＝ａｖｇ（Ｘ）／ｃ（ｎＸ）と定義する。
　複数のキャピラリ１１９の各々において、蛍光体Ｘの蛍光強度がＩｎｔ（ｎＸ）である場合、補正係数ｋ（ｎＸ）は、ｋ（ｎＸ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ）／｛ｒ（ｎＸ）×Ｉｎｔ（ｎＸ）｝と算出することができる。ｙは、第１の実施の形態と同様、蛍光強度が最小となるキャピラリの番号である。
　このようにして補正係数ｋ（ｎＸ）が得られると、実サンプルを計測して得られた蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、この補正係数ｋ（ｎＸ）を乗算することで、第１の実施の形態と同様に補正を実行することができる。なお、上述の変形例１の説明では、濃度ｃ（ｎＸ）の平均値を用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出したが、蛍光強度の最大値や最小値、中央値、又はある特定のキャピラリにおける数値を計算に用いても良い。
［変形例２］
　次に、第１の実施の形態の変形例２を説明する。第１の実施の形態では、波長校正時（ステップＳ３００）のデータを用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出したが、この変形例２では、任意の濃度比既知のサンプルに蛍光体Ｘを標識して電気泳動させ、その結果得られた蛍光強度のデータを用いて補正係数を算出する。
　補正係数ｋ（ｎＸ）の算出のために用いるＤＮＡの濃度比をｒ（ｎＸ）、蛍光体Ｘの蛍光強度をＩｎｔ（Ｘ）とする。ただしｎはキャピラリの末尾番号、Ｘは蛍光体の種類である。補正係数ｋ（ｎＸ）は、ｋ（ｎＸ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ）／｛ｒ（ｎＸ）×Ｉｎｔ（ｎＸ）｝と算出することができる。ｙは、第１の実施の形態と同様、蛍光強度が最小となるキャピラリの番号である。
　このようにして補正係数ｋ（ｎＸ）が得られると、実サンプルを計測して得られた蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、この補正係数ｋ（ｎＸ）を乗算することで、第１の実施の形態と同様に補正を実行することができる。
［変形例３］
　次に、第１の実施の形態の変形例３を説明する。第１の実施の形態では、特定の波長校正時（ステップＳ３００）のデータを用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出したが、この変形例２では、この変形例３では、複数の波長校正データから補正係数を算出する。
　キャピラリの末尾番号をｎ、使用する蛍光体の種類をＸとしてｍ回の波長校正を行う場合、蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）のｍ回の平均値Ａｖｇ（ｎＸ）が得られたとする。得られたｎ個の平均値Ａｖｇ（ｎＸ）のデータから、一番低い蛍光強度が得られたキャピラリ（番号ｙ）を特定し、その平均値Ａｖｇ（ｙＸ）を特定する。これにより、蛍光体Ｘにおける補正係数ｋ（ｎＸ）を、ｋ（ｎＸ）＝Ａｖｇ（ｙＸ）／Ａｖｇ（ｎＸ）と定めることができる。その後、蛍光体Ｘで標識された実サンプルの蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、補正係数ｋ（ｎＸ）を乗じることで補正後の蛍光強度を得ることができる。ここでは平均値を用いて補正係数を算出したが、最大値や最小値、中央値を用いても良い。
［第２の実施の形態］
　次に、図６を参照して、第２の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第２の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第１の実施の形態（図１）と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である（図３）。
　ただし、この第２の実施の形態では、補正係数の演算の手法が第１の実施の形態とは異なっている。具体的には、第１の実施の形態では、同一の蛍光体を用いた場合に複数キャピラリ間で補正後の蛍光強度が略同一となるか、又は少なくともそのばらつきが少なくなるよう、補正係数を算出していた。これに対し、第２の実施の形態では、キャピラリの相違、使用する蛍光体の相違に拘わらず、全ての組合せに関して、補正後の蛍光強度が略同一となるか、又は少なくともそのばらつきが少なくなるよう（有意なばらつきが、無視できるばらつきまで低減されるよう）、補正係数を決定する。この点を図６を参照して説明する。
　図６でも、一例として、キャピラリアレイ１０６が４本のキャピラリ１１９－１～４を備えているものとして説明する（図６（ａ））。図６（ｂ）及び（ｃ）は補正係数の演算の手順を図示したものであり、図６（ｅ）は、補正係数による補正後の蛍光強度の数値例を示している。図４と同様に、図６（ｃ）～（ｅ）の表中の数値は、あくまで説明のために記載した仮想の値であり、実際の計測値とは関連は無い。
　図６（ａ）～図６（ｃ）において、図４と同様に、分析開始前の波長校正時（図３のステップＳ３００）に、４本のキャピラリ１１９－１～４の各々の信号強度を各蛍光体で測定する。ここまでは第１の実施の形態と同様である。
　第２の実施の形態では、４本のキャピラリ１１９－１～４、及び３種類の蛍光体Ａ～Ｃの組合せに関し得られた１２通りの蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）の中で、最も小さい値Ｉｎｔ（ｎ０Ｘ０）を特定する。この図６（ｃ）では、キャピラリ１１９－１において蛍光体Ｂを使用して測定した場合の蛍光強度Ｉｎｔ（１Ｂ）がＩｎｔ（ｎ０Ｘ０）である。ｎ０は蛍光強度が最小となるキャピラリの末尾番号、Ｘ０は当該キャピラリにおいて蛍光強度を最小とする蛍光体の種類を表す。
　　この第２の実施の形態では、この最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｎ０Ｘ０）を基準として、補正係数ｋ（ｎＸ）を、ｋ（ｎＸ）＝Ｉｎｔ（ｎ０Ｘ０）／Ｉｎｔ（ｎＸ）と演算する。すなわち、この第２の実施の形態では、複数キャピラリ間で蛍光強度に差が生じないように補正をするだけでなく、複数通りの蛍光体の間でも蛍光強度に差が生じないように補正し、結果として、複数のキャピラリ及び複数の蛍光体の組合せの間において、蛍光強度が略同一か、少なくとも補正前に比べてバラつきが小さくなるように補正を実行する。
　図６（ｄ）は、このようにして計算された補正係数ｋ（ｎＸ）の一例であって、図６（ｃ）のように得られた蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）により、最低蛍光強度Ｉｎｔ（ｎ０Ｘ０）を除算して得られたものである。この図６（ｄ）の補正係数ｋ（ｎＸ）によれば、例えば蛍光体Ｘで標識された実サンプルの蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、ｋ（ｎＸ）を乗じることで、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）が図６（ｅ）の如く得られる。第１の実施の形態とは異なり、全ての蛍光強度ｆ’（ｎＸ）が、蛍光体の種類、キャピラリの種類に拘わらず０．６で一致している。
［第３の実施の形態］
　次に、図７を参照して、第３の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第３の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第１の実施の形態（図１）と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である（図３）。ただし、この第３の実施の形態では、蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）の実測値を用いて補正係数ｋ（ｎＸ）を算出するのに代えて、蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）の分布に従ったフィッティングカーブに基づいた近似値を求め、この近似値から補正係数ｋ（ｎＸ）を算出する。
　第３の実施の形態における補正係数の演算の方法について、図７を参照して説明する。ここでは、キャピラリアレイ１０６が９６本のキャピラリ１１９－１～９６を備え、２種類の蛍光体Ａ、Ｂを用いた場合を説明する（図７（ａ）、（ｂ））。この９６本という数も一例に過ぎず、他の数が採用可能であることは言うまでもない。図７（ｂ）～（ｅ）は近似値を算出し、更にこの近似値に基づいて補正係数の演算を行う手順を図示したものである。図７（ｆ）は、補正係数による補正後の蛍光強度の数値例を示している。なお、図７（ｃ）～（ｆ）の表中の数値は、あくまで説明のために記載した仮想の値であり、実際の計測値とは関連は無い。
　第１の実施の形態と同様に、波長校正データから蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）を得た後（図７（ｂ））、キャピラリの光源１０７からの距離を横軸とし、縦軸を蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）とした散布図が作成される（図７（ｃ））。得られた散布図のプロットを元に、蛍光体Ａ、Ｂの各々の蛍光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）についてのフィッティングカーブＣａ、Ｃｂが、例えば最小二乗法等を用いて求められる。このフィッティングカーブＣａ、Ｃｂから、蛍光強度の近似値Ｉｎｔ（ｎＸ’）をキャピラリ毎、及び蛍光体毎に算出する（図７（ｄ））。
　末尾番号ｎのキャピラリにおける蛍光体Ｘ（Ａ又はＢ）の近似値Ｉｎｔ（ｎＸ’）が、例えば図７（ｄ）のように得られると、補正係数ｋ（ｎＸ）はｋ（ｎＸ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ’）／Ｉｎｔ（ｎＸ’）と算出することができる（図７（ｅ））。ここで、Ｉｎｔ（ｙＸ’）は、蛍光体Ｘ（Ａ又はＢ）を用いた計測で最も小さい最低近似値を示している。この補正係数ｋ（ｎＸ）を用いることで、実サンプルの実測値ｆ（ｎＸ）の補正を実行することができる（図７（ｆ））。図７の例（図７（ｄ））では、蛍光体Ａ、Ｂの両方について、１番目のキャピラリ１１９－１において、最も小さい近似値Ｉｎｔ（ｙＸ’）が得られる。すなわち、近似値Ｉｎｔ（ｙＡ’）＝Ｉｎｔ（１Ａ’）＝１．１５、Ｉｎｔ（ｙＢ’）＝Ｉｎｔ（１Ｂ’）＝０．６５となる。
［第４の実施の形態］
　次に、図８を参照して、第４の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第４の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第１の実施の形態（図１）と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である（図３）。ただし、この第４の実施の形態では、光検出器１０４での光の検出の手法、及び補正係数の算出方法が前述の実施の形態とは異なっている。
　具体的には、前述の実施の形態では、実サンプルと同じ蛍光体で標識されたサンプルを用いて蛍光強度を計測し、その結果に基づいて補正係数を算出した。これに対し、第４の実施の形態では、複数のキャピラリ１１９に同一の物質（例えば、バッファ、又は他の物質（例えば水））を充填した状態で励起光を照射し、そのラマン光の強度を光検出器１０４により計測して補正係数を算出する。この点を、図８を参照して説明する。ラマン光の強度を測定するためにキャピラリ１１９に充填する物質は、一例としてバッファである。以下ではバッファからのラマン光を測定する場合を主に説明するが、バッファ以外の物質からのラマン光を計測しても同様の効果を得ることができる。
　補正係数を算出する場合には、キャピラリ１１９－１～４にバッファを充填した後、光源１０７から光照射部１０８に向けてレーザ光を照射する。そして、キャピラリ１１９－１～４の各々において、特定の波長Ｘでのラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）を計測する（ｎ＝１～４）。同じバッファがキャピラリ１１９－１～４に供給されているのであれば、理想的な場合には、得られるラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）は複数のキャピラリ間で互いに略等しくなる。しかし、キャピラリ１１９－１～４の構成的ばらつきから、キャピラリ１１９－１～４のラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）に関し有意なばらつきが生じることがあり得る（図４（ｂ）参照）。
　そして、キャピラリ１１９－１～４の各々で得られたラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＸ）のうちで一番信号強度の低いものを、最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＸ）として特定する。図８（ｃ）では、２番目のキャピラリ１１９－２のラマン光強度Ｉｎｔ（２Ｘ）が、Ｉｎｔ（２Ｘ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ）＝１．１と特定される。
　この最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＸ）を基準として、キャピラリ１１９－１～４の各々についての補正係数ｋ（ｎ）を、ｋ（ｎ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ）／Ｉｎｔ（ｎＸ）と計算する（図８（ｄ））。計算された補正係数ｋ（ｎ）は、補正指数データベース１０３５に記憶される。
　このようにして補正係数ｋ（ｎ）が得られた後、分析したいサンプル（以下、「実サンプル」という）を泳動して蛍光強度ｆ（ｎＸ）を得る。この蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、図８（ｄ）のように得られた補正係数ｋ（ｎ）を乗算することで、図８（ｅ）に示すように、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）を得ることができる。補正前の蛍光強度ｆ（ｎＸ）は、同一の蛍光体を用いて同一のサンプルを計測した場合であってもバラつきを有するが、図８（ｅ）に示すように、補正係数ｋ（ｎ）を乗算することで、補正後の蛍光強度ｆ’（ｎＸ）は、複数のキャピラリ１１９－１～４の間で略同一の値とすることができる。すなわち、キャピラリ間の構成的ばらつきによらず、キャピラリ間で同一条件下で略同一の蛍光強度を得ることができる。
［第５の実施の形態］
　次に、図９を参照して、第５の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。この第５の実施の形態は、第４の実施の形態と同様に、ラマン光強度に基づいて補正係数を算出するよう構成されている。第５の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第１の実施の形態（図１）と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である（図３）。第４の実施の形態では、バッファのラマン光の信号強度分布のピークの位置における信号強度を用いて補正係数を算出したが、第５の実施の形態では、バッファのラマン光の信号強度分布に含まれる複数の波長における信号強度を用いて補正係数を算出する。これを図９を参照して説明する。
　図９でも、一例として、キャピラリアレイ１０６が４本のキャピラリ１１９－１～４を備えているものとして説明する（図９（ａ））。図９（ｂ）～（ｄ）は補正係数の演算の手順を図示したものである。
　補正係数を演算する場合には、第４の実施の形態と同様に、キャピラリ１１９－１～４にバッファを充填した後、光源１０７から光照射部１０８に向けてレーザ光を照射する。すると、例えば図９（ｂ）に示す如く、バッファからのラマン光の強度分布Ｐ３は、蛍光体の発する蛍光の強度分布Ｐ１、Ｐ２に比べて広い波長範囲の分布となる。
　この第５の実施の形態では、キャピラリ１１９－１～４の各々において、バッファのラマン光強度分布のＰ３の波長λａ、λｂにおけるラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）を計測する（ｎ＝１～４）。この波長λａ、λｂは、実サンプルを標識する蛍光体Ａ、Ｂの蛍光波長である。図９（ｂ）のように、バッファからのラマン光強度分布Ｐ３が、実サンプルを標識する蛍光体の蛍光波長λａ、λｂと重なる場合には、その蛍光波長λａ、λｂにおけるバッファのラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）（ｎ＝１～４）を計測し、そのラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）に基づいて補正係数ｋ（ｎＡ）、ｋ（ｎＢ）を計算する。これにより、実サンプルの蛍光強度の補正をより正確に実行することができる。
　ラマン光強度Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）（ｎ＝１～４）が、キャピラリ１１９－１～４の各々について計算されると、次に、Ｉｎｔ（ｎＡ）、Ｉｎｔ（ｎＢ）のうちで、最も小さい値のものを、最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）、Ｉｎｔ（ｙＢ）として定義する。図９（ｃ）の例では、蛍光体Ａについては、キャピラリ１１９－２のラマン光強度Ｉｎｔ（２Ａ）が最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）であり、蛍光体Ｂについては、キャピラリ１１９－１のラマン光強度Ｉｎｔ（１Ｂ）が最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＢ）である。
　この最低ラマン光強度Ｉｎｔ（ｙＡ）、Ｉｎｔ（ｙＢ）を基準として、補正係数ｋ（ｎＡ）、ｋ（ｎＢ）が、ｋ（ｎＡ）＝Ｉｎｔ（ｙＡ）／Ｉｎｔ（ｎＡ）、ｋ（ｎＢ）＝Ｉｎｔ（ｙＢ）／Ｉｎｔ（ｎＢ）として計算される。このようにして得られた補正係数ｋ（ｎＡ）、ｋ（ｎＢ）が、蛍光体Ｘで標識された実サンプルの蛍光強度ｆ（ｎＸ）に乗算されることで、蛍光体Ａ、Ｂの蛍光強度が適切に補正される。
［第６の実施の形態］
　次に、図１０を参照して、第６の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第１の実施の形態では、実サンプルの電気泳動とは別個の電気泳動で得られた蛍光強度に基づいて補正係数を算出したが（例えば、図２のステップＳ３００）、この第６の実施の形態の装置は、実サンプルの電気泳動で得られた蛍光強度から補正係数を算出するように構成されている。以下、この点を図１０を参照して説明する。
　図１０では、説明の簡略化のため、キャピラリアレイ１０６が４本のキャピラリ１１９－１～４を備えているものとして説明する（図１０（ａ））。図１０（ｂ）～（ｄ）は補正係数の演算の手順を図示したものであり、図１０（ｅ）は、補正係数による補正後の蛍光強度の数値例を示している。なお、図１０（ｃ）～（ｅ）の表中の数値は、あくまで説明のために記載した仮想の値であり、実際の計測値とは関連は無い。
　初めに、実サンプルの標識に使われる蛍光体と同じ蛍光体で標識された標準品を、実サンプルと混交する。このような標準品が混交された実サンプルを電気泳動して、実サンプルの蛍光強度を通常通り測定する一方で、標準品の蛍光強度も、同じプロセスの中において測定する。この時標準品は、泳動データの上で時間的又は空間的に実サンプルと区別可能でなければならない。例えば、図１０（ｂ）に示すように、実サンプルの蛍光強度のピークＴ１が、標準品の蛍光強度のピークＲと時間的に異なるよう、標準品を実サンプル中に混交し、泳動制御を実行する必要がある。
　色変換（図２のステップＳ３１０に相当）後、観測された標準品の蛍光強度をＩｎｔｒ（ｎＸ）とする。但しｎはキャピラリの番号、Ｘは蛍光体の種類である。得られた４個の標準品の蛍光強度Ｉｎｔｒ（１Ｘ）、Ｉｎｔｒ（２Ｘ）、Ｉｎｔｒ（３Ｘ）、Ｉｎｔｒ（４Ｘ）のうち、最も小さい値のものを、最低蛍光強度Ｉｎｔｒ（ｙＸ）と定義する。図１０（ｃ）の例では、キャピラリ１１９－３の蛍光強度Ｉｎｔｒ（３Ｘ）が最低蛍光強度Ｉｎｔｒ（ｙＸ）である。
　最低蛍光強度が得られたら、上記の実施の形態と同様に、補正係数ｋ（ｎＸ）を、ｋ（ｎＸ）＝Ｉｎｔ（ｙＸ）／Ｉｎｔ（ｎＸ）として計算する。なお、上記の実施の形態と同様に、最小値(最低蛍光強度)を用いて算出するのに代えて、蛍光強度の平均値や最大値、中央値を用いることも可能である。この補正係数を用いて、他の実施の形態と同様にして、実サンプルの蛍光強度ｆ（ｎＸ）に、ｋ（ｎＸ）を乗じることで各蛍光体間の強度差を補正することができる。
　本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。また、上記の各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。
　１０１…装置本体、　１０２…制御用コンピュータ、　１０３…演算制御回路、　１０４…光検出器、　１０５…恒温槽、　１０６…キャピラリアレイ、　１０７…光源、　１０８…光照射部、　１０９…ロードヘッダ、　１１０…キャピラリ陰極端、　１１１…陰極用バッファ容器、　１１２…サンプル容器、　１１３…ポリマカートリッジ、　１１４…陽極用バッファ容器、　１１５…陽極、　１１６…直流電源、　１１７…アレイヘッダ、　１１８…搬送機、　１１９…キャピラリ、　１２０…シリンジ機構、　１２１…尖部、　１２２…ポリマカートリッジ上部、　１２３…加熱冷却機構、　２０１…レーザ光、　２０２…反射ミラー、　２０３…集光レンズ。

Claims (20)

  1. 　複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、
    　前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、
    　前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、
    　前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出する演算制御部と
    を備え、
    　前記演算制御部は、
    　前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体との組み合わせ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成された、マルチキャピラリ電気泳動装置。
  2. 　前記演算制御部は、実サンプルを計測して得られた信号強度に前記補正指数を適用した場合に、前記補正指数の適用後の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきが、前記補正指数の適用前の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきに比べて低減するよう前記補正指数を設定する、請求項１に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  3. 　前記演算制御部は、
    　前記複数のキャピラリのいずれかと、複数種類の蛍光体のいずれかの組み合わせ毎に定められた補正指数に基づいて、前記信号強度を補正する、請求項１に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  4. 　前記補正指数を演算する補正指数演算部を更に備え、
    　前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリに同一の条件を与えて前記複数のキャピラリ内のサンプルからの蛍光を測定して得られた信号強度に基づき、前記補正指数を演算する、請求項１に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  5. 　前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリのうちの１つで得られた信号強度を基準値とし、前記複数のキャピラリの各々で得られた信号強度の値を、前記基準値で除算した値を前記補正指数として算出する、請求項４に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  6. 　前記補正指数演算部は、前記信号強度の近似値を、前記信号強度の分布のフィッティングカーブに基づいて算出し、前記近似値に基づいて前記補正指数を演算する、請求項４に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  7. 　前記補正指数演算部は、実サンプルを標識する蛍光体と同一の蛍光体で標識された既知のサンプルを前記複数のキャピラリにおいて電気泳動させて得られた蛍光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する、請求項４に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  8. 　複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、
    　前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、
    　前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、
    　前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出すると共に、前記複数のキャピラリ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成された演算制御部と、
    　前記補正指数を演算する補正指数演算部と
    を備え、
    　前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリに励起光を照射してラマン光を計測し、そのラマン光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する、マルチキャピラリ電気泳動装置。
  9. 　前記補正指数演算部は、前記ラマン光の信号強度分布に含まれる特定波長における信号強度を用いて前記補正指数を算出する、請求項８に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  10. 　前記特定波長は、実サンプルを標識する複数種類の蛍光体の蛍光波長である、請求項９に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
  11. 　複数のキャピラリを備えたマルチキャピラリ電気泳動装置を用いてサンプルを分析するサンプル分析方法において、
    　複数のキャピラリを介して前記サンプルを電気泳動させるステップと、
    　前記複数のキャピラリに励起光を照射することで発生する蛍光を光検出器を用いて検出するステップと、
    　前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出するステップと
    　前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体の組み合わせごとに定められた補正指数に従い、前記蛍光の信号強度を補正するステップと
    を備えることを特徴とするサンプル分析方法。
  12. 　実サンプルを計測して得られた信号強度に前記補正指数を適用した場合に、前記補正指数の適用後の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきが、前記補正指数の適用前の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきに比べて低減するよう前記補正指数が設定される、請求項１１に記載のサンプル分析方法。
  13. 　前記複数のキャピラリのいずれかと、複数種類の蛍光体のいずれかの組み合わせ毎に前記補正指数が定められる、請求項１１に記載のサンプル分析方法。
  14. 　前記補正指数を演算するステップを更に備え、
    　前記補正指数を演算するステップは、前記複数のキャピラリに同一の条件を与えて前記複数のキャピラリ内のサンプルからの蛍光を測定して得られた信号強度に基づき、前記補正指数を演算する、請求項１１に記載のサンプル分析方法。
  15. 　前記補正指数を演算するステップは、前記複数のキャピラリのうちの１つで得られた信号強度を基準値とし、前記複数のキャピラリの各々で得られた信号強度の値を、前記基準値で除算した値を前記補正指数として算出する、請求項１４に記載のサンプル分析方法。
  16. 　前記補正指数を演算するステップは、前記信号強度の近似値を、前記信号強度の分布のフィッティングカーブに基づいて算出し、前記近似値に基づいて前記補正指数を演算する、請求項１４に記載のサンプル分析方法。
  17. 　前記補正指数を演算するステップは、実サンプルを標識する蛍光体と同一の蛍光体で標識された既知のサンプルを前記複数のキャピラリにおいて電気泳動させて得られた蛍光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する、請求項１４に記載のサンプル分析方法。
  18. 　複数のキャピラリを備えたマルチキャピラリ電気泳動装置を用いてサンプルを分析するサンプル分析方法において、
    　複数のキャピラリを介して前記サンプルを電気泳動させるステップと、
    　前記複数のキャピラリに励起光を照射することで発生する蛍光を光検出器を用いて検出するステップと、
    　前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出するステップと、
    　前記複数のキャピラリに励起光を照射してラマン光を計測し、そのラマン光の信号強度に基づいて補正指数を演算するステップと、
    　前記補正指数に従って前記蛍光の信号強度を補正するステップと
    　を備えたことを特徴とする、サンプル分析方法。
  19. 　前記補正指数を演算するステップは、前記ラマン光の信号強度分布に含まれる特定波長における信号強度を用いて前記補正指数を算出する、請求項１８に記載のサンプル分析方法。
  20. 　前記特定波長は、実サンプルを標識する複数種類の蛍光体の蛍光波長である、請求項１９に記載のサンプル分析方法。
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