CN113939733B - 多毛细管电泳装置、及样品分析方法 - Google Patents

多毛细管电泳装置、及样品分析方法 Download PDF

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Abstract

该多毛细管电泳装置具有：毛细管阵列，其排列多个毛细管而构成；光源，其对所述多个毛细管照射激发光；光检测器，其检测来自所述毛细管内的样品的荧光；以及运算控制部，其按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度。该运算控制部构成为，按照针对所述多个毛细管中的任一个与标识所述样品的荧光体的组合而确定出的校正指数，校正所述信号强度。

Description

多毛细管电泳装置、及样品分析方法
技术领域
本发明涉及多毛细管电泳装置、及样品分析方法。
背景技术
作为分析DNA的碱基序列或碱基长度的方法，电泳法广为人知。另外，作为电泳法的1种，有在毛细管(capillary)内进行电泳的毛细管电泳法。在该毛细管电泳法中，对填充了分离介质的毛细管注入包含DNA的样品，在该状态下对毛细管的两端施加高电压。此时，作为带负电的带电粒子的DNA依赖于自身的大小而在毛细管内向阳极侧移动，结果在毛细管内产生按照分子量的条带(band)。对各DNA进行荧光标识，通过激发光的照射而发出荧光。有时也使用多种荧光色素。通过对该荧光进行检测来决定DNA的碱基序列、碱基长度。
在分析时，出于实现其迅速化的目的，有时使用在1个电泳装置内排列了多个毛细管的毛细管阵列。这样的电泳装置也称为多毛细管阵列电泳装置，也将多个毛细管的排列称为毛细管阵列。
作为针对这样的毛细管阵列的光照射方法，有从毛细管阵列的一端或两端以激发光(例如激光光束)通过多个毛细管的方式进行照射并检测荧光的检测方法。在该情况下，激光光束依次通过排列的多个毛细管。在激光光束通过某毛细管时，激光光束在折射率不同的物质(例如毛细管的材质和空气)的边界面散射，激光光束衰减。因此，照射到多个毛细管中的靠近光源的毛细管的激光光束的强度最大，照射到远的毛细管的激光光束的强度弱。因此，在各毛细管检测的荧光强度也依赖于距光源的距离而变化。
在这样的多毛细管型电泳装置中，即使在各毛细管中分析等量的DNA，通过毛细管得到的荧光强度也不同。以下，将即使分析等量的DNA也产生的毛细管间的荧光强度差表现为“结构性偏差”。
该结构性偏差使通过分析得到的荧光强度在多个毛细管间的定量比较变得困难。为了应对该问题，在专利文献1中，采用了按毛细管使光的累计时间变化的方法。另外，在专利文献2中，提出了使用内部标准试样来校正荧光强度的方法。
但是，根据专利文献1和2的方法，也难以进行荧光强度在多个毛细管间的准确的定量比较。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-168138号公报
专利文献2：日本特开2016-176764号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述课题而完成的，其目的在于提供一种能够进行多个毛细管间的定量比较的多毛细管电泳装置以及样品分析法。
用于解决课题的手段
本发明的一方式的多毛细管电泳装置具有：毛细管阵列，其排列多个毛细管而构成；光源，其对所述多个毛细管照射激发光；光检测器，其检测来自所述毛细管内的样品的荧光；以及运算控制部，其按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度。该运算控制部构成为按照针对所述多个毛细管中的任一个与标识所述样品的荧光体的组合而确定的校正指数，校正所述信号强度。
另外，本发明的其他方式的多毛细管阵列电泳装置具有：毛细管阵列，其排列多个毛细管而构成；光源，其对所述多个毛细管照射激发光；光检测器，其检测来自所述毛细管内的样品的荧光；运算控制部，其构成为按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度，并且按照针对所述多个毛细管确定的校正指数来校正所述信号强度；以及校正指数运算部，其运算所述校正指数。所述校正指数运算部对所述多个毛细管照射激发光而测量拉曼光，根据该拉曼光的信号强度来运算所述校正指数。
另外，本发明的一方式的样品分析方法使用具有多个毛细管的多毛细管电泳装置对样品进行分析，具有：经由多个毛细管使所述样品电泳的步骤；使用光检测器检测对所述多个毛细管照射激发光而产生的荧光的步骤；按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度的步骤；以及按照针对所述多个毛细管中的任一个和标识所述样品的荧光体的组合而确定的校正指数，校正所述荧光的信号强度的步骤。
另外，本发明的其他方式的样品分析方法使用具有多个毛细管的多毛细管电泳装置对样品进行分析，具有：经由多个毛细管使所述样品电泳的步骤；使用光检测器检测对所述多个毛细管照射激发光而产生的荧光的步骤；按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度的步骤；对所述多个毛细管照射激发光而测量拉曼光，根据该拉曼光的信号强度来运算所述校正指数的步骤；以及按照所述校正指数校正所述荧光的信号强度的步骤。
发明效果
根据本发明，能够提供可以进行多个毛细管间的定量比较的多毛细管电泳装置以及样品分析法。
附图说明
图1是说明第一实施方式的多毛细管电泳装置的结构的概略图。
图2是更详细地说明光照射部108的结构的结构图。
图3是说明第一实施方式的多毛细管电泳装置中的样品的分析过程的流程图。
图4是说明第一实施方式中的校正系数的运算方法的概略图。
图5是表示实验的结果的图表。
图6是说明第二实施方式的概略图。
图7是说明第三实施方式的概略图。
图8是说明第四实施方式的概略图。
图9是说明第五实施方式的概略图。
图10是说明第六实施方式的概略图。
具体实施方式
以下，参照附图对本实施方式进行说明。在附图中，功能上相同的要素有时也以相同的编号进行显示。此外，附图示出了遵循本公开的原理的实施方式和安装例，但这些是理解本公开用的，决不用于限定性地解释本公开。本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上都不限定本公开的技术方案或应用例。
在本实施方式中，本领域技术人员为了实施本公开而充分详细地进行了说明，但需要理解的是，其他的安装和形态也是可能的，能够在不脱离本公开的技术思想的范围和精神的情况下进行结构和构造的变更、多样的要素的置换。因此，不能将以后的记述限定于此进行解释。
[第一实施方式]
首先，参照图1的概略图，对第一实施方式的多毛细管电泳装置的结构进行说明。该多毛细管电泳装置1具有装置主体101和控制用计算机102。
装置主体101通过通信电缆与控制用计算机102连接，操作员操作控制用计算机102来控制装置主体101所具有的各部，在控制用计算机102中接收由光检测器104检测的数据。控制用计算机102具有：作为数据显示画面的显示器，其用于显示授受的数据。此外，控制用计算机102也可以内置于装置主体101。
装置主体101还具有：运算控制电路103、光检测器104、恒温槽105、毛细管阵列106、光源107、以及光照射部108。
运算控制电路103根据光检测器104的检测信号执行测定值(荧光强度)的运算处理，并且对测定值(荧光强度)执行校正。另外，运算控制电路103按照来自控制用计算机102的输入、命令来控制装置主体101。光检测器104是对因作为从光源107照射到毛细管阵列106的激发光的激光光束而产生的荧光进行检测的光传感器。作为光源107能够适当使用液体激光器、气体激光器、半导体激光器，也能够用LED代替。并且，光源107也可以从毛细管阵列106的排列的两侧照射激发光，另外，也可以构成为分时地照射激发光。
恒温槽105是用于控制毛细管阵列106的温度的温度控制机构。恒温槽105为了在槽内将温度保持为恒定而被绝热材料覆盖，通过加热冷却机构123控制温度。由此，将毛细管阵列106的大部分的温度维持为例如60℃左右的恒定温度。
排列多根(在图1的例子中为4根)毛细管119而构成毛细管阵列106。毛细管阵列106能够构成为，在确认到破损、品质的劣化的情况下，能够适当更换为新品的更换部件。另外，毛细管阵列106能够根据测定而置换为具有不同根数、长度的毛细管的其他多毛细管阵列。
构成毛细管阵列106的多个毛细管119分别能够由内径数十～数百μm、外径数百μm的玻璃管构成。另外，为了提高强度，玻璃管的表面能够被聚酰亚胺覆膜覆盖。但是，在照射激光光束的部位及其附近，除去毛细管119的表面的聚酰亚胺覆膜。在毛细管119的内部填充有用于分离生物体试样(样品)中的DNA分子的分离介质。分离介质例如是从各公司作为电泳用而市售的聚丙烯酰胺系分离凝胶(以下称为聚合物)。
在毛细管阵列106的一部分配置有光照射部108。如后所述，光照射部108构成为使来自光源107的激光光束(激发光)共同入射到多个毛细管119，能够将从多个毛细管119发出的荧光导光至光检测器104。具体而言，为了对设置于毛细管阵列106的光照射部位照射作为测定光的激光光束，光照射部108具有光纤、透镜等投光光学系统。
装置主体101还具有：装载头109、阴极用缓冲容器111、样品容器112、聚合物盒113、阳极用缓冲容器114、阵列头117以及输送机118。
在毛细管阵列106的一端设置有装载头109。装载头109作为被施加用于向毛细管119内导入生物体试样(样品)的负电压的电极(阴极)而发挥功能。在毛细管阵列106的另一端设置有阵列头117，阵列头117将多根毛细管119捆扎成1束。另外，阵列头117在其下表面具有用于插入到聚合物盒113的尖部121。
另外，输送机118构成为在其上表面载置且输送阴极用缓冲容器111、样品容器112、聚合物盒113以及阳极用缓冲容器114。作为一例，输送机118具有3个电动马达和线性致动器，能够在上下、左右、前后这3个轴方向上移动。阴极用缓冲容器111和阳极用缓冲容器114是保持泳动用的缓冲的容器，样品容器112是保持测定对象的试样(样品)的容器。
另外，聚合物盒113是保持泳动用的聚合物的容器。聚合物盒113的上部122由橡胶、硅等可塑性高的材料密闭，与用于填充聚合物的注射机构120及输送机118连结。在阳极用缓冲容器114中，以与缓冲器接触的方式配置有施加泳动用的正电压的阳极115。在阳极115与作为阴极的装载头109之间连接有直流电源116。
输送机118将阴极用缓冲容器111及样品容器112输送至毛细管119的阴极端110。此时，阳极用缓冲容器114连动地移动到与毛细管119的阳极端接触的尖部121。样品容器112内置与毛细管119相同数量的样品管。操作员对样品管分注DNA。
运算控制电路103还具有：测定值运算部1032、校正指数运算部1033、校正部1034以及校正指数数据库1035。
测定值运算部1032根据光检测器104的检测信号来运算测定值(荧光强度)。校正指数运算部1033运算用于对由测定值运算部1032运算出的测定值进行校正的校正指数。另外，校正部1034运算对测定值运算部1032的测定值应用校正指数而进行了校正的测定值。校正指数数据库1035是存储这样运算出的校正指数的数据库。
从聚合物盒113向毛细管119内填充聚合物时的过程如下。
(1)输送机118进行动作，阵列头117移动到聚合物盒113的上侧。
(2)阵列头117的尖部121贯通聚合物盒113的上部122。此时，可塑性高的聚合物盒113的上部122包入阵列头117的尖部121，由此，两者紧密接触，聚合物盒113与毛细管119以密闭状态连结。
(3)注射机构120将聚合物盒113内部的聚合物上推，将聚合物注入到毛细管119中。
参照图2，更详细地对光照射部108的结构进行说明。作为一例，光照射部108由多个反射镜202以及聚光透镜203构成。反射镜202是用于使来自光源107的激光光束的行进方向变化的反射部件。另外，聚光透镜203将激光光束聚光于毛细管阵列106的光照射部位。此外，能够适当设置滤光器、偏振片、波长板等其他光学元件，在此为了简化，省略图示。
从光源107发出的激光光束201通过反射镜202改变行进方向，由聚光透镜203聚光后，照射到多个毛细管119。激光光束201依次入射到多个毛细管119。用光检测器104观测因该激光光束201的入射而发出的荧光的荧光强度，由此，能够执行样品中的DNA的分析。
以下，参照图3的流程图，对第一实施方式的多毛细管电泳装置中的样品的分析的过程进行说明。
首先，在步骤S300中，在对想要分析的样品(以下，称为“实际样品”)进行分析之前，进行光源107发出的激光光束的波长校准。在波长校准中，使与标识于实际样品的荧光体相同的荧光体所标识的已知的DNA样品(以下，称为“标准品”)电泳，取得成为基准的波长光谱数据。本作业在伴随劣化、长度变更的毛细管阵列106的更换时必须执行。
接着，作为事先准备(消耗品导入)，操作员将阴极用缓冲容器111、样品容器112、聚合物盒113、阳极用缓冲容器114设置于输送机118(步骤S301)。之后，通过基于操作员的来自控制用计算机102的命令，开始分析(步骤S302)。
在开始分析时，首先使输送机118动作，将聚合物盒113运送到阵列头117的尖部121(步骤S303)。此时，毛细管阴极端110与阴极用缓冲容器111所包含的阴极用缓冲器接触。之后，通过注射机构120对毛细管阵列106注入聚合物(步骤S304)。同时，在过去的泳动中使用的旧的聚合物被从毛细管119废弃到阴极用缓冲容器111。此外，从聚合物盒113注入到毛细管119中的聚合物的量由控制用计算机102指定，该指定的量的聚合物由注射机构120注入。
在聚合物的填充完成时，接着开始预备泳动(步骤S305)。先于本来的分析工序执行预备泳动，为了使毛细管119内的聚合物成为与分析相适合的状态而执行预备泳动。通常，在阳极115与装载头109之间以数～数十分钟施加数～数十kV左右的电压来执行预备泳动。
预备泳动结束后，用阴极用缓冲容器111清洗毛细管阴极端110(步骤S306)。接着，向毛细管阴极端110输送样品容器112(步骤S307)。该状态下，在对毛细管阴极端110施加数kV左右的电压时，在样品液与尖部121之间产生电场，样品容器112中的样品被导入到毛细管119内(步骤S308)。样品导入后，再次用阴极用缓冲容器111清洗毛细管阴极端110。
然后，施加预定的电压而开始样品的电泳(步骤S309)。所谓电泳是指通过在阴极和阳极缓冲器间产生的电场作用，对毛细管119中的样品赋予迁移率，通过依赖于样品的性质的迁移率之差对样品进行分离。在此，以样品为DNA的情况为例进行说明。
DNA通过相当于双螺旋的骨架的磷酸二酯键，在分离介质(聚合物)中具有负电荷。因此，在DNA电场中向阳极侧移动。此时，分离介质(聚合物)具有网眼状结构，因此，DNA的迁移率依赖于网眼的渗透容易度，换言之依赖于DNA的尺寸。碱基长度短的DNA容易穿过网眼状结构，迁移率也变高，碱基长度长的DNA与其相反。
由于对DNA预先标识了荧光物质(荧光体)，因此从碱基长度短的DNA起依次由光照射部108进行光学检测。通常，与泳动时间最长的样品匹配地设定测定时间和电压施加时间。将检测出的荧光与通过波长校准300得到的基准光谱进行对照，进行荧光体的识别。将该工序称为颜色转换(步骤S310)。从电压施加开始起经过了预定时间后，在数据取得后停止电压施加，结束分析(步骤S311)。以上是基本的电泳分析的过程。这样，在运算控制电路103的测定值运算部1032中，按毛细管119得到荧光强度的值作为测定值。
接着，参照图4的示意图，说明在第一实施方式中对得到的测定值(荧光强度)进行校正的过程的概略。如上所述，在该第一实施方式中，针对得到的测定值，作为校正指数的一例，取得与测定值相乘的“校正系数”，应用该校正系数来校正测定值。在此取得的校正系数为按多个毛细管119和多个荧光体的组合不同的值。换言之，即使是相同的毛细管119，在标识于测定对象的样品的荧光体不同的情况下，按不同的荧光体赋予不同的校正系数。另外，即使使用的荧光体相同，在毛细管119不同的情况下，也赋予不同的校正系数。此外，校正指数的优选的例子是与测定值相乘的校正系数，但校正指数只要是能够按照目的对测定值进行校正的系数即可，其形式不限。
参照图4对第一实施方式中的校正系数的运算方法进行说明。在此，为了简化说明，设为毛细管阵列106具有4根毛细管119-1～4来进行说明(图4的(a))。但是，该4根这样的数量只不过是一例，即使在设为其他数量的情况下，当然也能够同样地应用下述的说明。图4的(b)和(c)图示了校正系数的运算的过程，图4的(e)示出了基于校正系数的校正后的荧光强度的数值例。此外，图4的(c)～(e)的表中的数值只不过是为了说明而记载的假想的值，与实际的测量值没有关联。
在分析开始前的波长校准时(图3的步骤S300)，通过各荧光体测定4根毛细管119-1～4各自的信号强度。作为荧光体，作为一例，使用荧光体A、B、C这3种。此外，在波长校准中，对4根毛细管119-1～4赋予相同的条件来进行测量。例如，对与4根毛细管119-1～4对应的各样品管分注等量的DNA。该状态下，理想的是从波长校准得到的荧光强度在毛细管间没有差异。但是，实际上，因在多个毛细管间存在上述的“结构性偏差”以及其他理由，即使是上述的状况，在多个毛细管间得到的荧光强度也可能发现有意义的差异(偏差)。为了降低该偏差，在第一实施方式中，通过以下的过程来运算校正系数，并存储到校正指数数据库1035中，用于测定值的校正。
在对波长校准时的基准光谱数据进行颜色转换时，荧光体A、B、C的荧光强度Int(nX)在各毛细管119-1～4中得到(图4的(b))。在此，n是毛细管的末尾的编号(1～4)，X是荧光体的种类(A、B、C)。在图4的(b)中，3种荧光体A、B、C的荧光强度分别在4根毛细管119-1～4中得到。例如，在使用了荧光体A的测定中，针对4根毛细管119-1～4，得到荧光强度Int(1A)、Int(2A)、Int(3A)、Int(4A)。在使用了荧光体B的测定中，针对4根毛细管119-1～4，得到荧光强度Int(1B)、Int(2B)、Int(3B)、Int(4B)。在使用了荧光体C的测定中，针对4根毛细管119-1～4，得到荧光强度Int(1C)、Int(2C)、Int(3C)、Int(4C)。
在此，将荧光体A～C的荧光强度Int(nA)、Int(nB)、Int(nC)中的最小值的荧光强度定义为最低荧光强度Int(yA)、Int(yB)、Int(yC)。在图4的(b)的例子中，关于荧光体A，毛细管119-4的荧光强度Int(4A)＝0.7为最低荧光强度Int(yA)，关于荧光体B，毛细管119-1的荧光强度Int(1B)＝0.6为最低荧光强度Int(yB)，关于荧光体C，毛细管119-2的荧光强度Int(2C)＝0.9为最低荧光强度Int(yC)。
在该第一实施方式中，将该最低荧光强度Int(yA)、Int(yB)、Int(yC)作为基准值，通过将各测定值除以该基准值来运算校正系数k(nX)。例如，将相对于荧光体A的校正系数k(nA)运算为k(nA)＝Int(yA)/Int(nA)。将相对于荧光体B的校正系数k(nB)运算为k(nB)＝Int(yB)/Int(nB)。将相对于荧光体C的校正系数k(nC)运算为k(nC)＝Int(yC)/Int(nC)。这样，针对多个毛细管119-1～4和多个荧光体A～C共计12个的组合的每一个，运算校正系数k(nX)。
如图4的(d)所示，最低荧光强度Int(yX)的校正系数k(nX)为1.00时是最大的值，另一方面，关于荧光体A～C的每一个，针对最高的荧光强度的组合赋予最小的校正系数k(nX)。此外，在图4的(d)中，校正系数的数值在小数点以后第二位四舍五入，但并不限定于此。得到的校正系数k(nX)存储在校正指数数据库1035中。
此外，在图4的(c)、(d)的例子中，以最低荧光强度Int(yX)为基准值来计算校正系数，但并不限定于此，例如，也可以以荧光强度的平均值、最大值、中央值、或者某特定的毛细管中的数值为代表，用于计算。
针对毛细管119-1～4和荧光体A～C的组合的每一个得到校正系数k(nX)后，对实际样品进行电泳而得到荧光强度f(nX)。通过对该荧光强度f(nX)乘以如图4的(d)那样得到的校正系数k(nX)，如图4的(e)所示，能够得到校正后的荧光强度f’(nX)。
校正前的荧光强度f(nX)即使在使用同一荧光体测量了同一样品的情况下，在不同的毛细管间也具有偏差，但如图4的(e)所示，通过乘以校正系数k(nX)，校正后的荧光强度f’(nX)针对同一荧光体能够在多个毛细管119-1～4之间设为大致相同的值。
此外，基于校正系数k(nX)的校正不需要设定为校正后的荧光强度f’(nX)彼此大致相同。在对多个毛细管的信号强度应用(乘以)了校正系数k(nX)的情况下，只要将校正系数k(nX)设定为至少校正后的信号强度的多个毛细管间的偏差与校正前的偏差相比减少那样的数值即可。此外，在实际样品的测定中，在提高校正的效果的方面，优选使用与波长校准时使用的荧光体相同的荧光体，或使用至少发光波段共通的荧光体。
另外，在上述的实施方式中，将从一个装置中的波长校准数据得到的校正系数在相同的装置中用于测定值的校正。取而代之，也能够将在某特定的装置中得到的校正系数用于在另外其他的装置中得到的实际样品的测定值的校正。
[实施例]
使用下述所示的样品实际确认了本发明的实施方式的效果。
(样品)
在波长校准时的标准品中使用了PowerPlex(注册商标)4C Matrix Standard(Promega公司制)。在实际样品中使用了以由Promega公司提供的人基因组DNA为模板，通过PowerPlex(商标)16HS System(Promega公司制)扩增的产物。样品都按照Promega公司推荐的标准协议进行制备。此外，在本实验中，标准品和实际样品双方通过4种荧光体(5-FAM、JOE、TMR、CXR)进行标识。
(分析过程)
在毛细管型电泳中，一般情况下在各毛细管中使不同的实际样品泳动的情况较多。但是，在本实验中，为了明确本发明的效果，针对所有毛细管等量地分析了相同的实际样品。更具体而言，在具有图1所示的结构的毛细管型电泳装置的样品容器112中，等量地配置了波长校准时的标准品或实际样品。泳动时的毛细管长度为36cm，样品注入时的施加电压为1.6kV，泳动时的施加电压为15kV。
对通过波长校准300得到的数据实施颜色转换311，通过上述的方法计算出校正系数。接着，进行实际样品的泳动，对在所述校正系数的应用前后，毛细管间的荧光强度差如何变化进行比较。
(实验结果)
图5表示实验的结果。图5的纵轴表示荧光强度，横轴表示毛细管的末尾编号。图中各点表示在各扩增产物中观测到的荧光强度。在本实验中，如上所述，在样品容器中配置等量的实际样品。因此，在理想状态下，在毛细管间荧光强度一致。
但是，根据校正前的观测值(左侧)，在毛细管间确认到接近2倍的荧光强度差。并且，明确了由校正后的观测值(右侧)可知，该荧光强度差能够通过按照本实施例的校正而均衡化。
[变形例1]
接着，对第一实施方式的变形例1进行说明。在第一实施方式中，使用波长校准时(步骤S300)的数据来计算校正系数k(nX)，但在该变形例1中，对任意的浓度已知的样品标识荧光体X而使其电泳，使用其作为结果得到的荧光强度的数据来计算校正系数k(nX)。
将用于计算校正系数k(nX)的浓度已知的样品的DNA的浓度设为c(nX)。其中，n是毛细管119-1～4的末尾的编号，X是荧光体的种类。另外，将在多个毛细管间对DNA的浓度c(nX)进行了平均而得到的平均值设为avg(X)。另外，将多个毛细管间的DNA的浓度比r(nX)定义为r(nX)＝avg(X)/c(nX)。
在多个毛细管119的每一个中，在荧光体X的荧光强度为Int(nX)的情况下，校正系数k(nX)能够计算为k(nX)＝Int(yX)/{r(nX)×Int(nX)}。与第一实施方式一样，y是荧光强度最小的毛细管的编号。
在这样得到校正系数k(nX)时，对测量实际样品而得到的荧光强度f(nX)乘以该校正系数k(nX)，由此，能够与第一实施方式一样地执行校正。此外，在上述的变形例1的说明中，使用浓度c(nX)的平均值来计算校正系数k(nX)，但也可以将荧光强度的最大值、最小值、中央值、或者某特定的毛细管中的数值用于计算。
[变形例2]
接着，对第一实施方式的变形例2进行说明。在第一实施方式中，使用波长校准时(步骤S300)的数据来计算校正系数k(nX)，但在该变形例2中，对任意的浓度比已知的样品标识荧光体X而使其电泳，使用其作为结果得到的荧光强度的数据来计算校正系数。
将用于计算校正系数k(nX)的DNA的浓度比设为r(nX)，将荧光体X的荧光强度设为Int(X)。其中，n是毛细管的末尾编号，X是荧光体的种类。校正系数k(nX)能够计算为k(nX)＝Int(yX)/{r(nX)×Int(nX)}。与第一实施方式一样，y是荧光强度最小的毛细管的编号。
在这样得到校正系数k(nX)时，对测量实际样品而得到的荧光强度f(nX)乘以该校正系数k(nX)，由此，能够与第一实施方式一样地执行校正。
[变形例3]
接着，对第一实施方式的变形例3进行说明。在第一实施方式中，使用特定的波长校准时(步骤S300)的数据来计算校正系数k(nX)，但在该变形例2中，在该变形例3中，根据多个波长校准数据来计算校正系数。
在将毛细管的末尾编号设为n，将要使用的荧光体的种类设为X来进行m次的波长校准的情况下，设为得到了荧光强度Int(nX)的m次的平均值Avg(nX)。根据得到的n个平均值Avg(nX)的数据，确定得到最低的荧光强度的毛细管(编号y)，确定其平均值Avg(yX)。由此，能够将荧光体X中的校正系数k(nX)决定为k(nX)＝Avg(yX)/Avg(nX)。之后，对用荧光体X标识的实际样品的荧光强度f(nX)乘以校正系数k(nX)，由此，能够得到校正后的荧光强度。在此，使用平均值来计算校正系数，但也可以使用最大值、最小值、中央值。
[第二实施方式]
接着，参照图6，对第二实施方式的多毛细管电泳装置进行说明。第二实施方式的多毛细管电泳装置的结构本身可以与第一实施方式(图1)相同，因此，省略重复的说明。另外，整体的动作也大致相同(图3)。
其中，在该第二实施方式中，校正系数的运算方法与第一实施方式不同。具体而言，在第一实施方式中，以在使用了相同的荧光体的情况下在多个毛细管间校正后的荧光强度大致相同，或者至少其偏差减少的方式来计算校正系数。与之相对地，在第二实施方式中，无论毛细管的差异、要使用的荧光体的差异如何，关于所有的组合，都以校正后的荧光强度大致相同，或者至少其偏差变少的方式(以有意的偏差降低到能够忽略的偏差的方式)，来决定校正系数。参照图6对这方面进行说明。
在图6中，作为一例，对毛细管阵列106具有4根毛细管119-1～4的结构进行说明(图6的(a))。图6的(b)和(c)图示了校正系数的运算过程，图6的(e)示出了基于校正系数的校正后的荧光强度的数值例。与图4一样，图6的(c)～(e)的表中的数值不过是为了说明而记载的假想的值，与实际的测量值没有关联。
在图6的(a)～图6的(c)中，与图4一样，在分析开始前的波长校准时(图3的步骤S300)，通过各荧光体测定4根毛细管119-1～4各自的信号强度。目前为止与第一实施方式一样。
在第二实施方式中，在关于4根毛细管119-1～4和3种荧光体A～C的组合而得到的12种荧光强度Int(nX)中，确定最小的值Int(n0X0)。在该图6的(c)中，在毛细管119-1中使用荧光体B进行了测定的情况下的荧光强度Int(1B)为Int(n0X0)。n0表示荧光强度最小的毛细管的末尾编号，X0表示在该毛细管中将荧光强度设为最小的荧光体的种类。
在该第二实施方式中，以该最低荧光强度Int(n0X0)为基准，将校正系数k(nX)运算为k(nX)＝Int(n0X0)/Int(nX)。即，在该第二实施方式中，除了以在多个毛细管间荧光强度不产生差的方式进行校正，还以在多种荧光体间荧光强度也不产生差的方式进行校正，作为结果，以在多个毛细管及多个荧光体的组合间荧光强度大致相同，或至少与校正前相比偏差变小的方式执行校正。
图6的(d)是这样计算出的校正系数k(nX)的一例，是通过如图6的(c)那样得到的荧光强度Int(nX)除以最低荧光强度Int(n0X0)而得到的校正系数。根据该图6的(d)的校正系数k(nX)，例如对用荧光体X标识的实际样品的荧光强度f(nX)乘以k(nX)，由此，如图6的(e)那样得到校正后的荧光强度f’(nX)。与第一实施方式不同，所有的荧光强度f’(nX)不论荧光体的种类、毛细管的种类如何一致为0.6。
[第三实施方式]
接着，参照图7，对第三实施方式的多毛细管电泳装置进行说明。第三实施方式的多毛细管电泳装置的结构本身可以与第一实施方式(图1)相同，因此，省略重复的说明。另外，整体的动作也大致相同(图3)。但是，在该第三实施方式中，代替使用荧光强度Int(nX)的实测值来计算校正系数k(nX)的情况，而求出基于按照荧光强度Int(nX)的分布的拟合曲线的近似值，根据该近似值来计算校正系数k(nX)。
参照图7，对第三实施方式中的校正系数的运算方法进行说明。在此，对毛细管阵列106具有96根毛细管119-1～96，使用2种荧光体A、B的情况进行说明(图7的(a)、(b))。该96根这样的数量也不过是一例，当然能够采用其他的数量。图7的(b)～(e)图示了计算近似值，并且根据该近似值来进行校正系数的运算的过程。图7的(f)示出了基于校正系数的校正后的荧光强度的数值例。此外，图7的(c)～(f)的表中的数值不过是为了说明而记载的假想的值，与实际的测量值没有关联。
与第一实施方式一样，在从波长校准数据得到荧光强度Int(nX)之后(图7的(b))，制作以毛细管距光源107的距离为横轴，将纵轴设为荧光强度Int(nX)的分布图(图7的(c))。以得到的分布图的绘图为基础，例如使用最小二乘法等求出针对荧光体A、B各自的荧光强度Int(nA)、Int(nB)的拟合曲线Ca、Cb。根据该拟合曲线Ca、Cb，按毛细管和按荧光体计算荧光强度的近似值Int(nX’)(图7的(d))。
在例如如图7的(d)那样得到末尾编号n的毛细管中的荧光体X(A或B)的近似值Int(nX’)时，校正系数k(nX)能够计算为k(nX)＝Int(yX’)/Int(nX’)(图7的(e))。在此，Int(yX’)表示在使用了荧光体X(A或B)的测量中最小的最低近似值。通过使用该校正系数k(nX)，能够执行实际样品的实测值f(nX)的校正(图7的(f))。在图7的例子(图7的(d))中，针对荧光体A、B双方，在第一个毛细管119-1中，得到最小的近似值Int(yX’)。即，近似值Int(yA’)＝Int(1A’)＝1.15，Int(yB’)＝Int(1B’)＝0.65。
[第四实施方式]
接着，参照图8，对第四实施方式的多毛细管电泳装置进行说明。第四实施方式的多毛细管电泳装置的结构本身可以与第一实施方式(图1)相同，因此，省略重复的说明。另外，整体的动作也大致相同(图3)。但是，在该第四实施方式中，光检测器104中的光的检测方法以及校正系数的计算方法与所述的实施方式不同。
具体而言，在所述实施方式中，使用与实际样品相同的荧光体所标识的样品来测量荧光强度，根据该结果计算出校正系数。与此相对，在第四实施方式中，在对多个毛细管119填充了相同的物质(例如，缓冲器或其他物质(例如水))的状态下照射激发光，通过光检测器104测量该拉曼光的强度来计算校正系数。参照图8对这方面进行说明。为了测定拉曼光的强度而填充于毛细管119的物质作为一例是缓冲器。以下，主要对测定来自缓冲器的拉曼光的情况进行说明，但即使测量来自缓冲器以外的物质的拉曼光也能够得到一样的效果。
在计算校正系数的情况下，在对毛细管119-1～4填充了缓冲器之后，从光源107朝向光照射部108照射激光光束。并且，在毛细管119-1～4的每一个中，测量特定的波长X的拉曼光强度Int(nX)(n＝1～4)。如果相同的缓冲器供给到毛细管119-1～4，则在理想的情况下，得到的拉曼光强度Int(nX)在多个毛细管间相互大致相等。但是，因毛细管119-1～4的结构性偏差，毛细管119-1～4的拉曼光强度Int(nX)可能产生有意的偏差(参照图4的(b))。
并且，将分别在毛细管119-1～4中得到的拉曼光强度Int(nX)中的信号强度最低的拉曼光强度确定为最低拉曼光强度Int(yX)。在图8的(c)中，第二个毛细管119-2的拉曼光强度Int(2X)被确定为Int(2X)＝Int(yX)＝1.1。
以该最低拉曼光强度Int(yX)为基准，将针对毛细管119-1～4的每一个的校正系数k(n)计算为k(n)＝Int(yX)/Int(nX)(图8的(d))。计算出的校正系数k(n)存储在校正指数数据库1035中。
在这样得到校正系数k(n)后，对想要分析的样品(以下，称为“实际样品”)进行泳动而得到荧光强度f(nX)。对该荧光强度f(nX)乘以如图8的(d)那样得到的校正系数k(n)，由此如图8的(e)所示，能够得到校正后的荧光强度f’(nX)。校正前的荧光强度f(nX)即使是使用相同的荧光体测量了相同的样品的情况也具有偏差，但如图8的(e)所示，乘以校正系数k(n)，由此，校正后的荧光强度f’(nX)能够在多个毛细管119-1～4间设为大致相同的值。即，不论毛细管间的结构性偏差如何，都能够在毛细管间在同一条件下得到大致相同的荧光强度。
[第五实施方式]
接着，参照图9，对第五实施方式的多毛细管电泳装置进行说明。该第五实施方式与第四实施方式一样，构成为根据拉曼光强度来计算校正系数。第五实施方式的多毛细管电泳装置的结构本身可以与第一实施方式(图1)相同，因此，省略重复的说明。另外，整体的动作也大致相同(图3)。在第四实施方式中，使用缓冲器的拉曼光的信号强度分布的峰值的位置处的信号强度来计算校正系数，但在第五实施方式中，使用缓冲器的拉曼光的信号强度分布所包含的多个波长处的信号强度来计算校正系数。参照图9对此进行说明。
在图9中，作为一例，对毛细管阵列106具有4根毛细管119-1～4进行说明(图9的(a))。图9的(b)～(d)图示了校正系数的运算过程。
在运算校正系数的情况下，与第四实施方式一样，在对毛细管119-1～4填充了缓冲器之后，从光源107朝向光照射部108照射激光光束。于是，例如如图9的(b)所示，来自缓冲器的拉曼光的强度分布P3成为比荧光体发出的荧光的强度分布P1、P2宽的波长范围的分布。
在该第五实施方式中，在毛细管119-1～4的每一个中，测量缓冲器的拉曼光强度分布的P3的波长λa、λb下的拉曼光强度Int(nA)、Int(nB)(n＝1～4)。该波长λa、λb是标识实际样品的荧光体A、B的荧光波长。如图9的(b)所示，在来自缓冲器的拉曼光强度分布P3与标识实际样品的荧光体的荧光波长λa、λb重叠的情况下，测量该荧光波长λa、λb下的缓冲器的拉曼光强度Int(nA)、Int(nB)(n＝1～4)，根据该拉曼光强度Int(nA)、Int(nB)来计算校正系数k(nA)、k(nB)。由此，能够更准确地执行实际样品的荧光强度的校正。
在针对毛细管119-1～4的每一个计算拉曼光强度Int(nA)、Int(nB)(n＝1～4)时，接着，将Int(nA)、Int(nB)中的最小值定义为最低拉曼光强度Int(yA)、Int(yB)。在图9的(c)的例子中，针对荧光体A，毛细管119-2的拉曼光强度Int(2A)为最低拉曼光强度Int(yA)，针对荧光体B，毛细管119-1的拉曼光强度Int(1B)为最低拉曼光强度Int(yB)。
以该最低拉曼光强度Int(yA)、Int(yB)为基准，校正系数k(nA)、k(nB)计算为k(nA)＝Int(yA)/Int(nA)、k(nB)＝Int(yB)/Int(nB)。这样得到的校正系数k(nA)、k(nB)与用荧光体X标识的实际样品的荧光强度f(nX)相乘，由此，适当地校正荧光体A、B的荧光强度。
[第六实施方式]
接着，参照图10，对第六实施方式的多毛细管电泳装置进行说明。在第一实施方式中，根据通过与实际样品的电泳不同的电泳而得到的荧光强度来计算校正系数(例如，图2的步骤S300)，但该第六实施方式的装置构成为根据通过实际样品的电泳而得到的荧光强度来计算校正系数。以下，参照图10对这发明进行说明。
在图10中，为了简化说明，对毛细管阵列106具有4根毛细管119-1～4进行说明(图10的(a))。图10的(b)～(d)图示了校正系数的运算过程，图10的(e)示出了基于校正系数的校正后的荧光强度的数值例。此外，图10的(c)～(e)的表中的数值不过是为了说明而记载的假想的值，与实际的测量值没有关联。
首先，将与用于实际样品的标识的荧光体相同的荧光体所标识的标准品和实际样品混合。对混合有这样的标准品的实际样品进行电泳，如通常那样测定实际样品的荧光强度，另一方面，标准品的荧光强度也在相同的工艺中进行测定。此时，标准品必须能够在泳动数据的基础上在时间上或空间上与实际样品区别。例如，如图10的(b)所示，需要以实际样品的荧光强度的峰值T1与标准品的荧光强度的峰值R在时间上不同的方式将标准品混合到实际样品中，执行泳动控制。
在颜色转换(相当于图2的步骤S310)后，将观测到的标准品的荧光强度设为Intr(nX)。其中，n是毛细管的编号，X是荧光体的种类。将得到的4个标准品的荧光强度Intr(1X)、Intr(2X)、Intr(3X)、Intr(4X)中的最小值定义为最低荧光强度Intr(yX)。在图10的(c)的例子中，毛细管119-3的荧光强度Intr(3X)是最低荧光强度Intr(yX)。
在得到最低荧光强度后，与上述实施方式一样，将校正系数k(nX)计算为k(nX)＝Int(yX)/Int(nX)。此外，与上述实施方式一样，也能够代替使用最小值(最低荧光强度)进行计算，而使用荧光强度的平均值、最大值、中央值。使用该校正系数，与其他实施方式一样，通过对实际样品的荧光强度f(nX)乘以k(nX)，能够校正各荧光体间的强度差。
本发明并不限定于上述的实施方式，包含各种变形例。例如，上述的实施方式是为了容易理解地说明本发明而详细地进行了说明的实施方式，并不限定于必须具有所说明的全部结构。另外，能够将某实施方式的结构的一部分置换为其他实施方式的结构，另外，也能够对某实施方式的结构添加其他实施方式的结构。另外，对于各实施方式的结构的一部分，能够进行其他结构的追加、删除、置换。另外，上述的各结构、功能、处理部、处理单元等的一部分或者全部例如也可以通过由集成电路设计等而由硬件实现。
附图标记说明
101…装置主体、102…控制用计算机、103…运算控制电路、104…光检测器、105…恒温槽、106…毛细管阵列、107…光源、108…光照射部、109…装载头、110…毛细管阴极端、111…阴极用缓冲容器、112…样品容器、113…聚合物盒、114…阳极用缓冲容器、115…阳极、116…直流电源、117…阵列头、118…输送机、119…毛细管、120…注射机构、121…尖部、122…聚合物盒上部、123…加热冷却机构、201…激光光束、202…反射镜、203…聚光透镜。

Claims (6)

1.一种多毛细管电泳装置，其特征在于，具有：
毛细管阵列，其排列多个毛细管而构成；
光源，其对所述多个毛细管照射激发光；
光检测器，其检测来自所述毛细管内的样品的荧光；以及
运算控制部，其按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度，
所述运算控制部构成为，按照针对所述多个毛细管中的任一个与标识所述样品的荧光体的组合而确定的校正指数，校正所述信号强度，
所述多毛细管电泳装置还具有运算所述校正指数的校正指数运算部，
所述校正指数运算部根据对所述多个毛细管赋予相同的条件并测定来自所述多个毛细管内的样品的荧光而得到的信号强度，来运算所述校正指数，
所述校正指数运算部根据所述信号强度的分布的拟合曲线来计算所述信号强度的近似值，根据所述近似值来运算所述校正指数。
2.根据权利要求1所述的多毛细管电泳装置，其特征在于，
所述运算控制部在将所述校正指数应用于测量实际样品而得到的信号强度的情况下，设定所述校正指数，以使应用所述校正指数后的所述信号强度在所述多个毛细管间的偏差相比于应用所述校正指数前的所述信号强度在所述多个毛细管间的偏差降低。
3.根据权利要求1所述的多毛细管电泳装置，其特征在于，
所述运算控制部根据针对所述多个毛细管中的任一个和多种荧光体中的任一个的组合而确定的校正指数，来校正所述信号强度。
4.一种样品分析方法，其使用具有多个毛细管的多毛细管电泳装置对样品进行分析，其特征在于，所述样品分析方法具有：
经由多个毛细管使所述样品电泳的步骤；
使用光检测器检测对所述多个毛细管照射激发光而产生的荧光的步骤；
按照所述光检测器的信号计算所述荧光的信号强度的步骤；以及
按照针对所述多个毛细管中的任一个和标识所述样品的荧光体的组合而确定的校正指数，校正所述荧光的信号强度的步骤，
所述样品分析方法还具有运算所述校正指数的步骤，
在运算所述校正指数的步骤中，根据对所述多个毛细管赋予相同的条件并测定来自所述多个毛细管内的样品的荧光而得到的信号强度，运算所述校正指数，
在运算所述校正指数的步骤中，根据所述信号强度的分布的拟合曲线来计算所述信号强度的近似值，根据所述近似值来运算所述校正指数。
5.根据权利要求4所述的样品分析方法，其特征在于，
在将所述校正指数应用于测量实际样品而得到的信号强度的情况下，设定所述校正指数，以使应用所述校正指数后的所述信号强度在所述多个毛细管间的偏差相比于应用所述校正指数前的所述信号强度在所述多个毛细管间的偏差降低。
6.根据权利要求4所述的样品分析方法，其特征在于，
针对所述多个毛细管中的任一个与多种荧光体中的任一个的组合来确定所述校正指数。
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